Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản ở vùng phá Tam Giang, Thừa Thiên Huế

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế

Tập 17, Số 2 (2020)

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN PHÂN GIẢI TINH BỘT
TỪ HỒ NUÔI THỦY SẢN Ở VÙNG PHÁ TAM GIANG, THỪA THIÊN HUẾ

Hoàng Dương Thu Hương*, Nguyễn Thị Hồng Thảo
Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế
*Email:
Ngày nhận bài: 26/6/2020; ngày hoàn thành phản biện: 3/7/2020; ngày duyệt đăng: 02/10/2020
TÓM TẮT
Từ 12 mẫu đất đã phân lập được 60 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh
bột, số lượng vi khuẩn dao động trong khoảng 1,52 x 106 CFU/g – 6,23 x 106 CFU/g.
Tuyển chọn được hai chủng vi khuẩn T1 và T12 có khả năng phân giải tinh bột
mạnh với kích thước vịng phân giải đạt 25,33 mm – 25,67 mm. Nghiên cứu về điều
kiện nuôi cấy đã chỉ ra rằng, hai chủng vi khuẩn này có sự tích lũy sinh khối và
hoạt tính enzyme mạnh nhất trong mơi trường có pH 6,5 – 7,0 sau 48 – 60 giờ.
Từ khóa: Chủng vi khuẩn, điều kiện ni cấy, phân giải tinh bột.

1. MỞ ĐẦU
Tam Giang là vùng đầm phá nước lợ lớn nhất ở khu vực Đông Nam Á, nằm
trong hệ đầm phá Tam Giang - Cầu Hai, thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế. Trong những
năm gần đây, nghề nuôi thủy sản ở đây phát triển mạnh mẽ, hàng năm khai thác hàng
nghìn tấn hải sản, cá, tơm các loại [4]. Tuy nhiên, ảnh hưởng của ngành nuôi trồng
thủy sản đến môi trường, đặc biệt là nguồn nước nói chung và ao hồ nói riêng đang ở
tình trạng ô nhiễm đáng báo động gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ sinh thái và
sức khỏe của người dân trong khu vực.
Hiện nay, việc sử dụng các biện pháp sinh học để xử lí nước thải đã được
chứng minh là có hiệu suất xử lý cao hơn những biện pháp hóa lý khác [2]. Cơ sở của
việc xử lý chất thải các ao nuôi bằng vi sinh vật (VSV) là sử dụng VSV để phân giải các

chất ô nhiễm hữu cơ có trong chất thải, bã thải. Nhờ hoạt động của VSV, các chất ơ
nhiễm được chuyển hóa về nồng độ cho phép, ở mức không gây hại tới môi trường. Để
tìm hiểu về khả năng phân giải các chất hữu cơ như tinh bột của vi khuẩn trong chất
thải ao ni và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong các
phương pháp xử lí sinh học, làm cơ sở cho nghiên cứu tạo chế phẩm VSV hữu ích làm

107


Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản …

sạch chất thải và góp phần xử lý ơ nhiễm mơi trường, chúng tôi tiến hành phân lập các
chủng vi khuẩn này từ các hồ nuôi thủy sản ở vùng Tam Giang, Thừa Thiên Huế.

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu, địa điểm và thời gian thực hiện
Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột phân lập từ mẫu đất ở các
hồ nuôi thủy sản ở vùng phá Tam Giang, Thừa Thiên Huế.
Địa điểm thu mẫu: Vùng phá Tam Giang, Thừa Thiên Huế.
Thời gian thực hiện: từ tháng 12/2019 đến tháng 4/2020.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập và đếm số lượng tế bào
Sử sụng phương pháp Koch để phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải tinh
bột trên môi trường thạch Vinogradski thạch đĩa nhưng thay nguồn carbon bằng tinh
bột [3].
Xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong mẫu bằng phương pháp đếm gián tiếp
thông qua số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đĩa [3].
2.2.2. Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột
Các chủng vi khuẩn được cấy vạch lên bề mặt thạch đĩa, nuôi cấy ở thời gian và
nhiệt độ thích hợp sau đó nhuộm màu bằng thuốc nhuộm Lugol [1].

2.2.3. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
Các chủng vi khuẩn tuyển chọn được nuôi cấy lắc tốc độ 120 rpm ở nhiệt độ
phịng với thời gian thích hợp. Ly tâm dịch nuôi bằng máy ly tâm lạnh, tốc độ 8000
rpm trong 10 phút để thu phần dịch nổi.
Chuẩn bị các đĩa petri chứa thạch - cơ chất: gồm 2% thạch và 0,5% cơ chất là
tinh bột.
Tạo giếng thạch có đường kính 12 mm, dùng micropipette hút 0,7 ml dịch
enzyme vào giếng. Làm lạnh trong 12 giờ (4 - 6ᵒC) rồi đưa vào tủ ấm 28 - 30ᵒC ủ trong
36 giờ. Nhuộm màu bằng Lugol và đo đường kính vịng phân giải cơ chất [1].
2.2.4. Xác định sinh khối vi khuẩn
Phần sinh khối được tái huyền phù để tiến hành đo OD bằng máy quang phổ
kế ở bước sóng 610 nm, dựa vào đồ thị chuẩn để xác định sinh khối tạo thành.

108


TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế

Tập 17, Số 2 (2020)

2.2.5. Xác định một số đặc điểm hình thái
Quan sát đại thể trên môi trường thạch đĩa, sử dụng phương pháp làm tiêu bản
phiến kính để quan sát hình thái tế bào [3].
2.2.6. Thăm dị một số điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme amylase
của vi khuẩn
Tối ưu hóa một số điều kiện ni cấy: thời gian, pH thích hợp cho sinh trưởng
phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn bằng phương pháp “ một lúc – một
biến” (one – variable – at – a – time – method)
2.2.7. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2016 và phân tích ANOVA (Duncan’s

test p < 0,05) bằng chương trình SPSS 20.0.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột
3.1.1. Tìm hiểu số lượng vi khuẩn
Từ 12 mẫu đất ở đáy hồ nuôi thủy sản ở vùng phá Tam Giang - Thừa Thiên
Huế đã tiến hành phân lập và đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn có khả năng phân giải
tinh bột trên môi trường thạch cơ bản (chứa tinh bột). Kết quả về số lượng vi khuẩn
phân giải tinh bột được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Số lượng vi khuẩn trong các mẫu đất hồ nuôi thủy sản
STT

Ký hiệu
mẫu

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

CT1
CT2

CT3
CT4
CT5
CT6
RC1
RC2
RC3
RC4
CT7
CT8

Địa điểm thu mẫu
Hồ nuôi thủy sản ở cồn Tè
Hồ nuôi thủy sản ở cồn Tè
Hồ nuôi thủy sản ở cồn Tè
Hồ nuôi thủy sản ở cồn Tè
Hồ nuôi thủy sản ở cồn Tè
Hồ nuôi thủy sản ở cồn Tè
Hồ nuôi thủy sản ở Rú Chá
Hồ nuôi thủy sản ở Rú Chá
Hồ nuôi thủy sản ở Rú Chá
Hồ nuôi thủy sản ở Rú Chá
Hồ nuôi thủy sản ở Cồn Tè
Hồ nuôi thủy sản ở Cồn Tè

pH

Thời gian
thu mẫu

6,8
4,2
5,0
4,1
4,2
4,0
5,5
5,3
4,2
4,2
3,7
4,1

6/12/2019
6/12/2019
6/12/2019
6/12/2019
6/12/2019
6/12/2019
7/1/2020
7/1/2020
7/1/2020
7/1/2020
3/2/2020
3/2/2020

Số lượng vi
khuẩn
CFU/g (x106)
6,26

3,45
6,32
3,75
2,98
3,31
4,14
3,56
2,88
3,11
1,52
3,37

Từ kết quả bảng 1 cho thấy, số lượng vi khuẩn có sự khác biệt và dao động tùy
từng vị trí lấy mẫu. Số lượng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột cao nhất là mẫu
109


Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản …

CT3 (6,23 x106 CFU/g đất khô) được lấy từ hồ nuôi thủy sản ở Cồn Tè, số lượng vi
khuẩn có khả năng phân giải tinh bột thấp nhất là mẫu CT7 (1,52 x106 CFU/g đất khô)
cũng được lấy tại địa điểm này. Như vậy, trên cùng một địa điểm lấy mẫu nhưng ở các
thời điểm khác nhau thì số lượng vi khuẩn khơng giống nhau, điều này có thể phụ
thuộc vào nhiệt độ, pH và thời gian thu mẫu khác nhau.
3.1.2. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột của vi khuẩn
Bảng 2. Khả năng phân giải tinh bột của các chủng phân lập
Khả năng phân giải
Yếu
Trung Bình
Mạnh

Rất mạnh

Chiều rộng vạch phân giải
w < 10
10 ≤ w < 15
15 ≤ w < 20
w ≥ 20

Số chủng
9
26
18
7

Tỷ lệ (%)
15,00
43,33
30,00
11,67

Từ kết quả ở bảng 2 cho thấy, tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được đều có
khả năng phân giải tinh bột nhưng ở các mức độ khác nhau. Có 26 chủng có khả năng
phân giải tinh bột trung bình, chiếm tỷ lệ cao nhất (43,33%). Các chủng có khả năng
phân giải tinh bột mạnh chiếm tỷ lệ khá lớn (30,00%). Thông qua sơ tuyển phát hiện
được 7 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột rất mạnh chiếm tỷ lệ 11,67%.

Hình 1. Vạch phân giải tinh bột của một số chủng vi khuẩn mạnh

3.1.3. Hoạt lực phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Trong số các chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tôi chọn ra 10 chủng có kích

thước vạch phân giải lớn nhất để tiến hành tuyển chọn bằng phương pháp khuếch tán
thạch đĩa. Kết quả được trình bày ở bảng 3.
110


TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế

Tập 17, Số 2 (2020)

Bảng 3. Kích thước vòng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Chủng
T1
T6
T12
T14
T15
T17
T30

T43
T47
T55

Kích thước (mm)
25,33a
20,67bc
25,67a
21,33b
16,33de
18,67cd
21,00b
16,67de
17,33d
19,67c

Ghi chú: Sự sai khác giữa các chữ cái trên cùng một cột biểu hiện sai khác có ý nghĩa thống kê
với p < 0,05 (Ducans’ test)

Trong 10 chủng đã xác định hoạt tính enzyme, chủng T1 và T12 có vịng phân
giải lớn nhất, kích thước vịng phân giải lần lượt là 25,33 mm và 25,67 mm. Do đó
chúng tơi chọn chủng T1 và T12 làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 2. Vịng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn mạnh

3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn
3.2.1. Chủng T1
- Khuẩn lạc hình trịn, kích thước 2-3 mm, bề mặt trơn, nhẵn, màu trắng sữa, độ
dày 1-2 mm.

111


Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản …

- Tiến hành nhuộm Gram âm chủng T1 và quan sát trên kính hiển vi với độ
phóng đại x100, cho thấy tế bào chủng T1 bắt màu hồng, có hình que dài và đứng riêng
lẻ.

Hình 3. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng T1 (x100).

3.2.2. Chủng T12
- Khuẩn lạc hình trịn, kích thức 2-3 mm, bề mặt trơn, nhẵn, màu trắng trong,
dộ dày 1-2 mm.
- Tiến hành nhuộm Gram âm chủng T12 và quan sát trên kính hiển vi với độ
phóng đại x100, cho thấy tế bào chủng T12 bắt màu hồng có hình trịn và đứng riêng lẻ.

Hình 4. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng T12 (x100)

3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính
enzyme của vi khuẩn
Để thăm dị ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển và
hoạt tính enzyme của vi khuẩn, tiến hành nuôi cấy lắc hai chủng vi khuẩn trong môi

112


TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế

Tập 17, Số 2 (2020)

trường Vinogradski dịch thể. Sau các mốc thời gian 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ xác định
hoạt tính amylase và sinh khối 2 chủng vi khuẩn.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 12 giờ, sự tích lũy sinh khối và hoạt tính
amylase bắt đầu tăng mạnh ở cả hai chủng vi khuẩn và đạt cực đại ở 48 giờ đối với
chủng T1 và 60 giờ đối với chủng T12. Sau các khoảng thời gian này, hoạt tính amylase
và sinh khối bắt đầu giảm.
Bảng 4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển
và hoạt tính amylase của hai chủng T1 và T12
T1
Thời gian
ni cấy
(giờ)
12
24
36
48
60
72

Sinh khối
khơ
(mg/ml)
1,31f
1,66d
1,83b
2,03a
1,72c
1,50e

T12

Đường kính vịng
phân giải (mm)

Sinh khối khơ
(mg/ml)

Đường kính vịng
phân giải (mm)

13,67f
23,00c
25,33b
27,00a
20,33d
14,67e

0,41f
4,45e
0,87d
1,51b
2,07a
1,39c

17,33e
19,67d
20,00cd
22,33b
25,67a

20,33c

Ghi chú: Sự sai khác giữa các chữ cái trên cùng một cột biểu hiện sai khác có ý nghĩa thống kê
với p < 0,05 (Ducans’ test)

3.3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính enzyme
của vi khuẩn
pH mơi trường được điều chỉnh ở các mức 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 bằng
đệm phosphate; sau thời gian nuôi cấy thích hợp (48 giờ đối với chủng T1 và 60 giờ đối
với chủng T12) xác định hoạt tính amylase và sinh khối 2 chủng vi khuẩn.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cả hai chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh
trưởng và phát triển ở khoảng pH khá rộng trong đó chủng T1 thích hợp nhất ở pH 6,5
và chủng T12 thích hợp nhất ở pH 7. Khi pH mơi trường tăng lên, sinh khối và hoạt
tính enzyme của 2 chủng vi khuẩn đều giảm.
Bảng 5. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng phát triển và hoạt tính amylase
của hai chủng T1 và T12
T1
pH
5,0
5,5
6,0

Sinh khối
khơ
(mg/ml)
1,00g
1,35f
3,05c

T12

Đường kính vịng
phân giải (mm)

Sinh khối khơ
(mg/ml)

Đường kính vịng
phân giải (mm)

12,33g
21,00d
24,67c

1,95e
2,16d
2,51bc

17,33f
19,00e
24,00d

113


Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ ni thủy sản …
T1
Sinh khối
khơ
(mg/ml)

5,34a
4,24b
2,31d
1,63e

pH
6,5
7,0
7,5
8,0

T12

Đường kính vịng
phân giải (mm)

Sinh khối khơ
(mg/ml)

Đường kính vịng
phân giải (mm)

28,00a
26,33b
18,33e
15,67f

2,73b
3,30a
3,06ab

2,37c

26,67c
45,00a
27,33b
13,67g

Ghi chú: Sự sai khác giữa các chữ cái trên cùng một cột biểu hiện sai khác có ý nghĩa thống kê
với p < 0,05 (Ducans’ test)

4. KẾT LUẬN
Số lượng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột phân lập từ mẫu đất của các
hồ nuôi ở vùng phá Tam Giang dao động trong khoảng từ 1,52 x 106 CFU/g - 6,32 x 106
CFU/g.
Trong 60 chủng vi khuẩn phân giải tinh bột phân lập được từ 12 mẫu đất, đã
tuyển chọn được 2 chủng T1 và T12 có khả năng phân giải tinh bột mạnh.
Điều kiện tối ưu cho sinh trưởng phát triển và hoạt tính enzyme mạnh của 2
chủng vi khuẩn:
- Chủng T1: thời gian nuôi cấy là 48 giờ, pH môi trường 6,5.
- Chủng T12: thời gian nuôi cấy là 60 giờ, pH môi trường 7.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đồn Xn
Mượu, Phạm Văn Ty, 1978. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, Tập 2. Nxb Khoa học và
Kỹ thuật, Hà Nội.
[2]. K. Selvam, T. Selvankumar, R. Rajiniganth, P. Srinivasan, C. Sudhakar, B. Senthilkumar, M.
Govarthanan (2016), "Enhanced production of amylase from Bacillus sp. using groundnut
shell and cassava waste as a substrate under process optimization: Waste to wealth
approach", Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, Vol.7, pp. 250 - 256.
[3]. Phạm Thị Ngọc Lan, 2012. Giáo trình thực tập Vi sinh vật học, Nxb Đại học Huế.

[4]. />
114


TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế

Tập 17, Số 2 (2020)

ISOLATION AND SELECTION OF AMYLOLYTIC BACTERIA FROM
AQUACULTURE PONDS IN TAM GIANG LAGOON ,
THUA THIEN HUE PROVINCE

Hoang Duong Thu Huong*, Nguyen Thi Hong Thao
Faculty of Biology, University of Sciences, Hue University
*Email:
ABSTRACT
In this study, sixty strains of amylolytic bacteria were isolated from 12 soil samples
of aquaculture ponds. The number of bacteria strains is around 1,52 x 106 CFU/g 6,32 x 106 CFU/g. Among this number, two strains called T1 and T12 with strong
starch hydrolysis ability with enzyme activity at 25,33 mm - 25,67 mm were
seclected. This study indicates that these two amylolytic bacteria strains have the
best rise of biomass and enzyme at pH 6,5 - 7,0, after 48-60 hours.
Keywords: Amylolytic, bacteria strains, cultural conditions.

Hoàng Dương Thu Hương sinh ngày 30/04/1990. Bà tốt nghiệp chuyên
ngành Công nghệ sinh học năm 2013, tốt nghiệp Thạc sĩ chuyên ngành
Công nghệ sinh học năm 2015 tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế.
Từ năm 2013 đến nay là cán bộ giảng dạy tại Bộ môn Công nghệ sinh học,
Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế.

115

Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản …

116