Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn PED tại miền bắc việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN TRUNG TIẾN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA
BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED)
TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành:

Dịch tễ học thú y

Mã số:

9 64 01 08

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018



LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng
bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn
và các thơng tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2018

Tác giả luận án

Nguyễn Trung Tiến

i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất
nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả:
Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Bá
Hiên, người đã trực tiếp hướng dẫn tơi trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thành
luận án. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp q báu của thầy mà
luận án của tơi đã được hồn thành.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban
Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm,
Phịng Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, cùng tồn thể các thầy, cơ
giáo và cán bộ Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi
những kiến thức quý báu và giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu này.
Trân trọng cảm ơn Lãnh đạo, toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm Kiểm
nghiệm thuốc Thú y TW1, các bạn bè và đồng nghiệp đã luôn tạo điều kiện về thời gian,
động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tơi trong q trình học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận án.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2018

Tác giả luận án

Nguyễn Trung Tiến

ii


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ............................................................................................................................ iii
Danh mục các từ viết tắt .................................................................................................. vi
Danh mục bảng ............................................................................................................... vii
Danh mục hình ............................................................................................................... viii
Trích yếu luận án .............................................................................................................. x
Thesis abstract................................................................................................................. xii
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2

1.3.

Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 3

1.4.

Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................ 3

1.5.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 3

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4
2.1.

Giới thiệu chung ................................................................................................... 4

2.2.

Lịch sử bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn ............................................................... 4

2.3.

Tình hình dịch PED trên thế giới và Việt Nam .................................................... 5

2.3.1. Tình hình dịch PED trên thế giới .......................................................................... 5
2.3.2. Tình hình dịch PED ở Việt Nam........................................................................... 6
2.4.

Căn bệnh ............................................................................................................... 8

2.4.1. Phân loại và hình thái của PEDV.......................................................................... 8
2.4.2. Cấu trúc phân tử của virus gây bệnh ..................................................................... 9
2.4.3. Đặc tính ni cấy của virus ................................................................................ 12
2.4.4. Sức đề kháng của virus gây bệnh PED .............................................................. 12
2.4.5. Dịch tễ học lâm sàng ........................................................................................... 13
2.5.

Dịch tễ học phân tử ............................................................................................. 16

2.6.

Triệu chứng và bệnh tích của lợn mắc PED ....................................................... 18

2.6.1. Triệu chứng lâm sàng.......................................................................................... 18

iii


2.6.2. Bệnh tích ............................................................................................................. 19
2.7.

Các phương pháp chẩn đốn PEDV ................................................................... 20

2.7.1. Phát hiện virus .................................................................................................... 20
2.7.2. Chẩn đoán phân biệt ........................................................................................... 23
2.7.3. Phân lập virus...................................................................................................... 24
2.8.

Phòng và điều trị bệnh ........................................................................................ 25

Phần 3. Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu ........................................... 30
3.1.

Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................... 30

3.2.

Thời gian thực hiện đề tài ................................................................................... 30

3.3.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 30

3.3.1. Nghiên cứu tình hình dịch PED tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam ................. 30
3.3.2. Phân tích đặc điểm về trình tự gen...................................................................... 30
3.3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV ............. 30
3.4.

Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 31

3.5.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 31

3.5.1. Phương pháp điều tra một số đặc điểm dịch tễ ................................................... 32
3.5.2. Phương pháp theo dõi lâm sàng .......................................................................... 32
3.5.3. Phương pháp mổ khám ....................................................................................... 32
3.5.4. Phương pháp lấy mẫu ......................................................................................... 32

3.5.5. Phương pháp tách ARN tổng số ......................................................................... 33
3.5.6. Phương pháp tổng hợp cDNA ............................................................................ 33
3.5.7. Phương pháp phát hiện PEDV ............................................................................ 34
3.5.8. Phương pháp giải trình tự gen............................................................................. 34
3.5.9. Phương pháp xác định khoảng cách di truyền .................................................... 35
3.5.10. Phương pháp xây dựng cây phả hệ ..................................................................... 35
3.5.11. Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử ........................................ 35
3.5.12. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 36
Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 37
4.1.

Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc từ 2013-2015 ............................... 37

4.1.1. Kết quả thiết lập phản ứng RT-PCR phát hiện PEDV ........................................ 37
4.1.2. Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm từ 2013-2015 .......................... 41
4.1.3. Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc theo trang trại............................... 42

iv


4.1.4. Kết quả theo dõi triệu chứng, bệnh tích của lợn mắc PED ................................. 44
4.2.

Kết quả phân tích đặc điểm về trình tự gen ........................................................ 48

4.2.1. Đặc điểm gen S của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam ............................. 48
4.2.2. Đặc điểm gen ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt Nam....................................... 61
4.3.

Nghiên cứu một số đặc điểm về dịch tễ học phân tử của PEDV ........................ 67

4.3.1. Đặc điểm về sự lưu hành của PEDV theo nhóm di truyền ................................. 67
4.3.2. Hiện tượng tái tổ hợp của PEDV lưu hành ở Việt Nam ..................................... 73
4.3.3. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV theo không gian và thời gian ............. 75
Phần 5. Kết luận và đề nghị ......................................................................................... 85
5.1.

Kết luận ............................................................................................................... 85

5.2.

Đề nghị ................................................................................................................ 85

Danh mục cơng trình cơng bố có liên quan đến luận án ................................................. 87
Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 87
Phụ lục .......................................................................................................................... 103

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

vi

Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

CPE

Cytopathogenic effect

cs.

Cộng sự

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle’s Medium

DMSO

Dimethyl Sulfoxide

E

Envelope

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic acid

ELISA

Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay

FAO

Food and Agriculture Organization

FBS

Fetal Bovine Serum

M

Membrane

MOI

Multiplicity of Infection

N

Nucleocapsid

ORF

Open Reading Frame

ORF3

Open Reading Frame 3

PBS

Phosphate Buffer Saline

PDCoV

Porcine deltacoronavirus

PED

Porcine Epidemic Diarrhea

PEDV

Porcine Epidemic Diarrhea Virus

RNA

Ribonucleic Acid

RT-PCR

Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction

S

Spike protein

TCID50

50% Tissue Culture Infective Dose

TGE

Transmissible Gastroenteritis

TGEV

Transmissible Gastroenteritis Virus

TPB

Tryptose Phosphate Broth


DANH MỤC BẢNG
TT

Tên bảng

Trang

3.1.

Thông tin về mồi đặc hiệu được dùng trong nghiên cứu ....................................... 31

3.2.

Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .................................................................. 34

4.1.

Tương đồng trình tự nucleotide và amino acid của 11 chủng PEDV với các
chủng tham chiếu ................................................................................................... 39

4.2.

Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu thu thập từ 2013-2015.................................. 41

4.3.

Tình hình dịch PED ở lợn của một số tỉnh miền Bắc theo trang trại..................... 43

4.4.

Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PED ................................ 44

4.5.

Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn mắc PED ....................................... 46

4.6.

Danh sách các chủng PEDV thuộc genogroup 1 ................................................... 75

4.7.

Danh sách các chủng PEDV thuộc genogroup 2 nhóm châu Á ............................ 80

vii


DANH MỤC HÌNH
TT

Tên hình

Trang

2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.

Hạt virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc ........................................ 9
Mơ hình cấu trúc và bộ gen PEDV ........................................................................ 10
Hiệu giá của PEDV tồn tại trên bề mặt vật liệu theo thời gian ............................. 13
Con đường truyền lây của PEDV .......................................................................... 17
Bệnh tích đại thể ở lợn sơ sinh mắc PED .............................................................. 19

2.6.
4.1.
4.2.
4.3.

So sánh độ nhạy của một số phương pháp phát hiện PEDV ................................. 22
Kết quả RT-PCR phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm .................................... 37
Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR nhân lên bởi cặp mồi P1/P2 ......................... 38
Triệu chứng của lợn con theo mẹ mắc PED .......................................................... 45

4.4.
4.5.
4.6.
4.7.
4.8.

4.9.

Bệnh tích đại thể của lợn con theo mẹ mắc PED .................................................. 47
Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen S của 38 chủng PEDV .................................. 49
Phân loại các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen S ......................... 50
Khoảng cách di truyền của gen S giữa các chủng PEDV ...................................... 51
Đột biến thêm- xóa ở gen S của 38 chủng PEDV ................................................. 52
Tốc độ thay đổi nucleotide tại các vị trí codon của gen mã hóa vùng quyết

4.10.
4.11.
4.12.
4.13.
4.14.
4.15.
4.16.
4.17.
4.18.
4.19.
4.20.
4.21.
4.22.

viii

định kháng ngun................................................................................................. 54
Trình tự amino acid ở vùng COE của 38 chủng PEDV ........................................ 56
Trình tự amino acid ở vùng S1D của 38 chủng PEDV ......................................... 58
Trình tự amino acid ở vùng S10 của 38 chủng PEDV ........................................... 60
Trình tự nucleotide gen ORF3 của 12 chủng PEDV ............................................. 62

Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen ORF3 của 12 chủng PEDV .......................... 63
Phân loại chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen ORF3 ........................ 64
Khoảng cách di truyền của gen ORF3 giữa các chủng PEDV .............................. 65
Trình tự amino acid ORF3 protein của 12 chủng PEDV....................................... 66
Cây phả hệ của các chủng PEDV dựa vào trình tự gen S ...................................... 68
Đặc điểm phân nhánh cây phả hệ dẫn tới các chủng của Việt Nam dựa vào
trình tự gen S ......................................................................................................... 69
Cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen ORF3 ............................................... 70
Đặc điểm phân nhánh cây phả hệ dựa vào gen ORF3 của genogroup 1 của
Việt Nam................................................................................................................ 72
Kết quả đối chiếu nhánh cây phả hệ dựa vào trình tự toàn bộ và một phần
gen S (n =43) ......................................................................................................... 73


4.23.
4.24.
4.25.
4.26.
4.27.
4.28.
4.29.

Kết quả đối chiếu nhánh cây phả hệ dựa vào trình tự tồn bộ và một phần
gen S (n =911) ....................................................................................................... 74
Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1 dựa vào trình tự
gen ORF3 ............................................................................................................... 76
Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1 dựa vào trình tự
gen S ...................................................................................................................... 77
Sự phát tán theo không gian của genogroup 2 dựa vào gen ORF3 ....................... 79
Sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV nhánh châu Á ..................... 81

Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV
genogroup 2 nhánh châu Á .................................................................................... 82
Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của PEDV
genogroup 2 nhánh Bắc Mỹ................................................................................... 83

ix


TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
Tên tác giả: Nguyễn Trung Tiến
Tên Luận án: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở
lợn (PED) tại miền Bắc Việt Nam.
Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y

Mã số: 9 64 01 08

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Trong nghiên cứu này trước tiên làm rõ tình hình dịch PED ở 10 tỉnh miền Bắc,
bao gồm vùng đồng bằng sông Hồng và vùng trung du - miền núi. Trên cơ sở xác định
được sự lưu hành của PEDV, đặc điểm dịch tễ học được phân tích đa chiều, đi sâu tìm
hiểu những biến đổi có liên quan đến đáp ứng miễn dịch trung hịa virus. Đặc biệt, phân
tích mối liên hệ về gen được thực hiện trên cơ sở dữ liệu lớn nhằm làm rõ nhiều đặc
điểm dịch tễ học phân tử chưa được đề cập trong nhiều nghiên cứu trước đây.
Phương pháp nghiên cứu
Có hai nhóm phương pháp chính được dùng trong nghiên cứu này, bao gồm:
(i) phương pháp RT-PCR dùng trong phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm và giải
trình tự gen virus. (ii) Phương pháp phân tích đặc điểm sinh học phân tử và đặc điểm
dịch tễ học phân tử dựa vào các phần mềm như BioEdit, MEGA, MAFFT, BEAST...
Kết quả chính và kết luận

Có 5 nhóm kết quả nghiên cứu chính đã đạt được trong nghiên cứu này, bao gồm:
(i) Bằng phản ứng RT-PCR, đã xác định được dịch PED đã xuất hiện ở một không
gian trải rộng ở 10/10 tỉnh miền Bắc với tỷ lệ trung bình là 41,98% và liên tục theo thời
gian (trong các năm thu thập mẫu từ 2013-2015). Các trang trại ở vùng đồng bằng có tỷ
lệ trang trại dương tính PEDV cao hơn rõ rệt so với các trang trại ở các tỉnh trung dumiền núi (68,42% so với 35,29%).
(ii) Lợn mắc PED có triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh: phân tanh và
có mùi gây đặc trưng (64%), phân có sữa khơng tiêu (38%); ruột non trong (60%) và có
cục sữa khơng tiêu ở các đoạn ruột (20%).
(iii) Tính đa dạng di truyền của gen S và gen ORF3 của 38 chủng PEDV của Việt
Nam được phân tích đa chiều về tỷ lệ % tương đồng, phân loại theo nhóm di truyền và
khoảng cách di truyền giữa các chủng virus. Qua đó đã xác định được PEDV lưu hành ở
Việt Nam khơng có nguồn gốc từ các chủng virus vacxin và có tính đa dạng di truyền
với mức tương đồng trình tự gen S là 63,7-87,9% và gen ORF3 là 93-99%. Các chủng

x


virus mang đột biến thêm - xóa và đột biến điểm ở vùng quyết định kháng nguyên của
gen S được dự đốn khơng dẫn tới dẫn tới khả năng lẩn tránh kháng thể trung hịa.
(iv) Phân tích cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen S và gen ORF3 được
thực hiện với dung lượng mẫu lớn (n = 911 trình tự gen S, n = 886 trình tự gen ORF3)
được tạo ra trong nghiên cứu này và thu thập từ ngân hàng gen. Nghiên cứu này đã
khẳng định sự lưu hành của 2 genogroup PEDV ở Việt Nam. Trong đó genogroup 2 bao
gồm nhóm châu Á và nhóm Bắc Mỹ. Một số chủng là kết quả của quá trình tái tổ hợp ở
gen S giữa 2 chủng virus thuộc genogroup 1 và genogroup 2.
(v) Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV lưu hành ở Việt Nam được cho từng
genogroup virus, với hai kết luận quan trọng được rút ra. Thứ nhất, PEDV lưu hành ở
Việt Nam có nguồn gốc đa dạng: virus thuộc genogroup 1 và nhánh châu Á của
genogroup 2 có nguồn gốc trực tiếp từ Trung Quốc. Trong khi đó virus thuộc nhánh Bắc
Mỹ có nguồn gốc từ Mỹ. Thứ hai, chủng virus tổ tiên của PEDV hiện lưu hành được dự

đoán tồn tại trước thời điểm xảy ra dịch PED khoảng 6-9 năm. Sau khi xâm nhập, các
chủng PEDV của Việt Nam bắt đầu tạo thành những nhánh di truyền riêng biệt và lây
lan ra các địa phương khác.

xi


THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Nguyen Trung Tien
Thesis title: Epidemiological study of porcine epidemic diarrhea in pig populations in
the north of Vietnam.
Major: Veterinary epidemiology

Code: 9 64 01 08

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
This study firstly investigated the prevalence of PED in northern provinces which
were divided in to the river delta and the mountainous areas. Based on the identification
of PEDV in each region, the molecular epidemiology of PEDV was analyzed under
different aspects. For example, genetic substitutions which are related to neutralizing
epitopes were focused. Especially, based on a large data for phylogenetic inferences,
this study revealed several important aspect of molecular epidemiology which was
missed in several publications.
Materials and Methods
This study used two major methods, which were: (i) RT-PCR based method for
viral detection and Sanger sequencing. (ii) Method for molecular epidemiological
analyses was relied on several state-of-the-art tools, such as: BioEdit, MEGA, MAFFT,
BEAST, etc.
Main findings and conclusions

Five main results were drawn from this study, as the follows.
(i) The result of RT-PCR screening confirmed the emergence of PED in all
10/10 investigated provinces. The outbreaks were found consecutively from 2013-2015,
and the average rate of prevalence was 41.98%. Farms located in the river delta region
tended to have a higher PEDV positive rate (68.42%) in compare to those located in the
mountainous area (35.29%).
(ii) PEDV infected piglets displayed typical clinical symptoms as well as gross
lesions of PED, such as: typical odor (64%), un-digested milk in feces (38%); thin-wall
small intestine (60%) and milk curved in the intestinal lumen (20%).
(iii) The genetic diversities of S and ORF3 genes of 38 field strains were analyzed
under different aspects. It was concluded that field strains of PEDV in Vietnam were
not related to vaccine strain. The sequence similarities between field viruses were
63.7 - 87.9% for the S gene and were 93 - 99% for the ORF3 gene. Genetic insertion-

xii


deletions as well as point mutations in important epitopes of the spike protein were
predicted not resulting escape mutants.
(iv) Phylogenetic analyses were done on the large data of both S and ORF3 gene.
The results confirmed the prevalence both genogroup 1 and genogroup 2 of PEDV in
pig population in Vietnam. Of the genogroup 2, PEDVs in Vietnam were separated into
the emerging Asian and North American clades. Several strains were determined to be
the result of recombination on the S gene between genogroup 1 and genogroup 2.
(v) The molecular epidemiology was inferred for each genogroup. Firstly,
Vietnamese PEDVs were predicted originating from the viruses circulating in China
(for genogroup 1 and Asian clade of genogroup 2). Meanwhile, the North American
clade was predicted to derive from USA. Secondly, the most recent common ancestor of
Vietnamese PEDV was predicted to emerge in Vietnam 6-9 years prior to the first PED
outbreak. After the introduction, the viruses diversified locally to form Vietnamese

clade and started to diffuse spatial-temporally into different locations.

xiii



PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn (Porcine Epidemic Diarrhea - PED) là
một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ
Coronaviridae. Về mặt lâm sàng, biểu hiện của bệnh PED rất giống với bệnh
viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) mặc dù chúng là hai virus hoàn toàn khác
nhau cùng họ Cornonaviridae. Bệnh gây ra trên lợn ở tất cả các lứa tuổi với triệu
chứng lâm sàng là nôn và tiêu chảy. Tỷ lệ lây lan và tử vong ở lợn con dưới 5
ngày tuổi có thể tới 100% bởi tiêu chảy và mất nước nặng. Bệnh PED xảy ra
quanh năm nhưng thường phổ biến hơn vào mùa đông và trên 90% ca bệnh xảy
ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi. Dịch PED xuất hiện lần đầu tiên ở châu Âu vào
năm 1971 (Wood, 1977), sau đó bệnh lây lan ra nhiều quốc gia khác ở châu Á
như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan.
Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phân tích
đặc điểm di truyền của các chủng virus gây bệnh PED, so sánh sự khác nhau về
mặt di truyền, đặc điểm phát sinh loài của các chủng phân lập ở những địa điểm
khác nhau, từ đó đưa ra các dự đốn, khuyến cáo và biện pháp đối phó hiệu quả
trước sự biến đổi của virus. Park et al. (2007) đã phân tích sự phát triển di truyền
của gen S (spike glycoprotein gene) và gen M trên các mẫu virus PED thực địa
phân lập tại Hàn Quốc và chia các chủng virus thành 3 nhóm G1, G2, G3, (G1 có
3 dưới nhóm: G1-1, G1-2 và G1-3), các chủng đó rất khác biệt với các chủng từ
châu Âu. Khi phân tích trình tự gen mã hóa cho màng virus (gen M) từ các mẫu
phân lập tại Trung Quốc, Chen et al. (2008) đã phát hiện có một nhóm mới
(genotype) của virus PED đang lưu hành.

Ở Việt Nam, bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn lần đầu tiên được phát hiện
vào năm 2008, đầu năm 2009 (Do Tien Duy et al., 2011; Nguyễn Tất Toàn và
cs., 2012). Theo các nghiên cứu đã công bố bệnh tiêu chảy thành dịch xảy ra
trên lợn mọi lứa tuổi, lần đầu tiên được xác định là do Porcine Epidemic
Diarrhea Virus (PEDV) tại Việt Nam. Bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh
miền Đông Nam bộ, gây ảnh hưởng lớn đến kinh tế chăn nuôi heo do làm tăng

1


tỷ lệ bệnh, tỷ lệ chết cao đặc biệt trên lợn con theo mẹ từ 50 - 100%. Cho đến
nay có rất ít cơng trình trong nước tiến hành nghiên cứu về loại virus này. Do
Tien Duy et al. (2011) ở Thái Lan đã phân lập và giải trình một số chủng virus
PED trên các mẫu được lấy ở miền Nam Việt Nam trong thời gian từ 2009 đến
2010. Ở miền Bắc, theo báo cáo khơng chính thức từ các công ty, trang trại,
dịch tiêu chảy do PEDV đã xảy ra nghiêm trọng từ đầu năm 2010. Việc phòng
chống bệnh tiêu chảy do PEDV gây ra chủ yếu dựa vào sử dụng vacxin. Trong
khi các chủng virus thực địa thường xuyên có những biến đổi phức tạp về mặt
di truyền, do đó việc nắm bắt và cập nhật được các đặc tính phân tử của các
chủng PEDV đóng vai trị quan trọng, giúp cho việc lựa chọn được vacxin thích
hợp và hiệu quả phục vụ cho cơng tác tiêm phịng. Trong khi đó, việc đánh giá
và phân tích đặc điểm di truyền của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam cịn
hạn chế, đã gây khó khăn trong việc định hướng sử dụng vacxin trong cơng tác
phịng bệnh. Do đó, nghiên cứu về dịch tễ học phân tử, xác định các type virus
đang lưu hành trong nước cũng như tìm hiểu nguồn gốc phát sinh phân loại,
biến đổi di truyền của các type virus này là rất cần thiết cho việc phòng chống
dịch PED cũng như định hướng cho việc nhập khẩu và triển khai sử dụng
vacxin một cách hiệu quả, đồng thời cũng là một nền tảng quan trọng trong việc
định hướng sản xuất vacxin trong nước nhằm đạt hiệu quả miễn dịch cao hơn
cũng như chủ động được nguồn vacxin và tiết kiệm chi phí cho việc nhập khẩu.

Để hạn chế dịch PED, việc nghiên cứu xác định được các chủng virus
gây bệnh, đồng thời giải mã, phân tích hệ gen, xác định được nguồn gốc tiến
hóa và sự biến đổi di truyền của các chủng PEDV là vô cùng quan trọng và là
công việc nghiên cứu hết sức cần thiết mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn to
lớn để từ đó góp phần quan trọng trong định hướng chiến lược cho việc sản
xuất vacxin phòng bệnh trong tương lai.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED tại 10 tỉnh/
thành phố khu vực phía Bắc;
- Làm rõ được đặc điểm di truyền, đặc điểm dịch tễ học phân tử của các
genotype PEDV đang lưu hành ở miền Bắc.

2


1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Trang trại nuôi lợn tại 10 tỉnh miền Bắc có lợn mắc tiêu chảy nghi do
PEDV giai đoạn 2013 - 2015 (bao gồm một số mẫu hồi cứu thu thập năm 2013).
Các tỉnh/thành phố thuộc đồng bằng châu thổ sông Hồng (Hà Nội, Hải Dương,
Hưng Yên, Hải Phịng, Thái Bình và Vĩnh Phúc) và Trung du - Miền núi (Hịa
Bình, Bắc Giang, Thái Ngun và Lào Cai).
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Đây là một nghiên cứu có hệ thống về PED và PEDV ở Việt Nam.
- Đã làm rõ đặc điểm dịch tễ học bệnh PED trên địa bàn 10 tỉnh/ thành phố
của miền Bắc Việt Nam. Trên cơ sở xác định những biểu hiện bệnh lý của bệnh,
đặc điểm dịch tễ học phân tử của căn bệnh, đã khẳng định sự lưu hành phổ biến
của PED trong các trang trại chăn nuôi.
- Nghiên cứu này đã giải mã được 15 trình tự gen S hồn chỉnh và 8 trình tự
gen ORF3, so sánh và chứng minh được những chủng PEDV đang lưu hành tại
thực địa khơng có cùng nguồn gốc với các chủng vacxin đang sử dụng.

- Xác định được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử, từ đó chứng minh
được nguồn gốc đa dạng của các chủng PEDV đang lưu hành tại Việt Nam.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
- Luận án đã phân tích và chỉ ra một số đặc điểm dịch tễ học của PED tại 10
tỉnh/ thành phố thuộc miền Bắc Việt Nam và mức độ lưu hành của bệnh, chứng
minh được nguồn gốc của các chủng PEDV đang lưu hành tại thực địa.
- Là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho nghiên cứu về PED và PEDV; là tư
liệu tham khảo cho giảng dạy của chuyên ngành Thú y và Chăn ni - Thú y.
- Từ kết quả phân tích dịch tễ học phân tử của PEDV đã chỉ rõ mức tương
đồng trình tự gen giữa những chủng PEDV phân lập từ thực địa và những chủng
vacxin đang sử dụng, từ đó giúp cho việc hoạch định các biện pháp phịng chống
bệnh, trong đó có lựa chọn vacxin phịng bệnh phù hợp.

3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. GIỚI THIỆU CHUNG
Bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea, PED) là một
bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc giống
Alphacoronavirus, họ Coronaviridae gây ra. Dịch PED thường xảy ra ở lợn con
dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Dịch PED đã và
đang gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc
gia trên thế giới (Laude et al., 1993; Lee, 2015). Dịch PED lần đầu tiên được
phát hiện ở Anh vào năm 1971, sau đó các ổ dịch liên tục được phát hiện và xảy
ra phổ biến ở các quốc gia châu Âu khác như Bỉ, Đức, Pháp, Hà Lan, Thụy Sỹ,
và ở châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan (Chen et al., 2010;
Chen et al., 2008; Song and Park, 2012; Puranaveja et al., 2009). Ở Việt Nam,
dịch PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ đó đến nay dịch bệnh
thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn

trong cả nước (Do Tien Duy et al., 2011).
2.2. LỊCH SỬ BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN
Bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn được phát hiện đầu tiên tại nước Anh
vào năm 1971 (Oldham, 1972). Bệnh xảy ra trên lợn vỗ béo với các biểu hiện
lâm sàng giống với bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE), chỉ khác một đặc
điểm quan trọng đó là lợn con đang bú mẹ không mắc bệnh. TGEV và các tác
nhân gây bệnh đường tiêu hóa khác đã được xác định khơng phải là ngun nhân
gây ra bệnh trên. Sau đó căn bệnh này đã lây lan sang các nước châu Âu và được
gọi là bệnh “tiêu chảy thành dịch do virus” (Epidemic viral diarrhea - EVD).
Năm 1976 căn bệnh tiêu chảy giống TGE lại xuất hiện nhưng xảy ra trên tất cả
lợn ở mọi lứa tuổi, gồm cả lợn con đang trong giai đoạn bú sữa mẹ (Wood,
1977), khả năng nguyên nhân gây bệnh là TGEV và các tác nhân gây bệnh
đường tiêu hóa khác cũng đã được loại trừ. Khi đó, tên EVD loại 2 được đưa ra
để phân biệt với EVD loại 1 là bệnh bùng phát năm 1971 với sự khác nhau đó là
lợn con đang bú mẹ chỉ mắc EDV loại 2 mà không mắc EDV loại 1.

4


Năm 1978, Coronavirus đã được chứng minh là nguyên nhân gây ra các đợt
bùng phát EVD loại 2 (Chasey and Cartwright, 1978). Kết quả gây bệnh nghiệm
thực cho lợn bằng một chủng virus phân lập được (CV777) cho thấy bệnh tích
đường tiêu hố biểu hiện điển hình trên cả lợn con và lợn vỗ béo. Như vậy,
Coronavirus này liên quan tới sự bùng phát EVD loại 1 và loại 2, từ đó tên bệnh đã
được đổi thành “tiêu chảy thành dịch trên lợn” (Porcine Epidemic Diarrhea, PED).
2.3. TÌNH HÌNH DỊCH PED TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
2.3.1. Tình hình dịch PED trên thế giới
Từ đầu những năm 2000 trở lại đây, những trận dịch bùng phát cấp tính hầu
như khơng xảy ra ở những vùng mà virus trước kia đã từng lan rộng. Hiện nay,
các ổ dịch PED ít được ghi nhận ở châu Âu và ngày càng có ít nghiên cứu về

bệnh này. Hơn nữa, bệnh thường được thấy nhất ở lợn choai, lợn trưởng thành và
lợn mới sinh sản, trong khi lợn con bú mẹ lại ít khi nhiễm bệnh.
Trong thập niên 70 và 80 của thế kỷ XX, dịch PED lưu hành rộng rãi ở
châu Âu, gây bệnh ở lợn mọi lứa tuổi. Trong khoảng thời gian từ cuối thập niên
80 đến thập niên 90, dịch có xu hướng giảm đáng kể, với rất ít ổ dịch rời rạc
được ghi nhận ở một số nước như Tây Ban Nha, Hungary, Anh và Cộng hòa
Séc (Carvajal et al., 2015). Trong năm 2005 - 2006, dịch PED xảy ra nghiêm
trọng ở Ý, với tỷ lệ chết ở lợn con theo mẹ từ 8,3% đến 11,9% (Martelli et al.,
2008). Từ năm 2014 đến nay, PED được mô tả xuất hiện trở lại ở một số nước
như Đức (Hanke et al., 2015), Ý (Boniotti et al., 2016), Bỉ, Pháp (Grasland et
al., 2014)...
Hiện nay, PED ngày càng xuất hiện phổ biến ở các quốc gia châu Á, đặc
biệt PED ngày càng trở nên cấp tính và nghiêm trọng hơn (Song and Park, 2012).
Ở Trung Quốc, trường hợp nhiễm PEDV đầu tiên được phát hiện năm 1973, sau
hơn hai thập kỷ sử dụng vacxin vô hoạt nhũ dầu, sự xuất hiện trở lại của PEDV
tương đối ít. Tuy nhiên đến năm 2010, bệnh đã xuất hiện trở lại và bùng phát
ngày càng trầm trọng ở các tỉnh có sự phát triển ngành chăn nuôi lợn. Từ tháng 2
năm 2010 đến tháng 11 năm 2011, tỷ lệ lợn chết từ 90 tới 100% (tương ứng
50.000 con), chủ yếu là lợn dưới 7 ngày tuổi (Chen et al., 2012). Ở Nhật, dịch
PED xuất hiện lần đầu tiên năm 1993, gây chết 14.000 con, tỉ lệ chết từ 30 tới

5


100% lợn con, dịch PED năm 1996 gây chết 39.509 con. Ở Hàn Quốc, dịch PED
xuất hiện đầu tiên năm 1992, sau đó đến năm 2007-2008, dịch liên tiếp xuất hiện
ở các Quốc gia Ðông Nam Á như Thái Lan, Philippines và Việt Nam. Trong thời
gian cuối năm 2007-2008, tại Thái Lan, dịch phát hiện đầu tiên ở tỉnh
Nakornpathom trước khi nó lan rộng trong cả nước. Dịch lan rộng đã gây thiệt
hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn của Thái Lan. Phân tích cây phát sinh lồi, thấy

tất cả các PEDV phân lập được trong thời gian bùng phát dịch đều giống chủng ở
Trung Quốc JS - 2004 - 2.
2.3.2. Tình hình dịch PED ở Việt Nam
Năm 2008, virus PED đã được phát hiện trong một số đàn lợn bị tiêu chảy ở
Việt Nam. Trong năm 2008 - 2009, bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh miền
Đơng Nam bộ gây ảnh hưởng lớn đến ngành chăn nuôi lợn nước ta. Bệnh xảy ra
rất nhanh, trên toàn đàn lợn và gây chết gần như 100% lợn con theo mẹ. Tỷ lệ tử
vong giữa các tỉnh dao động từ 65 - 91%. Theo nhận định của các chuyên gia thì
nguyên nhân của tiêu chảy cấp có thể là do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn
(PED) hoặc do viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) gây ra. Năm 2010, dịch vẫn
tiếp tục xảy ra ở một số trại, thậm chí tái phát ở những trại đã từng xảy ra dịch
trong năm 2009. Theo thống kê của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt
Nam trong 5 tháng đầu năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED và tỉnh có
nhiều ca bệnh nhất là Đồng Nai với 15 ca bệnh. Các trại bị nhiễm bệnh này chủ
yếu tập trung ở miền Nam (Đồng Nai, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình
Phước, Củ Chi). Ở miền Bắc, theo báo cáo khơng chính thức các cơng ty, trang
trại tại Hải Dương, Thái Nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hưng Yên, Thái Bình,
Hà Nam, Nam Định, Hịa Bình,… dịch tiêu chảy do PEDV đã xảy ra nghiêm
trọng từ đầu năm 2010 và cho đến nay tình hình dịch bệnh tại các tỉnh phía Bắc
Việt Nam ngày càng trầm trọng hơn. Các nghiên cứu trước đó tại Viện Thú y
Quốc gia, Trung tâm chẩn đốn Thú y TW, Phịng thí nghiệm trọng điểm CNSH
Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã xác định được các ca nhiễm PED
trên lợn ở phía Bắc Việt Nam.
Ở Việt Nam, hiện tại có rất ít nghiên cứu tiến hành về bệnh PED. Bệnh
được phát hiện từ năm 2008 (Do Tien Duy et al., 2011; Nguyễn Tất Toàn và cs.,

6


2012). Sau đó, bệnh ngày càng lan rộng và bùng phát ở nhiều khu vực. Bệnh gây

thiệt hại nặng nề cho các trang trại bởi tỉ lệ mắc toàn đàn rất cao (gần 100%).
Theo thống kê khơng chính thức của phịng xét nghiệm nhanh cơng ty C.P Việt
Nam trong năm tháng đầu năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED. Các trại bị
nhiễm bệnh này chủ yếu tập trung ở các tỉnh nam bộ như Đồng Nai, Lâm Đồng,
Bình Phước, Bà Rịa - Vũng Tàu.
Cũng tại các tỉnh phía Nam, một số nghiên cứu xác định các yếu tố liên
quan lây truyền dịch bệnh cũng như đặc điểm về triệu chứng và bệnh tích của
dịch tiêu chảy cấp xảy ra ở các trại heo khu vực phía nam để góp phần định
hướng trong việc chẩn đốn bệnh PED và xây dựng biện pháp hạn chế sự lây lan
bệnh này ở các trại heo tại Việt Nam (Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy, 2012).
Qua khảo sát các ổ dịch tiêu chảy cấp, tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết xuất hiện trên heo
con theo mẹ là rất cao (tương ứng 93,94% và 81,67%). Hai tỷ lệ này giảm dần
theo lứa tuổi. Các yếu tố liên quan đến việc lan truyền dịch bệnh giữa các trại
phụ thuộc vào: khoảng cách đến với trại heo bị bệnh (trại càng gần có nguy cơ
lây bệnh càng cao), vệ sinh sát trùng (thực hiện trên 2 tuần, một lần có tỷ lệ
nhiễm bệnh cao hơn so với 1 tuần, một lần), quy mơ chăn ni (tỷ lệ nhiễm bệnh
cao ở trại có quy mô chăn nuôi nhỏ, dưới 50 heo nái), và nguồn nước sử dụng (tỷ
lệ nhiễm bệnh cao ở trại có nguồn nước chưa qua xử lý). Triệu chứng lâm sàng
đặc trưng của dịch tiêu chảy cấp trên heo con là tiêu chảy phân lỏng (100%), ói
mửa (90,33%), sau đó suy nhược, mất nước và chết nhanh. Các bệnh tích thường
gặp ở cơ quan tiêu hóa của heo con là dạ dày căng phồng, chứa sữa đông, thức ăn
không tiêu hóa (94,42%) và thành ruột non mỏng, phồng to, chứa nhiều nước và
dịch chất bên trong (86,33%). Bệnh tích vi thể cũng xảy ra trên cả dạ dày và 3
đoạn của ruột non với sự hư hại nặng phần niêm mạc và các tuyến. Các kết quả
này góp phần định hướng trong việc chẩn đoán bệnh PED và xây dựng biện pháp
hạn chế sự lây lan bệnh này ở các trại heo tại Việt Nam.
Ở khu vực phía Bắc, các nghiên cứu đã xác định được bệnh tiêu chảy thành
dịch trên lợn (Porcine epidemic diarrhea: PED) xảy ra tại 26 trại ở 6 tỉnh, trong
đó một số trại cộng nhiễm cả TGEV và Rotavirus. Tại các trại, PED thường bùng
phát vào mùa lạnh (từ tháng 11 đến tháng 4), thời gian lây lan nhanh, thường xảy

ra đầu tiên trên đàn lợn nái, tỷ lệ lợn biểu hiện tiêu chảy cao (trung bình 76,8%).

7


Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều bị tiêu chảy (có thể lên tới 100%), tỷ lệ chết cao ở
lợn con theo mẹ (68,6%). Có sự khác biệt lớn về mức độ cảm nhiễm, tỷ lệ biểu
hiện tiêu chảy, tỷ lệ chết, thời gian tiêu chảy giữa các trại và giữa các nhóm tuổi,
giới tính. Triệu chứng chủ yếu ở lợn mắc PED là tiêu chảy, nôn mửa, bỏ ăn, kèm
theo các rối loạn về hô hấp, thần kinh, mức độ trầm trọng tăng dần theo tuổi.
Bệnh tích đại thể ở lợn con thường gặp là thành ruột non mỏng, căng phồng toàn
bộ hoặc từng đoạn (61,3 - 94%); dạ dày sung huyết, xuất huyết (19,4 - 84%);
hạch lympho màng treo ruột, gan sung huyết, ứ huyết; tĩnh mạch màng treo ruột
sung huyết nặng, khó quan sát thấy mạch bạch huyết ở màng treo ruột. Bệnh tích
vi thể chủ yếu đường tiêu hóa: lơng nhung đứt nát, ngắn lại; tế bào biểu mơ hấp
thu thối hóa khơng bào; biểu mơ phủ dạ dày, ruột bong tróc; sung huyết, xuất
huyết, thâm nhiễm tế bào viêm ở lớp đệm và lớp hạ niêm mạc đường tiêu hóa
(Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014).
Việc ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán bệnh tiêu chảy do virus
PED ở lợn con theo mẹ dưới 10 ngày tuổi, cho thấy: Các lợn con bị mắc PED
thường có biểu hiện sốt, chán ăn, bỏ ăn, tiêu chảy phân nhiều nước, màu vàng
xám, có sữa khơng tiêu, lợn gầy yếu, ủ rũ, mệt mỏi. Dạ dày căng phồng chứa
thức ăn không tiêu, ruột non căng phồng, thành ruột bị bào mỏng, chứa dịch màu
vàng, hạch màng treo ruột sưng to. Kết quả phản ứng RT-PCR đã chỉ ra rằng các
lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, bệnh tích như trên đều mắc PED (Nguyễn
Văn Điệp và cs., 2014).
Bệnh tiêu chảy do virus PED gây ra có tính lây lan nhanh tuy nhiên chưa có
loại vacxin nào phịng bệnh thì nguy cơ tái phát, nguy cơ biến chủng của virus
cũng là vấn đề rất đáng lo ngại. Trước tình hình đó, việc hiểu biết về đặc điểm
căn bệnh và chẩn đoán nhanh là hết sức cấp thiết trong phịng chống dịch bệnh,

bảo vệ sức khỏe vật ni và kinh tế cho người chăn nuôi.
2.4. CĂN BỆNH
2.4.1. Phân loại và hình thái của PEDV
Dựa trên đặc điểm kháng nguyên và di truyền, virus PED (PEDV) được xếp
vào chi Coronavirus, họ Coronaviridae, cùng với TGEV, coronavirus ở mèo, chó
và coronavirus 229E ở người (Gonzalez et al., 2003). Hạt PEDV mang những

8


điểm đặc trưng của họ Coronaviridae. Theo phân loại về huyết thanh học, người
ta xác định vius PED hiện mới chỉ có 1 serotype. Các chủng PEDV phân lập từ
châu Âu, Hàn Quốc và Trung Quốc đều tương đồng về mặt huyết thanh với
chủng CV777 phân lập từ thực địa ở Bỉ năm 1978 (Kweon et al., 1993).
Hình thái của PEDV trong tế bào biểu mơ đường tiêu hố tương tự như các
coronavirus khác (Ducatelle et al., 1982). Virus có một nhân đậm đặc điện tử với
quầng sáng ở giữa và những phần toả ra từ nhân dạng chuỳ dài xấp xỉ 20nm. Hạt
virus xác định từ mẫu phân có hình thái đa dạng và đường kính từ 90 - 190nm
(minh họa tại hình 2.1) (Debouck et al., 1981). Virus nhân lên thông qua việc nẩy
chồi từ các màng bên trong bào tương tế bào vật chủ.

Hạt virus được nhuộm với urany acetat 2%, chiều dài thanh nằm ngang tương đương 100nm.

Hình 2.1. Hạt virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc
Nguồn: Kweon et al. (1993)

2.4.2. Cấu trúc phân tử của virus gây bệnh
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, PEDV là một virus có vỏ ngồi, vật chất di
truyền là RNA dạng sợi dương có kích thước khoảng 28 kb (hình 2.2). Hệ gen
bao gồm ít nhất bảy khung đọc mở mã hoá cho 4 loại protein cấu trúc [gai (S), vỏ

(E), màng (M) và nucleocapsid (N)] và 3 loại protein không cấu trúc (replicase
1a, 1b và ORF3), với thứ tự trên hệ gen 5’-replicase (1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3’

9