Bài giảng Thực hành Công nghệ vi sinh - ĐH Lâm Nghiệp

THS. NGUYỄN THỊ THU HẰNG

THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ VI SINH

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP - 2020


ii


MỤC LỤC
MỤC LỤC ...................................................................................................................... i
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1
GIỚI THIỆU MÔN HỌC ............................................................................................. 2
Bài 1. NHÂN SINH KHỐI NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE ............5
1.1. Mục tiêu và yêu cầu ............................................................................................ 5
1.2. Kiến thức lý thuyết ............................................................................................. 5
1.3. Nội dung thực hành ............................................................................................ 6
1.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu .............................................................................. 6
1.3.2. Thực hiện thí nghiệm .................................................................................... 6
1.4. Kiểm tra, đánh giá............................................................................................. 10
Bài 2. ỨNG DỤNG NẤM MEN ĐỂ LÀM TRƢƠNG NỞ BỘT MÌ .................... 13
2.1. Mục tiêu và yêu cầu .......................................................................................... 13
2.2. Kiến thức lý thuyết ........................................................................................... 13
2.3. Nội dung thực hành .......................................................................................... 14
2.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ............................................................................ 14
2.3.2. Thực hiện thí nghiệm .................................................................................. 14
2.4. Kiểm tra, đánh giá............................................................................................. 16

Bài 3. QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL .......................................................... 17
3.1. Mục tiêu và yêu cầu .......................................................................................... 17
3.2. Kiến thức lý thuyết ........................................................................................... 17
3.3. Nội dung thực hành .......................................................................................... 18
3.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ............................................................................ 18
3.3.2. Thực hiện thí nghiệm .................................................................................. 19
3.4. Kiểm tra, đánh giá............................................................................................. 25
Bài 4. QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC ............................................................... 28
4.1. Mục tiêu và yêu cầu .......................................................................................... 28
4.2. Kiến thức lý thuyết ........................................................................................... 28
i


4.3. Nội dung thực hành ...........................................................................................29
4.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ............................................................................29
4.3.2. Thực hiện thí nghiệm ..................................................................................30
4.4. Kiểm tra, đánh giá .............................................................................................35
Bài 5. QUÁ TRÌNH LÊN MEN ACETIC ...............................................................38
5.1. Mục tiêu và yêu cầu ..........................................................................................38
5.2. Kiến thức lý thuyết ............................................................................................38
5.3. Nội dung thực hành ...........................................................................................39
5.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ............................................................................39
5.3.2. Thực hiện thí nghiệm ..................................................................................39
5.4. Kiểm tra, đánh giá .............................................................................................40
Bài 6. QUÁ TRÌNH PHÂN GIẢI CELLULOSE NHỜ VI SINH VẬT ...............42
6.1. Mục tiêu và yêu cầu ..........................................................................................42
6.2. Kiến thức lý thuyết ............................................................................................42
6.3. Nội dung thực hành ...........................................................................................42
6.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ............................................................................42
6.3.2. Thực hiện thí nghiệm ..................................................................................43

6.4. Kiểm tra, đánh giá .............................................................................................43
Bài 7. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME CỦA VI SINH VẬT ........................45
7.1. Mục tiêu và yêu cầu ..........................................................................................45
7.2. Kiến thức lý thuyết ............................................................................................45
7.3. Nội dung thực hành ...........................................................................................45
7.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ............................................................................45
7.3.2. Thực hiện thí nghiệm ..................................................................................46
7.4. Kiểm tra, đánh giá .............................................................................................47
Bài 8. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA VI SINH VẬT ................48
8.1. Mục tiêu và yêu cầu ..........................................................................................48
8.2. Kiến thức lý thuyết ............................................................................................48
8.3. Nội dung thực hành ...........................................................................................48
ii


8.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ............................................................................ 48
8.3.2. Thực hiện thí nghiệm .................................................................................. 50
8.4. Kiểm tra, đánh giá............................................................................................. 51
Bài 9. ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ VI SINH TRONG Q TRÌNH PHÂN HỦY
RÁC HỮU CƠ ........................................................................................................... 53
9.1. Mục tiêu và yêu cầu .......................................................................................... 53
9.2. Kiến thức lý thuyết ........................................................................................... 53
9.3. Nội dung thực hành .......................................................................................... 54
9.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu ............................................................................ 54
9.3.2. Thực hiện thí nghiệm .................................................................................. 54
9.4. Kiểm tra, đánh giá............................................................................................. 54
Bài 10 THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC TỪ VI KHUẨN BACILLUS
THURINGIENSIS ..................................................................................................... 56
10.1. Mục tiêu và yêu cầu ........................................................................................ 56
10.2. Kiến thức lý thuyết ......................................................................................... 56

10.3. Nội dung thực hành ........................................................................................ 57
10.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu .......................................................................... 57
10.3.2. Thực hiện thí nghiệm ................................................................................ 58
10.4. Kiểm tra, đánh giá........................................................................................... 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 62

iii


iv


MỞ ĐẦU
Bài giảng “Thực hành Công nghệ Vi sinh” là tài liệu học tập chính cho sinh
viên năm thứ ba ngành Công nghệ sinh học, là tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành
Thú y và các ngành học liên quan của Trường Đại học Lâm nghiệp.
Bài giảng gồm 10 bài thực hành, được viết theo trình tự với các mục: Mục tiêu
và yêu cầu, kiến thức lý thuyết, nội dung thực hành (trình bày chi tiết các bước trong
thí nghiệm thực hành), kiểm tra và đánh giá. Các bài thực hành nhằm minh họa,
chứng minh lý thuyết của các quá trình: Lên men thu nhận sinh khối vi sinh vật, lên
men nhờ vi sinh vật tạo sản phẩm trong công nghệ thực phẩm, ứng dụng công nghệ
vi sinh trong giải quyết ô nhiễm môi trường... Do vậy, thông qua thực hiện các bài
thực hành, người học nắm vững, củng cố nhận thức, hiểu sâu sắc vai trò và tầm quan
trọng của vi sinh vật trong các quá trình chuyển hóa vật chất, từ đó biết cách định
hướng và ứng dụng vi sinh vật trong quá trình tác nghiệp sau khi ra trường.
Trong q trình biên soạn, mặc dù có nhiều cố gắng, tuy nhiên chắc chắn khơng
tránh khỏi có những thiếu sót. Tác giả mong nhận được ý kiến đóng góp của người đọc.
Tác giả

1

2


GIỚI THIỆU MƠN HỌC
1. Mục tiêu mơn học
Sau khi hồn tất môn học Thực hành Công nghệ vi sinh, sinh viên:
- Biết vận dụng kiến thức, kỹ thuật về vi sinh vật vào các lĩnh vực: công nghiệp
thực phẩm (cải thiện chất lượng, chế biến, bảo quản thực phẩm), nông nghiệp, chăn
nuôi, bảo vệ môi trường, bảo vệ thực vật…;
- Biết kết hợp giữa lý thuyết, thực hành, viết báo cáo, nhận xét, cách tra cứu tài
liệu và làm ra được một số sản phẩm lên men từ chủng vi sinh vật thuần khiết hoặc vi
sinh vật phân bố trong tự nhiên.
2. Yêu cầu của môn học
 Kiến thức căn bản cần biết trước
- Lý thuyết về Vi sinh vật học.
- Lý thuyết về Vi sinh vật ứng dụng.
- Lý thuyết về Q trình và thiết bị cơng nghệ
 Sau khi kết thúc thực hành, sinh viên nắm vững kiến thức lý thuyết và thực
hiện thành thạo, đúng kỹ thuật
- Cách làm môi trường, cấy và giữ giống vi sinh vật.
- Phân lập và tinh sạch vi sinh vật.
- Sàng lọc chủng vi sinh vật có ích (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc), có hoạt tính
sinh học để ứng dụng trong cơng nghiệp.
- Phân tích và đánh giá kết quả của các quá trình lên men do vi sinh vật.
3. Các bài thực hành
Bài 1. Nhân sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae.
Bài 2. Ứng dụng nấm men để làm trương nở bột mì.
Bài 3. Quá trình lên men ethanol.

Bài 4. Quá trình lên men lactic.
Bài 5. Quá trình lên men acetic.
Bài 6. Quá trình phân giải cellulose nhờ vi sinh vật.
3


Bài 7. Xác định hoạt tính enzyme của vi sinh vật.
Bài 8. Xác định hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật.
Bài 9. Ứng dụng công nghệ vi sinh trong quá trình phân hủy rác hữu cơ.
Bài 10. Thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis.
4. Cách thức tổ chức thực hiện
- Trước khi đi thực hành, sinh viên phải đọc, nắm vững kiến thức lý thuyết và
nội dung của bài thực hành.
- Sinh viên thực hiện thao tác thực hành dưới sự hướng dẫn trực tiếp của giảng
viên/trợ giảng.
- Sinh viên ghi các kết quả thực hành, xử lý số liệu và viết báo cáo kết quả theo
hướng dẫn của giảng viên/trợ giảng.
5. Cách thức kiểm tra, đánh giá
- Điểm chuyên cần: 20%.
- Kết quả thực hiện và báo cáo kết quả thí nghiệm của từng bài thực hành:
40%.
- Bài thi thực hành: 40%.

4


Bài 1
NHÂN SINH KHỐI NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE
1.1. Mục tiêu và yêu cầu
 Mục tiêu

Sinh viên hiểu rõ nguyên lý của quá trình lên men sản xuất chủng, giống vi sinh
vật đảm bảo chất lượng và có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm; làm nguồn
dinh dưỡng bổ sung cho con người, vật nuôi, cây trồng…
 Yêu cầu
- Củng cố và khắc sâu các kiến thức:
+ Sinh khối vi sinh vật chứa hàm lượng rất cao protein;
+ Công việc sản xuất sinh khối vi sinh vật có thể thực hiện tốt trong diện tích
nhỏ, sản phẩm dễ thu hoạch với hiệu suất thu hồi cao, việc sản xuất không phụ thuộc
thời tiết, khí hậu và sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm...
- Thực hành và rèn luyện các kỹ năng:
+ Chuẩn bị môi trường lên men sản xuất sinh khối nấm men;
+ Chuẩn bị giống nấm men, hoạt hóa giống, cấy giống vào mơi trường lên
men, thực hiện quá trình lên men nhân giống nấm men ở qui mơ phịng thí nghiệm;
+ Thu nhận sinh khối nấm men;
+ Xác định hiệu suất của quá trình lên men.
1.2. Kiến thức lý thuyết
Công nghệ sản xuất protein đơn bào (Sing - Cell Protein - SCP) hay công nghệ
nhân sinh khối vi sinh vật nhằm tạo chế phẩm có hàm lượng cao protein từ vi sinh vật
(tế bào vi sinh vật chứa nhiều protein). Công nghệ sản xuất protein qua ni cấy vi
sinh vật có nhiều ưu điểm: Có thể được thực hiện chỉ trong diện tích nhỏ; sản phẩm
dễ thu hoạch với hiệu suất thu hồi cao; trong thời gian ngắn có thể tạo lượng lớn sinh
khối vi sinh vật chứa nồng độ protein cao; việc nuôi cấy vi sinh vật khơng phụ thuộc
vào khí hậu, thời tiết của từng địa phương do điều kiện của môi trường nuôi cấy có
thể điều chỉnh được khá dễ dàng; có thể phân lập và lựa chọn các chủng vi sinh vật
thích hợp cho từng quy trình cơng nghệ, cho từng loại nguyên liệu; nồng độ protein
và thành phần dinh dưỡng chứa trong sinh khối vi sinh vật có thể được điều chỉnh
5


bằng thay đổi thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy, hoặc bằng thay đổi di

truyền của chủng giống vi sinh vật; môi trường lên men sản xuất sinh khối có thể tận
dụng nguồn nguyên liệu phi protein, rẻ tiền (phế liệu, phụ phẩm của một số ngành
công nghiệp và nông nghiệp như rỉ đường, dịch đường khi thủy phân gỗ tạp, rơm rạ,
bã mía…) góp phần làm giảm giá thành sản phẩm và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi
trường do chất thải và nước thải.
Trong số các vi sinh vật hữu ích cho sản xuất protein đơn bào, nấm men thường
được ứng dụng. Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, sinh sản theo
lối nảy chồi và có khả năng sinh sản nhanh. Tế bào nấm men chứa hàm lượng cao
chất dinh dưỡng: Hàm lượng protein có thể lên đến 40 - 60%, trong đó có nhiều loại
axit amin khơng thay thế; hàm lượng vitamin khá cao với hoạt tính hơn gấp 2 - 3 lần
vitamin tổng hợp... Hiện nay, có khá nhiều loài nấm men được sử dụng làm giống
cho sản xuất thu nhận protein như: Endomyces fibuligera, Torulopsis utilis, Candida
tropicalis, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula capsulata, Monilia candida,
Mycotorula japonica…, trong đó các chủng nấm men thuộc giống Torulopsis,
Candida, Saccharomyces được sử dụng phổ biến.
1.3. Nội dung thực hành
1.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu
- Giống vi sinh vật: Các ống giống nấm men Saccharomyces cerevisiae.
- Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong ni cấy vi sinh vật như: peptone,
glucose, K2HPO4, MgSO4.7H2O, các vitamin như Thiamine HCl…
- Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que cấy vi sinh vật đầu trịn,
cuvet, lam kính, lamen…
- Thiết bị: box cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, tủ định ôn nuôi cấy vi sinh vật,
máy so màu quang phổ, kính hiển vi quang học, máy li tâm, cân phân tích…
1.3.2. Thực hiện thí nghiệm
1.3.2.1. Pha chế môi trường nhân sinh khối nấm men
- Thực hiện pha chế 1 lít mơi trường dinh dưỡng lỏng nhân sinh khối nấm men
theo công thức như sau:

6

Thành phần

Hàm lƣợng

Peptone

10 g

Glucose

20 g

K2HPO4

3g

MgSO4 .7H2O

2g

Inositol

100 mg

Biotin

1 mg

Thiamine HCl

2 mg

Nước cất

Dẫn đến 1.000 ml

pH

6,5

Lưu ý: Cân, đong chính xác từng chất rồi hòa tan vào nước cất. Sau khi cân
đủ hóa chất thì dẫn nước cất đến đủ định mức và điều chỉnh pH môi trường bằng
máy đo pH.
- Môi trường sau khi pha chế được phân phối vào các bình tam giác 250 ml (50
ml/bình) và 500 ml (100 ml/bình). Dán nhãn ghi tên mơi trường, ngày pha chế mơi
trường, người pha mơi trường lên từng bình mơi trường. Làm nút bơng và nút giấy
cho các bình mơi trường.
- Khử trùng môi trường ở 118ºC trong 30 phút.
- Sau khi khử trùng, môi trường được bảo quản và làm nguội trong tủ đựng mơi
trường ở nhiệt độ phịng.
1.3.2.2. Cấy và hoạt hóa giống nấm men
- Dùng que cấy đầu tròn lấy giống nấm men Saccharomyces cerevisiae
trong ống giống.
- Cấy giống vào bình mơi trường dung tích 250 ml đã chuẩn bị. Lắc đều. Ghi ký
hiệu giống, thời điểm cấy giống và người cấy giống lên thành bình.

7

- Ni hoạt hóa nấm men trên máy lắc ở 28ºC, chế độ lắc 200 vòng/phút
trong 12h.
1.3.2.3. Nhân sinh khối và thu nhận sinh khối nấm men
- Cấy giống nấm men đã hoạt hóa sang bình tam giác dung tích 500 ml chứa
môi trường nhân sinh khối nấm men đã chuẩn bị.
- Nuôi cấy nấm men trong máy lắc ổn nhiệt ở 28ºC, chế độ lắc 200 vòng/phút
và thu hồi sinh khối nấm men tạo thành ở các thời điểm: Sau 0h, 0,5h, 1h, 3h, 6h, 9h,
12h, 15h, 18h, 24h, 36h, 48h, 60h và 72h lên men.
Lưu ý: Ở mỗi thời điểm thu nhận sinh khối nấm men, các bình lên men chứa
sinh khối nấm men được mang vào box cấy vô trùng. Dùng pipet vô trùng hút 3 - 5
ml dịch nấm men từ bình lên men sang một ống nghiệm vô trùng để kiểm tra lượng
sinh khối nấm men tạo thành. Tiếp theo đậy nắp bình nhân giống nấm men và tiếp
tục nuôi cấy trong tủ định ôn cho thu hồi sinh khối ở các thời điểm tiếp theo.
1.3.2.4. Xác định các đặc trưng của quá trình lên men
a. Xác định lượng sinh khối nấm men tạo thành
Xác định lượng sinh khối tạo thành để vẽ đường cong sinh trưởng của nấm men
bằng một trong hai phương pháp sau:
 Phương pháp đo độ đục nhờ tán xạ ánh sáng
- Nguyên tắc: Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào. Có thể đo
độ tán xạ ánh sáng bằng máy so màu quang phổ (spectrophotometer). Nồng độ nấm
men càng tăng thì độ đục của canh trường nuôi cấy cũng tăng theo và làm cản trở ánh
sáng đi qua dịch nuôi.
- Các bước thực hiện:
+ Hút 1 ml dịch lên men chứa sinh khối nấm men, cho vào cuvet, đặt vào vị trí
của mẫu cần đo độ đục của máy so màu quang phổ (mặt trong của cuvet phải đặt vào
vị trí ánh sáng tán xạ chiếu qua);
+ Đồng thời hút 1 ml dịch lên men vô trùng (không chứa sinh khối nấm men)
vào một cuvet khác và đặt vào vị trí dành cho mẫu trắng của máy so màu quang phổ;
+ Đo độ đục của canh trường nuôi cấy nấm men bằng máy so màu ở bước sóng 600 nm.

8


 Phương pháp xác định trọng lượng khô của tế bào
- Nguyên tắc: Sấy khô tế bào nấm men, sau đó xác định khối lượng khơ của
sinh khối nấm men thu nhận ở các thời điểm khác nhau bằng cân trên cân phân tích.
- Các bước thực hiện:
+ Sấy khơ và cân xác định trọng lượng của ống li tâm trên cân phân tích;
+ Hút dịch nấm men vào ống li tâm, tiến hành li tâm thu nhận sinh khối tế bào
nấm men ở 6.000 vòng/phút trong 15 phút;
+ Loại bỏ dịch nổi, thu nhận sinh khối nấm men ở dưới đáy ống li tâm;
+ Rửa tế bào nấm men với nước cất vô trùng;
+ Ly tâm lần 2, thu hồi sinh khối ở đáy ống li tâm;
+ Sấy khô sinh khối nấm men trong tủ sấy ở 50ºC;
+ Cân xác định trọng lượng khô của sinh khối nấm men được tạo thành (trọng
lượng khô của sinh khối nấm men bằng trọng lượng của ống li tâm chứa sinh khối
khô của nấm men trừ trọng lượng của ống li tâm khi không chứa tế bào nấm men).
b. Kiểm tra chất lượng nấm men bằng phương pháp quan sát dưới kính hiển vi
quang học
Làm tiêu bản nhuộm đơn nấm men cấy trong môi trường dịch thể với Xanh
methylen Loeffler. Quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x40 và x100.
Cách thực hiện:
+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen Loeffler lên phiến kính;
+ Nhỏ 1 giọt canh trường nấm men lên thuốc nhuộm;
+ Đặt lá kính lên giọt dịch thật nhẹ nhàng tránh khơng tạo thành bọt khí (để một
mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống). Nếu giọt dịch nhiều
quá tràn ra ngồi phần tiếp xúc của lá kính và phiến kính thì dùng giấy thấm bớt nước đi;
+ Đưa tiêu bản lên quan sát dưới kính hiển vi.
- Chỉ tiêu quan sát, thống kê: Thống kê các chỉ số: tỷ lệ tế bào nấm men sống; tỷ

lệ tế bào nấm men nảy chồi; tỷ lệ tế bào nấm men chết. Các tỷ lệ này được xác định
theo công thức:

9


Lưu ý: Tế bào nấm men chết là tế bào bắt màu xanh của thuốc nhuộm; tế bào
sống không cho thuốc nhuộm thấm qua thành và màng tế bào nên không bắt màu
xanh của thuốc nhuộm; tế bào nảy chồi là các tế bào đang phát triển và có nhiều chồi
mọc chồng chất lên nhau (Hình 1).

Hình 1.1. Hình thái tế bào nấm men quan sát dƣới kính hiển vi quang học
1.4. Kiểm tra, đánh giá
- Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/nhóm) phải chuẩn bị được 1 lít mơi
trường lên men, cấy giống nấm men đạt u cầu, tiến hành lên men đúng kỹ thuật và
đánh giá được hiệu suất của quá trình lên men trong từng cơng thức.
- Báo cáo kết quả thí nghiệm (thực hiện tại lớp, 1 bài báo cáo/1 nhóm) tuần tự
theo các nội dung như sau:
(i) Xác định lượng sinh khối nấm men tạo thành ở các thời điểm khác nhau sau
lên men và thống kê kết quả vào bảng:

10


Thu nhận sinh khối nấm men ở
các thời gian sau lên men (h)

Lượng sinh khối nấm men
tạo thành (OD600nm hoặc g/L)

0
0,5
1
3
6
9
12
15
18
24
36
48
60
72
(ii) Vẽ đường cong sinh trưởng của nấm men trong một hệ thống kín dựa
trên lượng sinh khối nấm men tạo thành đã xác định ở các thời gian thu hồi sinh
khối khác nhau.
(iii) Đánh giá chất lượng nấm men bằng phương pháp làm tiêu bản và quan sát
dưới kính hiển vi khi giống đang ở pha phát triển, thống kê kết quả vào bảng:

Tiêu
bản

Tổng
số TB
quan
sát

Số TB
sống

Tỷ lệ TB
sống (%)

Số TB
nảy
chồi

1
2
3

11

Tỷ lệ TB
nảy chồi
(%)

Tỷ lệ
Số TB
TB chết
chết
(%)


Lưu ý: Giống nấm men đạt yêu cầu để sử dụng làm giống trong các q trình
lên men phải có chất lượng: tỷ lệ tế bào nảy chồi > 10%; tỷ lệ tế bào chết ≤ 4%.
- Trả lời các câu hỏi sau:
+ Trong điều kiện nhân sinh khối nấm men đã thực hiện, thu nhận sinh khối
nấm men ở thời điểm nào cho phép thu nhận được nhiều sinh khối nấm men nhất?

Giải thích?
+ Thời điểm thích hợp nhất cho thu nhận nấm men để làm giống trong các quá
trình lên men (lên men ethanol, làm trương nở bột mì…) sử dụng nấm men làm vật
liệu vi sinh vật? Giải thích?

12


Bài 2
ỨNG DỤNG NẤM MEN ĐỂ LÀM TRƢƠNG NỞ BỘT MÌ
2.1. Mục tiêu và yêu cầu
 Mục tiêu
Giúp sinh viên nắm vững cơ sở khoa học, nguyên tắc và yêu cầu cơ bản trong
quá trình sử dụng nấm men để làm trương nở bột mì.
 Yêu cầu
- Nắm được, trình bày được vai trò và cơ chế hoạt động của nấm men trong quá
trình làm trương nở bột bánh mì.
- Củng cố và hình thành kỹ năng:
+ Bố trí nguồn nguyên liệu bột mì;
+ Phối trộn bột mì, một số chất phụ gia, nấm men;
+ Tạo điều kiện thích hợp để nấm men hoạt động làm trương nở bột mì hiệu
quả nhất.
2.2. Kiến thức lý thuyết
Hiện nay, giống để sản xuất trong công nghệ làm bánh thường sử dụng các
chủng Saccharomyces cerevisiae. Trong khối bột mì, nấm men Saccharomyces
cerevisiae trước hết sử dụng nguồn carbon là glucose, tiếp theo sử dụng các đường
khác như maltose, sucrose và fructose có sẵn trong bột để lên men. Để hoạt động của
nấm men tốt hơn, loại enzyme phân giải tinh bột thành đường làm nguồn cơ chất cho
lên men như α-amylase bền nhiệt thường được bổ sung vào vật liệu lên men. Quá
trình lên men làm trương nở bột mì dưới hoạt động của nấm men sẽ sản sinh CO2 tạo

các lỗ hổng trong bột. Bên cạnh đó, q trình lên men diễn ra sẽ tạo khoảng 0,5% 1,4% ethanol trong khối bột mì.
Phương trình tổng quát của quá trình lên men:
C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2 + 2ATP
Các chủng nấm men sử dụng cho sản xuất bánh mì phải là các chủng bền nhiệt,
có khả năng sinh sản nhanh và có hoạt tính enzyme α-amylase bền nhiệt. Hoạt lực
làm trương nở bột mì của nấm men là chỉ số chất lượng quan trọng của nấm men ứng
dụng trong cơng nghệ làm bánh mì. Bên cạnh đó, thời gian nấm men làm cho khối
13


bột trương nở càng ngắn thì chất lượng nấm men càng tốt (nấm men chất lượng tốt
thường làm nở bột sau 60 - 65 phút).

Hình 2.1. Kết quả làm trƣơng nở khối bột mì nhờ hoạt động của nấm men
2.3. Nội dung thực hành
2.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu
- Giống vi sinh vật: Sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae đã thu nhận
sau khi thực hành bài 1 (Nhân sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae) được
thu hồi bằng phương pháp li tâm và sấy khô ở nhiệt độ 40ºC.
- Dụng cụ: cốc thủy tinh, thước kẻ chia vạch.
- Thiết bị: tủ ấm, cân phân tích, cân kỹ thuật.
2.3.2. Thực hiện thí nghiệm
2.3.2.1. Kiểm tra sức sống của nấm men
- Cân 10 g bột mì bằng cân phân tích vào cốc thủy tinh.
- Cân 5 g sinh khối nấm men khô bổ sung vào cốc bột mì.
- Hút 7,5 ml nước vào cốc để thấm ướt bột mì và nấm men, trộn đều tạo khối
nấm men trộn bột mì.
- Nhanh tay nặn khối nấm men trộn bột mì thành các viên trịn có cùng đường
14

kính 1 cm, sau đó thả đồng loạt các viên vào cốc nước đã được làm ấm đến 35ºC.
- Quan sát sẽ thấy ban đầu các viên nấm men trộn bột mì (viên bột men) nặng
hơn nước lên nhanh chóng lắng xuống đáy cốc. Sau một khoảng thời gian, viên bột
men sẽ di chuyển từ đáy cốc lên bề mặt nước. Xác định khoảng thời gian cần thiết để
các viên bột men nổi lên trên bề mặt cốc nước ấm.
Lưu ý: Trong các viên nấm men trộn bột mì, dưới hoạt động lên men của nấm
men, các bọt khí CO2 tạo thành và thoát khỏi viên bột men đi lên mặt nước, qua đó
tạo lực đẩy các viên bột men nổi lên bề mặt nước. Thời gian cần thiết để các viên bột
men nổi lên càng ngắn thì nấm men càng có sức sống tốt và có khả năng làm trương
nở bột mì mạnh và ngược lại. Mặt khác, nấm men khơng hoạt động sẽ khơng tạo ra
bọt khí CO2 trong khối bột men và không tạo lực đẩy khối bột men nổi lên mà vẫn
nằm dưới đáy cốc và dần tan ra hịa vào cốc nước.
2.3.2.2. Hoạt hóa giống nấm men
- Cân 10 g nấm men khô, cho vào cốc chứa sẵn 100 ml nước, đặt vào tủ định ôn
ở 35ºC trong 30 phút.
- Thêm vào cốc 50 g bột mì, trộn đều, tiếp tục đặt vào tủ 35ºC trong 30 phút.
2.3.2.3. Sử dụng nấm men để làm trương nở bột mì
- Cân 850 g bột mì, 15 g NaCl cho vào cốc thủy tinh dung tích lớn.
- Bổ sung dịch nấm men đã hoạt hóa vào cốc bột mì, thêm 450 ml nước đã
được làm ấm đến 35ºC.
- Nhào trộn đều khối nấm men + bột mì + NaCl + nước bằng tay cho đến khi
bột được hòa tan thật đều với nước và men sữa (bột không cịn dính vào tay là được).
- Nặn bột thành hình 1 chiếc bánh lớn và cho vào khuôn đã đặt sẵn thước có
thang chia vạch. Xác định chiều cao của khối bột lúc ban đầu và tính thể tích của
khối bột khi chưa ủ.
- Đặt khuôn chứa bột nhào trộn nấm men vào tủ ấm ở 35ºC trong 1h.
- Sau thời gian ủ, lấy khối bột ra khỏi tủ ấm, đo chiều cao của khối bột men sau
ủ và xác định thể tích của khối bột men sau lên men.
- Tính mức độ làm trương nở 1 kg bột mì của nấm men thơng qua độ chênh lệch

về thể tích của khối bột sau và trước khi lên men (mức độ làm trương nở = thể tích
khối bột sau lên men - thể tích khối bột trước lên men).

15


- Song song làm công thức đối chứng với đầy đủ các bước như cơng thức thí
nghiệm nhưng khơng bổ sung sinh khối nấm men khô vào nguyên liệu bột mì.
- Kiểm tra chất lượng bánh sau khi nướng (trong q trình nướng, khi nhiệt độ
trong lị nướng đạt 50 - 60ºC thì nấm men bị giết chết), hoặc sau khi hấp cách thủy
bằng cảm quan.
2.4. Kiểm tra, đánh giá
- Mỗi nhóm sinh sinh viên (3 - 5 sinh viên/nhóm) phải tiến hành nhào trộn, ủ và
sử dụng nấm men để làm trương nở được 1 kg bột mì.
- Viết bài báo cáo kết quả thí nghiệm (thực hiện tại lớp) tuần tự theo các nội dung:
(i) Xác định năng lực làm trương nở 1 kg bột mì của nấm men sau 1h ủ ở 35ºC,
số liệu thống kê ở Bảng sau:
Cơng thức

Thể tích khối bột mì (cm3)
Trước ủ

Sau ủ

Thể tích khối bột mì
tăng lên (cm3)

Đối chứng
(khơng sử dụng nấm
men)

Thí nghiệm
(sử dụng nấm men)
(ii) Kết quả đánh giá bằng cảm quan chất lượng khối bột mì (sau khi nướng) đã
được làm trương nở nhờ hoạt động của nấm men: độ xốp nở, màu sắc, mùi, vị.

16


Bài 3
QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL
3.1. Mục tiêu và yêu cầu
 Mục tiêu
Sinh viên nắm vững cơ sở khoa học, nguyên tắc và yêu cầu cơ bản của quá trình
lên men sản xuất ethanol.
 Yêu cầu
- Củng cố các kiến thức về vai trò của nấm men, cơ chế của lên men sản sinh
ethanol, các vấn đề cần chú ý trong quá trình lên men để hiệu suất sinh cồn đạt cao nhất.
- Vận dụng kiến thức lý thuyết về quá trình lên men ethanol để định hướng tác
động và điều khiển quá trình lên men theo hướng tạo ra những sản phẩm đồ uống có
cồn với số lượng và chất lượng như mong muốn.
- Thực hành và rèn luyện kỹ năng: chuẩn bị nguyên liệu, các điều kiện cho lên
men ethanol; sử dụng chủng nấm men thuần chủng để lên men, theo dõi quá trình lên
men và xác định các đặc trưng của quá trình.
3.2. Kiến thức lý thuyết
Nấm men trong điều kiện kỵ khí chuyển hóa glucose thành ethanol trước hết
bằng con đường Embden - Meyerhof theo sơ đồ tổng quát:
C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2 + 2ATP
180 = [2 x 46 = 92] + [2 x 44 = 88]
Theo lý thuyết, mỗi mol glucose được lên men sẽ tạo thành 2 mol ethanol, 2
mol CO2, 2 mol ATP, tương ứng, mỗi gam glucose có thể tạo ra 0,51 gam rượu. Tuy

nhiên, sản lượng ethanol đạt được sau lên men trong thực tế thường không vượt quá
tỷ lệ 90 - 95% so với lý thuyết, do một phần chất dinh dưỡng đã được sử dụng để
tổng hợp sinh khối tế bào nấm men và cho các phản ứng liên quan tới sự duy trì tế
bào. Bên cạnh đó, các phản ứng phụ xảy ra (thường dẫn tới tạo thành glycerol và
succinate) cũng tiêu thụ tới 4 - 5% cơ chất tổng số trong môi trường dinh dưỡng.
Mặc dù lên men rượu là một q trình yếm khí nhưng nhất thiết trong giai đoạn
đầu phải được cung cấp một nồng độ nhỏ ôxi cho sự tổng hợp các chất béo chưa bão
17


hồ. Thơng thường oxi được giữ trong dịch lên men ở nồng độ 0,05 - 0,1 mmHg tính
theo áp suất oxi. Bất cứ nồng độ nào nằm trên giới hạn đó cũng sẽ kích thích sinh
trưởng, vi phạm đến sự tạo thành ethanol.
Các chủng nấm men sử dụng cho lên men ethanol qui mơ cơng nghiệp phải có
khả năng lên men tạo hiệu suất ethanol cao, chịu cồn, chịu nhiệt và chịu axit. Các loài
nấm men thường được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất ethanol gồm:
Saccharomyces
Saccharomyces
cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces.

uvarum

(carbergensis),

3.3. Nội dung thực hành
3.3.1. Chuẩn bị nguyên vật liệu
- Giống vi sinh vật: Dịch nấm men Saccharomyces cerevisiae đang sinh trưởng
ở pha logarit trong môi trường lỏng thu nhận sau khi thực hành bài 1 (Nhân sinh khối
nấm men Saccharomyces cerevisiae).

- Nguyên liệu, hóa chất:
+ Đường glucose, quả cam tươi, (NH4)2SO4, axit xitric, dung dịch NaOH 10%,
dug dịch Ca(OH)2 10%;
+ Thuốc nhuộm Xanh methylene Loeffer.
Thành phần

Hàm lượng

Ethanol 96º

300 ml

Xanh methylene

3g

Hòa tan hỗn hợp rồi lọc trong được dịch lọc 1.
Dịch lọc 1

30 ml

KOH 1%

1 ml

Nước cất

100 ml

+ Thuốc thử Fehling: Gồm 2 loại dung dịch là thuốc thử Fehling A và thuốc thử

Fehling B.

18