Ứng dụng kỹ thuật pcr phát hiện bệnh greening trên cây cam ở một số tỉnh miền bắc việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRƢƠNG THỊ THU
Tên đề tài:
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING
TRÊN CÂY CAM Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chun ngành
Khoa
Khố học

: Chính quy
: Cơng nghệ sinh học
: CNSH-CNTP
: 2013-2017

THÁI NGUN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRƢƠNG THỊ THU
Tên đề tài:
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING
TRÊN CÂY CAM Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
: Chính quy
Chun ngành
: Cơng nghệ sinh học
Lớp
: K45-CNSH
Khoa
: CNSH-CNTP
Khố học
: 2013-2017
Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Duy
TS. Nguyễn Tiến Dũng

THÁI NGUYÊN - 2017


i

LỜI CẢM ƠN
Được sự đồng ý của Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông Lâm- Đại học
Thái Nguyên. Em được thực tập tại phịng thí nghiệm Khoa CNSH-CNTP Trường
Đại học Nơng Lâm-Đại học Thái Nguyên với đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật PCR phát
hiện bệnh greening trên cây cam ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam” để hồn
thành khóa luận này ngồi sự nỗ lực của bản thân em cịn nhận được nhiều sự giúp
đỡ của Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm-Đại học Thái Nguyên, Ban chủ
nhiệm Khoa CNSH-CNTP, cùng các thầy cơ giáo đã tận tình giảng dạy cho em suốt
4 năm học.
Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Ban giám hiệu

trường Đại học Nông Lâm-Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa CNSHCNTP, cùng các thầy cô giáo đã tận tình giảng dạy cho em suốt 4 năm học vừa qua
để em có thể hồn thành khóa luận.
Đặc biệt, em xin được bày tỏ lịng kính trọng, lịng biết ơn sâu sắc tới
TS.Nguyễn Văn Duy và TS.Nguyễn Tiến Dũng, người đã tận tình hướng dẫn em
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã quan
tâm, ủng hộ và động viên em trong suốt q trình học tập và nghiên cứu giúp em
hồn thành tốt khóa luận này.
Do điều kiện và thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những thiếu sót.
Kính mong thầy cơ giáo và các bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài
của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 31 tháng 5 năm 2017
Sinh Viên
Trƣơng Thị Thu


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các lồi cam, qt có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất ..............................5
Bảng 2.2: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các châu lục trên thế giới giai đoạn 2012
-2014 ........................................................................................................11
Bảng 2.3: Tình hình sản xuất cam, quýt của nước ta giai đoạn 2010-2015. .............12
Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các vùng của nước ta năm 2014 ............13
Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi để phát hiện tác nhân gây bệnh Greening Hung và cs
(1999), Hung và cs (2004) [33], [34].......................................................24
Bảng 3.2: Các trang thiết bị máy móc dùng trong thí nghiệm ..................................25
Bảng 3.3: Bảng thu thập mẫu tại các địa phương .....................................................26
Bảng 3.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ...........................................................28

Bảng 4.1: Kết quả đánh giá mẫu cam sành huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang.....31
Bảng 4.2: Kết quả đánh giá mẫu cam sành và cam chanh Bố Hạ ( Bắc Giang) .......31
Bảng 4.3: Kết quả đánh giá mẫu cam Canh và cam Vinh tại xã Quyết Thắng, TP
Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên ..............................................................32
Bảng 4.4: Nồng độ DNA tổng số của các mẫu tách từ mô lá cam đã thu thập .........34
Bảng 4.5: Kết quả phát hiện bệnh vàng lá Greening trên các mẫu cam phân tích ..38


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Rầy chổng cánh Diaphorina citri ..............................................................15
Hình 2.2: Triệu trứng nhiễm bệnh vàng lá Greening trên cây có múi ......................16
Hình 4.1: Hình ảnh thu thập mẫu lá tại một số địa phương ......................................30
Hình 4.2: Kết quả tách chiết DNA tổng số ...............................................................33
Hình 4.3: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng PCR phát hiện bệnh Greening ... 35
Hình 4.4: Kết quả kiểm tra sản phẩm của phản ứng PCR sử dụng các nồng độ DNA
khn khác nhau ......................................................................................36
Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu lá giám định Greening ....................37


iv

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

BVTV

: Bảo vệ Thực vật

Cs

: Cộng sự

CTAB

: Cetyl trimethyl ammonium bromide

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

ĐC

: Đối chứng

dNTP

: Nước khử ion không chứa DNase và RNase

EDTA

: Ethylene diamine tetraacetate

FAO

: Tổ chức Nông Lương Thế giới

NN&PTNT

: Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RNA

: Ribonucleic Acid

VAC

: Vườn ao chuồng


v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................1
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ......................................................... iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................v
Phần 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát ......................................................................................2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể ...........................................................................................2
1.3. Ý nghĩa của đề tài .............................................................................................3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài .......................................................................3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ........................................................................3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................4
2.1. Tổng quan về cây cam ......................................................................................4
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại ..............................................................................4
2.1.2. Giá trị của cây cam .....................................................................................5
2.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây cam ...........................................................6
2.1.4. Yêu cầu sinh thái của cây cam ...................................................................9
2.1.5. Tình hình sản xuất cây cam ......................................................................10
2.2. Bệnh vàng lá Greening trên cây có múi .........................................................14
2.2.1. Lịch sử của bệnh .......................................................................................14
2.2.2. Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh .....................................................14
2.2.3. Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá Greening ......................................17
2.2.4. Một số biện pháp phòng tránh ..................................................................18
2.3. Cơ sở khoa học của việc ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện bệnh vàng lá
Greening.................................................................................................................19
2.4. Tình hình nghiên cứu về phát hiện bệnh Greening trên cây có múi ...............19


vi

2.4.1. Các nghiên cứu về phát hiện bệnh trên thế giới .......................................20
2.4.2. Các nghiên cứu về phát hiện bệnh ở Việt Nam ........................................22
Phần 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........24
3.1. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................24
3.1.1. Vật liệu thực vật .......................................................................................24
3.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ...............................................................24
3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................................25
3.2.1. Phạm vi nghiên cứu ..................................................................................25
3.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................25
3.3. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................26
3.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................26

3.4.1. Phương pháp thu thập mẫu vật liệu ..........................................................26
3.4.2. Phương pháp xác định sự biểu hiện của bệnh Greening ..........................27
3.4.3. Phương pháp phát hiện bệnh Greening trên cây có múi bằng kỹ thuật
PCR.....................................................................................................................27
3.4.4. Phương pháp sử lý số liệu ........................................................................29
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................30
4.1. Kết quả thu thập mẫu vật liệu .........................................................................30
4.2. Tách chiết DNA tổng số mẫu lá .....................................................................32
4.3. Thử nghiệm phản ứng PCR phát hiện bệnh Greening trên cây cam ..............35
4.4. Xác định độ nhạy của phản ứng PCR trong phát hiện bệnh Greening ...........36
4.5. Kết quả phát hiện bệnh Greening trên cây cam bằng phản ứng PCR ............37
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................40
5.1. Kết luận ...........................................................................................................40
5.2. Kiến nghị.........................................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................41


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây cam thuộc họ Rutaceae, là nhóm cây ăn quả quan trọng trong sản xuất
nơng nghiệp ở nước ta. Cây cam là loại cây trồng có giá trị dinh dưỡng và giá trị
kinh tế cao. Trong 100g thịt quả tươi có chứa 6-12% đường, vitamin C từ 40-90mg
acid hữu cơ từ 0,4-1,2%, các chất khoáng và dầu thơm [4]. Tất cả các bộ phận của
cây cam đều có thể sử dụng: Lá, hoa, vỏ quả cung cấp tinh dầu, làm dược liệu, quả
để ăn, cây để làm cảnh [44]. Cam khơng chỉ là hàng hóa đáp ứng cho tiêu thụ nội
địa mà còn là mặt hàng xuất khẩu có tiềm năng lớn. Ngồi ra, cây cam là loại cây
lâu năm, chóng cho thu hoạch (khoảng 2-3 năm) và cho thu hoạch trong thời gian

dài (25-30 năm). Theo ước tính, năng suất trung bình của cam quýt đạt 15-20
tấn/ha, các sản phẩm của cây có múi được bán trên thị trường với giá dao động
khoảng 15.000-20.000 đồng/kg mang lại thu nhập từ 300-400 triệu đồng [4]. Vì vậy
cây cam được chú trọng đầu tư và phát triển mạnh mẽ.
Cây cam có sự phân bố rộng do khả năng dễ thích nghi với nhiều mơi trường
sống khác nhau, dễ lai tạo những giống mới có khả năng thích nghi cao. Trên thế
giới, cây cam được trồng chủ yếu ở các nước thuộc vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn
đới. Ở Việt Nam cây cam được trồng ở cả ba miền Bắc, Trung và Nam. Năm 2014,
diện tích đất trồng cam ở Việt Nam là 75.600 ha với sản lượng đạt 736.100 tấn
(Theo Bộ NN & PTNT [1]). Song sự đa dạng khí hậu ở các vùng trồng trọt là điều
kiện phát sinh nhiều loại sâu bệnh hại trên cây cam như: bệnh thối rễ, ghẻ nhám,
vàng lá, nấm bồ hóng trên lá…đặc biệt là bệnh vàng lá Greening. Đây được coi là
một trong những nhân tố gây trở ngại chính để phát triển cây cam. Bệnh lan truyền
với tốc độ nhanh và gây hại nghiêm trọng cho nhiều vùng trồng cam, là nguyên
nhân ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng quả [8]. Bệnh do 2 dòng vi
khuẩn Gram âm gây ra. Dòng châu á có tên là Candidatus liberibacter asiaticus,
dịng châu phi có tên là Candidatus liberibacter africanus. Các dòng vi khuẩn này
sống trong mạch libe của cây và lây truyền từ cây này sang cây khác thông qua các


2

mắt ghép và môi giới truyền bệnh là rầy chổng cánh (Diaphorina citri) ở châu Á và
rầy cam (Trioza erytreae) ở châu Phi [33]. Đặc điểm của bệnh Greening là có thời
gian ủ bệnh dài, nên khó phát hiện bệnh ở giai đoạn đầu và thường hay nhầm lần
với bệnh khác như khi cây bị thiếu kẽm (Zn) [8]. Đến khi bệnh biểu hiện rõ ràng thì
cây đã bị bệnh nặng và các biện pháp chữa trị gần như vô nghĩa, rất nhiều biện pháp
đã được thực hiện nhưng vẫn khơng mang lại hiệu quả. Vì vậy, việc phát hiện
nhanh bệnh vàng lá Greening trong giai đoạn đầu là vô cùng quan trọng đối với việc
phòng và điều trị bệnh.

Những nghiên cứu bước đầu về bệnh ở Việt Nam đã được tiến hành, xong
những vấn đề về phòng trừ bệnh vẫn chưa được tìm hiểu một cách đầy đủ. Hiện
nay việc ứng dụng kỹ thuật Sinh học phân tử hiện đại cho phép chẩn đốn các
bệnh trên cây có múi mang lại hiệu quả cao với nhiều ưu điểm như: độ nhạy cao,
chính xác và tốn ít thời gian. Có thể kể đến một số phương pháp như: PCR, realtime PCR, các kỹ thuật lai phân tử...[12]. Kết quả thu được từ những nghiên cứu
chẩn đoán bằng sinh học phân tử là cơ sở để sớm đưa ra những giải pháp phịng
tránh bệnh. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: ‘‘Ứng
dụng kĩ thuật PCR phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây cam ở một số
tỉnh miền Bắc Việt Nam’’.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Chẩn đoán được bệnh vàng lá Greening trên cây cam bằng kỹ thuật PCR.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Thu thập nguồn vật liệu trên một số giống cam như: Cam Bố Hạ, Cam Vinh,
Cam sành... tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.
- Tách chiết DNA tồng số trong mẫu mô lá cam.
- Thử nghiệm phản ứng PCR phát hiện nhanh bệnh Greening trên mẫu lá cây cam.
- Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh bệnh Greening trên các mẫu cam
Bố Hạ (Bắc Giang), và một số giống cam khác như cam Vinh, cam Sành, cam
Canh.


3

1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Xác định được phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh Greening trên các giống
cam bằng kĩ thuật PCR từ đó sàng lọc các cây cam sạch bệnh phục vụ các nghiên
cứu tiếp theo.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Thông qua việc phát hiện nhanh bệnh Greening trên cây có múi sẽ góp phần
giúp sàng lọc cây sạch bệnh phục vụ khai thác và phát triển.


4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về cây cam
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
2.1.1.1. Nguồn gốc
Các tác giả Bùi Huy Đáp (1960) [5], Trần Thế Tục (1967) [19], Reuther W.
(1973) [38], Wakana (1998) [43], Rether Walter (1978) [39] cho thấy các loại cây
ăn quả, cùng với cây nho, cây có múi có lịch sử trồng trọt lâu đời nhất. Phần lớn kết
quả nghiên cứu đều thống nhất cây có múi có nguồn gốc ở miền Nam châu Á, trải
dài từ Ấn Độ qua Hymalaya, Trung Quốc xuống vùng quần đảo Philippin,
Malaysia, miền Nam Indonesia hoặc kéo dài đến lục địa châu Úc.
2.1.1.2. Phân loại
Cam quýt thuộc: Giới Plantae
Bộ Rutales
Họ Rutaceae
Chi Citrus
Được phân chia làm 130 giống (genera) nằm trong các họ phụ khác nhau [17]
Hiện nay tồn tại hai hệ thống phân loại cam quýt được nhiều người áp dụng, theo
Tanaka (Nhật Bản) cam quýt gồm 160-162 loài (Species). Tanaka đã quan sát, ghi
chép tỷ mỉ đặc điểm hình thái của các giống đã biến dị này và phân chúng thành
một lồi mới hoặc giống mới có tên khoa học được bắt đầu bằng tên giống hay tên
loài đã phát sinh ra chúng và kết thúc bằng chữ “Horticulturre‟‟. Swingle đã chia
cam quýt ra làm 16 loài [8]. Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn phải sử dụng hệ thống
phân loại của Tanaka để gọi tên các giống cam quýt vì bảng phân loại này chi tiết

tới từng giống. Theo Tanaka có 10 nhóm quan trọng nhất trong nhóm True Citrus
group, đây là những loài được trồng phổ biến và có ý nghĩa với con người, có thể
được mơ tả trong bảng sau [8].


5

Bảng 2.1: Các lồi cam, qt có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất
STT

Tên tiếng anh

Tên loài

Tên tiếng việt

1

C.sisnensis Osbeck

Sweets Orange

Cam ngọt

2

C.aurantium L

Sour Orange

Cam chua

3

C.reticulata Blanco

Mandarin

Quýt

4

C.limon Osbeck

Lemon

Chanh núm

5

C.medica L

Citron

Chanh yên

6

C.aurantifolia Swingle

Lime

Chanh vỏ mỏng

7

C.trifolia L

Trioliate

Chanh đắng

8

C.grandis L

Shadock

Bưởi

9

C.paradishi L

Pomelo

Bưởi chùm

10

C.fortunenna

Kumquat

Quất

(Đường Hồng Dật, 2003) [4]
2.1.2. Giá trị của cây cam
Sản phẩm của cây cam là một trong những sản phẩm có giá trị được nhiều
người ưa chuộng và được sản xuất ở nhiều nước trên thế giới.
- Thành phần dinh dưỡng trong thịt quả tươi bao gồm: đường, axit hữu cơ,
vitamin C. Trong 100g phần ăn được có chứa 88-94% nước; 6-12% chất khô chủ
yếu là đường, axit hữu cơ chiếm 0,4-1,4% chủ yếu là axit citric; 0,9% pectin, 4090mg% vitamin C; 0,07mg vitamin B1; 0,06mg vitamin B6; 0,1mg vitamin E, 2µg
vitamin A [11]. Ngồi ra cịn chứa các chất khống cần thiết như Ca, P, Mg, Fe…
và dầu thơm. Người ta còn phân tích được có 0,7-1,3g protein trong 100g thịt quả,
trong đó chứa nhiều axit amin khơng thay thế như aspatic (26,8mg), alanin (6mg),
valin (2,2mg), phenylalanin (3,4mg), lysin (90,8mg), leucin (1,2mg) và ocnithin
(3,4mg) [13].
- Giá trị công nghiệp và dược liệu: Vỏ quả có chứa tinh dầu. Tinh dầu được
cất từ vỏ, quả, lá, hoa được dùng trong công nghiệp thực phẩm và công nghiệp mỹ
phẩm. Ở nhiều nước trên thế giới, người ta đã dùng các loại quả thuộc chi Citrus


6

làm thuốc chữa bệnh. Ở thế kỷ XVI, các thầy thuốc Trung Quốc, Ấn Độ đã dùng
quả cam quýt để phòng ngừa bệnh dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu
dưới da. Ở Mỹ vào những năm 30 của thế kỷ XX, các thầy thuốc đã dùng các quả
cam quýt kết hợp với insulin để chữa trị bệnh đái tháo đường. Ở Nga bắt đầu từ
thế kỷ XI, các loại quả cây có múi đã được sử dụng để phòng ngừa và chữa trị

trong y học dân gian. Ở nước ta, nhân dân đã dùng cây ăn quả có múi để phịng và
chữa trị một số bệnh từ lâu [4].
- Giá trị kinh tế: Cây cam là một trong những loại cây lâu năm, nhanh cho thu
hoạch. Một số lồi có thể cho thu hoạch quả ở năm thứ 2 sau khi trồng. Ở nước ta,
năng xuất trung bình của cam qt ở thời kỳ 8 tuổi có thể đại tới 16 tấn/ha. Cây cam
quýt có thể sống và cho thu hoạch quả trong vòng 15-30 năm. Trong trường hợp đất
tốt, được chăm sóc đầy đủ và áp dụng các biện pháp kỹ thuật thâm canh cao, trong
các điều kiện khí hậu thích hợp và khơng bị sâu bệnh gây hại nặng, tuổi thọ của cam
quýt có thể kéo dài trên 50 năm [4].
- Giá trị sinh thái, môi trường: Cây cam là cây ăn quả lâu năm được trồng
trong các vườn cây của gia đình hộ nơng dân hoặc trồng trên đồi tại các trang trại.
Trong quá trình sinh sống, các loại cam, quýt, bưởi tiết ra oxy trong khơng khí làm
khơng khí trở nên trong lành, dịu mát. Trong những chừng mực nhất định các chất
bay hơi từ cây cam quýt có tác dụng diệt một số lồi vi khuẩn làm cho khơng khí trở
nên sạch hơn, môi trường sống của con người tốt hơn. Cam quýt trồng trên các đồi
đất, bên cạnh việc cho quả cịn có tác dụng phủ xanh đất, giữ nước ngăn cản dòng
chảy mạnh trên mặt đất sau các trận mưa lớn, do đó có ý nghĩa lớn trong việc làm
giảm q trình xói mịn, rửa trơi đất. Ở vùng trung du và miền núi, cam quýt được
trồng trong các vườn rừng, vườn đồi trong các hệ thống VAC là phương thức canh
tác được áp dụng rộng rãi tại các trang trại nông nghiệp và đã thể hiện nhiều ưu
điểm trong việc thực hiện nền nông nghiệp bền vững [4].
2.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây cam
Cây cam là cây ăn quả thân gỗ lâu năm, tán rộng, lá xanh quanh năm, cây
trưởng thành có thân, tán lớn, hạt đơn phôi…


7

- Rễ: Nhìn chung cam có bộ rễ ăn nơng, trên biểu bì của rễ non có nấm
cộng sinh. Nấm có tác dụng tốt cho rễ như vai trị của lông hút với các cây

trồng khác. Sự phân bố rễ của cây ăn quả có múi phụ thuộc vào đặc tính của
giống, mực nước ngầm và chế độ canh tác, chăm bón nhưng nhìn chung rễ cam
ăn nơng từ 0-30cm [7].
Theo GS.TS Trần Thượng Tuấn năm 1994 rễ có các thời kỳ phát triển
nhất định. Khi rễ hoạt động mạnh, rễ lông phát triển, thân cành phát triển chậm
và ngược lại [18].
Tuỳ từng giống, cây, điều kiện khí hậu và chăm sóc mà lượng cành và thời
gian ra các đợt cành này có sự thay đổi, cành non có thể quang hợp được, trong các
đợt cành thì cành xuân thường ra đều, tập trung vào cành ngắn, còn cành hè thường
khoẻ, lá to, dài nhưng rải rác hơn, cành thu kém hơn cành hè và cành đơng thì yếu.
Cành cây ăn quả có múi có ba loại: cành mẹ, cành dinh dưỡng và cành quả [7].
+ Cành mẹ: Sinh ra cành quả nó có thể là cành xuân, cành hè hoặc cành năm
trước. Qua theo dõi cho thấy tuỳ từng giống thường cành thu hoặc cành hè làm cành
mẹ thì số cành quả nhiều và tỷ lệ đậu quả cũng cao.
+ Cành dinh dưỡng: Cành không ra hoa, quả, chỉ có lá xanh có nhiệm vụ chính
là quang hợp, giữa cành mẹ và cành dinh dưỡng khơng có giới hạn rõ, năm nay là
cành dinh duỡng, sang năm sau có thể là cành mẹ.
+ Cành quả: Tuỳ giống cây ăn quả có múi mà cành quả có độ dài từ 3-25
cm, thơng thường từ 3-9 cm. Cành quả có lá thường đậu quả tốt hơn cành quả
khơng có lá.
- Lá gồm 3 phần chính: Phiến lá, eo lá và cuống lá. Lá thường có 2 mặt
(mặt lá và lưng lá), mặt lá có mơ dậu, chứa nhiều nhu mơ diệp lục làm nhiệm
vụ quang hợp. Độ dày của mô diệp lục thay đổi tuỳ theo giống. Lưng lá có mơ
xốp, nhiều khí khổng tập trung, phân bố ở mặt lưng lá (mật độ khí khổng phụ
thuộc vào từng giống như chanh có 650 khí khổng/mm2, cam khoảng 480500 khi khổng/mm2). Thường mật độ khí khổng càng cao thì nhu cầu nước và
ẩm độ của giống đó càng lớn. Trong năm cây thường ra 4 đợt lá, lá mùa xuân,
lá mùa hè, lá mùa thu và lá mùa đơng. Trong đó lá mùa xuân chiếm tỷ lệ cao


8

nhất, thường từ 60-70%, lá mùa xuân thường dài và hẹp, còn lá mùa hè, thu
ngắn và rộng. Tuổi thọ, kích thước của lá tuỳ thuộc vào điều kiện khí hậu, chế
độ chăm sóc và khả năng dinh dưỡng của cây. Tuổi thọ của lá cam quýt từ 23 năm tuỳ theo vùng sinh thái, vị trí lá và tình trạng sinh trưởng của cây, vị trí cấp
cành…[14].
- Lá: Là một chỉ tiêu để phân loại giữa các giống, tuổi thọ của lá thay đổi tuỳ
thuộc vào điều kiện khí hậu và điều kiện dinh dưỡng của cây. Lá cây có múi có eo
lá phụ thuộc vào từng lồi, eo lá là đặc điểm để phân biệt giữa các giống. Ở Việt
Nam tuổi thọ trung bình của lá là 15-24 tháng, ở vùng Á nhiệt đới có thể dài hơn,
nhưng hết thời kỳ sinh trưởng sẽ rụng rải rác trong năm và thường rụng nhiều vào
mùa đông. Tuỳ theo giống và tuỳ theo mùa, lá có thể khác nhau về hình dạng, độ
lớn, màu sắc, mật độ khí khổng, mật độ túi tinh dầu. Lá có quan hệ chặt chẽ với
sản lượng, nhất là với trọng lượng quả [21].
- Hoa: Là loại hoa lưỡng tính có khả năng tự thụ, tràng hoa thường có màu
trắng riêng hoa chanh có màu tím. Hoa thường có 5 cánh, nhị nhiều có từ 20-40
nhị. Hoa được phân hóa từ mùa đơng năm trước trong điều kiện khô và nhiệt độ
thấp [21].
- Quả: Cam thuộc loại quả mọng, vỏ quả dày, mỏng khác nhau tùy từng
lồi. Khi cịn xanh chứa nhiều acid đến khi chín thì lượng acid giảm, hàm lượng
đường và chất tan tăng lên. Cấu tạo quả gồm hai phần vỏ quả và vỏ thịt [7].
+ Vỏ quả: Gồm vỏ ngoài và vỏ giữa.
+ Thịt quả: Bộ phận chính của thịt quả là tép, mầu sắc của thịt quả phụ thuộc
vào sắc tố vàng da đỏ. Trong dịch nước quả cịn có các hạt dầu thơm quyết định
hương vị của quả.
Quả có hai đợt rụng sinh lý:
+ Đợt 1: Sau khi ra hoa được khoảng 1 tháng (tháng 3-4) quả còn nhỏ khi rụng
mang theo cả cuống.
+ Đợt 2: Khi quả đạt đường kính 3-4cm (cuối tháng 4) quả rụng khơng mang
theo cuống.

9

Sau hai lần rụng quả sinh lý này, quả lớn rất nhanh (tốc độ trung bình 0,5-0,7
mm/ngày) tốc độ lớn chậm lại ít ngày vào lúc trước khi hình thành hạt sau đó lại
tăng dần cho tới khi thu hoạch [23].
- Hạt: Tuỳ theo giống mà có sự khác nhau về kích thước, số lượng màu sắc và
phơi hạt. Các loại quả thuộc cây có múi phần lớn là hạt gồm nhiều phôi từ 1-7 phôi,
gọi là hiện tượng đa phơi, trong đó có 1 phơi hữu tính cón các phôi khác gọi là phôi
vô riêng cây bưởi là hạt đơn phôi [7].
2.1.4. Yêu cầu sinh thái của cây cam
- Nhiệt độ: Phần lớn cây cam sinh trưởng thích hợp nhất ở nhiệt độ 25-27oC,
cam sinh trưởng ở nhiệt độ 23-29oC. Một số lồi có thể chịu được nhiệt độ -5oC
trong thời gian ngắn. Những giống thích ứng với điều kiện nhiệt độ thấp thường có
phẩm vị ngon, hấp dẫn, mẫu mã đẹp. Ở nhiệt độ 40oC với thời gian kéo dài nhiều
ngày, cây ngừng sinh trưởng, lá rụng, cành bị khơ héo.Tuy nhiên, có những lồi chỉ
bị hại khi nhiệt độ lên tới 50-57oC [8].
- Ánh sáng: Cây cam thích hợp với ánh sáng có cường độ 10.000-15.000 lux
(tương ứng thời gian chiếu sáng 16-17h/ngày), cây có múi ưu ánh sáng tán xạ,
không ưu ánh sáng trực xạ. Các giống cam khác nhau có yêu cầu khác nhau về ánh
sáng: Cam cần ánh sáng nhiều hơn quýt, quýt cần nhiều ánh sáng hơn chanh [10].
- Nước: Ẩm độ không khí là một yếu tố khá quan trọng ảnh hưởng tới sinh
trưởng của cây cam, khi ẩm độ khơng khí cao làm cây ít thốt hơi nước, ít tiêu hoa
năng lượng cho quá trình hút nước. Nếu độ ẩm quá cao sẽ tạo điều kiện cho bệnh
hại phát triển. Ẩm độ khơng khí phù hợp nhất vào khoảng 70-75% [3]. Theo viện
NC Cây ăn quả Miền Nam (2004), cây có múi cần nhiều nước, nhất là trong thời kì
ra hoa và kết quả nhưng cũng rất sợ ngập úng. Ẩm độ thích hợp nhất là 70-80%.
Lượng nước cần khoảng 1000-2000mm/năm.
- Gió: Theo GS. Trần Thượng Tuấn năm 1992 [18], gió nhẹ với vận tốc 510km/h có tác dụng giảm nhiệt độ của vườn cây trong mùa hè, làm thoáng mát
tránh được một số sâu bệnh hại. Khi làm vườn chú ý hướng gió, giúp vườn cây

được thơng khí, tránh làm cây bị gẫy đổ, thụ phấn tốt trong mùa hoa nở.


10

- Đất: Các yếu tố đất đai quan trọng khi lựa chọn đất trồng cây có múi đó là
tầng sâu đất, đất dễ thoát nước, mực nước ngầm sâu hoặc ổn định. Mực nước
ngầm phải tối thiểu sâu 1,5m dưới mặt đất. Độ pH thích hợp với sinh trưởng của
cam quýt từ 5,5-5,6. Đất quá chua sẽ có nhiều dinh dưỡng bị rửa trơi, và cũng có
thể gây ngộ độc một số nguyên tố như đồng (Cu). Đất quá kiềm làm cây thiếu
hụt một số nguyên tố nên có biểu hiện thiếu kẽm (Zn), sắt (Fe). Nhìn chung, đất
phù hợp với trồng cây có múi là đất phù sa, phù sa cổ, đất bồi tụ, đất đỏ bazan,
đất mùn đá vôi [3].
- Dinh dưỡng: Để phát triển tốt cây cam cần cung cấp đầy đủ và cân đối các
nguyên tố dinh dưỡng đa lượng N, P, K cũng như các ngun tố khống vi lượng
Cu, Mg, B.
2.1.5. Tình hình sản xuất cây cam
2.1.5.1. Tình hình sản xuất trên thế giới
Hiện nay, cây cam là một trong những loại cây ăn quả chủ lực và được trồng
tại nhiều nước và vùng lãnh thổ trên thế giới.


11

Bảng 2.2: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các châu lục trên thế giới
giai đoạn 2012-2014
Chỉ tiêu

Năm

Châu lục
2012

2013

2014

Châu Phi

953.493

958.945

947.084

Châu Mỹ

99.440

106.579

110.600

Diện tích

Châu Á

373.172

311.322

297755

(ha)

Châu Âu

3485

3512

4740

Châu đại dương

1178

1221

1270

Thế giới

1.430.769

1.381.590

1.361.449

Châu Phi

5,0414

5,0255

5,0505

Châu Mỹ

10,4929

10,5510

9,9524

17,4365

20,5004

21,8961

Châu Âu

14,0985

14,1745

12,1302

Châu đại dương

9,4771

9,4603

9,4890

Thế giới

8,6789

8,9661

9,1617

Châu Phi

4.806.917

4.819.143

4.783.218

Châu Mỹ

1.043.412

1.124.515

1.100.734

6.506.806

6.382.423

6.519.671

Châu Âu

49.134

49.783

57.492

Châu đại dương

11.164

11.551

12.049

Thế giới

12.417.487

12.387.415

12.473.165

Năng suất Châu Á
(tấn/ha)

Sản lƣợng Châu Á
(tấn)

(Nguồn: FASTAT/FAO Statistics- năm 2015) [30]
Năm 2012 diện tích cam, qt của tồn thế giới là 1.430.769 ha, năng suất
trung bình đạt 8,6786 tấn/ha, sản lượng đạt 12.417.487 tấn. Đến năm 2015 diện tích
giảm xuống 1.361.449 ha nhưng do kĩ thuật chọn giống và canh tác tốt năng suất
đạt 9,1617 tấn/ha từ đó sản lượng tăng lên 12.473.164 tấn.


12

Châu Á có diện tích trồng cam qt lớn nhất thế giới, kế tiếp tới châu Mỹ,
châu Phi và châu Âu. Châu đại dương là châu lục có diện tích trồng cam quýt nhỏ
nhất (năm 2014 là 1270 ha).
2.1.5.2. Tình hình sản xuất ở Việt Nam
Ở nước ta, cây cam là cây trồng được thâm canh từ lâu đời, cho đến nay đã
chọn ra được nhiều giống có năng suất và chất lượng cao đem trồng ở hầu hết các
vùng trên cả nước.
Từ những năm 1960, nước ta có khoảng 3000 ha cam quýt và phát triển khá
mạnh, sản lượng hàng năm đã đạt vài nghìn tấn, năng suất bình quân vào khoảng
135-140 tạ/ha. Thời kỳ từ những năm 1975 trở lại đây ở miền Bắc diện tích và sản
lượng cam có xu hướng giảm dần, tuy nhiên ở miền Nam diện tích và sản lượng
cam quýt lại tăng lên, các tỉnh có diện tích trồng cam nhiều như Vĩnh Long, Tiền
Giang, Đồng Tháp... Trong những năm trở lại đây diện tích, năng suất và sản lượng
cam quýt trên cả nước được tăng lên rất mạnh mẽ và ổn định.

Bảng 2.3: Tình hình sản xuất cam, quýt của nƣớc ta giai đoạn 2010-2015.
Năm

Chỉ tiêu
Diện tích (nghìn ha)
Diện tích cho thu hoạch
(nghìn ha)
Năng suất (tấn/ha)
Sản lượng (nghìn tấn)

2010

2012

2013

2014

2015

75,3

67,5

70,3

78,5

85,8

64,1

55,6

56,6

59,0

59,0

11,4

12,7

12,5

12,9

12,6

728,6

704,1

706,0

758,9

741,1

(Nguồn: Niên giám thống kê năm 2015) [9]
Kết quả thống kê cho thấy diện tích sản xuất cam qt nhìn chung tăng từ năm
2010- 2015, từ năm 2010 đến năm 2012 giảm 7,8 (nghìn ha). Từ năm 2012 đến năm
2015 tăng vọt từ 67,5 (nghìn ha) lên 85,8 (nghìn ha). Diện tích cho thu hoạch có xu
hướng khơng ổn định, năm 2010 đạt 64,1 (nghìn ha) đến năm 2012 giảm xuống
55,6 (nghìn ha). Sản lượng thu hoạch khơng đều, năm 2010 đạt 728,6 (nghìn tấn),
sau đó giảm xuống năm 2013 đạt 706,0 (nghìn tấn). Sản lượng thu hoạch cao nhất là


13

năm 2014 đạt 758,9 (nghìn tấn). Năng suất năm 2010 đạt 11,4 (tấn/ha) đến năm
2015 đạt 12,6 (tấn/ha).
Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam, quýt ở các vùng của nƣớc ta năm 2014
STT

1

2

3

Vùng trồng
Đồng bằng Sơng
Hồng
Trung du miền núi
phía Bắc
Bắc Trung bộ và
Dun hải miền Trung

Diện tích
gieo trồng
(nghìn ha)

Diện tích
thu hoạch
(nghìn
ha)

Năng suất
(tấn/ha)

Tổng sản
lƣợng (Nghìn
tấn)

5,4

4,8

12,5

59,8

15,7

9,3

8,1

75,3

8,1

5,3

9,2

48,9

4

Tây Ngun

1,0

0,6

7,5

4,5

5

Đơng Nam Bộ

6,2

4,5

11,5

51,6

39,2

33,8

14,7

496,0

75,6

58,3

12,6

736,1

6

Đồng bằng Sơng Cửu
Long
Cả nước

(Nguồn: Bộ NN & PTNN-2015) [1]
Từ bảng thống kê cho thấy diện tích gieo trồng, diện tích cho thu hoạch và sản
lượng các vùng của nước ta không đồng đều. Vùng có diện tích gieo trồng cao nhất,
tổng sản lượng lớn nhất là Đồng bằng Sông Cửu Long: với diện tích gieo trồng là

39,2 (nghìn ha), tổng sản lượng đạt 496,0 (nghìn tấn), năng suất đạt 14,7 (tấn/ha).
Tiếp theo là các vùng Trung du miền núi phía Bắc, Bắc trung bộ và Dun hải miền
Trung… Vùng có diện tích gieo trồng và sản lượng thấp nhất là Tây Nguyên với
diện tích gieo trồng là 1,0 (nghìn ha), sản lượng đạt 4,5 (nghìn tấn) và năng suất là
7,5 (tấn/ha). Nhìn chung tình hình gieo trồng cây có múi đang được các vùng chú
trọng, nâng cao năng suất, sản lượng tăng thu nhập cho các địa phương và người
dân. Năm 2014, tổng diện tích cây cam qt đạt 75,6 (nghìn ha), với diện tích thu


14

hoạch là 58,3 (nghìn ha), tổng sản lượng đạt 736,1 (nghìn tấn) và năng suất đạt 12,6
(tấn/ha).
2.2. Bệnh vàng lá Greening trên cây có múi
2.2.1. Lịch sử của bệnh
- Bệnh vàng lá Greening là dịch hại nguy hiểm nhất trên cây có múi, bệnh do
vi khuẩn Liberibacter asiaticus gây nên. Bệnh vàng lá Greening đã được ghi nhận
từ năm 1992 ở Trung Quốc, với nhiều tên gọi khác nhau như Huanglongbing hay
chồi vàng ở Nam Trung Quốc và được tài liệu hóa năm 1943, Greening ở Nam Phi
(năm 1947), Likkubin (Đài Loan, năm 1951), Leaf mottle yellows ở Philippines,
Greening ở Myanmar (năm 1970), Greening ở Việt Nam, Lào, Campuchia (năm
1980), Huanglongbing ở Brazil (năm 2004) và ở Frorida, Hoa Kỳ (năm 2005). Đến
nay chưa được ghi nhận ở Ostraylia [8].
- Tại Việt Nam, bệnh Greening phát triển mạnh qua hai giai đoạn:
+ Giai đoạn 1: Vào các năm 1970 tại hầu hết các nơng trường cam phía Bắc.
+ Giai đoạn 2: Từ đầu thập kỷ 1990 tại các vùng trồng cam quýt quan trọng
trong cả nước: Hà Giang, Tuyên Quang, Nghệ An, Đồng Tháp, Vĩnh Long... Người
sản xuất đa phần chưa hiểu biết những kỹ thuật trồng và thâm canh cây có múi, do
đó tạo ra những vườn cây kém chất lượng.
2.2.2. Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh

2.2.2.1. Nguyên nhân gây bệnh
Bệnh vàng lá Greening do hai dòng vi khuẩn Liberibacter gây ra, dịng châu Á
có tên là Liberibecter asiaticum và dịng châu Phi có tên là Liberibacter africanum.
Dịng châu Á là dòng chịu nhiệt, chịu được nhiệt từ 27-32oC, dòng châu Phi là
dòng ưu nhiệt, chịu được nhiệt từ 22-24oC [33].
Bệnh Greening lan truyền theo hai cách:
+ Do chiết ghép và nhân giống từ các cây bị bệnh
+ Lây truyền qua môi giới là rầy chổng cách Diaphorina citri ở châu Á và rầy
Trioza erytrea ở châu Phi. Rầy chổng cánh Diaphorina citri Là loại rầy có kích
thước dài 3,2- 3,5 mm, toàn thân màu xám tro, hơi phớt xanh. Mắt kép nhỏ, râu đầu


15

có 9 đốt hai đốt cuối màu đen. Đỉnh đầu có hai mảnh nhọn nhơ ra phía trước như
lưỡi kéo. Cánh màu trong đục, có nhiều đốm nâu nhỏ.
Rầy non và rầy trưởng thành chích hút dịch trên cây, lá non, lá bánh tẻ.
Thời gian phát triển của trứng từ 4-12 ngày, rầy non từ 10-35 ngày, rầy trưởng
thành vũ hóa sau 6-7 ngày thì đẻ trứng. Rầy trưởng thành sống được từ 50-60
ngày. Ở điều kiện miền Bắc nước ta rầy chổng cánh phát sinh 9-10 lứa trong một
năm [40].

A

B

Hình 2.1: Rầy chổng cánh Diaphorina citri
A – Rầy trƣởng thành; B – Trứng và rầy non.
(Nguồn: Brlansky.R.H và Rogers.M.E, 2007) [29]
2.2.2.2. Triệu chứng của bệnh vàng lá Greening

Bệnh rất phổ biến, là bệnh hại quan trọng nhất của nhất trên cây ăn quả có
múi ở các vùng trên thế giới. Tuy nhiên, triệu chứng bệnh biểu hiện với mức độ
khác nhau tùy thuộc vào từng chủng loại, giống cây trồng, môi giới truyền bệnh,
tuổi của cây, chủng vi khuẩn gây bệnh cũng như kĩ thuật canh tác, chăm sóc, bảo
vệ cây trồng. Song triệu chứng chung nhất của bệnh là cây còi cọc, phiến lá
ngắn, hẹp, gân lá bị xanh, những mô lá liền kề bị vàng hoặc đốm vàng, đơi khi
gân lá bị hóa bần [10].
Khi cây bị nhiễm bệnh vàng lá Greening vi khuẩn không gây hại mạch gỗ
nhưng gây các vết chết hoại trong mạch libe, sự vận chuyển đường đến các bộ


16

phận của cây bị cản trở. Lá nhỏ, tuổi thọ của lá bị rút ngắn, sự phân chia tế bào
luôn xảy ra khiến gân lá bị sưng. Vi khuẩn cũng hiện diện nhiều ở cuống quả và
làm quả bị lệch tâm, quả nhỏ, khối lượng quả giảm và hàm lượng đường trong
quả thấp dẫn đến chất lượng của quả giảm [27]. Rễ cây bị bệnh làm nghẽn mạch
dẫn, rễ bị hoại tử nhiều, rễ tơ không hút được dinh dưỡng để nuôi cây. Cây
nhiễm bệnh bị rụng quả cùng với sự phát triển của bệnh, cây sẽ chết sau 2-5 năm
tùy theo mức độ nhiễm [28].
Đỗ Đình Đức năm 1991 [6] đã chia triệu chứng bệnh làm bốn dạng:
- Dạng thứ nhất xuất hiện trên một vài lá, một vài cành hay một phần của tán cây,
những cành khác vẫn xanh tốt bình thường, gân chính và gân phụ của lá xanh đậm, thịt
lá giữa các gân vàng hay xanh lốm đốm, kích thước lá phát triển bình thường.
- Dạng thứ hai bệnh biểu hiện trên toàn cây, gân và thịt lá vàng, lá uốn cong
hình thìa, nhỏ và dày, cây lùn xơ xác, thân cây nơi tiếp hợp phình to, phần gỗ có
nhiều gai nhỏ hay lỗ nhỏ, hoa nở sớm, dị hình, kéo dài, rễ tơ bị thối.
- Dạng thứ ba bệnh chỉ biểu hiện trên giống cam Sông Con ghép trên gốc bưởi
và đặc biệt là gốc cam Voi Quảng Bình.
- Dạng triệu chứng thứ tư bệnh biểu hiện trên lộc xuân của giống cam Sông

Con và Washington Navel, dọc theo gân chính thịt lá màu xanh thẫm hơn, rìa vết
bệnh màu vàng nhạt [6].

A

B

Hình 2.2: Triệu trứng nhiễm bệnh vàng lá Greening trên cây có múi
(Nguồn: Brlansky.R.H và Rogers.M.E, 2007) [29]


17

2.2.3. Phương pháp chẩn đốn bệnh vàng lá Greening
Bệnh có thể được phát hiện và chẩn đoán dựa trên các dạng triệu chứng trên
đồng ruộng, tuy nhiên các dạng triệu chứng này sẽ thay đổi theo từng đối tượng và
giai đoạn khác nhau và có thể nhầm lẫn với một số bệnh thiếu dưỡng chất như thiếu
Zn… Mặt khác sự biểu hiện của triệu chứng bệnh còn phụ thuộc vào số lượng vi
khuẩn trong cây, khi số lượng vi khuẩn trong cây thấp thì cây vẫn khơng biểu hiện
triệu chứng nên không thể phát hiện được [8].
Xác định tác nhân bằng kính hiển vi điện tử: Dưới kính hiển vi điện tử có thể
quan sát được vi khuẩn có lơng cứng, kích thước 350-550 × 600-1500 nm, vách tế
bào có hai lớp, độ dày từ 20-25 nm. Hình dạng của vi khuẩn thường có hình gậy,
thon dài và được thay đổi từ lúc tế bào non đến lúc thành thục [35]. Bằng phương
pháp cắt lát siêu mỏng và soi dưới kính hiển vi điện tử, Kim J.S và cs năm 2009 đã
nghiên cứu sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh greening và cho thấy phần mạch
dẫn (phloem) tích tụ tinh bột dẫn đến thối hóa mạch dẫn, lục lạp trong lá bị ảnh
hưởng nghiêm trọng. Dẫn đến lá bị bệnh thường khơng có khả năng quang hợp, hấp
thu và vận chuyển dinh dưỡng theo mạch dẫn [37]. Phương pháp này cũng được Lê
Mai Nhất năm 2014 sử dụng để giám định các tác nhân gây bệnh vàng lá Greening

tại một số địa phương phía Bắc Việt Nam và cho kết quả tương tự [8].
Cho đến năm 1992, kính hiển vi điện tử đã được sử dụng rộng rãi để xác định
tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên, sử dụng kính hiển vi điện tử khơng thể phân biệt
được các dịng vi khuẩn châu Á và châu Phi [8].
Xác định tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử là phương
pháp đã và đang được đẩy mạnh nghiên cứu, trong đó PCR là kỹ thuật được sử
dụng rộng rãi nhất trong cơng tác chẩn đốn các tác nhân gây bệnh. Hung và cs năm
1999 đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu để chẩn đoán bệnh vàng lá Greening, sản phẩm
thu được có kích thước 226 bp. Phương pháp PCR cũng được sử dụng để phát hiện
Liberibacter asiaticum trong cơ thể rầy chổng cánh Diaphorina citri [32]. Bằng kỹ
thuật này năm 2004 người ta đã phát hiện được dòng vi khuẩn châu Mỹ là
Liberibacter americanum đã có mặt tại 46 điểm của bang Sao Paulo-Brasil, và chỉ
một năm sau đã lên tới 79 điểm. Kết quả này cho thấy sự lan truyền nhanh chóng