Nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme laccase từ chủng nấm aspergillus niger phân lập được từ rừng núi luốt đại học lâm nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin bày tỏ long biết ơn sau sắc
nhất đến TS. Nguyễn Nhƣ Ngọc ngƣời đã dành nhiều thời gian hƣớng dẫn tận
tình, cung cấp nhiều kiến thức quý báu, tạo mọi điều kện thuận lợi và tốt nhất
cho em trong q trình thực hiện đề tài khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cơ cán bộ phịng Vi Sinh Hóa Sinh
Viện Cơng Nghệ Sinh Học là những ngƣời đã giúp đỡ tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho em học tập và trong q trình làm khóa luận tốt nghiệp.
Tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ và tạo điều kiện để
hoàn thành đề tài này.
Một lần nữa, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người!
SINH VIÊN THỰC HIỆN

Nguyễn Thị Minh Hiền


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC SƠ ĐỒ
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................. 3
1.1. Enzyme Laccase ............................................................................................. 3
1.1.1. Giới thiệu về enzyme Laccase .................................................................... 3
1.1.2. Tính chất hóa sinh của Laccase................................................................... 5
1.1.3. Cơ chế hoạt động của enzyme..................................................................... 8
1.1.4. Ứng dụng của enzyme Laccase ................................................................... 8
1.2. Hệ vi sinh vật có khả năng sinh Laccase ..................................................... 10
1.2.1. Nấm và thực vật ........................................................................................ 10

1.2.2. Vi khuẩn và xạ khuẩn ................................................................................ 11
1.2.3. Côn trùng ................................................................................................... 11
1.3. Tổng quan vể chủng nấm Aspergillus niger ................................................ 11
1.4. Tình hình nghiên cứu về enzyme Laccase ................................................... 12
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................ 12
1.4.2. Tính hình nghiên cứu trong nƣớc .............................................................. 13
CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
............................................................................................................................. 14
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 14
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 14


2.3. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 14
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ........................................................................................ 14
2.3.1.Hóa chất và mơi trƣờng sử dụng ................................................................ 15
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 19
2.4.1. Xác định hoạt tính enzyme Laccase của chủng Aspergillus niger ........... 19
2.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy các chủng sinh
enzyme Laccase................................................................................................... 20
2.4.3. Thử hoạt tính enzyme Laccase .................................................................. 23
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 25
3.1. Kết quả xác định hoạt tính của enzyme laccase của chủng nấm Aspergillus
niger..................................................................................................................... 25
3.2. Kết quả xác định, chọn lọc môi trƣờng ni cấy thích hợp cho chủng
Aspergillus niger sinh tổng hợp enzyme Laccase ............................................... 25
3.3. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng pH đến khả năng sinh tổng hợp Laccase........ 27
3.4. Kết quả ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme Laccase ......... 29
3.5. Kết quả ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp Laccase..... 30
3.6. Kết quả ảnh hƣởng của các nguồn đƣờng đến khả năng sinh tổng hợp
Laccase ................................................................................................................ 32

3.7. Kết quả ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
của chủng Aspergillus niger ................................................................................ 33
PHẦN 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 36
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 36
4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC VIẾT TẮT

Ký hiệu

Viết tắt

l

Microlit

ml

Mililit

mm

Milimet

ABTS

2, 2 '-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate

ETDA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

SDS

Natri dodecyl sulfat

VSV

Vi sinh vật

h

Giờ

RBBR

Rubidium bromide


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc phân tử Laccase ........................................................ 4
Hình 1.2: Hình ảnh cụm xúc tác của Laccase ....................................................... 8
hình 3.1: Hình thái của chủng nấm mốc Aspergillus niger trên mơi trƣờng PDA
............................................................................................................................. 25
Hình 3.2: Hình ảnh thử hoạt tính trên cơ chất acid tannic của chủng nấm mốc
Aspergillus niger ................................................................................................. 25
Hình 3.3: Ảnh vịng phản ứng màu của Laccase trên môi trƣờng chứa cơ chất
acid tannic sau 96 giờ .......................................................................................... 26

Hình 3.4: Ảnh vịng phản ứng màu của Laccase nuôi ở pH 3 đến pH 7 của sau
96 giờ. .................................................................................................................. 28
Hình 3.5: Ảnh vịng phản ứng màu của Laccase ở nhiệt độ từ 4oC đến 40oC sau
khi thu dịch ở 96 giờ ........................................................................................... 29
Hình 3.6: Ảnh đƣờng kính vịng phản ứng màu của Laccase với cơ chất aacid
tannic ở tốc độ lắc từ 50 – 200 vịng/phút ........................................................... 31
Hình 3.7: Ảnh vịng phản ứng màu của Laccase ở các nguồn cacbon sau 96 giờ
nuôi cấy. .............................................................................................................. 32
Hình 3.8: Hình ảnh vịng phản ứng màu của chủng Aspergillus niger ở các
nguồn nitơ khác nhau sau 96 giờ......................................................................... 34


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng sinh enzyme Laccase sau
96 giờ nuôi cấy .................................................................................................... 26
Biểu đồ 3.2: Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh enzyme Laccase ở 96h ...... 27
Biểu đồ 3.3:Đồ thị ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
Laccase ................................................................................................................ 29
Hình 3.4: Biểu đồ ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến khă năng sinh tổng hợp enzyme
Laccase ................................................................................................................ 31
Biểu đồ 3.5: Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme Laccase................................................................................................... 32
Biều đồ 3.6: Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh enzyme Laccase
............................................................................................................................. 34


MỞ ĐẦU
Việt Nam là một trong những nƣớc mà tình trạng ô nhiễm môi trƣờng đang
trở nên báo động, trong đó có tình trạng ơ nhiễm bởi nguồn thuốc nhuộm công
nghiệp và chế biến bột giấy, công nghiệp sản xuất, bảo quản thực phẩm vải, ....

không đƣợc xử lý tốt. Đa số nƣớc thải từ các khu công nghiệp nhà máy đƣợc xử
lý chủ yếu bằng các phƣơng pháp hóa học và vật lý nhƣ hấp phụ, keo tụ tạo
bông, trao đối ion, oxy hóa và điện hóa. Tuy nhiên, những phƣơng pháp này có
một số hạn chế nhƣ tạo ra bùn thải, chi phí cao và sử dụng một lƣợng lớn hóa
chất. Do đó, xử lý nƣớc thải bằng phƣơng pháp sinh học có vai trị quan trọng do
giá thành rẻ, xử lý triệt để, không tạo sản phẩm thứ cấp....
Xu hƣớng ứng dụng enzyme ngoại bào nhƣ: Laccase, mangan peroxidase
(MnP), lignin peroxidase (LiP),.... có khả năng xúc tác các phản ứng oxy hóa
khử đƣợc xem là biện pháp hiệu quả và có tiềm năng ứng dụng cao trong việc
phân giải các hợp chất hữu cơ, vô cơ nhƣ: Dichloro - Trichloroethane Diphenyl,
lignin (nƣớc thải nhà máy giấy), hydrocarbon vịng thơm (biphenol,benzidine,..)
có trong nƣớc ơ nhiễm bởi dầu mỏ,.... . Trong đó Laccase đặc biệt đƣợc quan
tâm bởi enzyme này nằm trong hệ enzyme lignolytic và là một polyphenol
oxydase, do đó có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan, do
đó loại enzyme này có thể xử lý nƣớc thải của các nghành công nghiệp nhƣ: dệt
nhuộm , tổng hợp hữu cơ, thực phẩm , dƣợc phẩm v.v...
Mặt khác hiện nay các chủng tổng hợp Laccase trong tự nhiên thƣờng có
hoạt tính thấp và địi hỏi các chất cảm ứng tạo enzym với giá thành cao. Trên thị
trƣờng enzyme Laccase đã đƣợc thƣơng mại hóa nhƣng chƣa đƣợc sử dụng phổ
biến tuy nhu cầu sử dụng của con ngƣời vẫn cao nhƣng ngƣời ta thƣờng hƣớng
tới các chế phẩm sinh học hoặc hóa học vẫn có thể xử lý chất độc trong nƣớc
thải mà giá thành rẻ hơn.
Trong vài năm gần đây các nghiên cứu nhằm phân lập các chủng mới hoặc
đột biến các chủng vi sinh vật có khả năng sinh Laccase ngày càng nhiều. Cùng
1


với đó là rất nhiều nghiên cứu về khảo sát các điều kiện nuôi cấy của các chuẩn
đã phân lập tuyển chọn đƣợc đó để sinh enzyme nhằm mục đích đƣa ra mơi
trƣờng thích hợp cho các chủng đó tiết enzyme là cao nhất có thể để tạo ra nhiều

chế phẩm enzyme Laccase hoạt tính tốt giá thành giảm đi để phục vụ cho nhu
cầu sử dụng của con ngƣời. Để đáp ứng nhu cầu nguồn sử dụng enzyme tôi đã
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp
enzyme Laccase từ chủng nấm Aspergillus niger phân lập được từ rừng núi
Luốt Đại Học Lâm Nghiệp”.

2


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Enzyme Laccase
1.1.1. Giới thiệu về enzyme Laccase
Laccase là một enzyme nằm trong hệ enzyme lignolytic có khả năng oxy
hóa mạnh các hợp chất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, lignin,
dioxin,....và các hợp chất có liên quan ngồi ra chũng cịn phân giải các hợp chất
vơ cơ nhƣ iot[17]. Laccases đóng một vai trị quan trọng trong sự hình thành
lignin bằng cách thúc đẩy sự liên kết oxi hóa monolignols, một họ phenol xảy ra
tự nhiên [1,12].
Ở dạng dimer hoặc trimer thì enzyme lacase có hoạt tính chúng có thể
oxy hóa phân giải các chất độc hại trong nƣớc thải ô nhiễm. Mà quá trình phân
giải chất độc hại trong nƣớc thải thì các chủng vi sinh vật chỉ cần lấy oxy từ
không khí để sinh trƣởng phát triển để sinh enzyme Laccase và sản phẩm phụ
duy nhất tạo thành sau phản ứng là nƣớc [4].
Năm 1896, Laccase đã đƣợc chứng minh là có mặt trong nấm lần đầu
tiên bởi cả Bertrand và Laborde. Kể từ đó hầu hết các Laccases đã đƣợc phân
lập là từ nguồn gốc nấm đặc biệt là từ nấm thối trắng thuộc các lớp khác nhau
nhƣ Ascomycetes, Basidiomycete và Deuteromycetes [10].
Năm 1996, Orly Ardon và cộng sự nghiên cứu thân cây bơng đã đƣợc
tìm thấy là một chất nền tuyệt vời cho việc canh tác Pleurotus, chiết xuất cuống
bơng đã đƣợc nghiên cứu cho thấy kích thích sự phát triển của nấm trong các

môi trƣờng bề mặt và hoạt động Laccase ngoại bào trong các môi trƣờng
lỏng. Cảm ứng của hoạt động Laccase phụ thuộc vào nồng độ của chiết xuất bổ
sung. Sự kích thích của Laccase đƣợc quan sát sớm nhất là 3 giờ sau khi sửa đổi
CSE. Chất nhuộm hoạt tính Laccase sau khi tách bằng điện di gel cho thấy hai
dải chính trong cả điều khiển và các mơi trƣờng có chiết xuất cuống bơng gây
ra.
Tất cả Laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với
4 nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này đƣợc chia thành ba nhóm: Loại 1
3


(T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng
và thế điện. Các ngun tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử tạo thành
phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện từ hấp
phụ điện tử và có thể hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh [6].

Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc phân tử Laccase
Trái ngƣợc với hầu hết các enzym, Laccase hoạt động trên nhiều loại
chất nền nhƣ diphenol, polyphenol, amin thơm, benzenethiols và thậm chí một
số hợp chất vơ cơ nhƣ iốt. Mặc dù, hầu hết các chất nền Laccases là nhiều hợp
chất phenolic , độ đặc hiệu của chúng có thể đƣợc mở rộng bằng các chất trung
gian nhƣ: ABTS và 1-hydroxybenzotriazole [10].
Với tính chất phản ứng với nhiều chất nền enzyme Laccases đƣợc ứng
dụng trong nhiều nghành công nghiệp khác nhau nhƣ: tẩy thuốc nhuộm, tẩy
trắng bột giấy và xử lý sinh học..... Vì vậy, cần tìm hiểu, nghiên cứu về Laccases
vi sinh từ nhiều nguồn khác nhau và nghiên cứu thêm nhiều đặc tính khác để
mở rộng tiềm năng và ứng dụng của hệ enzyme Laccase với sinh thái.
4

1.1.2. Tính chất hóa sinh của Laccase
1.1.2.1. Ảnh hưởng của pH đến enzyme Laccase
pH là yếu tố ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp Laccase ,
mỗi chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme Laccase sẽ có một ngƣỡng pH
thích hợp để sinh tổng hợp và hoạt hóa enzyme. Nếu pH khơng phù hợp sẽ làm
giảm hoạt tính enzyme hoặc làm cho các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp
enzyme Laccase thấp.
Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4 – 6 đối với cơ chất
phenolic. Khi tăng pH xang vùng trung tính hoặc cùng kiềm thì hoạtt tính của
Laccase bị giảm do các anion hydroxide đa ức chế hoạt động của Laccase. Đối
với các cơ chất khơng phải phenolic nhờ ABTS thì các phản ứng oxy hóa khơng
liên quan đến sự vận chuyển các ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2 –
3. Laccase bền trong pH kiềm nằm trong khoảng 8 – 9 [6].
Theo nghiên cứu của Trần Thị Thu Hiền và cộng sự (năm 2016) chủng
nấm FBD154 đƣợc phân lập từ vƣờn quốc gia Bidoup - Núi Bà, Làm Đồng, Việt
Nam có khả năng sinh tơng hợp Laccase với hoạt tính cao. Chủng Polyporus sp.
FBD154 có khả năng sinh tổng hợp Laccase ở pH rất rộng từ pH 2- pH 9 và sinh
trƣởng tốt nhất ở mơi trƣờng acid có pH4 đạt hoạt tính cao nhất là 18727 u/l. Ở
pH 3 và pH 5 chủng nấm này cũng cho hoạt tính khá cao, lần lƣợt là 12835 u/l
và 8344 u/l, trong khi đó tại pH từ 10 -12 hoạt tính enzyme đo đƣợc rất thấp, chỉ
từ 28 đến 74 u/l và tốc độ sinh trƣởng cua nấm cũng rất kém. Nhƣ vậy, pH 4 phù
hợp nhất cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp Laccase ở chủng FBD154 [8].
1.1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme Laccase
Nhiệt độ bền của Laccase giao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc
của vi sinh vật mà enzyme Laccase có có nhiệt độ bền khác nhau, nhìn chung
enzyme Laccase bền trong khoảng 30oC – 50oC và nhanh chóng mất hoạt tính ở
60oC. Enzyme bền nhiệt thƣờng đƣợc phân lập chủ yếu ở prokaryote, ví dụ: thời
gian phân hủy của Laccase đƣợc tổng hợp từ Streptomyces lavendulae là 100
phút ở 70oC và protein cotA từ chủng Bacillus subtilis là 112 phút ở 80oC. Thời
5

gian bán hủy của các enzyme có nguồn gốc từ nấm thƣờng nhỏ hơn 1 giờ ở 70oC
và dƣới 10 phút ở 80oC[6].
Theo nghiên cứu của Nguyễn Nguyên Quang (năm 2010), chủng nấm
sợi FBH11 phân lập từ Biên Hòa sinh tổng hợp enzyme Laccase tốt nhất trên
môi trƣờng Czapek cải tiến với nguồn cacbon là dịch chiết malt (5 g/l) và nguồn
nitơ là hỗn hợp KNO3 và NaNO3 ở pH 6, 30o C chứa 200 mg/l chất pyrene. Với
hoạt tính Laccase cao nhất là 1496 U/l [20].
Ngoài ra Laccase chiết xuất từ Stereumostrea cho thấy hoạt tính cao
nhất ở nhiệt độ 30oC và 40 ° C. Khi nấm đƣợc trồng trong mơi trƣờng có độ pH
5.0, Laccase sẽ tạo ra quá nhiều nhƣng hầu hết các nghiên cứu cho thấy pH giữa
4,5 và 6,0 thích hợp cho sản xuất enzyme [14,16,17].
1.1.2.3. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng
Laccase có thể bị ức chế bởi các ion nhỏ nhƣ: azide, halogenua, xyanua
và florua, axit amin , axit béo các ion này liên kết với đồng loại 2 và loại 3 và
phá vỡ việc chuyển electron qua các trung tâm đồng, do đó làm giảm hoạt động.
Các ion kim loại, axit béo, hydroxyglycine cũng có thể ức chế Laccase bằng
cách làm thay đổi dƣ lƣợng axit amin, thay đổi cấu trúc hoặc sự thải trừ đồng.
Kết quả nghiên cứu của D‘Souza-Ticlo và cộng sự (2009) cho thấy
isozyme của Laccase bị ức chế hoạt động với sự có mặt của natri azit, SDS và
mercaptoethanol. Khoảng 56% và 48% hoạt động của Laccase bị ức chế với sự
hiện diện của Crom. Đối với các chất khác Ag và Hg thì sự ức chế chỉ là 3237%. Các ion kim loại khác không cho thấy sự ức chế đáng kể [15].
Năm 2010 kết quả nghiên cứu của Nguyễn Nguyên quang cho thấy các
chất cảm ứng nhƣ ứng 4-hydroxylbenzoic axit, ABTS, ferulic axit và vanillin
làm tăng hoạt tính Laccase của chủng FBH11. Hoạt tính bổ khi sung các chất
cảm ứng trên lần lƣợt là 6940 U/l, 5469 U/l, 4691 U/l, 4511 U/l [2].
1.1.2.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ
Vi sinh vật phát triển trên môi trƣờng đều cần có nguồn nitơ (pepton, cao
nấm men, ure, NH4Cl, NaNO3,...) và cacbon (glucose, mantose, fructose, CO2,...)

6


để sinh trƣởng và phát triển. Nếu trên môi trƣờng dƣ thừa hoặc thiếu lƣợng nitơ
và cacbon thì cũng sẽ làm giảm khả nằn sinh trƣởng, phát triển và sinh tổng hợp
các enzyme, vitamin,... của vi sinh vật.
Theo kết quả nghiên cứu của Wang và cộng sự năm 2006 một số cơng
bố trên thế giới, hoạt tính Laccase của chủng Polyporus arcularius A08 tăng đến
1.480 u/l khi bổ sung nguồn carbon hỗn hợp chứa cám gạo và hemicelluloses
trong môi trƣờng với tỷ lệ C/N cao . Chủng Monotospora sp. sinh trƣởng trên
nguồn cacbon là 2 g/l maltose đã tạo Laccase với hoạt tính 13.550 U /Ị tăng 4
lần so với môi trƣờng cơ sở.
Kết quả nghiêm cứu của Sathishkum và cộng sự năm 2010 chủng
Pleurotus diyinus IBB 903 sinh tổng hợp Laccase và cho hoạt tính 6.025 u/l sau
10 ngày nuôi cậy khi sử dụng nguồn nitrogen là (NH4) 2SO4 với nông độ là
10mM [2].
Ở Việt Nam, chủng nấm Trichoderma sp. FCP3 phân lập từ gô mục ở
rừng Quốc gia Cúc Phƣơng đƣợc biết là sinh tổng hợp Laccase và cho hoạt tính
là 132 U/l khi bổ sung NaNO3, và KNO3 (tỷ lệ 3:7) với nồng độ 3 g/1 [8].
1.1.2.5. Ảnh hưởng của ion kim loại đến khả năng sinh Laccase
Ảnh hƣởng của các ion kim loại có thể ảnh hƣởng đến hoạt tính của
enzyme các ion kim loại này có thể làm tăng hoặc giảm hoạt tính của enzyme.
Năm 2014 Ngụy Thị Mai Thảo và cộng sự khảo sát đƣợc ảnh hƣởng của
ion Cu2+ bổ sung Cu2+ hoạt tính enzyme cao nhất đạt đƣợc là 1.333 U/ml và
1.407 U/ml sau 7 ngày nuôi cấy khi Cu2+ đƣợc bổ sung lần lƣợt ở ngày thứ 3 và
4 và hoạt tính đạt 1.332 U/ml sau 14 ngày nuôi cấy nếu Cu2+ đƣợc bổ sung sau 5
ngày nuôi. Nếu bổ sung Cu2+ vào những ngày nuôi cấy muộn hơn, ngày thứ 6 và
7, hoạt tính thấp hơn, đạt xấp xỉ 1.000 U/ml sau 11 ngày nuôi cấy [7].
Các ion kim loại nặng hóa trị 2 khác nhƣ Co 2+, Cd2+,Hg2+, Mn2+ lại là
nguyên nhân gây ức chế hoạt động enzyme Laccase.

Ngoài ra cịn có các yếu tố nhƣ tốc độ lắc, nồng độ các chất vi
lƣợng,...cũng ảnh hƣởng đến khả năng sinh enzyme và hoạt động của enzyme
7


1.1.3. Cơ chế hoạt động của enzyme
Loại 1(T1), (T1) đồng tạo màu xanh điển hình cho protein và là nơi xảy
ra q trình oxy hóa chất nền. Màu xanh nƣớc biển điển hình cho protein trong
phân tử Laccase đƣợc tạo thành do liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên
tử lƣu huỳnh của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bƣớc
song 600nm. Đồng loại 2 (T2) và loại 3 (T3) tạo thành cụm trinuclear, là nơi
làm giảm oxy hóa phân tử và giải phóng nƣớc diễn ra [20,21].

Hình 1.2: Hình ảnh cụm xúc tác của Laccase
Ngoài ra các chất trung gian tổng hợp phổ biến nhất là 1-hydroxy
benzotriazole (HOBT), N-hydroxyphthalimide (NHPI), 2,2'-azinobis- (3ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) (ABTS) và acid hydroxyanthranilic 3 Trong sự
có mặt của oxy ABTS Sự hấp thụ bởi Laccase nhanh hơn HOBT [6,18].
1.1.4. Ứng dụng của enzyme Laccase
Enzyme Laccase là loại enzyme quan trọng vì nó oxy hố cả các chất
độc và khơng độc hại. Nó đƣợc sử dụng trong cơng nghiệp dệt, công nghiệp chế
biến thực phẩm, công nghiệp chế biến gỗ, cơng nghiệp dƣợc phẩm và cơng
nghiệp hóa chất. Enzym này rất cụ thể, bền vững về sinh thái và là một chất xúc
tác thông dụng.
1.1.4.1. Laccase trong phân giải nước thải nghành công nghiệp dệt, nhuộm
Ngành dệt chiếm 2/3 tổng thị trƣờng thuốc nhuộm và tiêu thụ một lƣợng
lớn nƣớc và hóa chất để chế biến ƣớt hàng dệt. Do cấu trúc hóa học của của
thuốc nhuộm có khả năng chống phai màu khi tiếp xúc với ánh sáng, nƣớc. Hầu
8

hết chúng khó phân hủy do tổng hợp của chúng từ nhiều nguồn khác nhau. Việc
sử dụng Laccase trong ngành công nghiệp dệt đang phát triển nhất là trong phân
giải nƣớc thải nhà máy dệt, nhuộm.
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Khởi Nghĩa phân lập đƣợc từ mẫu
gỗ đồng bằng sơng cửu long đƣợc dịng nấm HG1 có khả năng loại màu thuốc
nhuộm xanh cao nhất sau 8 ngày nuôi cấy, giảm 457 mg.L-1, chiếm 92% nồng
độ ban đầu (500 mg.L-1) trong khi dịng nấm TV13 có khả năng loại màu thuốc
nhuộm đen tốt nhất sau 7 ngày nuôi cấy, giảm 493 mg.L-1, chiếm 99% nồng độ
ban đầu [3].
1.1.4.2. Laccase trong xử lý nước thải và tẩy trắng bột giấy
Trong công nghiệp giấy và bột giấy nƣớc thải của nhà máy trƣớc đây
thƣờng sử dụng các chất oxy hoá hóa học chứa clo và oxy đƣợc sử dụng để tách
và phân hủy lignin cần thiết để chuẩn bị giấy ở cấp độ công nghiệp và tẩy trắng
giấy. Nhƣng hiện nay ngƣời ta hƣơng tới sử dụng enzyme để sử lý nƣớc thải và
tẩy trắng bột giấy trong đó Laccase là một enzyme nằm trong hệ enzyme
lignolytic có khả năng oxy hóa mạnh các hợp chất lignin trong nƣớc thải nhà
máy giấy và có thể sùng để tẩy trắng bột giấy [14,19].
1.1.4.3. Ứng dụng của enzyme Laccase trong chế biến và xử lý nước thải của
công nghiệp chế biến thực phẩm
Khi cho thêm enzyme Laccase đƣợc thêm vào bột và các sản phẩm
nƣớng thì các sản phẩm đó đƣợc cải thiện về một số đặc tính nhƣ: tăng khối
lƣợng sản phẩm, cải thiện cấu trúc crumb, làm cho các sản phẩm nƣớng mềm
hơn. Ngồi ra Laccase có thể chịu trách nhiệm cho việc tạo màu nâu, tạo sƣơng
mù và phát triển độ đục trong nƣớc trái cây, bia và rƣợu vang rõ ràng.
Trong nƣớc thải nghành công nghiệp thực phẩm enzyme Laccase loại bỏ
các hợp chất phenolic không mong muốn trong bánh mì, nƣớc trái cây, bia và
rƣợu để ổn định và cải thiện các đặc tính cảm quan của chúng loại bỏ oxy trong
thực phẩm đóng gói hoặc có nguồn gốc từ thực vật để tránh quá trình oxy hóa
khơng mong muốn [1].
9

1.1.4.4. Các ứng dụng khác của Laccase
Laccases có thể đƣợc sử dụng để giải độc các loại đất có chứa các chất ô
nhiễm phenolic và các chất độc do thuốc trừ sâu,... do phạm vi bề mặt rộng của
enzyme.
Laccase cũng có thể đƣợc sử dụng để loại bỏ mùi phát ra từ những nơi
nhƣ các bãi thải rác, các trang trại chăn nuôi,...
Enzyme Laccases đƣợc sử dụng nhƣ một bộ cảm biến sinh học để phát
hiện các hợp chất phenolic trong nƣớc ép trái cây và nồng độ oxy trong nƣớc
thải, ngồi ra enzyme +Laccase cịn đƣợc dùng để phát hiện morphine và
codeine, catecholamin, flavonoid thực vật [14,19].
1.2. Hệ vi sinh vật có khả năng sinh Laccase
Laccases là các enzyme oxi hóa có chứa đồng có trong nhiều loại nhƣ
nấm, vi sinh vật, thực vật động vật.
1.2.1. Nấm và thực vật
Trong thực vật, Laccase đóng một vai trị trong lignifications trong khi
trong nấm nó đã đƣợc liên quan đến delignification, sporulation, sản xuất sắc tố,
hình thành cơ thể đậu quả, và bệnh sinh thực vật [15].
Các chủng nấm sinh enzyme Laccase thƣờng đƣợc tìm thấy trong các chi
Ascomycetes, Deuteromycetes và Basidiomycetes,.. đặc biệt phong phú trong
nhiều loại nấm thối trắng chúng có khẳ năng chuyển hóa lignin, ở nấm khả năng
tiết enzyme Laccase phân giải lignin cao hơn sơ với thực vật và vi khuẩn [20].
Ngồi ra cịn nhiều chủng nấm khác có khả năng sinh enzyme Laccase:
Aspergillus sp,Aspergillus niger, Aspergillus oryzca, Aspergilluss candidus,
Fusarium sp, Trichoderma reesei ru, Streptomycest-c30, Kluyverromyces lactic,
torulopsis spherical, Torulopsis pseudotropicalis, Saccharomyces fragilis,….
Phạm Duy Hải và cộng sự nghiên cứu ―Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi
trƣờng dinh dƣỡng và các điều kiện nuôi cấy bề mặt tạo sinh khối chứa enzyme
phytase có hoạt lực cao từ Aspergilus niger‖. Phạm Duy Hải và cộng sự của

ông đã tối ƣu hóa đƣợc thành phần trung bình và điều kiện lên men trạng thái
10


nửa rắn cho phytase ngoại bào bởi Aspergillus niger YD với mục tiêu tăng sản
lƣợng để làm cho nó kinh tế nhƣ một sản phẩm thƣơng mại đã đạt đƣợc với kết
quả đạt đƣợc, trung bình Thành phần: tinh bột ngô (73%) và bột đậu tƣơng
(24,44%); và lên men nhiệt độ tối ƣu nhƣ nhiệt độ là 370C, thời gian lên men là
5 ngày và tƣơng đối độ ẩm của môi trƣờng là 70%.
1.2.2. Vi khuẩn và xạ khuẩn
Một số chủng vi khuẩn xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme Laccase
- Vi khuẩn: Lactobacillus acidophilus, Lactobaccillus sp, Lactobaccillus
lactic,

Bacillus

sutilis,

Bacillus

curculans,

Streptococcus

sativarius,

Streptococcus thermophilus, E.coli, S.lavendulae, S.cyaneus, Marinomonas
mediterranea …
- Xạ khuẩn: Streptomyces, Streptomyces sp,…
1.2.3. Côn trùng

Laccase đã đƣợc tìm thấy trong lớp biểu bì của nhiều lồi cơn trùng từ
nhộng tằm, lớp biểu bì của bọ cánh cứng màu đỏ, Tribolium castaneum. Gần
đây, một Laccase trong tuyến nƣớc bọt của N.cincticeps [15].
1.3. Tổng quan vể chủng nấm Aspergillus niger
Nấm Aspergillus niger có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử
đính khơng nằm trong bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở 2 đầu tạo
bọng hình cầu 5-6 x 20-30mm, đơi khi 6-10 x 60-70mm. Thể bình gồm 2 lớp,
lớp thứ nhất hình tam giác cân ngƣợc, lớp thứ 2 hình chai; bào tử đính xịe ra,
hình cầu xù xì, có gai nhọn, màu nâu đen đến đen than, đƣờng kính 4-5mm [7].
Sinh trƣởng đƣợc ở nhiệt độ tối thiểu 6-8 độ C, tối đa 45-47 độ C, tối ƣu 25-28
độ C
- Một số loại enzyme phổ biến mà enzyme mà Aspergillus niger có thể
tiết ra
+ A-amylase: Aspergillus niger có khả năng tổng hợp a-amylase ngoại
bào để thủy phân nhanh tinh bột tạo dextrin và một ít maltose và glucose.
+ Protease: Aspergillus niger có khả năng tạo 2 loại protease. Protease thứ nhất
11


phân giải protein thành polypeptid, pepton; protease thứ hai tiếp tục chuyển hóa
các sản phẩm trên thành acid amin.
+ Cellulase: Aspergillus niger có khả năng tạo cellulase, chủ yếu là
cellulase Cl, cellulase Cx và b-glucosidase hay cellobiase.
+ Pectinase, Xylanase: Aspergillus niger có khả năng tạo pectinase,
xylanase ở
Ngồi ra, Aspergillus niger cịn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzyme
khác nhƣ: lipase, mananase, chitinase, pectinase
Trong công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm nhƣ: tƣơng chao, nƣớc
mắm, nƣớc tƣơng;công nghiệp sản xuất một số axit hữu cơ nhƣ: acid citric, acid
glucomic

Aspergillus niger là một loại nấm và một trong những loài phổ biến nhất
của các chi Aspergillus. Nó gây ra một căn bệnh đƣợc gọi là nấm mốc đen trên
một số loại trái cây và rau quả nhƣ nho,....
1.4. Tình hình nghiên cứu về enzyme Laccase
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 2008 Dube và cộng sự quan sát thấy axít tetraacetic ethylene
diamine (EDTA) (5 mM) hồn tồn ức chế hoạt động của Laccase. EDTA, SDS
và arginine có tác dụng ức chế nổi mạnh nhất đối với hoạt động của Laccase
[15].
Năm 2017 amit kumar và cộng sự Thanh lọc dựa trên gel và nghiên cứu
sinh hóa của Isozym Laccase sản xuất từ Ganoderma sp. Kết quả đạt đƣợc các
isozyme Laccase từ G. Lucidum đã đƣợc tìm thấy có vai trị chống oxy hóa và
do đó có khả năng trong các gốc tự do nhặt rác trong quá trình sinh bệnh. Đây là
nghiên cứu chi tiết đầu tiên về đặc điểm sinh hóa của tất cả các isozyme Laccase
đƣợc tinh chế bằng phƣơng pháp mới dựa trên gel.

12


1.4.2. Tính hình nghiên cứu trong nước
Laccase là một enzyme có nhiều ứng dụng trong các nghành các cơng
nghiệp xử lý môi trƣờng, ...mà phổ phản ứng với cơ chất khá là rộng đó cũng là
lý do enzyme Laccase đang đƣợc quan tâm và nghiên cứu nhiều ở nƣớc ta.
Năm 2012, Nguyễn Thị Phƣơng Mai và cộng sự đã tinh sạch và xác định
đặc tính của Laccase tái tổ hợp từ Aspergillus niger d15#26 lcc1 1.8b. Laccase 1
từ T. versicolor 06 đƣợc biểu hiện trong A. niger D15#26 lcc1 1.8B, với cơ chất
cảm ứng là glucose, đạt hoạt độ cao nhất 4250 U/L sau 7 ngày nuôi ở tốc độ lắc
200v/phút, pH 6. Laccase tinh sạch có khối lƣợng phân tử 70 kDa, phản ứng tối
ƣu ở nhiệt độ 450C và pH 4. Enzym bền trong khoảng nhiệt độ từ 30 – 35 0C và
pH 4 - 6. Các thông số động học của Laccase trong phản ứng với ABTS l Km

1,35 àM; Vmax 53,14 àM/phỳt-1; Kcat 10,42 ì 106 s-1 v Kcat/Km 7,72 ì 106
àM-1s -1 cho thy enzyme hoạt động hiệu quả trong oxy hóa cơ chất ABTS [5].
Năm 2015 Trịnh Thu Thủy và cộng sự nghiên cứu phân lập các
chủng nấm mốc sinh tổng hợp Laccase từ gỗ kết quả nghiên cứu đã phân lập
đƣợc 5 chủng nấm mốc có kí hiệu là BN1, BN2-1, BN2-2, ĐA3-1 và BV1 có
hoạt độ enzyme Laccase dao động từ 1.480 - 24.720 U/ml. Trong các chủng này,
chủng BV1 là chủng có hoạt tính enzyme cao nhất (24.720 U/ml ). Chủng BV1
sơ bộ đƣợc xếp vào chi Meruliporia sp [1].

13


CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp
Laccase của chủng nấm Aspergillus niger đã đƣợc phập lập ở rừng núi Luốt
trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu lựa chọn mơi trƣờng lên men thích hợp sinh tổng hợp
enzyme Laccase cho chủng nấm Aspergillus niger
- Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng (cacbon, nito) đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme Laccase từ chủng nấm Aspergillus niger.
- Khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, tốc độ lắc)
đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Laccase từ chủng nấm Aspergillus niger.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
- Chủng nấm Aspergillus niger đã đƣợc phân lập từ gỗ mục tại rừng núi
luốt Đại Học Lâm nghiệp Việt Nam.
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là các loại máy móc, trang

thiết bị có ở phịng thí nghiệm của Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện
Cơng nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp.
Stt

Thiết bị

Xuất sứ

1

Box cấy vô trùng (Box laminar PII)

Đức

2

Tủ ấm (Memmert)

Đức

3

Nồi hấp khử trùng (Lequenx)

Pháp

4

Cân điện tử (AL300)

Mỹ

5

Kính hiểm vi quang học

Đức

14


6

Bếp điện/ bếp từ

Việt nam

7

Tủ sấy

Mỹ

8

Lị vi sóng

Mỹ

9

Máy đo Ph

Nhật

10

Máy lắc

Đức

11

Máy ly tâm lạnh

Đức

Đĩa petrti,ống đong, bình thủy tinh 100ml,
250ml, 500ml,1000ml, ống falcon, giấy

12

Việt Nam, Trung
Quốc,...

cân, đèn cồn,..
2.3.1.Hóa chất và mơi trường sử dụng
2.3.2.1. Hóa chất

Các loại hóa chất sử dụng: Glucose, Pepton, KH2PO4, FeSO4, MnSO4,

MgSO4, ZnSO4, K2HPO4 , (NH4)2SO4, CaCl2, MgSO47H2O, NH4Cl, NaNO3,
HCl, NaOH, KCl,.....
2.3.2.2. Môi trường sử dụng


Môi trƣờng kiểm tra khả năng sinh enzyme Laccase chủng nấm CN1



Mơi trƣờng thử hoạt tính enzyme Laccase
Stt

Hóa chất

g/l

1

Agar

15

2

Acid tannic

5

 Các môi trƣờng sử dụng lên men lỏng sinh tổng hợp laccse
+ Mơi trƣờng PDB

STT

Hóa chất

g/l

1

Dịch chiết khoai tây

200

15


2

Glucose

10

+ Mơi trƣờng VIS
STT

Hóa chất

g/l

1

Pepton

3

2

Glucose

10

3

KH2PO4

0.6

4

FeSO4

0.0005

5

MnSO4

0.05

6

MgSO4

0.5

7

ZnSO4

0.001

8

K2HPO4

0.4

+ Mơi trƣờng GYMP
STT

Hóa chất

g/l

1

MgSO4.7H2O

0.5

2

KH2PO4

0.4

3

K2HPO4

1

4

Glucose

10

5

Pepton

2

6

Cao nấm men

2

7

NH4Cl

1

8

Cao malt

2

Chú ý: môi trƣờng pH 6

16


+ Mơi trƣờng MEG
STT

Hóa chất

g/l

1

KH2PO4

1

2

Na2HPO4

4

3

NaCl

0.2

4

MgSO4

0.2

5

CaCO3

0.5

6

Cao men

4

7

Cao malt

2

8

Glucose

4

 Mơi trƣờng bán rắn sinh tổng hợp Laccase
+ Môi trƣờng bán rắn (cám trấu)
STT

Hóa chất

g/l

1

Trấu

50

2

Cám

40

3

Saccharose

4

4

(NH4)2SO4

0.1

5

Ure

2.2

6

CaCl2

0.1

7

KCl

0.05

8

MgSO47H2O

0.05

9

HCl

0.05

Chú ý: Đối với mơi trƣờng bán rắn khi thu enzyme ngoại bào
dùng đệm photphat tách enzyme ngoại bào.
17


 Các loại môi trƣờng dùng trong khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy và các
chất dinh dƣỡng
 Môi trƣờng khảo sát pH nhiệt độ và tốc độ lắc
STT

Hóa chất

g/l

1

Pepton

3

2

Glucose

10

3

KH2PO4

0.6

4

FeSO4

0.0005

5

MnSO4

0.05

6

MgSO4

0.5

7

ZnSO4

0.001

8

K2HPO4

0.4

 Mơi trƣờng thử các loại đƣờng
STT

Hóa chất

g/l

1

Pepton

3

2

Glucose/ mantose/ saccharose/
fructose/ lacctose

10

3

KH2PO4

0.6

4

FeSO4

0.0005

5

MnSO4

0.05

6

MgSO4

0.5

7

ZnSO4

0,001

8

K2HPO4

0.4

18


 Môi trƣờng khảo sát ảnh hƣởng của các nguồn nitrogen
STT
1

Hóa chất
Pepton/cao nấm men/ NH4Cl/
(NH4)2SO4

g/l
3

2

Đƣờng

3

KH2PO4

0.6

4

FeSO4

0.0005

5

MnSO4

0.05

6

MgSO4

0.5

7

ZnSO4

0.001

8

K2HPO4

0.4

Chất nhuộm: lugol, tím kết tinh, fucshin
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Xác định hoạt tính enzyme Laccase của chủng Aspergillus niger
Nguyên tắc:
Dựa trên sự biến đổi màu sắc của nấm trên mơi trƣờng thử hoạt tính
Laccase và vịng phân giải của nấm.
 Tiến hành
- Ni chủng nấm Aspergillus niger trên môi trƣờng PDB lỏng
- Nuôi ở nhiệt độ 30oC,trong điều kiện có lắc, sau 4 ngày tiến hành thu
dịch enzyme đi ly tâm ở 10000 vòng/phút ở 4oC.
- Dịch thu đƣợc thử hoạt tính theo phƣơng pháp đục lỗ thạch trên mơi
trƣờng thử hoạt tính.
- Nhỏ 100

dịch enzyme vào lỗ thạch.

- Ủ đĩa đã nhỏ dịch enzyme trong tủ lạnh 2 giờ, sau 2 giờ cho đĩa thử
hoạt tính vào tủ ấm ủ ở 25oC trong 4 ngày.
- Sau 4 ngày tiến hành đo vòng hoạt tính.
19