Nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận và thử nghiệm ứng dụng gama PGA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP
----------o0o----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN THU NHẬN VÀ
THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG GAMA-PGA
NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ

: 7420201

Giáo viên hướng dẫn
Sinh viên thực hiện
Lớp
Khóa

: TS. Nguyễn Như Ngọc
: Lưu Thị Thơm
: 60_CNSH
: 2015 – 2020

Hà Nội, 2020


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin cảm ơn sâu sắc đến cô TS. NGUYỄN NHƯ NGỌC –
Trường Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam, là người đã tận tình hướng dẫn và giúp
đỡ tơi trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thành đề tài nghiên cứu.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô ở Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh của

Viện Cơng Nghệ Sinh Học Lâm Nghiệp - Trường Đại học Lâm Nghiệp đã chỉ
bảo, tạo điều kiện giúp tơi hồn thành đề tài nghiên cứu này.
Thơng qua q trình thực hiện đề ra, tơi đã học hỏi được nhiều điều và rút
ra cho mình nhiều kinh nghiệm q báu để giúp ích cho cơng việc sau này của
bản thân. Vì kiến thức cịn hạn chế, trong q trình thực hiện, hồn thiện đề tài
này khơng tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến đóng
góp từ các thầy, cơ.

i


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ATP

Adenosine triphosphate

CFU/ml

Colony forming unit

D,L-PGA

Axit D,L- Poly γ- glutamic

D-PGA

Axit D-Poly γ- glutamic

K – γ-PGA

Kali – γ-PGA

L-PGA

Axit L-Poly γ-glutamic

NCBI

Trung tâm thông tin công nghệ Sinh học quốc gia – Mỹ

TCA

Axit Tricarboxylic

v/p

Vòng/ phút

γ-PGA

Axit Poly γ- glutamic

g/l

Gram/lít

ii

MỞ ĐẦU
Việc nghiên cứu tạo ra những sản phẩm có nguồn gốc từ quá trình lên
men hiện nay đang là một xu hướng mới, tiến bộ bởi tính an tồn, khả năng ứng
dụng cao, ít ảnh hưởng đến mơi trường sống. Trong lĩnh vực công nghiệp thực
phẩm ở Việt Nam hiện nay, việc lạm dụng các phụ gia có nguồn gốc hóa học
đang được sử dụng bừa bãi, với việc nhiều loại hóa chất cơng nghiệp được sử
dụng trong chế biến thực phẩm. Do đó, việc nghiên cứu ra những loại phụ gia
thực phẩm mới, phù hợp tiêu chuẩn an tồn, được các tổ chức trong nước và
quốc tế cơng nhận đang là mối quan tâm lớn của các nhà khoa học trong nước và
thế giới.
Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) là một polymer sinh học được tạo thành từ
các phân tử axit glutamic. Với ưu thế là một polymer có khả năng phân hủy,
không độc với con người và tự nhiên nên γ-PGA đang được nghiên cứu và ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong công nghệ môi trường, γ-PGA được
sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình lắng; trong y dược, γ-PGA được dùng
như các chất mang, chất giữ ẩm... Trong công nghiệp thực phẩm, γ-PGA được
sử dụng như một dạng phụ gia ổn định chất lượng sản phẩm, chất chống kết
tinh, chất ổn định… Hiện nay, axit poly γ-glutamic được sản xuất bằng cách
trùng hợp các axit glutamic, thơng qua con đường tổng hợp hóa học, hoặc bằng
con đường lên men sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axit
poly γ-glutamic.
Để đáp ứng một phần nhu cầu đó đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men
thu nhận và thử nghiệm ứng dụng γ-PGA ” nhằm khai thác những những điểm
mạnh của vi khuẩn Bacillus, để tạo ra sản phẩm lên men an toàn cho chế biến
thực phẩm ngày nay.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1.

Giới thiệu về axit poly γ-glutamic
Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) là một polymer tự nhiên, mang điện tích

âm, có các đơn phân là axit L-glutamic hay axit D-glutamic hoặc chứa cả hai
đơn phân trên liên kết với nhau bằng mối liên kết giữa nhóm γ-carboxyl và
nhóm α-amino [25, 38]. Khả năng tham gia phản ứng hóa học với nhóm α-NH2
của nhóm α-COOH và γ-COOH theo thứ tự giảm dần theo mạch.. Nhờ quá trình
polymer hóa, γ-PGA có thể được hình thành từ hơn 10.000 phân tử axit
glutamic. γ-PGA có thể được hình thành với 3 loại khác nhau, trong đó có D-γPGA, L-γ-PGA và hai dạng này sẽ đồng trùng hợp tạo ra D,L-γ-PGA gọi chung
là γ-PGA [38].

Hình 1.1: Cấu trúc γ-PGA [4].
Hiện nay, cần phải nghiên cứu nhiều chủng vi khuẩn hơn để sản xuất γPGA có năng suất cao với các tính chất khác nhau. Nhiều ứng dụng y tế (đặc
biệt là phân phối thuốc) đã khai thác α-PGA. Vì γ-PGA thực chất khác với αPGA (nó khơng liên quan đến bước điều chỉnh hóa học và khơng nhạy cảm với
proteases) nên nó có thể được sử dụng tốt hơn trong các ứng dụng y học. Phân
tích sản xuất γ-PGA và kiến thức về enzyme và gen liên quan đến sản xuất γPGA sẽ không chỉ giúp tăng năng suất, giảm chi phí sản xuất mà cịn giúp hiểu
được cơ chế hoạt động của γ-PGA để ứng dụng rộng rãi hơn.
1.2.

Cơ chế tổng hợp γ-PGA
Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để làm sáng tỏ con đường trao đổi

chất và các enzym có liên quan đến q trình polymer hóa tạo γ-PGA nhằm tăng
hiệu suất chuyển hóa của vi khuẩn bằng việc tác động vào các enzym trong quá
2


trình tạo γ-PGA. Đã có nhiều nghiên cứu cơng bố cho thấy sự tham gia của

enzym transglutaminase của B. subtilis NR-1 là yếu tố chính xúc tác sinh tổng
hợp γ-PGA và cơ chế đồng phân hóa L-glutamic sang D-glutamic nhờ enzym
alanine recemase. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng phản ứng kéo dài chuỗi γpeptid được xúc tác bởi hệ enzym: glutamate dehydronase, glutamine
synthetase, pyruvic acid aminotransferase, PGA synthetase [22]. Tuy nhiên, B.
anthracis và B. subtilis khơng có sự chuyển hóa này mà vẫn tạo ra γ-PGA. Điều
đó chứng tỏ đây không phải là cơ chế tạo ra γ-PGA mà thực tế chỉ là một bước
trong cả một quy trình chuyển hóa tạo γ-PGA [12].
Các nghiên cứu đã chỉ ra chủng B. licheniformis 9945A có hệ enzym tổng
hợp γ-PGA dạng tự do là glutamyl transamidase. Hệ enzym này xúc tác cho việc
tạo ra một loại γ-PGA chứa 60% axit L-glutamic và trong q trình tổng hợp
này địi hỏi phải có sự tham gia của Mn2+ với vai trò co-factor [28].
Việc chuyển hóa tạo γ-PGA cần sử dụng các hệ enzym đa dạng tùy thuộc
vào hệ vi sinh và môi trường ni cấy. Sơ đồ hình thành nên γ-PGA được minh
họa trong hình 1.2 như sau:

Hình 1.2: Con đường sinh tổng hợp γ-PGA [23]
Con đường sinh tổng hợp γ-PGA được nghiên cứu và đưa ra từ năm 1982
bởi Hara và các cộng sự vẫn là vấn đề đang gây tranh cãi giữa các nhà khoa học,
bởi mỗi chủng vi khuẩn có những cách chuyển hóa riêng [23]. Tuy nhiên có một
3


số điểm chung trong các nghiên cứu về con đường tổng hợp γ-PGA là: từ các
hợp chất polysaccharide sau khi chuyển hóa thành các dạng đường cơ bản là
glucose hoặc sacccarose được vi khuẩn chuyển hóa qua q trình đường phân
thành axit pyruvic. Từ axit pyruvic nhờ sự chuyển hóa của vi khuẩn qua chu
trình TCA chuyển hóa thành axit α-ketoglutaric. Với sự tham gia xúc tác của
NH4+ , phản ứng chuyển hóa axit α-ketoglutaric và L-glutamine thành axit Lglutamic. Nhờ axit α-ketoglutaric và axit pyruvic mà axit L-glutamic có thể
chuyển hóa một phần thành D-glutamic. Giai đoạn polymer hóa nhờ sự xúc tác
của enzym PGA synthetase sản sinh bởi vi khuẩn, các phần tử L-glutamic và Dglutamic liên kết với nhau thành D,L-γ-PGA.

 Quá trình tổng hợp γ-PGA nhìn chung có thể tổng kết qua bốn giai
đoạn là:
- Giai đoạn 1: Q trình racemic hóa γ-PGA: Do γ-PGA là một hỗn hợp
chỉ gồm L hoặc D –glutamic hoặc cả D và L glutamic, tùy thuộc vào chủng vi
khuẩn tham gia. Tuy nhiên, để có được D-glutamic cần phải có q trình
racemic hóa từ L-glutamic. Vi khuẩn B. subtilis, có đoạn mã gen liên quan đến
sự hình thành enzyme có khả năng racemic hóa là glr và yrpC. Trong đó glr là
enzym cytosolic có khả năng lựa chọn glutamic cao và đặc biệt đối với Lglutamic. Quy trình racemic hóa L-glutamic thành D-glutamic được xảy ra như
sau: Lglutamic được enzym pyruvic aminotransferase xúc tác chuyển hóa thành
L- alanine, sau đó L-alanine được enzym alanine racemase xúc tác racemic hóa
thành D-alanine. Cũng nhờ xúc tác của enzym pyruvic aminotransferase mà Dalanine chuyển hóa thành D-glutamic [22, 38].
- Giai đoạn 2: Quá trình polymer hóa γ-PGA: cơ chế polymer hóa các
phân tử γ-PGA phụ thuộc vào các phần tử ATP được chỉ ra trong hình 1.3. Đầu
tiên là nhóm carboxyl ở cuối của phân tử γ-PGA kết hợp với nhóm phosphoryl
từ gamma phosphate của ATP. Tiếp theo, nhóm amino của axit glutamic tấn
cơng thay thế vào các phần tử phosphorylated trên nhóm carboxyl, kết quả hình
thành liên kết amin mới làm kéo dài mạch γ-PGA [40].

4


Hình 1.3: Phản ứng polymer hóa γ-PGA bởi ATP [40]
- Giai đoạn 3: Quá trình phân cắt γ-PGA (depolymer γ-PGA): hai enzym
(endo-γ-glutamyl peptidase và exo-γ-glutamyl peptidase được chứng minh là
những enzym phân cắt γ-PGA. Trong thực tế đã chứng minh có sự phân cắt γPGA trong canh trường do enzym ngoại bào của vi khuẩn B. subtilis NX2, là
nguyên nhân giảm khối lượng phân tử γ-PGA [46]. Những enzym này được thể
hiện rõ ở pha cuối của quá trình sinh tổng hợp.
- Giai đoạn 4: Quá trình điều tiết γ-PGA: Theo nhiều nghiên cứu quá trình
sinh tổng hợp γ-PGA được điều tiết bởi các gen ComPA, DegSU và DegQ điều
khiển mức độ phiên mã để thể hiện các đặc tính cảm ứng tối thiểu, thẩm thấu và

sự biến đổi pha.
1.3.

Tính chất của γ-PGA
Axit poly γ-glutamic có thể bị phân hủy sinh học, không độc với môi

trường, sinh vật và con người. γ-PGA hòa tan tốt trong nước và tạo được các
liên kết bền vững với nước, do vậy khả năng giữ nước được xem là một tính
chất nổi trội của γ-PGA. Nó có thể được phân tách với các thành phần trung tính
khác nhờ sắc kí giấy. γ-PGA khác biệt với protein cả về cấu trúc và tính chất
chính bởi liên kết γ-peptid. Thường thì các liên kết α-peptid bị phân cắt bởi
protease nhưng liên kết γ-peptid trong γ-PGA chỉ có thể bị phân cắt sinh học bởi
enzym γ-GTP [38].
Axit poly γ-glutamic có thể kết hợp với một số ion kim loại để tạo nên các
loại muối dạng phức với các ion: Na+ , K+ , Mg2+, Ca2+, NH4+ có ứng dụng rộng
rãi trong ngành y tế, môi trường, mỹ phẩm [32].
Kích thước cũng như khối lượng của axit poly γ-glutamic rất đa dạng, phụ
thuộc vào cấu trúc cũng như dạng liên kết của nó với các chất khác trong canh
trường vi sinh vật. Khối lượng trung bình của các phân tử γ-PGA từ vài kilo
dalton đến hàng triệu kilo dalton. Nhìn chung, các phân tử D,L-γ-PGA thường

5


có khối lượng lớn hơn nhiều so với D-γ-PGA hay L-γ-PGA và dạng neo giữ
thường có kích thước nhỏ hơn dạng tự do [18].
Tùy vào điều kiện mơi trường hình thành khác nhau mà γ-PGA có 5 dạng
hình thể là: cấu trúc xoắn anpha, thẳng beta, xoắn cuộn liên tục ngẫu nhiên, cuộn
ngẫu nhiên, bao phủ thành khối thì điều kiện mơi trường hình thành khác nhau.
Đối với các dạng D-PGA và L-PGA riêng rẽ, chúng có khả năng tan trong

ethanol, nhưng khi chúng là một hỗn hợp đẳng mol thì bị kết tủa trong ethanol.
Axit poly γ-glutamic có độ nhớt cao ngay cả khi ở nồng độ thấp chính bởi
vậy người ta sử dụng phương pháp đo độ nhớt để xác định γ-PGA [28].
1.4.

Phân loại γ-PGA
Có thể phân loại γ-PGA dựa vào cấu trúc và phương thức tồn tại trong

canh trường vi sinh vật.
1.4.1. Theo cấu trúc
Dựa trên cấu trúc, γ-PGA được phân làm 3 loại sau:
 Loại 1: Axit poly γ-D-glutamic (D-γ-PGA): chỉ chứa các đơn phân là
axit D-glutamic và loại polymer này hiện nay mới được chứng minh chỉ tạo ra
bởi chủng vi khuẩn B. anthracis một chủng vi khuẩn được tìm thấy trên các vật
chủ bị bệnh than [9, 17].
 Loại 2: Axit poly γ- L-glutamic (L-γ-PGA): là polymer chỉ chứa các
đơn phân là axit L- glutamic loại này được sản xuất chủ yếu từ các vi khuẩn
Natrialba aegyptiacia một loài ưa mặn, γ-PGA được sinh ra trong vi khuẩn này
nhằm để chống lại sự mất nước của vi khuẩn trong điều kiện môi trường nước
biển. L-γ-PGA cũng được tìm thấy rất nhiều trong các động vật có xúc tu (sứa
biển, san hơ) và thành phần chính trong chất dính của Hydra. L-γ-PGA kết hợp
với các cation như Ca²+ , Mg2+ và K+ giúp vi khuẩn và các sinh vật khác điều
hòa áp suất thẩm thấu bên trong tế bào [10].
 Loại 3: Axit poly γ-D,L- glutamic (DL-γ-PGA): là polymer trong
phân tử chứa cả axit L-glutamic và axit D-glutamic, DL-γ-PGA được sản xuất
chủ yếu từ Bacillus và được chia thành 2 nhóm:
 Cần bổ sung axit L-glutamic vào môi trường nuôi cấy để tổng hợp γPGA.
6

 Không cần bổ sung axit L-glutamic vào môi trường nuôi cấy để tổng
hợp γ-PGA.
Tỷ lệ đồng phân D/L trong DL-γ-PGA thường phụ thuộc vào tỷ lệ Mn2+
trong môi trường phát triển của vi khuẩn và tùy thuộc vào loài vi khuẩn [10].
Đồng phân của axit poly γ-glutamic được hình thành bởi D và L-Glutamic tùy
thuộc vào chủng giống vi sinh vật tạo ra.
1.4.2. Theo phương thức tồn tại trong canh trường vi sinh vật
Dựa vào phương thức trong canh trường vi sinh vật, có 2 dạng như sau:
- Dạng 1: Axit poly γ-glutamic dạng neo giữ: Chủ yếu có trong vi khuẩn
B. anthracis đối với loài vi khuẩn này γ-PGA là một hợp chất có tác dụng kháng
thực khuẩn thể, ngăn cản chúng tấn công vào bên trong tế bào. Dạng neo giữ
thường được tìm thấy dưới dạng nội bào, được tiết ra ngoài dưới dạng các sợi
liên kết giữa vi khuẩn và mơi trường ngồi khi gặp điều kiện bất lợi. Do vậy
việc sử dụng γ-PGA từ dạng neo giữ ít được nghiên cứu [25].
- Dạng 2: Axit poly γ-glutamic dạng tự do được tiết trực tiếp vào mơi
trường ni cấy: Dạng này chủ yếu được tìm thấy trong các lồi lành tính của
chi Bacillus mà điển hình là B. subtilis. Lồi vi khuẩn điển hình cho γ-PGA
dạng tự do là B. subtilis, γ-PGA chủ yếu tạo độ nhầy bao quanh tế bào vi khuẩn
và có vai trị cung cấp chất dinh dưỡng cho chúng trong trường hợp môi trường
thiếu dinh dưỡng, trong giai đoạn suy vong của vi khuẩn [40].
1.5.

Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA
Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh axit poly γ-glutamic được

sản sinh bởi các chủng vi khuẩn thuộc các loài: B. subtilis, B. licheniformis, B.
thuringensis, B. cereus, B. pumilus, B. amyloliquefaciens, B. mojavensis, B.
atrophaeus, B. megaterium, Staphylococcus epidermidis, Natrialba aegyptiaca,
Lysinibacillus sphaericus và Fusobacterium nucleatum trong đó một số chủng vi
khuẩn này đã được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp và đời sống

[18, 44].

7


Có nhiều nghiên cứu cũng cho thấy tất cả các vi khuẩn tạo ra γ-PGA đều
là vi khuẩn Gram dương và chủ yếu là các vi khuẩn thuộc chi Bacillus, γ-PGA
có chức năng đa dạng khác nhau tùy theo lồi tổng hợp và môi trường của
chúng. Trong những chủng vi khuẩn sản sinh ra axit poly γ-glutamic, thuộc chi
Bacillus các nghiên cứu đi sâu hơn vào các chủng của loài B. subtilis, đây là
những vi sinh vật được sử dụng rất phổ biến trong công nghiệp và các nghiên
cứu cũng chỉ ra rằng chúng có lợi cho đường ruột. Trong tự nhiên, chúng được
phân bố rộng rãi và phổ biến: cỏ khô, bụi, đất nước… B. subtilis là trực khuẩn
nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương, thuộc họ Bacillaceae, đứng riêng rẽ hoặc kết
thành chuỗi, sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí khơng bắt buộc,
pH mơi trường có độ biến động cao. Chúng có khả năng hình thành bào tử khi vi
khuẩn gặp điều kiện bất lợi như dinh dưỡng trong môi trường bị cạn kiệt, hàm
lượng kháng sinh, chất ức chế cao, nhiệt độ quá cao hoặc q thấp hoặc biến
động mạnh… Bào tử có kích thước nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào. Bào tử
có thể quan sát được dưới kính hiển vi bằng phương pháp nhuộm bào tử hoặc
nhuộm gram. Nhờ tính chất đặc trưng này mà có thế phân lập được B. subtilis
trong mơi trường.
1.6.

Các yếu tố ảnh hưởng tới quả trình sinh tổng hợp γ-PGA

1.6.1. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng
Nguồn dinh dưỡng là yếu tố cốt lõi để vi sinh vật sinh trưởng và tạo thành
các sản phẩm mong muốn. Các chủng vi sinh vật tạo ra những sản phẩm khác
nhau khi được nuôi cấy trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau. Thơng

thường mỗi sản phẩm đều có một môi trường đặc hiệu khác nhau, sau nhiều năm
nghiên cứu về γ-PGA các nhà khoa học trên thế giới đã đưa ra một môi trường
đặc hiệu riêng, cơ bản cho các loại vi khuẩn sinh γ-PGA (môi trường E). Thành
phần mơi trường E được trình bày trong bảng 1.2:

8


Bảng 1.2: Thành phần môi trường cho vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA
Thành phần

Nồng độ (g/l)

Axit L-glutamic

20

Axit citric

12

Glycerol

80

NH4Cl

7

MgSO4.7H2O

0,5

FeCl3.6H2O

0.04

K2HPO4

0.5

CaCl2.2H2O

0,15

MnSO4.H2O

0,1

Môi trường dinh dưỡng này được gọi tắt là môi trường cơ bản E. Tùy
thuộc vào từng loại vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA mà sự điều chỉnh các thành
phần trong môi trường dinh dưỡng bao gồm: nguồn carbon, nguồn nitơ, nguyên
tố vi lượng trong đó có Mn2+, Mg2+,...[33]. Những yếu tố này được thay đổi phụ
thuộc vào chủng giống vi khuẩn khi tổng hợp và những tính chất đặc điểm cần
đạt của γ-PGA như khối lượng phân tử, năng suất, tỷ lệ đồng phân D và Lglutamic trong γ-PGA.
1.6.1.1.

Nguồn carbon

Cùng với việc sử dụng các chất hữu cơ sẵn có trên thị trường như axit

citric, đường glucose, glycerol, muối khoáng, vi lượng…, Q trình nghiên cứu
và ứng dụng ln hướng đến việc sử dụng những hợp chất sẵn có trong tự nhiên,
các phế phụ phẩm từ quá trình sản xuất khác (nước đậu, dịch chiết của một số
quá trình nên men…) làm cơ chất cho q trình nghiên cứu; để từ đó tận dụng
được triệt để các nguồn phát thải, cũng như giảm giá thành sản xuất, nhằm nâng
cao hiệu quả ứng dụng [20].
Theo một số nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, vi khuẩn B.
subtilis có thể sinh tổng hợp γ-PGA từ các nguồn carbon có trong đậu tương, do
9


đậu tương có thành phần dinh dưỡng như: protein (35-45%), ngồi ra cịn có các
loại axit amin cơ bản isoleucine, leucine, lysin, methionine, phenylamin,
tryptophan, valin… isoflavones. Trong đậu tương axit glutamic chiếm khoảng
10g/kg là thành phần chính tham gia vào q trình tổng hợp γ-PGA. Ngồi ra
đậu tương có chứa: glucose (15-25%), nước (8%), chất vơ cơ, muối khống như
Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S (5%), vitamin: A, B1, B2, D, E, F, globulin, chất xơ...
Những nghiên cứu về thành phần của đậu tương đã cho thấy, đây có thể là
nguồn thức ăn cung cấp nhiều dinh dưỡng cho vi khuẩn Bacillus tạo ra sản phẩm
γ-PGA có tính ưu việt, phù hợp với mục tiêu đề ra [45].
Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp γ-PGA đã sử dụng hai nguồn carbon
tự nhiên là bột đậu tương và bột mỳ làm cơ chất trên môi trường rắn. Những
nghiên cứu khác sử dụng nguồn carbon từ phụ phẩm của quá trình sản xuất natri
glutamat cho mơi trường sinh tổng hợp γ-PGA, để từ đó làm phụ gia thực phẩm
cho người và ứng dụng trong một số lĩnh vực có liên quan đến sức khỏe.
Nguồn carbon thường được sử dụng trong các nghiên cứu về γ-PGA gồm
đường glucose, galactose, lactose, sacharose, glycerol, glutamic... Ngồi nguồn
carbon là gluxit thì các chất hữu cơ khác như các axit béo phân tử lượng lớn
glycerol, axit hữu cơ… cũng được dùng làm nguồn C. Thông thường trong các
môi trường sinh tổng hợp γ-PGA các thành phần carbon thường được sử dụng là

glycerol, axit citric, axit L-glutamic. Nghiên cứu về các đặc tính và khả năng
chuyển hóa của 3 nguồn carbon là axit citric, glycerol và axit glutamic được cụ
thể như sau:
- Axit citric: Theo chu trình chuyển hóa γ-PGA việc sử dụng các nguồn
carbon từ axit citric là nguồn cacbon chính, bởi nó là mắt xích trung gian quan
trong trong chu trình axit tricacboxylic. Vì vậy nó xuất hiện trong trao đổi chất
của gần như mọi sinh vật. Hai phần ba nguồn năng lượng sử dụng cho các quá
trình trao đổi chất của vi sinh vật là lấy từ citric. Chu trình chuyển hóa axit
tricarboxylic cho thấy tất cả các hợp chất polysaccharide đều phải chuyển hóa
thành axit citric trước khi thành axit α-ketoglutaric và glutamic. Một số nghiên
10


cứu đã chỉ ra có thể khơng sử dụng glucose làm nguồn carbon khi tổng hợp γPGA, nhưng nếu không sử dụng axit citric trong thành phần của môi trường, thì
việc hình thành γ-PGA là rất ít hoặc khơng có. Tuy nhiên điều này chỉ đúng với
một số loại vi khuẩn.
Những nghiên cứu về sự ảnh hưởng của axit citric và các hợp chất
ammonium trong sinh tổng hợp γ-PGA trong một số chủng vi khuẩn như
Bacillus velezensis NRRL-23189 cho thấy có sự ảnh hưởng khơng nhỏ của yếu
tố NH4+ trong sự hình thành γ-PGA bởi yếu tố này là tác nhân trong chu trình
tổng hợp glutamic. Sự chuyển hóa của axit citric trong quá trình tổng hợp γPGA được khảo sát trên đối tượng là vi khuẩn B. licheniformis cho thấy với
nồng độ ban đầu là 12 g/l, sau 10 giờ lên men nồng độ citric giảm mạnh và gần
như bằng không sau 21 giờ lên men. Để tăng hàm lượng γ-PGA, các nghiên cứu
đã tiến hành bổ sung một lượng từ 2-5 g/l axit citric vào thời điểm sau 21 giờ lên
men, kết quả cho thấy lượng γ-PGA được cải thiện khoảng 15% [49].
- Glycerol: Glycerol tham gia trong chu trình tổng hợp này như một chất
xúc tác cho q trình polymer hóa L-glutamic. Ngồi ra vi khuẩn cịn sử dụng
glycerol như một dạng cơ chất để phát triển. Trong canh trường lên men γ-PGA
của vi khuẩn B. licheniformis ATCC 18 9945A, nồng độ glycerol cao trong canh
trường đã tác động đến lớp màng phospholipids trên lớp màng tế bào. Vì vậy các

phần tử C18:1 và C16:1 trong phospholipids bị giảm xuống và các phân tử
C12:0 và C10:0 tăng lên. Nhờ sự thay đổi này mà lớp màng tế bào của vi khuẩn
được giãn rộng ra, tạo điều kiện cho sự bài tiết γ-PGA qua lớp màng tế bào. Vì
vậy trong nhiều nghiên cứu với vi khuẩn B. subtilis NX-2, tác giả đã điều chỉnh
nồng độ glycerol nhằm thay đổi khối lượng phân tử của γ-PGA. Glycerol ảnh
hưởng đến hàm lượng γ-PGA ngay ở thời kỳ đầu của quá trình tổng hợp. Khi
hàm lượng glycerol tăng hàm lượng γ-PGA tăng, khối lượng phân tử γ-PGA
giảm, đồng nghĩa với việc giảm độ nhớt trong canh trường lên men.
Nghiên cứu về sự thay đổi nồng độ glycerol trong toàn bộ quá trình lên
men trên B. licheniformis cho thấy nồng độ glycerol thay đổi không đáng kể

11


trong khoảng thời gian 36 giờ đầu quá trình lên men, giảm khoảng 10-15% từ 36
giờ đến 50 giờ. Hàm lượng glycerol trong canh trường lên men còn lại 45-50%
sau thời gian 96 giờ và giá trị này tùy thuộc vào giá trị pH của canh trường nuôi
cấy. Giá trị pH càng gần 8 thì lượng glycerol cịn lại trong canh trường càng cao.
Những nghiên cứu về sự biến đổi glycerol trong canh trường lên men B.
licheniformis NCIM 2324 cho thấy lượng glycerol bằng không sau 96 giờ lên
men trong điều kiện sục khí và khuấy trộn ở tốc độ trên 750 vòng/phút. Glycerol
là nguyên nhân tạo độ nhớt trong canh trường, tác động đến sự trao đổi oxy của vi
khuẩn trong canh trường. Do vậy quá trình khuấy và glycerol có tương quan đến
nhau trong nghiên cứu sinh tổng hợp γ-PGA.
- Axit glutamic: Các nghiên cứu đi trước đã cho ta thấy γ-PGA được tạo
thành từ các thành phần chính là L-glutamic và D-glutamic thơng qua hệ enzym
polymerase của vi khuẩn. Tùy thuộc vào enzym được sinh tổng hợp từ các
chủng vi khuẩn mà tỷ lệ D-glutamic/L-glutamic là khác nhau và khối lượng
phân tử γ-PGA khác nhau. Dựa trên chu trình tổng hợp γ-PGA (hình 1.2) có thể
thấy axit glutamic trong quá trình tổng hợp γ-PGA được tham gia trong chu

trình bằng hai cách. Cách thứ nhất glutamic được thêm vào trong canh trường từ
ban đầu, cách thứ 2 glutamic được tạo ra từ các nguồn carbon khác. Theo một số
nghiên cứu về γ-PGA, vi sinh vật tham gia tổng hợp chia làm hai nhóm :
+ Nhóm1: Mơi trường địi hỏi sử dụng axit L-glutamic để kích thích tế
bào phát triển và tổng hợp γ-PGA
+ Nhóm 2: Mơi trường khơng địi hỏi axit L-glutamic để sản sinh γ-PGA.
Nhóm sử dụng axit L-glutamic bao gồm các chủng B. subtilis ATCC9945a,
IFO3335 và F-2-01... Các nhóm vi khuẩn khơng phụ thuộc vào axit L-glutamic
bao 19 gồm các chủng B. subtilis 5E, TAM-4 và B. licheniformis A35. Vi khuẩn
không phụ thuộc axit L- glutamic thường sử dụng axit citric và glucose làm
nguồn carbon chính cho việc tạo thành γ-PGA. B. subtilis A35 có thể sản sinh γPGA từ glucose và NH4Cl. B. subtilis TAM-4 có thể tạo ra một lượng lớn γPGA khi môi trường nuôi cấy chứa muối amoni và đường làm nguồn thức ăn
nitơ và carbon. B. subtilis 5E có thể sản sinh γ-PGA từ L proline như nguồn nitơ
12


và carbon trong mơi trường khống. Vi khuẩn B. licheniformic ATCC9945a sử
dụng axit citric và glycerol như một nguồn carbon chính, nhưng vẫn được đưa
vào nhóm phụ thuộc vào axit L-glutamic, bởi trong q trình chuyển hóa thành
γ-PGA thì glutamic được sử dụng như một dạng tiền chất, có tác dụng hoạt hóa
các hệ enzym tổng hợp γ-PGA.
Nghiên cứu sử dụng L-glutamic như một dạng tiền chất ở vi khuẩn B.
subtilis ZJU-7 cho thấy với hàm lượng glutamic ban đầu cao (trên 80 g/l) sẽ tạo
điều kiện thuận lợi cho việc tích tụ γ-PGA (54 g/l). Khi lượng glutamic ở mức
độ thấp (dưới 60 g/l) sự tích tụ γ-PGA vẫn hình thành (4-5 g/l), độ nhớt vẫn
tăng, nhưng kèm theo sự hình thành đáng kể các sản phẩm phụ gây nhớt có cấu
trúc fructan [21, 37].
1.6.1.2.

Nguồn Nitơ

Nguồn dinh dưỡng Nitơ sử dụng trong canh trường có thể là các hợp chất
hữu cơ hoặc vô cơ. Các hợp chất hữu cơ là những hợp chất giàu đạm như cao
ngô, bột đậu tương, khô đậu, khô lạc, cao nấm men, cao thịt bị, pepton,
tryptone, protein từ cá… Nguồn nitơ vơ cơ như urê, NH4NO3, các muối amon
khác. Nguồn nitơ là yếu tố quyết định cho sự sinh trưởng của tế bào và là yếu tố
xúc tác cho q trình chuyển hóa thành axit glutamic [31].
Trong mơi trường sinh tổng hợp γ-PGA ngồi các nguồn nitơ có trong các
sản phẩm tự nhiên như bột đậu tương cao ngô… Nguồn nitơ trong canh trường
nuôi cấy địi hỏi phải có gốc NH4+ bởi đây là yếu tố chính trong việc chuyển hóa
tạo thành L-glutamic. Sự khác nhau về chủng giống vi sinh vật cũng ảnh hưởng
nhiều đến việc sử dụng nguồn nitơ. Nhiều nguồn nitơ có khả năng tăng cường
sinh tổng hợp enzym, một số khác lại kìm hãm hoặc khơng có ảnh hưởng rõ rệt.
Nhiều chủng có thể sử dụng một trong hai nguồn nitơ là NH4+ hoặc cao nấm
men, hoặc có thể dùng đồng thời hai loại này như B. subtilis ZJU-7.
Các nguồn nitơ bổ sung vào canh trường lên men quyết định đến giá thành
sản phẩm sau lên men. Nếu sử dụng nguồn nitơ từ các nguồn như cao nấm men,
đậu tương, nitơ vô cơ giá thành sẽ rẻ hơn rất nhiều so với các nguồn nitơ đặc
chủng như tryptone. Trong sản xuất γ-PGA bởi chủng B. subtilis RKY3, cao ngô
13


từ nguồn phế phẩm nông nghiệp, được thay thế cho pepton làm nguồn nitơ. Hiệu
suất sinh tổng hợp từ cách thay thế này, tạo ra lượng γ-PGA bằng 80% so với sử
dụng pepton.
1.6.1.3.

Ảnh hưởng của muối

Nồng độ muối NaCl trong canh trường ảnh hưởng đến khối lượng phân tử
γ-PGA được tạo thành. Khi nồng độ muối trong canh trường tăng từ 0% đến 4%

khối lượng phân tử γ-PGA tạo thành bởi B. licheniformis 9945a tăng từ 1200
kDa lên 2200 kDa. Nồng độ muối cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ đồng
phân D và L-glutamic trong γ-PGA sản sinh bởi chủng B. subtilis [34].
Nồng độ muối NH4Cl cũng được xem là một yếu tố ảnh hưởng đến sự
sinh trưởng của tế bào. Đặc biệt, muối (NH4)2SO4 là một muối làm giảm sự tăng
trưởng của tế bào, nhưng lại làm tăng sản lượng γ-PGA và tạo ra γ-PGA khối
lượng phân tử lớn đối với canh trường có vi khuẩn B. subtilis IFO3335. Trong
canh trường B. subtilis chungkookjang, với hàm lượng (NH4)2SO4 cao tỷ lệ đồng
phân L-glutamic trong γ-PGA cao hơn D-glutamic [34].
Nghiên cứu ảnh hưởng của CaCl2 cho sinh tổng hợp γ-PGA từ B. subtilis
CGMCC 2108 thấy: khi tăng hàm lượng CaCl2 độ nhớt trong canh trường giảm,
tăng lượng tiêu thụ glutamat ngoài tế bào lên 11,4%, nhưng làm tăng lượng γPGA từ 7,88g/l lên 9,07 g/l. Nguyên nhân là do CaCl 2 làm tăng hoạt tính ba loại
enzym có liên quan trong tổng hợp γ-PGA ở nhánh 2-oxoglutarate trong chu
trình TCA (isocitrate dehydrogenase, glutamate dehydrogenase và 2
oxoglutarate dehydrogenase). Tăng lượng CaCl2 dường như lượng oxoglutarate
được chuyển hóa nhiều hơn, vì vậy lượng γ-PGA tăng [28].
1.6.1.4.

Nguyên tố vi lượng

Các ngun tố khống cũng có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng
hợp enzym. Các nguyên tố này bao gồm cả nguyên tố đa lượng và vi lượng.
Trong sinh tổng hợp γ-PGA các nguyên tố vi lượng là mangan, magie, sắt, kẽm,
kali, canxi và đồng. Các nguyên tố này thường có trong nước hoặc trong các
thành phần hữu cơ khác của môi trường (bột, cao ngô và dịch chiết khác) do đó

14


không cần bổ sung hoặc chỉ bổ sung ở dạng rất ít. Nếu nồng độ của các nguyên

tố này tăng sẽ kìm hãm mạnh sự phát triển của vi sinh vật.
Sinh tổng hợp γ-PGA còn chịu ảnh hưởng bởi, Ca2+ , Mg2+ , Fe3+ , Mn2+
… là các yếu tố vi lượng được đưa vào dưới dạng muối vô cơ với hàm lượng
nhỏ hơn 0,5% thành phần của môi trường. Trong các nguyên tố này cần lưu ý
đến các ion Mn2+ và Mg2+.
Ion Mg2+ được coi là thành phần cốt yếu trong việc hình thành γ-PGA và
khơng thể thay thế bởi một ion kim loại nào khác.
Đối với ion Mn2+ được chứng minh có ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình
thành trong cấu trúc của γ-PGA, nó quyết định đến sự hình thành của các phần
tử D-glutamic trong chuỗi polymer. Trong nghiên cứu về vi khuẩn B. subtilis
NX-2, sự có mặt của Mn2+ từ khoảng 0 đến 1230µM sẽ tạo ra γ-PGA có 10-90%
là D-glutamic và khối lượng phân tử từ 400-2000 kDa. Khi nồng độ Mn2+ từ
khoảng 0 đến 0,09 g/l thì lượng D-glutamic tăng từ 18-77%. Nghiên cứu trên
chủng B. licheniformic 9945a cho thấy khi khơng có sự tham gia của MnSO4 , tế
bào vi khuẩn bị suy thối sau 50 giờ ni. Tuy nhiên khi thêm MnSO4 vào canh
trường ni cấy thì lượng này hầu như cịn ngun sau 96 giờ ni cấy. Sự có
mặt của MnSO4 giúp tế bào đồng hóa glycerol, L-glutamic và axit citric tốt hơn
khi khơng có nó. Sự có mặt của MnSO4 tạo ra một lượng γ-PGA (13g/l) cao hơn
so với lượng γ-PGA (5g/l) khi khơng có sự tham gia của MnSO4 [54].
Ion Ca2+ tuy khơng ảnh hưởng nhiều đến q trình sinh tổng hợp nhưng
nó ảnh hưởng đến tính chất của sản phẩm khi ứng dụng. Sự có mặt Ca2+ trong γPGA sản phẩm sẽ giúp tăng sự hấp thụ Ca2+ trong cơ thể giúp ứng dụng trong
các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm chức năng [8].
1.6.2. Ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đến quá trình lên men
Các yếu tố và điều kiện mơi trường ni cấy có khả năng ảnh hưởng đến
vi khuẩn, cụ thể là ảnh hưởng đến thành tế bào như sự thương tổn thành tế bào,
làm giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất, thay đổi đặc tính keo của
ngun sinh chất, gây kìm hãm, ức chế sự hoạt động của các enzym, phá hủy
các quá trình tổng hợp của tế bào. Các yếu tố đó cụ thể như:
15

1.6.2.1.

Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến mơi trường sống của vi khuẩn,
do vậy nó ảnh hưởng rất lớn đến các quá trình sinh tổng hợp. Trong nghiên cứu
về ảnh hưởng nhiệt của nhiệt độ đến vi khuẩn chia làm các khoảng nhiệt độ như
sau:
Dải nhiệt độ sinh trưởng của vi khuẩn thông thường chia làm 3 dải: vi
khuẩn ưa lạnh nhiệt độ dưới 200C, vi khuẩn ưa ấm nhiệt độ từ 20 – 450C, vi
khuẩn ưa nóng từ 450C trở lên. Đây cũng là đặc tính để phân lập, tuyển chọn,
định danh vi khuẩn và cũng là cơ sở cho các q trình ni, sinh tổng hợp γPGA. Đối với các chủng sinh tổng hợp γ-PGA, tùy theo đặc tính của từng lồi
mà nhiệt độ tối ưu của các chủng khác nhau.
Nghiên cứu trên các chủng B. licheniformic ATCC 9945, B. licheniformic
A35, B. subtilis F02-1 sinh tổng hợp γ-PGA thích hợp ở nhiệt độ 300C. Trong khi
đó nhiệt độ thích hợp cho các chủng B. subtilis IFO3335, B. subtilis ZJU-7, B.
subtilis TAM-4, B. amyloliquefaciens C1 cho tổng hợp γ-PGA là nhiệt độ 370C.
Còn chủng B. subtilis natto, nhiệt độ 400C là tối ưu nhất cho tổng hợp γ-PGA [11,
22].
1.6.2.2.

Ảnh hưởng của pH

Yếu tố pH quyết định đến mức độ hoạt động của ion H+ trong canh
trường, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong canh
trường. Giá trị pH sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật bởi
hoạt độ ion H+ trong môi trường làm thay đổi trực tiếp đến trạng thái điện tích
của thành tế bào.
Trong q trình lên men, pH canh trường ln thay đổi, tuỳ theo chủng vi

sinh vật, dạng sản phẩm lên men cần thu nhận mà các nghiên cứu sẽ hiệu chỉnh
hoặc khơng hiệu chỉnh pH theo q trình lên men. Nếu giá trị pH không phù hợp
sẽ làm tổn thất trong quá trình lên men tăng nhanh. Trong các nghiên cứu về giá
trị pH đối với chủng sinh tổng hợp γ-PGA các giá trị pH thông thường được
khảo sát quanh giá trị pH = 7.

16


Nghiên cứu về chủng B. licheniformis NCIM 2324 cho thấy pH = 6,5 là
giá trị tối ưu cho sinh tổng hợp γ-PGA, và axit citric được cho là sử dụng tốt ở
giá trị pH này. Trong một nghiên cứu khác về chủng vi khuẩn B. subtilis
IFO3335 cho thấy, pH tối ưu là 7 và lượng γ-PGA tạo thành là 23 g/l cao gấp
1,44 lần trước khi tối ưu pH. Một số trường hợp đặc biệt trong nghiên cứu ảnh
hưởng của pH đến quá trình tổng hợp γ-PGA bởi chủng B. subtilis CGMCC
0833, có hai trạng thái pH tối ưu đối với chủng này, tại pH = 6,5 tối ưu cho việc
sử dụng glutamat, cịn pH = 7 thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của vi khuẩn.
Chính vì vậy trong quá trình sinh tổng hợp γ-PGA, trong 24 giờ đầu pH = 7, sau
24 giờ giá trị pH được điều chỉnh về 6,5. Sự điều chỉnh giá trị pH của canh
trường đã giúp tăng hiệu suất tổng hợp γ-PGA lên 24,8%.
Khảo sát trên một số chủng vi khuẩn B. licheniformis ATCC 9945a cho
thấy chủng có khả năng sinh γ-PGA cao nhất tại pH tối ưu là 7,4. Như vậy có
thể nói giá trị pH tối ưu cho mỗi canh trường nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều vào
các chủng vi khuẩn tham gia tổng hợp γ-PGA [55,56].
1.6.2.3.

Ảnh hưởng của sục khí và khuấy trộn

Poly γ-glutamic là nguyên nhân chính tạo độ nhớt trong canh trường, độ
nhớt là yếu tố cản trở sự trao đổi các chất dinh dưỡng và oxy của q trình lên

men. Điều khiển, duy trì sục khí và khuấy trộn là yếu tố rất quan trọng đối với
quá trình lên men γ-PGA. Kết quả nghiên cứu của Shih và các cộng sự cho thấy
khi tăng lưu lượng sục khí từ 0,5 lít/phút lên 2,0 lít/phút và tốc độ khuấy từ 250
vịng/phút lên 800 vịng/phút trong q trình ni cấy B. licheniformis thì lượng
γ-PGA thu được tăng từ 15 g/l lên đến 23 g/l. Sục khí và khuấy trộn cịn ảnh
hưởng đến mức độ đồng hóa glutamat và citric trong quá trình tổng hợp. Đối với
vi khuẩn B. licheniformis sau 96h nếu khơng có sục khí và khuấy trộn thì lượng
glutamat và citric cịn lại tương ứng là 8,3 g/l và 7,5 g/l, nhưng khi có khuấy
trộn và sục khí, lượng glutamat và citric cịn lại tương ứng là 0,2 g/l và 2,2 g/l.
Mức độ cung cấp oxy cho q trình lên men γ-PGA thơng qua khuấy và sục khí
là yếu tố cần thiết cho việc sinh tổng hợp của vi sinh vật, bởi như vậy các nguồn

17


dinh dưỡng mới được đồng hóa triệt để, tạo sản phẩm có khối lượng phân tử lớn,
năng suất cao [38].
Trong nghiên cứu qui trình lên men ở quy mơ phịng thí nghiệm, q trình
lắc (cấp khí và khuấy trộn) có thể khơng thể hiện chính xác, tương ứng với quy
mơ khi nhân rộng. Nhưng ở quy mô thực nghiệm quy mơ lớn, q trình sục khí,
khuấy trộn ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất của quá trình lên men. Các chủng vi
khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA khi nuôi cấy trên quy mơ phịng thí nghiệm thường
được nghiên cứu ở chế độ nuôi tĩnh, trong khi thực hiện ở quy mô công nghiệp
thường được nghiên cứu bổ sung thêm chế độ sục khí hoặc khuấy trộn đển đảm
bảo nguồn oxy cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và tổng hợp γ-PGA. Vì
vậy, trước khi lên men trên quy mơ lớn cần phải nghiên cứu kỹ đặc tính chu kỳ
sinh trưởng và tổng hợp của chủng vi khuẩn để đưa ra những chế độ cấp khí và
khuấy trộn phù hợp [19, 49].
1.7.

Xác định và đánh giá chất lượng và γ-PGA

1.7.1. Định tính và định lượng γ-PGA
Poly γ-glutamic được nghiên cứu từ năm 1913, để xác định được γ-PGA
có thể thơng qua các kĩ thuật phân tích như sau:
Đo độ nhớt: đặc tính tạo nhớt của γ-PGA tỷ lệ thuận với nồng độ γ-PGA,
do vậy đo độ nhớt được lựa chọn để đánh giá chủng vi khuẩn có khả năng tạo ra
nhiều γ-PGA nhất trong canh trường. Sau khi thu nhận γ-PGA từ các mẫu thí
nghiệm theo các mốc thời gian tiến hành ly tâm loại bỏ xác vi sinh vật, tủa bằng
cồn 98% với tỷ lệ 3:1, đem kết tủa và hòa tan trong nước với cùng một tỷ lệ như
nhau, đem đi đo độ nhớt bằng nhớt kế Brookfield. Tuy nhiên trong nhiều trường
hợp sự tạo nhớt trong canh trường là những hợp chất không phải là γ-PGA mà là
hợp chất polysaccharide. Để có thể kết luận chính xác cần bổ sung thêm cơng
đoạn định tính γ-PGA bằng cách thủy phân γ-PGA thành các monomer axit
glutamic và xác định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng.
Xác định hàm lượng γ-PGA bằng cetyl trimethyl ammonium bromide
(CTAB), CTAB sẽ kết hợp với γ-PGA tạo phức. Phức chất này sẽ được hấp thụ
ở bước sóng 400nm. Khi phức chất tạo ra càng nhiều, giá trị hấp thụ màu của

18


phản ứng CTAB ở bước sóng 400nm càng lớn. Hàm lượng γ-PGA được xác
định dựa trên độ tăng khả năng hấp thụ màu của hỗn hợp.
Xác định hàm lượng γ-PGA bằng cách đo độ hấp thụ trong vùng ánh sáng
tử ngoại: phương pháp được dựa trên đặc tính hấp thụ cực đại của dung dịch γPGA tại vùng ánh sáng tử ngoại, bước sóng 216nm. Nghiên cứu về cách đo này
đã được Zeng và các cộng sự nghiên cứu và chứng minh năm 2012 và đã được
ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu gần đây. Phương pháp đơn giản, được sử
dụng trong việc xác định các hợp chất hữu cơ và vơ cơ, có thể thực hiện dễ dàng
trong các phịng thí nghiệm. Phương pháp dựa trên đặc tính hấp thụ ánh sáng

cực đại của γ-PGA khi hòa tan trong nước deion tại vùng ánh sáng tử ngoại, có
thể xác định hàm lượng γ-PGA mà không bị ảnh hưởng bởi khối lượng phân tử
γ-PGA [52].
1.7.2. Thu nhận và tinh sạch γ-PGA
Một vài nghiên cứu về γ-PGA từ vi khuẩn đã được tiến hành thông qua
việc đo độ nhớt, đo phổ hấp thụ hồng ngoại. Các kết quả nghiên cứu cho thấy
trong phần nhầy của Natto có 58% γ-PGA và 40% polysaccharide, pH khoảng 5
– 8,8 và phần nhầy này sẽ thay đổi tỷ lệ γ-PGA và polysaccharide khi pH môi
trường thay đổi. Nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ polymer tới cấu trúc cho
thấy γ-PGA có cấu trúc xoắn khi ở nồng độ thấp và có dạng  khi nồng độ cao.
γ-PGA được sản xuất chủ yếu bởi vi khuẩn Gram dương, bao gồm chi Bacillus.
Nó cũng đã được báo cáo rằng ít nhất một loại vi khuẩn Gram âm
(Fusobacterium nucleatum), một số vi khuẩn cổ và sinh vật nhân chuẩn có khả
năng sản xuất γ-PGA.
Thu nhận γ-PGA từ môi trường lên men lỏng thường đơn giản bởi γ-PGA
là một polymer có khả năng tan trong nước, nên có thể loại bỏ các tạp chất bằng
cách lọc hoặc ly tâm. Đối với γ-PGA thu được bằng phương pháp lên men trên
mơi trường rắn, sau khi kết thúc q trình lên men, γ-PGA được trích ly bằng
nước nhiều lần và đem đi lọc trước khi mang đi tinh sạch [25, 38].
Một số nghiên cứu về γ-PGA của các nhà khoa học đã đưa ra nhiều
phương pháp tinh sạch γ-PGA, các phương pháp này chủ yếu là sử dụng cồn
98% để làm sạch γ-PGA sau khi lên 26 men. Tỷ lệ cồn và dịch nổi thu hồi từ
19


quá trình lên men thường được sử dụng theo tỷ lệ 1:3 hoặc 1:4. Cồn sau khi sử
dụng tinh sạch γ-PGA được đem thu hồi và xử lý lại. Phương pháp sử dụng cồn
chỉ có tác dụng khi tinh sạch với các axit D-L γ-PGA bởi chỉ các axit này mới bị
kết tủa. Khi sử dụng cồn, γ-PGA và protein bị kết tủa, một số khác không bị kết
tủa sẽ được loại bỏ theo dịch. Nhờ tính chất phân cực của mình sau khi kết tủa γPGA có thể hịa tan trở lại trong môi trường nước đã được deion, một đặc tính ít

thấy ở protein.
Trong cơng nghiệp sản xuất đại trà γ-PGA của các nhà máy lớn, γ-PGA
được tinh sạch bằng các hệ thống lọc và các hệ thống chất hấp thụ như than hoạt
tính, cation, anion, celite.. nhằm loại bỏ các ion kim loại, hợp chất tạo màu, tạo
mùi ảnh hưởng đến sản phẩm. Dựa trên tính chất tạo nhớt của γ-PGAcó thể thu
hồi làm sạch bằng cách làm giảm độ nhớt của γ-PGA bằng cách giảm pH, tăng
nhiệt độ dịch sau đó sử dụng các phương pháp như lọc, ly tâm, hấp thụ để loại
bỏ các tạp chất. Nghiên cứu các phương pháp tinh sạch γ-PGA từ một số chủng
B. subtilis natto, B. subtilis BS 62 và B. licheniformis CCRC1286 cho thấy phần
lớn quá trình tinh sạch γ-PGA có áp dụng kết tủa bằng cồn và để giảm lượng
ethanol sử dụng trong q trình tinh sạch, có phối hợp khai thác các kỹ thuật
khác như ly tâm, lọc, tẩy màu, tẩy mùi... là những phương pháp tinh sạch được
sử dụng hiện nay [25, 39].

20


Phương pháp của Goto và Kunioka [22]
Dịch lên men
Thêm 1 phần nước cất theo tỷ lệ
1:1
Ly tâm 20.000v/p 15 phút nhằm loại
bỏ
Lặp lại 3 lần

Kết tủa bằng cồn 98% theo tỷ lệ
ethanol: dịch = 4:1

Ly tâm 20.000v/p, 15 phút thu kết
tủa

Hòa kết tủa trong nước deion

Thẩm tách 4oC trong 24 giờ bằng
nước
Thu nhận

Hình 1.4. Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phương pháp của Goto và
Kunioka [22]

21


1.8.

Ứng dụng của γ-PGA

1.8.1. Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm
Axit poly γ-glutamic được sử dụng làm chất bảo quản đông lạnh mà
không gây ảnh hưởng tới sức khỏe do chúng khơng gây độc cho con người.
Ngồi ra nó cịn được sử dụng làm chất ổn định mà không làm ảnh hưởng đến
chất lượng của sản phẩm cũng như tới sức khỏe của con người.
Canxi chiếm khoảng 1,5-2% trọng lượng cơ thể nhưng khả năng hấp thụ
Canxi trong ruột bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố như chế độ ăn uống, hàm lượng
phytate và oxalate. Các chất trên hình thành các muối ít tan với canxi nên khơng
được hấp thụ qua đường ruột mà thải ra ngồi thơng qua đường tiêu hóa. Khi
thiếu hụt canxi có thể dẫn đến chứng loãng xương, đặc biệt là ở phụ nữ lớn tuổi,
lượng ion Ca2+ trong máu thấp có thể dẫn đến hiện tượng loãng xương co cứng
cơ hay chuột rút. Năm 2007, nghiên cứu của Tanimoto và các cộng sự đã chỉ ra
rằng γ-PGA làm tăng khả năng hấp thụ canxi đường ruột người nhờ khả năng
tạo muối tan đặc biệt không bị phân hủy bởi protease và sẽ từ từ ngấm qua thành

ruột và được cơ thể hấp thụ.
Axit poly γ-glutamic có khả năng làm giảm sự hấp thụ và lưu giữ Na+
tăng hấp thụ K+ trong máu nên nó có khả năng chống cao huyết áp [27, 40].
Phức hệ γ-PGA -Vitamin C có khả năng ức chế Collagenase giúp giảm
nếp nhăn khi da lão hóa [14].
Axit poly γ-glutamic được sử dụng thay thế một phần cho CMC trong
công nghệ chế biến thực phẩm để tạo trạng thái và ổn định sản phẩm [14, 24].
Trong công nghệ sản xuất bánh kem xốp, nó được bổ sung vào trong
nguyên liệu làm kem cùng với chất nhũ hóa để làm tăng tính ổn định sản phẩm,
tăng cường tính chất của kem giữa hai mặt bánh, giảm độ dày lớp kem mà
không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
Trong đồ uống từ quả tươi thường xảy ra hiện tượng đắng bởi các monodiglyceride kết hợp với axit polycacboxylic hoặc muối của axit đó. γ-PGA
có tác dụng làm giảm độ đắng do hỗn hợp những este này gây nên và giúp
22