Nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng sắn ở đông yên quốc oai hà nội

Ả
: “Nghiên cứu khả
năng sinh enzyme ngoại bào của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất
trồng Sắn ở Đơng n – Quốc Oai – Hà Nội”
T

T

T
ù

V
ấ

Qúy

ầy

V

y

S

ứ

s

q

ì

.
T

q

ấ

ì

ự

sự

sự

ì

ú
V s

H

s

V
V

T

s

y
T .S

y

s
T

H

y
ữ

s

ầy

GS.TS ù
V

-

V

ữ

T

.

T
V

s

ì

ữ

ú
q ý

ỡ

ự
ú

ứ

s
y.

ù

s

s
s

T

ử

ì
ự

è

ú

ỡ

.

!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018.
Sinh viên
u n

n

p


HƯƠ G 1. T
1.1

G QU

V

GHI

U ................................ 2

Enzyme amylase ...................................................................................... 2
ú

1.1.1
1.1.2 V s

y s .............................................................. 10

1.1.3

ụ

1.1.4 Tì

ì

1.2

y s ........................ 2

y s

s

............................................................. 10

ứ

y s ........................................................ 11

Enzyme cellulase ................................................................................... 12
y

1.2.1

s ........................................................... 12

ụ

1.2.2
1.2.3 V s

y

s ................................................ 13

y

s ................................................ 13

y

1.2.4

1.2.5 Tì

ì

ứ

HƯƠ G 2.

s ....................................................... 14

I U GV

ụ

2.1

s .......................................................... 14
HƯƠ G H

GHI

U .............. 16

ứ .............................................................................. 16
ứ ............................................................................. 16

2.2
2.3

V

2.4

T

................................................................................................... 16
ụ

ụ

ấ ................................................................. 16

ụ g ụ

2.4.1

2.4.2 H

.................................................................................. 16

ấ ............................................................................................... 16
ứ ....................................................................... 17

2.5
ấy

2.5.1

.......................................................................... 17

2.5.2

......................................................................... 17

2.5.3

s

2.5.4
ứ

2.5.5

ầ

ấ
3.2.1

s

s

T QU V TH

T

3.2

ấy
s

HƯƠ G 3.
3.1

ữ
s

2.5.6

ự
q

VSV

s
y

y

. .......... 19

............................................... 19
s

y

s
U

y

20

................ 21

............................................... 23

s
ấ
.............................................................................. 23
y s

s ............... 23

................................................................................ 23


q

3.2.2
3.2.3 Q
s

s

y

y s

.... 24

s
s
s
. .................................................................................................... 25
q

3.3

s

y s

3.3.1

s .............. 27

................................................................................ 27
q

3.3.2
3.3.3 Q
s

s

ấ
ấ

3.4.1

3.4.3 Q
s
T U

s

.... 27

s

y s

s ................ 30

s .................................................................................. 30

q

3.4.2

y s

s
s
s
..................................................................................................... 28
q

3.4

y

s

y

y s

s

ấ

s

... 30

s
s
s
ấ s
. .................................................................................................... 32
V

I

GH ........................................................................ 34

........................................................................................................... 34
......................................................................................................... 34
À

ỆU HA

KHẢO


A H
1.1

s VSV s

3.1 T
3.2

3.7

s

ấ ..................... 23

q

........................................... 24
s

V

4

q

3.5
3.6

ấ cellulase ........................................................ 14

ầ

3.3
3.4

Ả

2 ................................ 26

........................................... 27
s

X T1 ....................................... 29

q

........................................... 30
s

2

2

3 ................................ 33

A H

H

H

Hì

1.1 Cấu trúc khơng gian c

α-amylase ................................................... 3

Hì

1.2 ấu trúc khơng gian c

β-amylase ................................................... 5

Hì

1.3 ấu trúc khơng gian c a glucoamylase ............................................. 6

Hì

1.4 Cấu trúc khơng gian c a enzyme pullulanase .................................... 8

Hì

1.5 Cấu trúc khơng gian c a oligo-1,6-glucosidase ................................. 9

Hì

1.6 Quá trình th y phân tinh b

i sự xúc tác c a m t s lo i enzyme

amylase ............................................................................................................ 10
Hì

1.7

Hì

2.1 S

Hì

3.1 Hì

Hì

3.2 Si

Hì

3.3 Hì

Hì

3.4 S

tác dụng c a cellulase .......................................................... 13
y

s

....... 23
y s

3.6 S

s
2

X
s

3
y s

ấ

V 24
....................... 27

y s

Hì h 3.5 Hì

Hì

ấ ................................ 17

s

X 27
................ 30

s

S 30


Ấ
y

y ù

sự

y

ẽ

s
ự

ấ

y

:

sử ụ

ầ

ự

…H

y

300.000 ấ
ự

s
y

s

500

ấ

US

.
Q

sử ụ
q
ấ

s

s

ấ

ấ

y

s

s

ấ

.
Ở
ù

s

c ta l
s

ấ

y

ấ

ấ

y

ú.V

ứ

ứ
s

VSV

ứu, các nhà máy
E y

y
ụ
s

ầ

q

sử ụ

V

.
y

.
Vì

ứ s

ự

V

ấ

s

y

s
ú

y
ấ

s

ụ

ấ

q ý

y
sẵ

.V

ự

y
ữ

ự

ầ

s
s

sử ụ .
V

ì
ự

ự

ì

s

VSV

s

y

ú

tài: “Nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào của một số

chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng Sắn ở Đông Yên – Quốc Oai – Hà
Nội”

1


HƯ

1.

UA

Ấ

H

U

1.1 Enzyme amylase
1.1.1 K

n m

tn v

t

y s

y

y

y

ấ

s

y

ử

ú
sự

y

y s

y
y s

y

ử
s

ử

s

s

s
ỗ
y s .

y s

:

ử

ử ự

.

p là Pullulanase

-1,6-glucosidase hay
s .

ys

y

y

y

.

y s

y γ-

y
2

s ;

: E
.

y s

y

α-dextrin 6-

E

y

α-

OH – RH + R’ H

2

y s

y

c:

ứ : R.R.’ + H – OH Amylase

6
E

.

ứ

ys
ì

amylase

β-amylase và glucoamylase (amyloglucosidase
y

ữ

y

y

ầ

ử

ỗi polysaccharide.
tn

a)

v

t

enz me α-amylase (1,4-α-glucan

glucanhydrolase)
α-

y s

ỗ

nhau,

ầ

α-

y s

. α-amylase

y s

Ty

y

acid aspartic (Asp).
ấ
α-

ử

y s

y

T

Glu) và

s

¼

:
7 - 10

ys

(Cys).
T

ử
. α-

y s

α-

y s

ứ

-COOH và NH3 trong trung tâm

.
2


α-

y s

H4)2SO4 25 - 30%, α-

y s

60%.
α-

y s

y

ấ

globuline.
ẳ

ù

G

H

ù

y

α-

y s

αữ 48

H

y s

ụ

y

6 9. T y

ẳ
H

Bacillus acidocadarius
H

Bacillus licheniformis

4 2 - 5,7

35

y

9 0.

α-amylase

ùy

60 -70o

y
80 - 90o

s

.

H nh 1.1 Cấu trúc không gian của α-amylase ( />ụ : α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase)
α-1,4ấ

s

ử

y
. αQ

y s

ự
ỉ

y

ys

ì

y

y

y
ấ

.
α-a y s

:
3

q

ì

y

q


G

dextrin hóa

G

y

s

y

s

Maltotetrose, maltotriose và maltose

T

ụ
s
α-

α-

s
y s

y s

y

s
ỉ

ử

y

ấ . T y
y

ấ

ử

tose. K
α-

y s

ấ

y

ì sẽ

. Vì

y s

y
tn

b)

y s

y

v

y
y

y s

t

ụ
.

β-mylase (α-1,4 glucan-

maltohydrolase)
E y

β-

y s

y

ứ

.

-SH

sự
βs

C1
y

y s .

y

y

ứ

sẽ
s

sẽ

ụ

y
ụ

y

β-

. Es

ử

s

y

y

.
ử β-

ử 60.000
E y

y s

ỉ

ỗ

y

.
β-

y s

H

ữ 5

H=3-4
4

6 β-amylase khá
50 - 65o . β-amylase


70o . β-

ấ
y
y s β-

ẹ

ỉ

y s

y s

ụ

ụ

.
+2

ữ

α-

.

H nh 1.2 Cấu trúc không gian của β-amylase ( />ụ

β-

y s : β-

α-1 4
y

trong

β-

ử
ầ

ụ

y s

54 - 58%

y

s

ầ
β. T

E y

y s

y

ử

α-1,6.

y

y s
β-amylos .

β-

ỉ
ầ

ầ .Q

ì

y

y

y

ử
ử

s

y sẽ

y

α-1 6

y s

ứ

y

ầ

ẳ

.
tn v

c)

t

lu o m l se (α-1,4 glucan-

glucohydrolase)
y
ữ
ử

ú

T

ấ

ử

ys

y s

ấ

ấ

ữ 27.000

112.000

ử

y s
.
5

.
.
ứ
y s

T
ấ


ữ

ứ

5

20%

ử

s

manose và glucosamin.
ẳ

y s

ấ.

ẳ

y s

6 5;

Aspergillus niger

Aspergillus awamori là 7,5; Rhizopus delemar là 7,4.

H nh 1.3 Cấu trúc không gian của glucoamylase ( />G

y s

ầ
G

y

α-1,4 glucan trong polysaccharide,

ự

s

y s

ú

. G

y s

ys

y

α-1 4

ử

α-1,6
y

s .

y

α-oligosaccharide. Ngoài các liên

α-1 6

α-1 2

li

.

y

s
α-1 4

ử

y

ầ

ù

ầ

s

y s

y

α-1,3 glucoside.

s

y s

ự

ù

y

”. T
40 - 60oC.

H 3 5 - 5 5;
2

Glucoamylase t

“

3

AM-1 (HM), AM-2 (LM)
ụ

y s v
q

sự

s
ấ

ấ

ì
6

y
1

ử

s


.

Ty T

Hs

-COOH và COO- thì tham gia vào quá trình

ấ

ú

.V

y

α-1 4

y
S

ì

y
y

s

ú

.

y

y s

e

α-1 4
G

y

s :

y s

Rhizopus delemar

100% glucose

α-1,6 )

y s

80 - 85% glucose + Oligosaccharide

Aspergillus niger

oligosacca

khác nhau

tn v

c)

không
ấ

G

T

α-1 6

ự
q

T

Hs

t

pullulanase (α-dextrin 6-

glucosidase)
E y

y

ỷ

α-1 6

.

pululan và các

úý
y

α-1 4

sự
sự

α-1,6

ầ
ấ

α-1 4

s

ữ
ầ

s

q
ữ

s

ụ

s

s
y

ỉ

ì

α-,6 glucoside.

α-1 6

α-1 4.
ấ

y

ấ ý
ử

T

α-1,6 có

.

y.

ử

y

ứ
xtrin phân

α-1,6 glucoside.

α-amylase và

s

y

y

phân hồn tồn.
s
ụ

H

y

y

ì

.

10 – 50oC. Ion Ca2+

5-7
H

7

2+

, Zn2+, Cu2+, Ag2+ và Co2+


H nh 1.4 Cấu trúc không gian của enzyme pullulanase
( />tn v

d)
tớ

t

ol o-1,6-glucosidase hay dextrinase

ạn
E y

y

ỷ

α-1,6-glucoside trong isomaltose,
.E y

panose và
s
ầ

y

.

s

-1,6-

ầ

y

s

ầ

y

s

y

-1,6-glucosidase hay R-enzyme và dextrin-1,6y

glucoside hay amylo-1,6-glucoside hay dextrin-6y

y

ỷ

α-amylase và β-

ỷ

s
y

30oC; pH 5,0 - 6 0 s
y sẽ

y
96

s .H
y s

.
40oC và H

s
là 5,1.H

y

Rhizopus delemar

.

H
50o s

15%

8

y
2

y
.


H nh 1.5 Cấu trúc không gian của oligo-1,6-glucosidase
( />tn v

e)

t

Ở

ấ

s

Aspergillus, enzyme transglucosidase ln ln

y s .T
y
y

. Vì
sự

s

ữ

sy

s

s

.T
y

s

ử
s .

9

s

ý ấ
s

ụ

s

s

s

s ; ứ

ử

s

α-1,6 glucoside. Pazur
s

s

s

s

s

ụ
y

s

s

Aspergillus niger

s
ỉ

s

y s .T
α-1,4

y

trên DEAE -

sf

sự

ú
y

s
s

y

s

16

s

sự

ầ

ự

tr ns lu os d se

s

s
α-


Hì

1.6 Q

ì

y

sự ú

s

y

amylase( />1.1.2

sn v tt n

p m l se

V s
ấ

y s
ấ

ù
ì

ù

s

.

y s

s :

ấ

: Aspergillus, Rhizopus.

ấ

: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces
: Bacillus mesentericus, B. subtilis, B. macecassavanum,

Vi kh

Clostridium acetobutylium, Penicillium saccharophila,…
s

4–6 ầ s
ú

s
1.1.3

.

n dụn

m l se v s n v t

y s

s

sử ụ

:

y
ấ

s
ì

q

ự

s

ầ

ấ

s

ấ
ầ

…

10

ầ
ỗ

1.1.4 Tình hình nghiên cứu v amylase
n

1.1.4.1

n n

i n ứu tron n ớ

Ở

ấ

ì

y s

s

ứ

ụ

s

ứ

ấ

y

S s
y

s

.

ứ

y s

ì

“

ứ

Asp.niger TH3 – 19
ù

y

y s

s

”

.V.H

sự.

2003 H

ứ

ấ

ỷ

s

ấ
V

s

ứ

ầ

y s

y

S

s

.

ấ

ứ

s

ấ

ứ

ỷs
s

ầ

q y

-S và Bio-E q
α–

ính

y s

y s

s

T. H s

ì
s

y
.

q

ử

s

ấy s

15-20

1 1-1 3
n

1.1.4.2

n n

ớ

ầ

y

S

T
các c ấ

ứ

ứu

ứ

.W

s

ứ

Asp. flavus .
.
s

ấ

.

y

s

2001.

Asp.carbonarius
ì

ì

f

2001

Gầ

s

ì

sự s

y
s

ứ .

:
ì

y

ữ

n ứu trên t

T
y s

s

y

U
ứ “

S

ứ

s
y s

11


Aspergillus” 2008
s
1.2

w

y ase và gl

T y

..

ấy sự

y s

ấ

q

ữ

y.

Enzyme cellulase

1.2.1 K

n m v enzyme cellulose
s

ứ

β-

y

s .T

y

y

s

q
ụ

ử

ứ

s

s

ứ

s

y

là Exo-β-(1,4)-glucananse hay enzyme C1, Endo-β- glucananse hay
s

y

β-(1,4)-glucosidase hay

-ase hay Cx

cellobioase:
 Exo-1,4cellobiose

s

y

y

s

ầ

s
ử

ụ

s

s

ầ .T
s

ụ

ì

ụ

õ
õ

s
ỗ

s

s
ùy
y

y
ì

y

s

E

3.2.1.21
s

s

ì
.

ấ

ụ

s .

 ß-1,4-glucosi s

ỗ

y

ù

ù

s

s

-1,4ử

.E y

y
ùy

s .

s
y

.

E 3.2.1.4

ỗ

y

y
s

s

ß-1,4-glucoside và
ì

ụ

ì

 Endo-1,4-glucanase (hay CMC- s
q

1 E 3.2.1.91

ứ

ứ

y

s

ú
ấ

ß-glucosi s
s .

12

ẽ

ỉ

sự

y


1.2.2

tác dụng c a enzyme cellulase
s

y
s

ứ

sự

y

s

cùng thành glucose.

Sự

s

3

y

ụ

y

s

y

s :

T

ứ

y

ấ

ụ

s

sẽ

ú

.T

y

ụ

s

1

ứ

ú

ose hòa tan

y

x

cellobiose.
Ở

ù

ụ

s E 3.2.1.21

s

y

ß-1,4-glucosidase (hay

y

s .

H nh 1.7 Cơ chế tác dụng của cellulase

1.2.3 Vi sinh v t t ng h p enzyme cellulase
T

ự
y

s

s
.

y

VSV

ù

y

s .S

y

ự
q

y
VSV

ấ

s
ấ

VSV

ú.

ú

s
s
ấ

s
ấy

ì

i này.

13


ảng 1.1
Nấ

ột số S sản uất cellulase

s

X

V

Aspergillus niger

Actinomyces aureus

Preudomonas

A.oryzae

Act.cellulose

Fluorescens

A.terreus

Act.diastaticus

B.megaterium

A.syndovii

Act. roseus

B.mensenteroides

A. flavus

Act.griseus

Clostridium sp

n dun

1.2.4
H

enz me ellul se

y

y

s

ứ

ụ

:

ự
ứ

s

ấ

ẽ
s

sú

ấy

s

ấ

y

s

s

y

s

q

s
n

ấ

...

s

1.2.5

ấ

n n

n ứu v

.

ellul se

1.2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên th giới
ấ
y

:

. .
. Esw

s

ấ

ứ

y

s
ấ

s
.

.

H. . 2008

ấ

s

.

s Y. .

ấ

s

s

ứ "T
sử ụ

ụ

R. . 2011 "T

F

ss s . R

2010

ấy
s

n

men ", Bioresour.
Nghiên ứ
s

Annamalai N., Elayaraja S., Vijayalakshmi S. và
T. - T

s
trong T

f

s

s sử ụ
ứ H

lipase
ầ

s

ấ
5 2011

14


1.2.5.2 Tình hình nghiên cứu tron n ớc
T

ữ

s

ầ

y

V

s

y cellulase ( H
ì

Q

sự 2003; T

sự 2007;
ứ

y

ứ
sự 2006 .

y

ấ

s

s y

giá
s

:

s

y

ứ

s
H 1 T

y

s
ấ

ữ

s

ý

.

s

ì

penicillium sp. DTQ -

sự 2007 .

ứ

s

X S2

sự 2006 .
y

T

Tú

y
yT

y
T

ì
s

ầ

ứ 2. N

Q y

ì
y

q

.b
2015.

T

ứ

y

s

sp. NDV 01

.

15

ấ
2011.

sự


HƯ

2.

U

ụ t un

2.1

À HƯ

H

H

U

n ứu

 X

ầ

s

ấ


VSV

.

s

y

y s

s

ấ.

vi sinh
2.2 Nội dung nghiên cứu


y

s

VSV

s

y

.
 Nghiên cứ S
y

s

VSV

.

 X

s

s

.

tl u

2.3

Tấ
H y

ấ

Q
ụng ụ t

2.4.1

s

T .H
t bị dụn

2.4
T

y s

X

Y -

.

ụ và

ất

tb

ấy vơ trùng

T

ử

ử ù

Ố

T ấ
ì

Máy ly tâm
q

y

s

Pipet

y
2.4.2 H

ất
y

G

s

ấ

3

ấ

T

K2HPO4

KNO3

NaCl

FeSO4.7H2O

CMC

KH2PO4

16

ứ


2.5

n p

pn

2.5.1

n p

p lấ mẫu

T

n ứu

ấ

-T .H

s

Y -H y

Q

.

T

ù

ỗ

ấ

s
n p

2.5.2

ẹ

ầ

ấ

ụ

ự

…

5 – 20 cm.
pp

nl p

H nh 2.1 Sơ đồ d y pha lo ng, phân lập vsv từ m u đất
n

n p

nl p

ấy 10

mẫu ất n

ấ

s u:

ì

ứ 90

ấ

ù

.

10-1 - 10-5. ấy 1
ứ
ứ

ấ

ì

ứ 90

ứ

s

ấ

ấy 1

y

.
ấ

ch L
ù

. ù
10-3,10-4, 10 -5

lỗng

y
S

.

ấ

ù

q

3
.
37 0 . S

ấy

n

ú 0.1

ấy
q

ử

s

ẵ

ầ
ù

th ch.
17

24

q

c.


G s I
ù

. ù
10-3,10-4, 10 -5

lỗng ,
y
S

.

ấ

ù

q

:

ú 0.1

ấy

.
370C. S

q

s

ù ì

5 - 7 ngày

ầ

ì

.

.
ấ

. ù
3

2-3
s

ử ù

. ù
.S

q

ấ

,

ú 0.1

10-3,10-4, 10 -5
370C. S

ử

3

ấy

ấ

ấ

n

y

s

ấ

q

ấy

ấy

ấ

ầ

u ý:

ự

trùng:
T y

ú

ấy

ấy
v t uần k

ử ù

ử ù

.

UV.

t k uẩn lạ :
ữ

ấy

ấy

ẽ

ỗ

ầy

ấy

ghi kí

ứ

ấ
s

ấy
s

24

s

ầ .

37 0C. Sau
5-7

VSV

ầ

ấy

ầ
.

ầ
ữ

ấ

ì ấy

ng

ấ

s

ù

q
ấ

y

ấy
37o . S
18

ấy
2-3

y

ấ
ầ


q

s

ầ

ấ
ấ

n p

2.5.3

ầ

ù

s

s

p

:

s

s

ữ

ịn s l

.

n k uẩn lạ

m

tr n

s

ú

ú

4

ầ

.V

s

y

ỗ

ỗ

s

ấy
q :

ý

.T y

ự

ì

y

ầ

ấy

2-3

. Vì

y

ì .

y

ì

ấ

y

s
“

.

ù
ì

”
y

FU - Clony Forming Unit).

s

FU

1

ữ

s y
ấ

s

T

ứ s :

CFU/g = A.1/k.1/V
T

:
s

ì

ù
ấ ấy

V

ấ

S

.

ấy

.

FU 1

s

ấy 0 1

.

FU

ấ
n p

2.5.4

ữ gi ng và cấy chuy n

s

ẽ ấy
.T

ầ

ấy

.G

40

ấ
ỡ

ấ

30 - 300
p

S

1

ầ
1

q
.S

s

1
.T

.
19

ấy
sử ụ

y

ì
ầ

ầ

ểm sinh h c c a các ch ng vsv tuyển ch n

2.5.5 Nghiên cứu một s
n pháp p

2.5.5.1

n loạ qu n s t
q

VSV
q

ểm

s

.

ấy

ì

ự

ỉs :


.



.



s



.

Hì




Hì

s
n p

2.5.5.2

s

ấ

p n uộm gram

y

sử ụ
õ

ì

s

.

u n tắ : Sự
trình ấ

s

ụ

s
.

y

y
ấ

ụ

ữ
G

n :

.

+

ữ
ù

y

ấ

ữ

ứ

y

ụ
ữ

quá
q

ứ

y

t n

ấ

-)

ấ

ù

q

ấy

ấy

.H

ử
q

è

ì

ầ

2-3 ầ
sẽ

sẽ
ú

.

y

.
G

ữ 1-2

úý

ử

y
ấ.T

tiêu
20