Khảo sát thành phần hóa học cây cành giao euphorbia tirucalli l thu hái ở tỉnh bình thuận

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả sự trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn
Thầy Bùi Xuân Hào và thầy Dương Thúc Huy đã theo sát, nhiệt tình giảng dạy,
hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên em trong q trình làm khóa luận tốt nghiệp.
Tất cả q thầy cơ Khoa Hóa, đặc biệt q thầy cơ Bộ mơn Hóa hữu cơ đã tận tình
dạy dỗ, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học quý báu trong suốt bốn năm qua.
Các bạn trong phịng thí nghiệm đã giúp đỡ, chia sẻ những vui buồn trong q trình
làm khóa luận.
Ba, Mẹ và những người thân trong gia đình là chỗ dựa tinh thần vững chắc nhất giúp
em vượt qua mọi khó khăn, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành tốt khóa luận này.

i


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

.i

MỤC LỤC

.ii

DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

.iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

.v

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

.vi

LỜI MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 2
1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CÀNH GIAO .......................................................... 2
1.1.1. Mô tả chung .......................................................................................................... 2
1.1.2. Vùng phân bố ....................................................................................................... 2
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH .................................................................... 3
1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền ............................................................................ 3
1.2.2. Nghiên cứu về dược tính ...................................................................................... 4
1.2.3. Độc tính ................................................................................................................ 4
1.2.4. Ứng dụng khác ..................................................................................................... 4
1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ............................................. 5
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ...................................................................................... 10
2.1. HĨA CHẤT, THIẾT BỊ ........................................................................................... 10
2.1.1. Hóa chất .............................................................................................................. 10
2.1.2. Thiết bị................................................................................................................ 10
2.2. NGUYÊN LIỆU ....................................................................................................... 10
2.2.1. Thu hái nguyên liệu ............................................................................................ 10
2.2.2. Xử lí mẫu nguyên liệu ........................................................................................ 11
2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO .................................................................................. 11
2.4. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE ........... 11
2.4.1. Sắc ký cột silica gel trên cao ethyl acetate ......................................................... 11
ii

2.4.2. Sắc ký cột trên phân đoạn HA.1.(7+8) ................................................................. 12
2.4.3. Sắc ký cột trên phân đoạn HA.1.(7+8).2. ............................................................. 12
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 13
3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C4 ............................................................ 13
3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C3 ............................................................ 15
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................ 17
4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................................ 17
4.2. ĐỀ XUẤT ................................................................................................................... 17
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 18
PHỤ LỤC

iii


DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

Ký hiệu,

Tiếng Anh

Tiếng Việt

chữ viết tắt
Proton (1) Nuclear Magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của

Resonance

proton (1)

Carbon (13) Nuclear Magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của

Resonance

carbon (13)

AcOH

Acetic acid

Acid acetic

C

Chloroform

Cloroform

Bu

n-Butanol

n-Butanol

d

Doublet

Mũi đôi

dd

Doublet of doublets

Mũi đôi đôi

ddd

Doublet of doublet of doublets

Mũi đôi đôi đôi

EA

Ethyl Acetate

Ethyl acetate

Et

Ethanol

Ethanol

H

n-Hexane

n-Hexane

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Coherence

nhiều liên kết

Me

Methanol

Methanol

ppm

Par per million

Một phần một triệu

s

Singlet

Mũi đơn

1

H-NMR

13

C-NMR

SKC

Sắc ký cột

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

UV

Ultra Violet

Tia cực tím

W

Water

Nước

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU
 HÌNH ẢNH
Hình 1.1.

Cây cành giao ......................................................................................... 2

Hình 1.2.

Các hợp chất cơ lập được từ E.tirucalli ................................................. 7

Hình 3.1.

Cấu dạng và tương quan HMBC của G.C4.......................................... 14

Hình 3.2.

Cơng thức cấu tạo và tương quan HMBC của G.C3............................ 16

Hình 4.1.

Hai hợp chất cơ lập được từ cao ethyl acetate ...................................... 17

 SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1.

Q trình ly trích và cơ lập từ cây cành giao ....................................... 13

 BẢNG BIỂU

Bảng 1.1.

Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây ......................................... 4

Bảng 1.2.

Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây ............................................ 6

Bảng 2.1.

Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate ..................................................... 11

Bảng 3.1.

Dữ liệu phổ của hợp chất G.C4 ........................................................... 14

Bảng 3.2.

Dữ liệu phổ của hợp chất G.C3 ........................................................... 16

v


DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1.

Phổ 1H-NMR của hợp chất G.C4

Phụ lục 2.

Phổ 13C-NMR của hợp chất G.C4

Phụ lục 3.

Phổ HMBC của hợp chất G.C4

Phụ lục 5.

Phổ 1H-NMR của hợp chất G.C3

Phụ lục 6.

Phổ 13C-NMR của hợp chất G.C3

Phụ lục 7.

Phổ HMBC của hợp chất G.C3

vi


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nhiệt đới có nhiều điều kiện thuận lợi cho các lồi thực vật có
giá trị phát triển. Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh, từ
đó tìm ra được nhiều phương thuốc có thể chữa được một số bệnh nan y như ung thư, sốt

rét… Ngày nay, ngành hóa học các hợp chất tự nhiên kết hợp với ngành y dược học, sinh
học không ngừng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các dược thảo
có trong các phương thuốc cổ truyền để ứng dụng vào việc chữa bệnh. Tuy nhiên nhiều cây
thuốc chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, chưa được nghiên cứu một cách có hệ
thống, trong đó có cây cành giao.
Cây cành giao mọc hoang tại nhiều vùng ở Việt Nam. Tuy nằm trong từ điển cây
thuốc Nam nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu hóa sinh học về cây cành giao được thực
hiện. Những nghiên cứu đi trước về Euphorbia tirucalli L. cho thấy cây cành giao là loại
cây có nhiều tiềm năng.
Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần
hóa học của cây cành giao với mong muốn tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học góp
phần nâng cao giá trị của các dược thảo Việt Nam.

1


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN

1.1.

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CÀNH GIAO[1]

Tên thông thường: Cành giao
Tên gọi khác: lục ngọc thụ, xương khơ, bút chì, thanh san hô, san hô xanh, nọc rắn.
Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

Tên khoa học: Euphorbia tirucalli L.

Hình 1.1 Cây cành giao
1.1.1. Mơ tả chung[1]
Cây cành giao có thể cao 4-7 m, thân có thể có đường kính bằng cổ tay, cành nhiều,
mọc so le hay hơi vịng, màu xanh, gầy.
Lá nhỏ, hình mác hẹp, hơi dày, rất chóng rụng, phiến lá dài 12-16 mm, rộng 2 mm.
Hoa tập trung ở những chỗ phân nhánh hoặc tận cùng ở đầu cành. Quả nang, hơi có
lơng, có 3 mảnh vỏ. Hạt hình trái xoan, nhẵn.
1.1.2. Vùng phân bố
Cành giao có nguồn gốc ở đảo Mangat (châu Phi). Phát hiện thấy ở Việt Nam từ
năm 1970.[1]
Cây cành giao có mặt ở hầu hết các châu lục, đặc biệt các vùng có khí hậu nhiệt đới
hoặc khô như châu Phi, châu Á và Nam Mỹ. Cây cành giao được xác định bởi Linnaeus
vào năm 1973.[7]

2


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

1.2.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH

1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền
Tồn cây cành giao có vị cay, hơi chua, tính mát, hơi có độc, có tác dụng thúc sữa,
sát trùng, khử phong, tiêu viêm, giải độc. Dân gian thường dùng cành giao để trị đau nhức,

côn trùng đốt, chấn thương…
Theo Schmelzer, Gurib-Fakim (2008) và Van Damme (1989) thì ở Đơng Phi, mủ
của cành giao được sử dụng để chống liệt dương, mụn cóc, động kinh, đau răng, trĩ, rắn
cắn. Ở Malaysia, rễ hoặc thân cành giao được dùng để chữa trị loét mũi, trĩ và các chỗ
sưng. Các mảnh rễ trộn với dầu dừa chữa đau dạ dày. Ở Ấn Độ, Kumar (1999) ghi lại rằng
cành giao là loại cây không thể thiếu trong vườn nhà và được sử dụng như là một phương
thuốc cho các bệnh như: phì lá lách, hen suyễn, bệnh phù, bệnh phong, huyết trắng, khó
tiêu, vàng da, đau bụng, các khối u, sỏi bàng quang. Duke (1983) và Van Damme (1989)
đề cập rằng tại Brazil, cành giao được sử dụng chống lại bệnh ung thư, u dạng ung thư, ung
thư biểu mô, bướu thịt, các khối u và mụn cóc mặc dù vẫn cịn tranh cãi về cơ sở khoa học
về hợp chất chống ung thư của cây. Ở Malabar (Ấn Độ) và Moluccas, mủ được sử dụng
như thuốc gây nôn và trị giang mai. Ở Indonesia, dịch của rễ được sử dụng trị đau nhức
xương trong khi thuốc đắp của rễ hoặc lá cây được sử dụng điều trị loét mũi, trĩ. Nước sắc
từ thân cây để chữa bệnh phong và tê liệt tay chân sau khi sinh con (Duke, 1983). Ở Java,
mủ được sử dụng để chữa trị các bệnh về da và gãy xương.[15]
Một số bài thuốc theo y học cổ truyền:
Chữa viêm xoang, viêm mũi dị ứng: dùng khoảng 15 đốt cành cây cành giao, cắt
nhỏ từng đoạn 5 mm, cho vào túi nilon đập nát rồi cho vào ấm có vịi với lượng nước vừa
đủ, đun sôi, dùng giấy cuộn thành ống lắp vào đầu vịi, cho vào mũi để hít hơi nước, hơi
thuốc vào mũi, thỉnh thoảng hít cả vào miệng. Thời gian xông 10-15 phút. Xông liên tục 35 ngày, bệnh nặng có thể xơng 7-10 ngày. Cần chú ý khơng dùng cho phụ nữ có thai.[26]
Chữa cơn trùng, ong đốt, rắn cắn, bò cạp đốt…: dùng cành cây cành giao giã nhỏ,
đắp lên vết thương.[22]

3


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

Chữa mụn cơm: dùng nhựa mủ cây cành giao đắp lên mụn cơm.[26]
1.2.2. Nghiên cứu về dược tính
Cao chiết các bộ phận của cây được thử nghiệm các loại hoạt tính sinh học và dược
học, được mơ tả trong Bảng 1.1
Bảng 1.1 Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây

Hoạt tính
Kháng virus

Nguồn
Nhựa cây

Kháng ung thư và điều trị AIDS
Kháng viêm
Miễn dịch

Cao chiết cây
Nhựa cây
Cao chiết cây

Kháng khuẩn
Kháng oxi hóa và chức năng bảo vệ gan
Chất diệt côn trùng và sinh vật gây hại:
Brevicoryne brassicae
Aedes aegypti và Culex quinquefasciatus
Biomphalaria gabrata
Lymneae natalensis

Cao chiết cây
Cao chiết cây

Nhựa cây

Tài liệu trích dẫn
Ramesh 2009[16]
Avelar 2011[2]
Betancur-Galvis 2002[3]
Dias 2006[4]
Santana 2014[17]
Valadares 2006[19]
Lirio 1998[11]
Jyothi 2008[9]
Mwine J., Van Damme
2011[15]

1.2.1. Độc tính
Các lồi Euphorbia đều chứa nhựa nhưng nhựa cây cành giao được xem độc nhất.
Cây cành giao có nhiều diterpenoid loại phorbol gây độc tuy không gây chết người nhưng
làm tổn thương nặng da và mắt. Nhựa của cây cành giao có thể làm phồng da và xung
huyết da, gây nôn mửa với liều lớn nhưng nó lại là thuốc tẩy với liều nhỏ và chữa trị đau
răng, đau tai, thấp khớp, mụn cóc, ho, thần kinh và bọ cạp cắn.[5][6]
1.2.2. Ứng dụng khác
Nguồn năng lượng thay thế: Nhựa cây chứa hàm lượng lớn triterpenoid có 30
carbon có thể thực hiện cắt mạch để cho xăng có chỉ số octane cao.[15]

4


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

Nguồn cao su: Nhựa cây chứa nhiều terpene và resin có thể chuyển hóa thành cao su
với giá thành thấp. Trong suốt chiến tranh thế giới thứ II, nhựa cây được sử dụng ở Nam
Phi.[15]
Nơng lâm nghiệp: Với đặc tính chống hạn cây được sử dụng ở các vùng đất bán hạn
hán để bảo vệ đất.[15]
1.3.

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

Euphorbia tirucalli có chứa chất nhựa màu trắng như sữa trong tồn cây khi cắt
ngang. Nhựa cây có thể chiếm tới 28% trọng lượng khơ, trong đó gồm 21-27% các hợp
chất tan trong nước, 59-63% resin và 12-14% các hợp chất như cao su.[15]
Cho đến nay, số lượng nghiên cứu về thành phần hóa học của Euphorbia tirucalli L.
tương đối ít và thành phần hóa học chính chủ yếu là các hợp chất phytosterol, tritepene,
diterpene, polyphenol…(Uchida Hidenobu Y.H. và cộng sự, 2009; Lin S.-J. và cộng sự,
2001; Yoshida T. và cộng sự, 1991).[11][18][21] Nhựa của Euphorbia tirucalli L. cũng được
nghiên cứu riêng cho thấy thành phần chính gồm các diterpene thuộc khung sườn ingenane
và tigliane (Fuerstenberger G. và cộng sự, 1985; Fuerstenberger G., 1977).[5][6]
Năm 1977, Fuerstenberger G. và Hecker E. cô lập được 4 hợp chất mới từ mủ của
cây Euphorbia tirucalli. Đó là các hợp chất 12,13,20-tri-O-acetylphorbol (1), phorbol (2),
3,5,20-tri-O-acetylingenol (3) và ingenol (4).[5]
Năm 2001, Lin S.-J. đã cô lập được 14 hợp chất, đó là 3,3',4-tri-O-methyl-4-Orutinosyl ellagic acid (22), gallic acid (23), 1-O-galloyl-β-D-glucoside (24), 1,2,3-tri-Ogalloyl-β-D-glucoside (25), corilagin (26), pedunculagin (27), casuariin (28), quercitrin
(29), putranjivain B (30), putranjivain A (31), 3,3'-di-O-methyl gallic acid; 2,3-(S)hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranoside và rutin 5-desgalloylstarchyurin.[10]

5


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

Bảng 1.2 Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây [15]
Hợp chất hóa học
4-Deoxyphorbol di-ester (5)

Nguồn
(bộ phận)
Nhựa cây

Tài liệu trích dẫn
Kinghorn 1979

Campesterol (7), stigmasterol (8),
β-sitosterol (9), isofucosterol (10),
cycloartenol (11) (sterol)
Cycloeuphordenol (12) (triterpene)

Toàn cây

Uchida và cộng sự 2010

Nhựa cây

Khan 2010

Cyclotirucanenol (13) (triterpene)

Nhựa cây

Khan và Ahmed 1988

Diterpene ester

Nhựa cây

Khan và Malik 1990

Euphol (14) và β-amyrin (15)
(triterpenoid)

Toàn cây

Uchida và cộng sự 2010

Euphorbin A (polyphenol)

Thân cây

Yoshida và Yokoyama 1991

Euphorcinol (16) (pentacyclic triterpene)

Vỏ thân cây Khan 1989

Euphorbol (17)

Nhựa cây

Furstenberger và Hecker 1977

Serine protease

Nhựa cây

Lynn và Clevett 1985

Steroid

Nhựa cây

Nielson và cộng sự 1979

Taraxerane triterpene (18)

Vỏ thân cây Rasool 1989

Tirucalicine (6) (diterpene)

Nhựa cây

Khan 2010

Tirucallin A (19) (tannin)

Thân cây

Yoshida và Yokoyama 1991

Tirucallin B (20) và euphorbin F (21)

(dimer)

Thân cây

Yoshida và Yokoyama 1991

Trimethylellagic acid

Nhựa cây

Chatterjee và cộng sự 1977

6


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

HO
H

OAc

H
HH

O

H

OH

OAc

HO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

OH

O

HH

O
HO

HO

HO HO
HO

CH2OH
Phorbol (2)

OAc
12,13,20-tri-O-acetylphorbol (1)

3,5,20-tri-O-acetylingenol (3)
O
OH

H

H
H

AcO
O

HH

O

Ingenol (4)

OAc

MeO

CH2OH
4-Deoxyphorbol (5)

CH2OAc

OAc

H

H
AcO HO

AcO

CH2OH

OH

HO

H
O

H
H

Tirucalicine (6)

H
H

H

H

H

H
H

HH

H

H
H

HO

HO

HO

β-Sitosterol (9)

Stigmasterol (8)

Campesterol (7)

H

H
H
H

H
H

H

HO

HO

HH
HO
Isofucosterol (10)

Cycloeuphordenol (12)

Cycloartenol (11)

H
H

H
H

H
H
HO

Cyclotirucanenol (13)

HO

HO

H

H

β-Amyrin (15)

Euphol (14)

Hình 1.2 Các hợp chất cơ lập từ E. tirucalli
7


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

H

H

H

H

HO

OH
Euphorcinol (16)

H
Taraxerane (18)

H
Euphorbol (17)

OH

OH
OH

HO

O

OH
O

O OO
O O
O

OH

HO

O

O

HO

OH
OH

OH

O

HO

OH

O O
O
O
O

O

O
OH

O
O

OH

O

O
H

O
OH

H O
O

OH
OH
OH

HO

OH

OH OH
Tirucallin A (19)

HO

OH

OH OH
Tirucallin B (20)

OH
HO

OH

O O

HO

OH

OH

O

HO

OH

O

OH HO

O

O

OHHO

HO

O

O

OH

O

O

H

OH

OH HO

HO

H

H

H

O
O

HO

O

O

HO

O

O

O
O

HO

O

OH

O

OH
OHHO

O
OH

OH
HO

OH

HO

O

HO
OH

HO

O
OH
HO HO

H

OH

OH
b

O

O
O

O
CO

CO

OH

O

HO
Euphorbin F (21)

MeO

OH
O

CO

OH

H

OH

O
O

O

OMe O

OH
OH
OH

O

OH

O
CO

O
OH

OH
OH
O a

O

MeO
OH

OO
O

HO

O

HO

OH

OH
3,3',4-tri-O-methyl-4'-O-rutinosyl ellagic acid (22)

8

SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG
COOH

HO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017
HO

HO
HO
O
OH

OH
OH

O
OH

O

HO
O
O galloyl
O
a
o
ll
l
g y

galloyl

O galloyl

1-O-galloyl-β − D-glucoside (24)

Gallic acid (23)

OH

O

O

OH

galloyl =

OH

1,2,3-tri-O-galloyl-β − D-glucoside (25)

HO

OH

OH HO

OH

HO
HO

OH

CO

HO

OCH2

HO

COO

O
CO

OH
O

OH

O

H

O

HO

CO

HO

O
O

H
H

O

HO
OH

HO
O

OH
OH

O O

OH

O

HO
OH

OH HO
Pedunculagin (27)

OH
OH
Casuariin (28)

HO

HO

OH

OH

OH
HO

HO

HO

OH

O

OH
HO

CO

O CH2

O
O

HO

OH
HO

O

O
HO

O

O

O

H

HO

OH

OH
O

HO

O
OH

O

O

O
O

HO
OH

Quercitrin (29)

OH

OOC

HO

OH

OH H

HO

O

O

Putranjivain B (30)

O HO

CO

OH
O

OH

HO
Putranjivain A (31)

Hình 1.2 Các hợp chất cơ lập từ E. tirucalli (tiếp)

9

OH

OH

O

HO

OH

O
CO O

H

O

HO

O

OH

H

HO

HO

OH

O

O

CO


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

CHƯƠNG 2.
THỰC NGHIỆM

2.1.

HỐ CHẤT, THIẾT BỊ

2.1.1. Hoá chất
 Silica gel 0.04-0.06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí.
 Sắc kí bảng mỏng loại Kieselgel 60F

254

(20×20), Merck.

 Dung mơi dùng cho q trình thí nghiệm gồm: n-hexane, ethyl acetate, acetic
acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, n-butanol và nước cất.
 Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: sử dụng
vanillin/H 2 SO 4 .
2.1.2. Thiết bị
 Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.
 Các cột sắc kí.
 Máy cơ quay chân không.
 Bếp cách thuỷ.
 Đèn soi UV bước sóng 254 nm và 365 nm.
 Cân điện tử.
 Các thiết bị ghi phổ 1H-NMR (500 MHz),

13

C-NMR (125 MHz) và HMBC

trên máy Bruker, tại phịng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên
thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. NGUYÊN LIỆU
2.2.1. Thu hái nguyên liệu
Mẫu được dùng trong nghiên cứu khoá luận là thân cây cành giao Euphorbia
tirucalli L. được thu hái tại huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận vào tháng 3 năm
2015.

10


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu
Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khơ rồi xay thành bột
mịn. Sau đó tiến hành đun hoàn lưu với ethanol và phân lập các hợp chất.
2.3.

ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Bột cây 3.5 kg được trích kiệt với ethanol mỗi lần 10 lít và lặp lại hai lần theo
phương pháp đun hoàn lưu trong vịng 7 giờ, lọc, cơ quay thu hồi dung mơi. Trong q
trình cơ quay thu hồi dung mơi, thấy kết tủa xuất hiện, lọc riêng phần tủa ethanol thô

(250.4 g) và phần dịch ethanol thô Et1 (290.3 g). Tiếp tục hịa phần tủa ethanol thơ với
ethanol đun nóng, thu được phần dịch Et2 (101.2 g) và phần tủa còn lại (149.2 g). Cao
ethanol Et1, Et2 được chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi n-hexane, ethyl acetate và
butanol thu được các cao tương ứng như minh họa trong Sơ đồ 2.1.
2.4.

CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE

2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate
Sắc ký cột cao ethyl acetate - EA1, EA2 trên silica gel pha thường sử dụng hệ dung
hexane: ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 50% đến 100% ethyl acetate. Dịch giải ly
qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi q trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM).
Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn.
Bảng 2.1 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate
Tên

Phân

Sắc kí lớp mỏng

Ghi chú

đoạn

EA1

EA2

EA1

EA2

EA1

EA2

1

HA.1.1 (1.58 g)

HA.2.1 (0.37 g)

Nhiều vết

Vệt dài

Chưa khảo sát

Chưa khảo sát

2

HA.1.2 (2.76 g)

HA.2.2 (3.14 g)

Vệt dài

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Đã khảo sát

3

HA.1.3 (1.15 g)

HA.2.3 (2.12 g)

Nhiều vết

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Chưa khảo sát

4

HA.1.4 (2.48 g)

HA.2.4 (4.21 g)

Nhiều vết

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Đã khảo sát

5

HA.1.5 (2.35 g)

HA.2.5 (2.69 g)

Vệt dài

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Chưa khảo sát

6

HA.1.6 (2.50 g)

HA.2.6 (3.15 g)

Nhiều vết

Nhiều vết

Đã khảo sát

Chưa khảo sát

7

HA.1.7 (1.95 g)

HA.2.7 (1.84 g)

Nhiều vết

Nhiều vết

Đã khảo sát

Chưa khảo sát

11


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG
8

HA.1.8 (0.24 g)

HA.2.8 (0.89 g)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

Nhiều vết

Vệt dài

Đã khảo sát

Chưa khảo sát

2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn HA.1.(7+8)
Phân đoạn HA.1.(7+8) cho SKLM nhiều vết nên phân đoạn HA.1.(7+8) được thực
hiện SKC silica gel với hệ dung môi rửa giải H:EA:Ac:AcOH (3:1:1:0.2). Dịch giải ly qua
cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM. Những lọ cho kết quả
SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 18 phân đoạn
(HA.1.(7+8).1-HA.1.(7+8).18), được trình bày trong Sơ đồ 2.1.
2.4.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn HA.1.(7+8).2
Phân đoạn HA.1.(7+8).2 cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn HA.1.(7+8).2
được thực hiện sắc ký cột qua cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH. Dịch giải ly
qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM. Những lọ cho kết
quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 10 phân
đoạn (HA.1.(7+8).2.1-HA.1.(7+8).2.10).
Phân đoạn HA.1.(7+8).2.5-7 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ đẹp màu cam, xuất hiện
tủa. Lọc thành 2 phần tủa và dịch. Lấy phần tủa cho qua SKC với hệ dung môi
H:C:EA:Ac:H 2 O ( 5:1:2:2:0.02) thu được hai hợp chất GC3 (6 mg) và GC4 (8 mg) có
dạng bột màu vàng. Quá trình thực hiện được tóm tắt theo Sơ đồ 2.1.

12


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017
Bột cành giao khơ (3.5kg)
Đun hồn lưu với ethanol, lọc,
cơ quay thu hồi dung môi.

Phần cao tủa ethanol
250.4 g

Et1
290.3 g

Cao H1
94.2 g
HA.1.1-5
10.32 g

Cao Bu1
27.0 g

Cao EA1
61.8 g

HA.1.(7+8)
6.19 g

HA.1.6
2.5 g

Cao H2
50.2 g

SKC
H:EA:Ac:AcOH
HA.1.(7+8).1
0.70 g

HA.1.(7+8).2
2.43 g

Cao EA2
32.0 g

HA.1.(7+8).3-18
4.12 g

Sephadex LH-20 /MeOH
HA1.(7+8).2.1-4 HA1.(7+8).2.5-7 HA1.(7+8).2.8-10
10.6 mg
157.3 mg
50.2 mg
Hòa tan bằng MeOH
Lọc
Tủa
41.9 mg

Dịch
114.1 mg
PTLC
GC3
6 mg

GC4
8 mg

Cao tủa ethanol

149.2 g

Et2
101.2 g

Sơ đồ 2.1. Q trình ly trích và cơ lập từ cây cành giao
12

Cao Bu2
10.5 g


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

13


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

CHƯƠNG 3.
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C4
Hợp chất G.C4 thu được được từ phân đoạn HA.1.(7+8) của cao ethyl acetate với

các đặc điểm như sau:
 Chất bột vô định hình màu vàng.
 Hiện hình với thuốc thử vanillin/H 2 SO 4 khi hơ nóng cho vết màu cam, hấp
thu UV cho vết màu tím sáng rõ.
 Phổ 1H-NMR (Acetone-d 6 ): Phụ lục 1.

 Phổ 13C-NMR (Acetone-d 6 ): Phụ lục 2.
 Phổ HMBC (Acetone-d 6 ): Phụ lục 3.
Biện luận cấu trúc
Phổ 1H-NMR cho thấy GC4 là một flavonoid glycosid với sự hiện diện của phân
tử L- rhamnopyranosyl bao gồm tín hiệu của proton anomer tại δ H 5.52 trên phổ

1

H-

NMR, bốn proton gắn oxygen trong vùng từ 3.40 – 4.22 ppm, một tín hiệu đặc trưng của
nhóm methyl tại δ H 0.91 (3H, d, 5.5). Tín hiệu của một cặp proton nhân thơm ghép meta
với nhau tại δ H 6.26 và 6.46 (mỗi 1H, d, 2.0), ba proton nhân thơm ghép cặp với nhau ở
vị trí 1,2,4 tại δ H 7.51 (1H, d, 2.0), δ H 7.40 (1H, dd, 8.5, 2.0), δ H 6.98 (1H, d, 8.0), một
nhóm hydroxy kiềm nối tại δ H 12.72 giúp xác định hợp chất chứa một phân tử aglycone.
Phổ HMBC cho thấy tương quan của tín hiệu proton H-1” (δ H 5.52) và C-3 (δ C
135.9) chứng tỏ phân tử L-rhamnose được liên kết với phân tử aglycone tại C-3.
Ngoài ra, phổ 13C-NMR cho thấy các tín hiệu carbon tương ứng với bảy tín hiệu
carbon thơm liên kết trực tiếp với oxygen trong vùng từ 135 – 164 ppm, bảy tín hiệu
carbon thơm khơng liên kết với oxygen, một tín hiệu của nhóm carbonyl C=O tại δ C
179.4, một tín hiệu nhóm methyl tại δ C 17.8 và bốn tín hiệu cacbon liên kết với oxygen
của phân tử đường L-rhamnopyranosyl.

13


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

Dựa vào sự phân tích các dữ kiện phổ trên, so sánh các dữ kiện phổ của hợp chất
G.C4 với các dữ kiện phổ của hợp chất quercitrin đã được cơng bố[4] thấy có sự tương
đồng, do đó cấu trúc của hợp chất G.C4 được đề nghị như Hình 3.1.
OH
3'

2'

HO

9

O

C

A
6

10

5

OH

1'

2

3'

OH

4'

HO

5'
6'

1

8

7

9

A

3

O

4

10

5

O

OH

H

O

5'

2

C

6

B

1'

O

6'

3

O

4

O
H

O

HO

OH

4'

2'

B

1
8
7

OH

HO

HO

HO

OH

OH

Hình 3.1 Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC của GC4
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của hợp chất GC4 và quercitrin
GC4

Quercitrin

(Acetone –d 6 )
N
2
3

δC
158.4
135.9

4

179.4

5
6
7

8
9
10
1’
2’
3’
4’
5’
6’
1”
2’’
3”
4”

163.2
99.3
164.9
94.7
158.0
105.7
122.9
116.1
149.0
145.8
116.8
122.6
102.8
71.3
71.5
73.0

5”
6”
5-OH

δH

m, J (Hz)

δC
158.1
136.0

(CD 3 OD)
δH

m, J (Hz)

179.3
159.1
99.5
165.8
94.3
163.0
105.5
122.5
116.2
146.2
149.5
116.7

122.7
103.4
71.8
72.0
73.1

6.26

d, 2.0

6.46

d, 2.0

7.51

d, 2.0

6.98
7.40
5.52
4.22
3.74
3.41

d, 8.0
dd, 8.5,2.0
br
m
dd, 9.0, 3.0

m

72.2

3.33

m

71.7

17.8

0.91
12.71

d, 6.0
s

17.5

14

6.10

d, 1.8

6.29

d, 1.8

7.57

d, 1.9

6.77
7.53
5.01

d, 8.2
dd, 8.2
d, 2

1.02

d, 6.0


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

3.2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C3
Hợp chất G.C3 thu được được từ phân đoạn HA.1.(7+8) của cao ethyl acetate với

các đặc điểm như sau:
 Chất bột vơ định hình màu vàng.
 Hiện hình với thuốc thử vanillin/H 2 SO 4 khi hơ nóng cho vết màu cam, hấp
thu UV cho vết màu tím sáng rõ.

 Phổ 1H-NMR (Acetone-d 6 ): Phụ lục 4.

 Phổ 13C-NMR (Acetone-d 6 ): Phụ lục 5.
 Phổ HMBC (Acetone-d 6 ): Phụ lục 6.
Biện luận cấu trúc
So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR của GC3 và GC4 chứng tỏ GC3 cũng là một
flavonoid glycoside với một phân tử đường L-rhamnose (Bảng 3.2). Phân tử đường Lrhamnopyranosyl được xác định tại vị trí C-3 nhờ tương quan H-1” (δ H 5.54 ) và C-3 (δ C
135.6).
Sự khác biệt giữa hai hợp chất GC3 và GC4 là những tín hiệu trên nhân thơm B.
Cụ thể, nhân thơm benzen có ba nhóm thế ở vị trí 1,2,4 của GC4 trở thành nhân benzen
hai nhóm thế 1,4 trong GC3 đặc trưng bởi hai proton ghép ortho với nhau trên nhân thơm
tại δ H 7.86 (2H, d, 8.5) và δ H 7.01 (2H, d, 8.5).
Dựa vào sự phân tích các dữ kiện phổ trên, so sánh các dữ kiện phổ của hợp chất
G.C3 với các dữ kiện phổ của hợp chất afezin đã được cơng bố[6] thấy có sự tương đồng,
do đó cấu trúc của hợp chất G.C3 được đề nghị như Hình 3.2.

15


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017
3'

3'
4'

2'

HO

1

8

7

9

A

1'

O

10

5

OH

HO

5'

1'

O

9

C

O

10

5

OH

O

6'

O

4

O

H

O

5'

3

6

3

B

2

A

6'

4

1

8

7

H

O
HO

HO

HO

HO

OH

OH

Hình 3.2 Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC của GC3
Bảng 3.2 Dữ liệu của hợp chất GC3 và afzelin
GC3

Afzelin

(Acetone –d 6 )

(DMSO–d 6 )

δH
(Hz)

δC

m, J

N

δC

2
3

158.4
135.6

157.2
134.2

4

nd

177.7

5
6
7
8
9
10
1’
2’
3’
4’
5’
6’
1”

163.2
98.8
164.9
93.5
157.5
105.5

121.0
128.5
116.1
161.0
116.8
128.5
102.8

2”

161.3
98.9
164.8
93.9
156.6
104.0
120.5
130.6
115.5
160.1
120.5
130.6
101.8

6.26

d, 2.0

6.46

d, 2.0

7.86
7.01

d, 8.5
d, 8.5

7.01
7.86
5.54

d, 8.5
d, 8.5
d, 1.5

71.2

4.21

dd, 3.0, 1.5

70.4

3”

71.4

3.74

dd, 8.5, 3.0

70.7

4”

73.2

3.33

71.1

5”

72.2

3.30

m
m

6”
5-OH

17.9

0.90
12.71

70.1

d, 5.5
s

16

17.5

δH

OH

4'

2'

B

2

C

6

OH

m, J (Hz)

6.21

d, 2.5

6.42

d, 2.5

7.74
6.91

d, 8.4
d, 8.4

6.91
7.74
5.29

d, 8.4
d, 8.4
d, 1.5


SVTH:NGUYỄN VƯƠNG PHƯƠNG DUNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP_2017

CHƯƠNG 4.
KẾT LUẬN – ĐỀ XUẤT
4.1

KẾT LUẬN

Trong khóa luận này, chúng tơi đã bước đầu tiến hành khảo sát thành phần hóa

học cao ethyl acetate của cây cành giao Euphorbia tirucalli L. thu hái ở tỉnh Bình Thuận
vào tháng 3 năm 2015.
Thực hiện các phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với sắc ký cột trên silica gel
pha thường, đã cô lập được hai hợp chất cấu trúc là quercitrin (G.C4) và afzelin (G.C3).
Đây là lần đầu tiên hợp chất afzelin được cô lập từ cây cành giao.
OH
3'

2'
1

HO

8

9

7

O

C

A
6

10

5

OH

1'

2

OH

4'

3'

B
5'

HO

6'

9

A

3

10

5

O

OH

H

O

1'

O

5'
6'

3

O

4

O
H

O

HO

B

2

C

6

O

4

1

8

7

OH

4'

2'

HO

HO

HO
OH

OH
GC4

GC3

4.2 ĐỀ XUẤT
Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài
này, chúng tôi chỉ khảo sát trên phân đoạn cao HA.1.(7+8). Trong thời gian sắp tới, nếu
có điều kiện chúng tơi sẽ tiến hành khảo sát trên các phân đoạn cao cịn lại. Đồng thời
chúng tơi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp chất đã
cô lập được.
17