Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng trichoderma SP phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Lịch

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ENZYME
CHITINASE THƠ TỪ CHỦNG TRICHODERMA
SP. PHỊNG TRỪ VI NẤM GÂY HẠI TRÊN
CÂY CÀ CHUA

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Lịch

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ENZYME
CHITINASE THƠ TỪ CHỦNG TRICHODERMA
SP. PHỊNG TRỪ VI NẤM GÂY HẠI TRÊN
CÂY CÀ CHUA

Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. TRẦN THANH THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh – 2013


LỜI CÁM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy, người đã trực tiếp hướng
dẫn, tận tình chỉ dẫn tơi trong suốt q trình xây dựng đề cương và hồn thành luận văn. Cơ đã giúp
đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đề tài này.
Xin chân thành cám ơn PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu, TS. Võ Thị Hạnh, TS. Nguyễn
Hữu Phúc đã hết lịng giúp đỡ tơi trong q trình học tập và nghiên cứu.
Xin gởi lời cám ơn đến Ths. Trần Thị Minh Định, bạn Nguyễn Thái Bình, bạn Nguyễn
Thiện Phú, cùng tồn thể các thầy cơ khoa Sinh, phịng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, phịng thí
nghiệm Di truyền – Thực vật Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp
đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gởi lời cám ơn đến các thầy cô, bạn bè, và những người thân trong gia
đình đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn.

1


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học của chính tơi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được cơng bố trong bất kì cơng trình
nào khác.

Tác giả luận văn

Phạm Thị Lịch

2


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN .............................................................................................................. 1
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 2
MỤC LỤC .................................................................................................................... 3
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... 6
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 7
1. Lí do chọn đề tài..............................................................................................................7
2. Mục tiêu ...........................................................................................................................8
3. Nhiệm vụ ..........................................................................................................................8
4. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................................8
5. Ý nghĩa của đề tài ...........................................................................................................8
6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................................9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 10
1.1. Nấm Trichoderma spp. ..............................................................................................10
1.1.1. Vị trí phân loại ......................................................................................................10
1.1.2. Đặc điểm sinh học.................................................................................................10
1.1.3. Cấu trúc của Trichoderma spp. .............................................................................11
1.1.4. Các cơ chế đối kháng của Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng..................12
1.1.5. Vai trò - tiềm năng ứng dụng của Trichoderma spp. ............................................14
1.2. Chitin và hệ enzyme chitinase ..................................................................................16
1.2.1. Chitin.....................................................................................................................16
1.2.2. Định nghĩa - Phân loại enzyme chitinase .............................................................17
1.2.3. Đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase .............................................................18
1.2.4. Nguồn thu nhận enzyme chitinase từ vi nấm........................................................19
1.2.5. Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận enzyme chitinase ..................................20
1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma spp. ..........21

1.2.7. Tình hình nghiên cứu và sử dụng chế phẩm enzyme chitinase ............................23
1.3. Vi nấm gây hại trên cà chua .....................................................................................27
1.3.1. Đặc điểm sinh thái cây cà chua .............................................................................27
1.3.2. Các tác nhân vi nấm gây hại chủ yếu trên cây cà chua (giai đoạn cây con) .........28
1.3.3. Biện pháp phòng trừ vi nấm trên cây cà chua.......................................................29

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 32
2.1. Vật liệu ........................................................................................................................32
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................................32
3


2.1.2. Hóa chất - Nguyên liệu .........................................................................................32
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ...............................................................................................32
2.1.4. Các MT nghiên cứu đã sử dụng ............................................................................33
2.2. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................................34
2.2.1. Xác định họat tính sinh enzyme ngoại bào của NS bằng phương pháp khuếch tán
trên MT thạch ..................................................................................................................34
2.2.2. Phương pháp bảo quản mẫu bằng dầu khống .....................................................35
2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái NS ......................................................................35
2.2.4. Xác định hàm lượng glucosamine theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS
.........................................................................................................................................36
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase .................................................37
2.2.6. Phương pháp nuôi cấy NS thu nhận chitinase trên MT bán rắn ...........................38
2.2.7. Phương pháp tách chiết dịch và thu nhận chế phẩm enzyme thô từ MT nuôi cấy
.........................................................................................................................................39
2.2.8. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt độ enzyme chitinase
của CPE ...........................................................................................................................39
2.2.9. Phương pháp thẩm tích CPE bằng màng cellophane ............................................40
2.2.10. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và hoạt độ

chitinase của NS ..............................................................................................................40
2.2.11. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến các đặc tính lí hóa của CPE
chitinase ..........................................................................................................................41
2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối vi nấm gây bệnh bởi
CPE chitinase và các tác nhân kháng nấm khác .............................................................42
2.2.13. Phương pháp khảo sát khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh
cây trồng bởi CPE và các tác nhân kháng nấm khác ......................................................43
2.2.14. Gây nhiễm nấm bệnh vào cây cà chua bằng phương pháp nhân tạo [6] ............44
2.2.15. Xác định mật độ BT bằng phương pháp đếm KL [19] .......................................45
2.2.16. Xác định mật độ BT bằng phương pháp đo mật độ quang [14] .........................45
2.2.17. Phương pháp xử lí CPE chitinase từ Trichoderma sp. phịng vi nấm gây hại trên
cây cà chua ......................................................................................................................46
2.2.18. Phương pháp xử lí số liệu thống kê ....................................................................47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 48
3.1. Kết quả tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt độ chitinase cao ........................48
3.2. Ảnh hưởng của MT và các điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ chitinase của chủng
Trichoderma BL2 ..............................................................................................................49
3.2.1. Ảnh hưởng của MT lên men bán rắn ....................................................................49
3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng ...............................................................51
4


3.2.3. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất cảm ứng ...................................................................53
3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ MT nuôi cấy ..................................................................54
3.2.5 Ảnh hưởng pH ban đầu của MT nuôi cấy..............................................................55
3.2.6. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của MT nuôi cấy .......................................................56
3.2.7. Động thái quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng Trichoderma BL2 ..........58
3.3. Chiết tách dịch enzyme và thu nhận CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma
BL2 .....................................................................................................................................59

3.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân tủa đến hoạt tính của CPE ...........59
3.3.2 Quy trình thu nhận CPE chitinase thơ từ chủng Trichoderma BL2 ......................60
3.4. Ảnh hưởng của các yếu tố lí hóa đến hoạt độ enzyme chitinase của CPE ...........62
3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng ........................................................................62
3.4.2. Ảnh hưởng của pH phản ứng ................................................................................63
3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ......................................................................64
3.4.4. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến hoạt độ chitinase của CPE ..65
3.5. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của CPE chitinase thơ từ chủng
Trichoderma BL2 phịng trừ vi nấm gây bệnh cây trồng ..............................................67
3.5.1. Khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối vi nấm gây bệnh ........................................67
3.5.2. Khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh ..................................69
3.6. Kết quả việc sử dụng của CPE chitinase từ Trichoderma BL2 và các tác nhân
kháng nấm khác trong phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua ...........................74
3.6.1. Ở các lô gây nhiễm Phytophthora sp ....................................................................74
3.6.2. Ở các lô gây nhiễm Fusarium sp ..........................................................................76

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 81
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 82
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 88

5


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BT

Bào tử

CPE

Chế phẩm enzyme

CPSH

Chế phẩm sinh học

DNS

3,5-dinitrobenzoic acid

HLĐK

Hiệu lực đối kháng

KL

Khuẩn lạc

MT

Môi trường

Nxb

Nhà xuất bản

NS

Nấm sợi

OD

Hiệu số giữa mật độ quang của mẫu thử thật và thử khơng

TB

Trung bình

TLB

Tỉ lệ bệnh

TN

Thí nghiệm

UI

Imeasurre Unit (Đơn vị hoạt độ enzyme)

VSV

Vi sinh vật

6


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Khí hậu nước ta có nhiều thuận lợi để phát triển sản xuất nơng nghiệp, song cũng tạo

điều kiện tốt để các sinh vật gây hại sinh trưởng, phát triển và phá hại nghiêm trọng mùa
màng. Trong đó, bệnh hại cây trồng do vi nấm trong đất là một vấn đề mà người nông dân
cịn gặp nhiều khó khăn trong việc quản lý và phịng trừ.
Vi nấm đất gây bệnh có thể tồn tại trong đất trong thời gian rất dài kể cả trong điều
kiện khơng có cây ký chủ. Chúng bảo tồn bằng các sợi nấm, hạch nấm, hậu bào tử, bào tử
trứng và những bào tử có vách dày ở trong đất và trên tàn dư cây trồng. Nấm xâm nhiễm,
gây hại cây trồng làm cho rễ và các tế bào mạch dẫn của cây khơng cịn khả năng hút nước
và chất dinh dưỡng từ giá thể. Vì vậy mà các triệu chứng của các bệnh do vi nấm trong đất
gây ra thường rất giống nhau, đều héo vàng, còi cọc và chết cây, làm giảm năng suất thu
hoạch. Riêng đối với cà chua, theo thống kê của ngành Bảo vệ Thực vật Lâm Đồng (năm
2012), tại 2 huyện Đơn Dương và Đức Trọng:
Bệnh xoăn lá nhiễm trên diện tích gần 600 ha, tỷ lệ hại 2,9 - 20%.
Mốc sương: bệnh nhiễm trên 1.236,6 ha tại Đơn Dương, Đức Trọng, tỷ lệ hại 8,4 30%, tăng 271,1 ha so với kỳ trước.
Đốm lá vi khuẩn: bệnh nhiễm tại Đơn Dương 1.620 ha, tỷ lệ hại 16,7 - 30%, tăng 120
ha so với kỳ trước.
Để phòng trừ vi nấm gây hại trên cây trồng có rất nhiều biện pháp như cơ giới, canh
tác, hóa học và biện pháp sinh học. Trong đó, biện pháp sinh học được xem là mang lại hiệu
quả, thân thiện, an tồn với mơi trường. Biện pháp sinh học tạo mơi trường thuận lợi cho
các loại sinh vật có ích (kẻ thù tự nhiên của dịch hại) phát triển nhằm góp phần tiêu diệt
dịch hại, bảo vệ thiên địch tránh khỏi độc hại do dùng thuốc hoá học, tạo nơi cư trú cho
thiên địch sau vụ gieo trồng bằng cách trồng xen, làm bờ rạ cho thiên địch ẩn nấp.... Sử
dụng chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật có tác dụng trừ dịch hại, khơng độc hại với các loại
sinh vật có ích, an tồn với sức khỏe con người và mơi trường.
Trong số các nhóm vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm phòng trừ bệnh hại trên
cây trồng thì Trichoderma là lồi nấm đối kháng đang được quan tâm nhiều hiện nay trong
lĩnh vực sản xuất nơng nghiệp. Do Trichoderma có khả năng tiêu diệt vi nấm gây hại cây
trồng bằng nhiều cơ chế như kí sinh, sinh kháng sinh, tiết các enzyme ngoại bào,… Hệ
7

enzyme ngoại bào của Trichoderma đóng vai trị rất quan trọng trong đấu tranh sinh học,
đặc biệt là enzyme chitinase.
Chitinase của Trichoderma sẽ phân hủy vách tế bào chủ của các lồi nấm gây hại, vì
chitin là một trong những thành phần cấu tạo chính của vách tế bào vi nấm gây bệnh trên
cây trồng.
Từ những lí do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu tạo
chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng Trichoderma sp. để phòng trừ vi nấm gây hại trên
cây cà chua”

2. Mục tiêu
Tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng nấm mốc Trichoderma sp. có khả năng
phịng trừ vi nấm gây hại trên cà chua.

3. Nhiệm vụ
Tuyển chọn chủng Trichoderma sp. có khả năng sinh enzyme chitinase cao trong các
chủng Trichoderma khảo sát.
Nghiên cứu điều kiện môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho việc sinh tổng
hợp chitinase của chủng tuyển chọn.
Thu nhận enzyme chitinase và tạo chế phẩm enzyme.
Nghiên cứu các đặc điểm lí hóa của chế phẩm enzyme chitinase.
Thử nghiệm khả năng phòng – diệt nấm bệnh trên cây cà chua của chế phẩm trong
điều kiện in vivo.

4. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng nấm Trichoderma nhận từ Viện Sinh học Nhiệt đới và phịng thí nghiệm
Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp. HCM.
Chủng Fusarium sp. nhận từ Bộ môn Bảo vệ thực vật – Khoa Nông học Đại học
Nông Lâm.
Chủng Phytophthora sp. nhận từ Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp miền Nam.

5. Ý nghĩa của đề tài
 Ý nghĩa khoa học
Góp phần tìm hiểu về khả năng phòng trừ nấm bệnh gây hại cà chua của chế phẩm
enzyme chitinase từ Trichoderma sp.
8


 Ý nghĩa thực tiễn
Dựa vào kết quả thu được và chế phẩm tạo ra trong đề tài có thể ứng dụng làm chế
phẩm sinh học để phòng trừ vi nấm gây bệnh trên cây cà chua.

6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: 12/2012 – 8/2013
Địa điểm: phòng Vi sinh – Sinh hóa Trường Đại học Sư phạm TP. HCM

9


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nấm Trichoderma spp.
1.1.1. Vị trí phân loại
Trichoderma được xem là nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong phân loại vì các
đặc điểm cần thiết cho việc phân loại chưa được phân tích đầy đủ.
Trước đây, người ta cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales,
họ Moniliaceae [64].
Hiện nay, dựa vào việc phân tích trình tự một số gen đặc trưng như ITS, tef, rpb,
ech24, Druzhinina và cộng sự (2006) đã phân loại Trichoderma như sau [30]:
Giới

Fungi

Ngành

Ascomycota

Lớp

Euascomycetes

Bộ

Hypocreales

Họ

Hypocreaceae

Chi

Trichoderma

1.1.2. Đặc điểm sinh học
Trichoderma spp. được tìm thấy nhiều trong MT tự nhiên, đặc biệt trong MT đất.
Chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các lồi nấm khác).
Trichoderma spp. là nhóm vi nấm phổ biến ở đất (pH = 3 – 8) như đất nông nghiệp, đồng
cỏ, rừng, đầm muối và đất sa mạc…[33], [63].
Phần lớn Trichoderma spp. ưa độ ẩm, riêng T. hamatum và T. pseudokoningii có thể
chịu độ ẩm cao hơn so với những loài khác. Tuy nhiên, các loài Trichoderma spp. thường
khơng chịu được độ ẩm thấp vì thế số lượng Trichoderma giảm đáng kể trong nơi có độ ẩm
thấp [60].

Đa số các chủng Trichoderma phát triển trong đất có độ pH từ 2.9 đến 9.5; pH tối
thích là từ 4.6 đến 6.5. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 30oC. Một vài dòng phát triển tốt ở
35oC, một số ít phát triển ở 40oC [64].
KL nấm có màu trắng hoặc từ trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các
chủng Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh, KL có thể đạt đường kính từ 4 – 9 cm sau 4
ngày nuôi cấy ở 25oC.

10


Hình thái KL và BT của Trichoderma khác nhau khi ở những điều kiện nhiệt độ
khác nhau. Ở 35oC chúng tạo ra những KL rắn, dị thường với sự hình thành BT nhỏ và mép
KL bất thường, ở 37oC không tạo ra BT sau 7 ngày nuôi cấy. Hầu hết các lồi Trichoderma
khơng có giai đoạn sinh sản hữu tính, chúng sinh sản vơ tính bằng BT đính từ khuẩn ty.
Khuẩn ty của Trichoderma không màu, cuống sinh BT phân nhánh nhiều. Ở cuối nhánh
phát triển thành một khối tròn mang các BT trần khơng có vách ngăn, thường khơng màu.
BT có dạng hình cầu, hình trứng hoặc hình trụ ngắn. Sợi nấm có đường kính từ 0,5 – 10 µm,
được bao bọc bởi thành tế bào. Thành tế bào không chứa cellulose như thực vật mà chứa
chitin và một số thành phần khác như polysaccharide, lipit, protein, hexozamin, chất màu.
Màng tế bào chất dày khoảng 7 µm chứa lipit (40%) và protein (38%) [62].
Trichoderma spp. có thể sinh tổng hợp được nhiều loại enzyme ngoại bào như
chitinase, glucanase, xylanase, pectinase, cellulase…để phân hủy các nguồn xác bã hữu cơ
thực vật và vách tế bào nấm bệnh [13].
1.1.3. Cấu trúc của Trichoderma spp.
Bề mặt tế bào của hầu hết các loại nấm bao gồm 3 lớp: màng nhày, vách tế bào,
màng tế bào. Cấu trúc vách tế bào của Trichoderma thuộc dạng chitin-β-glucan. Tuy nhiên,
chitin hiện diện ở hệ sợi nấm lại khơng có ở BT của T. viride. Vách tế bào của một vài
chủng Trichoderma đã được phát hiện chứa galactose và N-acetyl-β -D-galactosimin lectin
[43], [66].
Trichoderma spp. có nhân điển hình, được bao quanh bởi một màng đơi. BT đính

thường chứa nhiều hơn 1 nhân. Trichoderma spp. có số lượng nhân khác nhau, một số đơn
nhân, một số đa nhân. T. reesei hình thành nhân nhỏ sau khi xử lý colchicin do sự phân chia
nhân bất bình thường. Hàm lượng DNA trung bình của những nhân nhỏ này bằng khoảng
30% của nhân bình thường, gọi là đa bội lệch. Những nhân này có thể hữu ích cho việc vận
chuyển những lượng DNA nhỏ vào trong thể nguyên sinh [43], [66].
Nghiên cứu gần đây cho thấy trong tế bào của chúng có tất cả các bào quan của một
eukaryote. Cấu trúc của 1 số bào quan (như thể golgi) thì khác biệt so với eukaryote nhưng
vẫn chưa biết rõ những đặc tính về sinh hóa có khác nhau hay khơng. Một vài loài
Trichoderma spp. chứa một lượng lưới nội chất khá lớn và nhiều nhất là ở chủng T. reesei
[43], [66].

11


1.1.4. Các cơ chế đối kháng của Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng
Nấm đối kháng là những nhóm VSV phổ biến của hệ vi sinh trong đất. Chúng
thường tiết ra các men, kháng sinh gây độc cho nấm gây bệnh hoặc cạnh tranh điều kiện
sống với nấm gây bệnh.
Nấm đối kháng có thể kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của nấm gây bệnh trên cây
và giúp cây hồi phục, sinh trưởng phát triển.
Trichoderma cũng là một trong những giống nấm có khả năng ức chế một số nấm
gây bệnh như: Sclerotium rolfsii, Phytophthora, Fusarium, Pythium, Rhizoctonia… gây
bệnh trên nhiều lồi cây trồng.
Sự đối kháng của nấm Trichoderma thơng qua nhiều cơ chế
 Cơ chế kí sinh
Vào năm 1932, Weinding đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây
bệnh và đặt tên cho hiện tượng đó là “Giao thoa sợi nấm” [68].
Hiện tượng giao thoa gồm ba giai đoạn như sau:
Giai đoạn 1: Sợi nấm Trichoderma hướng về sợi nấm gây bệnh (nấm kí chủ). Hiện
tượng này là đặc tính hướng hóa của Trichoderma spp., chúng sẽ hướng về nơi có chất hóa

học do nấm chủ tiết ra. Khi tơ nấm Trichoderma đến gần tơ nấm kí chủ, chúng có xu hướng
tiếp xúc và cuộn xung quanh sợi nấm chủ, sau đó hình thành cấu trúc móc hoặc ép sát sợi
nấm kí chủ và phát triển song song với nấm kí chủ [68].
Giai đoạn 2: Sau khi vây quanh, sợi nấm Trichoderma sẽ thủy phân vách nấm kí chủ
bằng cách tiết ra các enzyme ngoại bào như: chitinase, glucanase, cellulase [68].
Giai đoạn 3: Cuối cùng sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng màng sinh chất
của tế bào nấm kí chủ, làm cho chất nguyên sinh trong nấm kí chủ bị phân hủy và dẫn đến
nấm bệnh bị chết [68].
 Cơ chế cạnh tranh
Một cơ chế khá phổ biến đã được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây là sự
cạnh tranh của nấm đối kháng với nấm bệnh tại vùng rễ. Trichoderma spp. có thể biểu hiện
tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nguồn gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú.
Nấm Trichoderma thường định cư trước so với các nguồn gây bệnh cây. Do đó, chúng
chiếm chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nguồn gây bệnh [27].
 Cơ chế tiết kháng sinh

12


Một số chất như trichozianine, trichothecene, trichotoxin A, viridin, ergokonin A…
là kháng sinh có hoạt tính kháng nấm được phát hiện nhiều ở loài T. harzianum, T.
polysporum, T. viride, T. longibrachiatum [27].
 Cơ chế tiết enzyme
Cơ chế quan trọng giúp Trichoderma đối kháng hiệu quả với nấm gây bệnh cây trồng
là nhờ vào khả năng tiết ra nhiều loại enzyme.
Các loại enzyme do Trichoderma tiết ra gồm có: Endochitinase, glucanase 1,3-βglucosidase, chitobiosidase, trypsin, chymotrypsin, cellulase, protease, N-acetyl- β glucusaminidase (NAGase)...[46].
Cơ chế tác dụng của hệ enzyme chitinase Trichoderma phổ biến hiện nay là dựa vào
vị trí thủy phân, gồm 3 nhóm:
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer tạo
thành sản phẩm là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng

chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính của endochitinase không thể
phân cắt thêm được nữa [46].
Chitin 1,4-β-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer [(GlcNAc)n, n>3] từ đầu
không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2 [46].
β-N-acetyl hexosaminidase (exochitinase) phân cắt các chitooligomer hay chitin một
cách liên tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl-glucosamine
(GlcNAc) [46].
Ngồi ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide
làm cơ chất. Các oligsaccharide thường được thủy phân bên trong, trên một vài vị trí xác
định hoặc một cách ngẫu nhiên. Một số enzyme chitinase có khả năng thủy phân
trisaccharid, một số khác thì khơng. Có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một
phân cắt bên trong tạo disaccharid và trisaccharid; một phân cắt bên ngoài tạo các
monosaccharid và tetrasaccharid. Tóm lại chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên [50],
[54].
Endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ
chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên
chitin thô thu từ vỏ tôm. Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp
cho endochitinase hơn là chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase. Chitooligomer
(GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng β-N13


acetyl hexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù
chitin. (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của β-N-acetyl hexosaminidase nhưng không là cơ chất
của endochitinase hay chitobiosidase. Chính vì thế, có thể sử dụng (GlcNAc)2 để phân biệt
hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetyl hexosaminidase. Sản phẩm sau
cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine [54].
Như vậy, nhờ sự kết hợp của cơ chế tiết các enzyme ngoại bào và các cơ chế đối
kháng khác mà Trichoderma spp. đã thể hiện khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh một
cách tối ưu, hiệu quả.
1.1.5. Vai trò - tiềm năng ứng dụng của Trichoderma spp.

 Kích thích cơ chế tự bảo vệ của thực vật
Trong trường hợp này, Trichoderma spp. đóng vai trị là những nhân tố mẫn cảm với
rễ, kích thích hệ thống miễn dịch chủ động và bị động ở thực vật. Khả năng đề kháng của
thực vật tăng khi tăng: nồng độ của chất chuyển hoá; các enzyme liên quan đến cơ chế tự
bảo vệ (phenylalanine ammonio-lyase, chalcone synthase); các enzyme liên quan tới sự tổng
hợp phytoalexin, chitinase và glucanase. Sự có mặt các chất trao đổi của Trichoderma kích
thích sự tổng hợp phytoalexin ở thực vật. Đây là những protein liên quan đến sự kháng bệnh
của cây. Nhờ đó, hệ thống gen thực vật có thể chủ động phản ứng lại các tác nhân gây bệnh
và các nhân tố kích thích khác.Cơ chế tự bảo vệ thực vật có thể hoạt động mà khơng nhất
thiết địi hỏi sự kích thích của các sinh vật sống [41].
Ví dụ, lúa mạch có sức đề kháng với sự nhiễm Fusarium tăng lên khi có mặt của
endochitinase từ T. atroviride. Thuốc lá và khoai tây mang gen mã hóa chitinase từ T.
harzianum có sức chịu đựng cao hơn với điều kiện bất lợi của MT và hoàn toàn kháng lại
nấm bệnh Alternaria alternate, Alternaria solani, Botrytis cinerea trên lá và với nấm bệnh
từ đất như Rhizoctonia solani. Những kết quả tương tự đã đạt được với enzyme chitinase
trong dâu tây; chitinase và β-1,6-glucanase trong dưa và cây cà chua. Sự kích hoạt các phản
ứng tự bảo vệ thực vật sử dụng các nhân tố kích thích có thể là một chiến lược có giá trị như
một thay thế cho việc sử dụng các thực vật biến đổi gen, để bảo vệ thực vật chống lại tác
nhân gây bệnh [8].

 Kích thích sự tăng trưởng của thực vật
Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh khi cây được xử lí và rễ bị xâm nhiễm bởi
những loài Trichoderma một cách thường xuyên sẽ làm tăng cường sự phát triển hệ rễ và
năng suất cây trồng, tăng sức đề kháng với những điều kiện vô sinh, tăng khả năng hấp thu
14


và sử dụng dinh dưỡng. Năng suất cây trồng trong các cánh đồng có thể tăng lên đến 30%
sau khi bổ sung T. hamatum hay T. koningii. Các thử nghiệm tiến hành trong điều kiện nhà
kính, đã cho thấy có sự tăng sản lượng đáng kể khi hạt giống cây được xử lí với các

BT Trichoderma trước khi gieo trồng [41].
Yedidi chỉ ra rằng sự thúc đẩy sinh trưởng hiệu quả khi có sự hiện diện
của Trichoderma spp. ở vùng rễ giúp rễ hấp thu được nhiều chất dinh dưỡng có sẵn trong
đất, ngay cả trong điều kiện MT đất hạn chế dinh dưỡng [69].
Ngồi khả năng kích thích cơ chế tự bảo vệ của thực vật và kích thích sự tăng trưởng
của thực vật, Trichodema spp. cịn có khả năng tái tạo lại quần thể, làm tăng BT trong đất để
kháng các vi nấm gây hại... Chính vì vậy mà hiện nay trên thị trường có nhiều dạng chế
phẩm nấm Trichoderma:
Chế phẩm dạng sợi nấm: là loại chế phẩm được sản xuất từ sinh khối của sợi nấm,
trong đó nấm chuyên tính được nhân sinh khối theo phương pháp lên men chìm hoặc lên
men xốp (lên men trong giá thể có bổ sung dinh dưỡng, lên men trên MT bán rắn). Sau khi
sinh khối hệ sợi nấm đạt cao nhất, thu hoạch hệ sợi rửa sạch và loại bớt nước bằng cách ly
tâm và phơi trong khơng khí để đạt độ ẩm 40%. Sản phẩm dạng này phải được bảo quản
trong điều kiện lạnh cho đến khi sử dụng. Ưu điểm của sản phẩm này là dễ làm, ít tốn kém
song khơng bảo quản được lâu, có nguy cơ bị tạp nhiễm cao và hiệu lực không ổn định [8].
Chế phẩm dạng BT: người ta nhân sinh khối nấm trong MT xốp đến khi BT nấm
hình thành và chín, thu hồi sinh khối nấm cùng giá thể sau đó phơi khô và nghiền mịn. Ưu
điểm của chế phẩm dạng này là có thể bảo quản được lâu, ít tạp nhiễm, có hiệu lực cao, ổn
định. Để tránh tạp nhiễm từ bên ngồi các thao tác ni, trồng, thu hoạch và chế biến phải
được tiến hành trong điều kiện vô trùng, người sản xuất phải có kinh nghiệm và trang thiết
bị đắt tiền [8].
Chế phẩm dạng lỏng: bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Nông Lâm TP.HCM đã
nghiên cứu sản xuất chế phẩm Trichoderma dạng lỏng dùng cho rau sạch và ứng dụng thử
nghiệm thành cơng ở Hóc Mơn, Củ Chi,... Chế phẩm Trichoderma sau khi nhân đạt mật độ
BT cao nhất có thể sử dụng ngay để trừ bệnh trên đồng ruộng, tuy nhiên sẽ tốn công vận
chuyển, khó bảo quản và nhanh bị thối [8].

15

1.2. Chitin và hệ enzyme chitinase
1.2.1. Chitin
 Khái niệm
Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một polymer sinh học được
tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật. Lượng chitin được sản xuất hàng năm trên thế giới
chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g/ 1 năm/1 m2 bề mặt trái đất. Trong
tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế bào
của nấm và một số tảo Chlorophiceae. Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu
trúc quan trọng trong lớp vỏ của một số động vật không xương sống như cơn trùng, nhuyễn
thể, giáp xác và giun trịn… Ở động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua ghẹ, mai
mực, hàm lượng chitin chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khơ. Vì vậy vỏ tơm,
cua ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng
[30], [53].
Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau. Mặc dù
chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chính của chitin là từ vỏ
cua và tôm. Trong công nghệ chế biến, do chitin tồn tại ở dạng phức hợp với một số chất
như: CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ… nên việc tách chiết cịn khó khăn vì phải đảm
bảo cả hai yếu tố cùng một lúc là vừa loại hết tạp chất đồng thời khơng làm biến đổi tính
chất của chitin [30], [53].
 Cấu trúc phân tử
Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc, người ta thấy
rằng chitin là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-β-D-glucosamine liên kết
với nhau bởi liên kết 1- 4 glucoside [53].
Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như : α, β và γ; sự khác nhau này thể hiện ở sự
sắp xếp các chuỗi. Các chuỗi α–chitin xếp xi, ngược xen kẽ nhau; nhưng có một cặp xếp
cùng chiều. Ở chuỗi β–chitin các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định. Chuỗi γ–chitin có
các cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc [53].
 Tính chất của chitin
Chitin ở thể rắn, có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các mạch.
Chitin không tan trong nước, trong dung dịch acid loãng, dung dịch kiềm loãng, trong cồn

và trong các dung mơi thơng thường. Nó chỉ tan được trong một số acid vô cơ đặc (HCl,
H2SO4, H3PO4…) [31].
16


1.2.2. Định nghĩa - Phân loại enzyme chitinase
1.2.2.1. Định nghĩa
Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin
thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1
và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin [50].
1.2.2.2. Phân loại

 Dựa vào phản ứng phân cắt
Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4- β-chitobiosidase, Nacetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase)
Endochitinase (EC 3.2.1.14): là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách
ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide [30], [54].
Chitin-1,4- β-chitobiosidase: là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính
là các dimer chitobiose [30], [54].
N-acetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase): là enzyme tiếp tục phân cắt chitin từ
một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine [30], [54].

 Dựa vào cấu trúc phân tử
Enzyme chitinase được xếp vào 3 họ Glycohydrolase
-

Enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18

Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn trịn,
được tìm thấy ở hầu hết các lồi thuộc eukaryote, prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ
yếu là enzyme chitinase, ngồi ra cịn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase

và N-acetyl glucosaminidase. Các enzyme chitinase này hoạt động thơng qua một cơ chế
kiểm sốt mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β-monomer. Các
chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas
hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serrati
marcescens…[50].
-

Enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19

Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra cịn có ở xạ khuẩn
Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với
một vịng xoắn. Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV [50].
-

Enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 20
17


Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-glucosamine acetyl hexosaminidase từ
vi khuẩn, Streptomyces và người [50].

 Dựa vào trình tự amino acid
Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận
biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm [61]:
Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với
tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycine hoặc proline ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận
biết). Vùng giàu cystein có vai trị quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin
nhưng khơng cần cho hoạt động xúc tác.
Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn
giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase

ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn.
Nhóm III: trình tự amino acid hồn tồn khác với chitinase nhóm I và II.
Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình
tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn
giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I.
Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin
(vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong q trình tiến hóa ở thực vật bậc cao.
1.2.3. Đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase

 Trọng lượng phân tử
Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử
khoảng 30 kDa (kilodalton). Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng
cư, thú), một số chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40 - 90 kDa hoặc cao hơn cả là
khoảng 120 kDa. Trọng lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn
có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa [38], [58].

 Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis
Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3 – 10 ở thực vật bậc
cao và tảo; pI từ 4,7 – 9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pI từ 3,5 – 8,8 ở VSV
[49].
Hằng số Michaelis : 0,010 – 0,011 (g/100ml) [49].

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

18


Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase ở VSV hoạt động là 400C, ngoại
trừ chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối
thích là 50OC [34]. Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các enzyme chitinase có thể

có những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau. Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III
và chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng cho thấy khả năng chịu
đựng nhiệt độ cao đến 800C. Bendt và cộng sự (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân chitin
mạnh nhất của chitinase từ Vibrio sp. từ 30 – 450C và chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus
sp. BG-11 hoạt tính cao nhất ở 40 – 600C [49].
Lorito (1998) đã khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng T. harzianum Rifai
nhận thấy enzyme này có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25 – 600C,
nhiệt độ tối ưu là 400C [54].

 Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH tối thích của hệ enzyme chitinase từ 4 – 9 đối với các enzyme chitinase ở
thực vật bậc cao và tảo; hệ enzyme chitinase ở động vật là 4.8 – 7.5 và ở VSV là 3.5 – 8.0.
pH tối thích của enzyme chitinase có thể phụ thuộc vào cơ chất được sử dụng. Đa số các
enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pH tối ưu khoảng 5.0 khi cơ chất là chitin. Các
nghiên cứu đã chứng tỏ rằng chitinase hoạt động được trong khoảng pH từ 4.0 – 8.5 [53].
Chitinase của vi nấm cho hoạt tính cao nhất ở pH = 5.0 trong khi ở vi khuẩn pH tối thích là
8.0 [48].

 Sự ổn định hoạt tính
Enzyme chitinase thơ hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh khoảng 2
năm. Chúng bị mất hoạt tính nhanh chóng ở 37oC trong trường hợp khơng có mặt của cơ
chất. Chu kì bán hủy ở 37oC là 40 ngày và ở 5oC là 230 ngày [49].
1.2.4. Nguồn thu nhận enzyme chitinase từ vi nấm
Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các sinh vật: thực vật, động vật, vi khuẩn, vi
nấm. Enzyme chitinase có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy nhiên trong
các MT nuôi cấy VSV, người ta đều cho thêm chitin – cơ chất của enzyme chitinase để làm
tăng khả năng tổng hợp enzyme chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính enzyme chitinase sau
q trình chiết tách [37], [41].
Ở vi nấm, chitinase chủ yếu được tổng hợp bởi các loại NS. Các chủng NS cho
enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia… Riêng đối với

Trichoderma spp. cơ chế cảm ứng hệ enzyme chitinase là chủ đề được nhiều nhà khoa học
19


quan tâm. Sự cảm ứng enzyme ngoại bào rất hiệu quả khi ni cấy Trichoderma trong MT
có chitin, vách tế bào nấm hoặc hệ sợi nấm [43].
Các enzyme khác nhau thì cơ chế cảm ứng khác nhau. Ví dụ: N-acetyl-glucosamine
chỉ cảm ứng đặc trưng cho việc tạo ra β-N-acetyl-hexosaminidase mà không cảm ứng tạo ra
endochitinase hoặc chitobiosidase ở Trichoderma. Trong q trình kí sinh của Trichoderma
trên những kí chủ khác nhau thì mức độ cảm ứng và thành phần các sản phẩm tạo thành
khác nhau, chủ yếu là 1,4-β-N-acetyl-glucosaminidase 102 kDa và 72 kDa và một vài
enzyme endochitinase của nhóm II. Inbar và Chet đã chứng minh sự tạo thành enzyme
chitinase của chủng T. harzianum kí sinh được bắt nguồn bởi việc tiết ra chất trung gian
tương tác với kí chủ là lectin. Hiện tượng này xảy ra khi có sự cảm ứng của chitooligomer.
Lectin là hệ thống nhận biết kì chủ của vi nấm kí sinh và có giá trị trong nghiên cứu pha
sớm của q trình kí sinh nấm. Sự hoạt động của hệ enzyme chitinase của Trichoderma bị
ảnh hưởng bởi các hoạt động của những hợp chất cảm ứng khác như các enzyme phá hủy
vách (protease, glucanase), các liên kết protein trong vách tế bào chất, permease và chất
kháng sinh [37], [41], [43].
Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm cũng đóng vai trị quan trọng về
mặt dinh dưỡng, nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển
và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào
nấm. Chitinase cịn giữ vai trị chính trong hoạt động kí sinh nấm nhằm đối kháng với các
loài nấm gây bệnh thực vật.
1.2.5. Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận enzyme chitinase
 Phương pháp ni cấy chìm – MT ni dạng lỏng.
NS được ni trong dung dịch chitin huyền phù có bổ sung nguồn nitơ vô cơ để tạo
điều kiện cho NS sinh trưởng và phát triển tốt, tổng hợp nhiều chitinase. Phương pháp này
địi hỏi phải có cánh khuấy hay máy lắc để đảo trộn MT cung cấp ôxy cho NS phát triển. Để
thu nhận enzyme, dịch enzyme được cô đặc ở nhiệt độ thấp [16].

 Phương pháp này có ưu điểm:
- NS được cấy và phân tán khắp mọi điểm trong MT, nên bề mặt xung quanh NS dễ
tiếp xúc với dịch dinh dưỡng.
- Các thiết bị lên men dễ cơ khí hóa và tự động hóa.
 Tuy nhiên, phương pháp ni cấy chìm cũng có một số nhược điểm sau:
- Đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vô trùng tuyệt đối.
20


- Trong q trình ni cấy phải thổi khí và khuấy liên tục.
- Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ.
- Cần chọn thành phần MT với tỉ lệ dinh dưỡng thích hợp và chú ý tới chất cảm ứng
để NS sinh enzyme ở mức tối đa.
 Phương pháp nuôi cấy bề mặt – MT bán rắn
Là phương pháp tạo điều kiện cho NS phát triển trên bề mặt MT. Nguyên liệu chính
thường là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ, hoặc tấm gạo,… được bổ sung trấu để
làm tăng độ thống khí. MT được bổ sung chitin và một số chất dinh dưỡng khác, rồi tiến
hành trộn đều với nước sao cho độ ẩm khoảng 55 – 60%. Hấp thanh trùng ở 1 – 1,5 atm /45
– 60 phút, để nguội rồi cho BT nấm vào. MT đã cấy giống được trải lên các khay sạch với
chiều dày từ 2 – 5 cm và nuôi ở các điều kiện thích hợp. Sau khoảng thời gian ni cấy,
người ta thu nhận MT đem sấy nhẹ ở 400C để đạt độ ẩm 8 – 12%, nghiền nhỏ. Hoặc thu
dịch chiết enzyme, li tâm loại bỏ BT, sợi nấm và các tạp chất; sau đó lắng tủa bằng tác nhân
tủa phù hợp; sấy khơ, xay mịn. Đây chính là chế phẩm enzyme dạng thơ [16].
 Phương pháp này có nhược điểm là:
- Tốn diện tích mặt bằng.
- Khó cơ khí hóa và đặc biệt là khó tự động hóa được tồn bộ q trình.
- Chi phí nhân cơng, điện nước... cho một đơn vị sản phẩm cao.
Trong hai phương pháp trên, thì nuôi cấy NS trên MT bán rắn đem lại hiệu quả cao
hơn, vì NS là VSV hiếu khí bắt buộc do đó ni trên MT này thì độ thống khí cao. Nồng
độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều so với ni cấy chìm. MT khơng cần điều kiện vơ trùng

tuyệt đối, nếu bị nhiễm VSV lạ cũng dễ dàng xử lý. Chế phẩm dễ sấy khô, bảo quản, dễ vận
chuyển và ít tổn hao hoạt tính enzyme. Là phương pháp sử dụng trong điều kiện không cần
thu enzyme tinh khiết, rất dễ thực hiện, quy trình cơng nghệ đơn giản khơng địi hỏi q cao
về trang thiết bị [21], [39], [40].
1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma spp.
1.2.6.1. Nguồn dinh dưỡng

 Nguồn dinh dưỡng cacbon
NS có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau, trong đó nguồn
cacbonhydrat là dễ hấp thu nhất. Do chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm
ứng nên trong MT ni cấy NS sinh chitinase, cần có nguồn chitin là chất cảm ứng và là
nguồn cacbon nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase [31]. Nhìn chung sự hiện
21


diện của chitin trong MT ni cấy hữu ích cho việc tạo chitinase. Trong số các cơ chất,
chitin huyền phù có khả năng kích thích tạo chitinase cao nhất. Trong hầu hết các trường
hợp, khi nồng độ chitin khoảng 1 – 1,5% là VSV có khả năng tạo chitinase [51].
Năm 2003, Binod và cộng sự đã sử dụng nhiều cơ chất khác nhau (như vách tế bào
nấm, vỏ tôm, cua ...) để tạo chitinase từ NS nuôi cấy trên MT bán rắn. Việc tận dụng phế
liệu này vừa đem lại hiệu quả kinh tế, vừa góp phần giảm thiểu ơ nhiễm MT.
Nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp và các đồng tác giả chỉ ra rằng hệ enzyme chitinase
của Trichoderma sp. có thể được cảm ứng bởi vách tế bào vi nấm (Curvularia oryzae,
Phytophthora primulae), vách tế bào nấm lớn (Schizophyllum commune, Trametes
versicolor) hoặc chitin vỏ tơm, trong đó vách tế bào nấm cảm ứng quá trình sinh tổng hợp
hệ enzyme chitinase của Trichoderma tốt hơn chitin từ vỏ tôm [7].

 Nguồn dinh dưỡng nitơ
Nguồn nitrogen có ý nghĩa lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của NS. Khi loại
urea ra khỏi MT nuôi cấy sẽ làm tăng khả năng tổng hợp chitinase. Takashi và cộng sự

(2002) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ NS Aspergillus sp. đã chỉ ra rằng hoạt tính
chitinase cao khi sử dụng nguồn nitơ từ (NH4)2SO4 [25].
Theo Nampoothiri và cộng sự (2003), khi bổ sung 2,0% (w/w) cao nấm men vào MT
nuôi cấy bán rắn thì khả năng tạo chitinase ở Trichoderma harzianum tăng đáng kể. Tuy
nhiên, theo Kovacs và cộng sự (2003), trong nuôi cấy bán rắn, nguồn nitrogen bổ sung vào
MT cám gạo-chitin không ảnh hưởng đến khả năng tạo chitinase. Suresh và
Chandrasekharan (1999) cũng ghi nhận sự gia tăng sản lượng enzyme này khi MT nuôi cấy
T. harzianum được cung cấp muối amonium phosphat và cao nấm men.

 Nguồn dinh dưỡng khoáng
Các chất khống như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu ... có vai trị quan trọng như tham gia vào
q trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào NS, tham gia thành phần cấu tạo
protein, enzyme, điều hòa pH của MT nuôi cấy nên ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme nói chung, chitinase nói riêng [26], [57].
1.2.6.2. Điều kiện nuôi cấy

 Ảnh hưởng của độ ẩm
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu của MT thích hợp với NS là 50 – 60%, nếu
độ ẩm dưới 50% thì hoạt tính enzyme sẽ giảm. Độ ẩm MT cần phải được duy trì trong quá
trình sản xuất. Độ ẩm cao sẽ làm giảm độ thống khí của MT, cịn khi độ ẩm thấp sẽ kìm
22


hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV. Đối với T. harzianum, hoạt tính chitinase cao
nhất ở độ ẩm MT là 65% [55].

 Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH của MT ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp
chitinase của các chủng NS. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH ban đầu của MT
ni cấy thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Nhìn chung, các chủng Trichoderma có thể

phát triển ở MT acid (pH = 6), khoảng tối ưu là 5 – 6.5, một số chủng phát triển tốt ở pH <3
và một số ít phát triển ở pH > 9 [43], [56]. Các nghiên cứu trên T. harzianum chỉ ra rằng pH
thích hợp cho nấm này sinh trưởng tạo chitinase có hoạt tính cao khoảng pH = 4 – 6 [27].

 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiệt độ có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển
của Trichoderma. Nhiệt độ phát triển tối ưu của Trichoderma là từ 25 – 30oC. Một vài loài
phát triển tốt ở 35oC. Một số ít phát triển tốt ở 40oC [39]. Các loài, như T. harzianum,
thường được phân lập từ những vùng đất nhiệt đới ấm áp, trong khi đó T. polysporum và T.
viride lại chủ yếu được tìm thấy ở những vùng có nhiệt độ lạnh. Các lồi Trichoderma có
thể sinh trưởng trong khoảng giới hạn nhiệt độ tương đối rộng, ở nhiệt độ thấp 0oC đối với
T. polysporum hay ở nhiệt độ cao 40oC đối với T. koningii. Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng
tới sự sinh trưởng của các lồi Trichoderma mà cịn tác động tới hoạt động biến dưỡng của
chúng, đặc biệt là sự sinh tổng hợp kháng sinh và các enzyme ngoại bào [37].
1.2.7. Tình hình nghiên cứu và sử dụng chế phẩm enzyme chitinase
1.2.7.1. Khả năng ứng dụng của enzyme chitinase từ Trichoderma spp. trong nông
nghiệp
 Cơ sở khoa học ứng dụng enzyme chitinase trong phòng trừ nấm gây bệnh thực
vật
Thành tế bào của vi nấm dày khoảng 0,2 µm, có tính phản quang rất mạnh nên có thể
phân biệt rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhiều cơng trình đã chứng minh cấu tạo thành tế
bào vi nấm vừa có cấu trúc bản mỏng vừa có cấu trúc sợi.
Bảng 1.1. Cấu tạo chính của thành tế bào ở các nhóm nấm chủ yếu [1], [72]:
Cấu tạo chính của thành tế

Nhóm phân loại
Nấm nhầy

bào

Myxomyces

Cellulose

23