Sử dụng chỉ thị phân tử phân tích sinh vật biến đổi gen và sản phẩm của chúng

GI O
Ƣ

“SỬ DỤ

V

OT O

Ọ
………………………

KĨ THUẬ PCR PHÂN TÍCH SINH CÁC CÂY TRỒ
Ổ

S

Ẩ

u nn
ã số

Ủ

n

n n

Sn

: 307

Giáo viên hướng dẫn: TS. Đặng Trọng Lương
ThS. Bùi Văn Thắng
Sinh viên thực hiện :

Dương Thị Hoa

- 2009

ọc


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đặng Trọng Lương và ThS.
Phí Cơng Ngun đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu cũng
như trong q trình hồn thành bản khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Bùi Văn Thắng, Trung tâm
giống và công nghệ sinh học – Khoa lâm học - Đại học Lâm Nghiệp đã tận
tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy, các cơ trong cùng các bạn sinh
viên trong phịng Kĩ thuật Di truyền , Viện Di truyền Nông Nghiệp đã giúp đỡ
và tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt bản khóa luận.
Em cũng xin cảm ơn thầy Hồ Văn Giảng cùng các thầy, cô thuộc
Trung tâm Công nghệ sinh học, Bộ môn giống và công nghệ sinh học, khoa
Lâm học – Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ em trong quá trình học tập và
nghiên cứu.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới gia đình, người
thân và bạn bè đã tạo điều kiện cả về vật chất lẫn tinh thần để em hồn thành
tốt khóa học và đề tài khóa luận này.
Sinh viên

Dương Thị Hoa


MỞ ẦU
Khoảng thời gian cuối thế kỉ XX, cùng với công nghệ thông tin, công
nghệ sinh học (CNSH) trở thành ngành công nghệ mũi nhọn. Liên hợp quốc đã
thành lập trung tâm quốc tế về CNSH và công nghệ gen, trong đó Việt Nam là
một thành viên. CNSH đã được đưa vào chương trình hợp tác quốc tế trong hội
đồng tương trợ quốc tế. Cùng với sự phát triển vượt bậc của CNSH thì cơng
nghệ gen đã mở ra một chân trời mới, chứa đựng một tương lai đầy hứa hẹn về
cải tiến giống cây trồng, vật nuôi và vi sinh vật. Sinh vật biến đổi gen hay còn
gọi là GMOs đã trở thành một bộ phận không thể thiếu của môi trường và là
một phần trong chuỗi thực phẩm. GMOs và sản phẩm của chúng đã và đang
được thương mại hóa rộng rãi ở nhiều quốc gia. Ở khía cạnh nào đó, việc sử
dụng các thành tựu CNSH đặc biệt là cơng nghệ gen có thể chứa đựng các rủi ro
về mặt kinh tế, xã hội và môi trường. Vì vậy việc quản lý và đề ra các pháp chế
kiểm soát các GMOs là rất cần thiết. Nhiều quốc gia đã có những pháp chế đối
với vấn đề quản lý sử dụng GMOs: Vấn đề dán nhãn sản phẩm cây trồng biến
đổi gen và sản phẩm của chúng đang là yêu cầu bắt buộc. Ở một số nước châu
Âu và một số quốc gia như Nhật Bản, Australia… đã có dự luật đối với việc
dán nhãn sản phẩm biến đổi gen như: Bắt buộc những sản phẩm chứa trên 1%
thành phần GMC ( ối với

hâu Âu), 5% GM

( ối với Nhật Bản), 3% (với

các nước khác) thì phải dán nhãn ghi rõ nơi sản xuất gen chèn, nguồn gốc gen
chèn, quy trình sản xuất các sản phẩm.

Ở Việt Nam, sự phát triển của công nghệ gen cũng đã tạo ra được một số
giống cây trồng, vật nuôi và vi sinh vật chuyển gen. Trong khi các sản phẩm
khoa học này đều được các nhà khoa học Việt Nam quản lý chặt chẽ thì một số
sản phẩm GMOs của các công ty xuyên quốc gia du nhập vào nước ta theo con
đường khơng chính thống lại đang được trồng trên đồng ruộng hoặc bán trên thị
trường mà khơng có sự quản lý của nhà nước.
1


ho đến nay, Việt Nam vẫn chưa có quy chế an toàn sinh học quy định về
việc quản lý GMOs và sản phẩm của chúng. Nhưng chúng ta cũng có những đề
xuất, soạn thảo, làm tờ trình để chính phủ phê duyệt về “Quy chế quản lý an
toàn sinh học các GMOs và sản phẩm của chúng”. Nhằm đáp ứng yêu cầu giao
dịch thương mại quốc tế và để công nghệ gen nước ta được phát triển mạnh hơn
nữa không chỉ ở quy mơ phịng thí nghiệm.
ể góp phần cho quản lý GMOs chúng tôi thực hiện đề tài “Sử dụng kĩ
thuật PCR phân tích các cây trồng biến đổi gen và sản phẩm của chúng .
Nghiên cứu phát hiện những gen ngoại lai trong cây trồng biến đổi gen và sản
phẩm của chúng trên cơ sở các kĩ thuật PCR, mutiplex P R, điện di trên gel
agrose...

2


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LI U
1.1 Khái ni m về GMO
Sinh vật biến đổi di truyền (GMO – Genetically Modified Organims) là
cơ thể sống (cây trồng, vi sinh vật…) mà vật chất di truyền của nó đã bị biến
đổi nhờ kĩ thuật gen [14, 35,32]. Sự biến đổi di truyền thường bao gồm sự chèn

ADN, tái tổ hợp những mảnh ADN nhỏ hơn vào trong genome của cơ thể bị
biến đổi. Quá trình này được gọi là chuyển nạp. Cấu trúc của gen chèn điển
hình trong GMO được tạo nên bởi 3 cấu phần [35]:
-

ọan promoter (đoạn khởi động) có chức năng như một chiếc công tắc

bật/mở để đọc gen đã biến đổi hoặc gen đã chèn.
- Gen đã được chèn (hoặc gen đã bị biến đổi) để mã hóa các đặc điểm đã
chọn lọc riêng biệt.
-

oạn terminator (đoạn kết thúc), có chức năng như một tín hiệu dùng để

đọc gen đã chèn (hoặc gen đã biến đổi).
Ngoài ra, một vài thành tố khác có thể có mặt trong cấu trúc của gen
chèn và chức năng của chúng thường là để điều chỉnh và ổn định chức năng của
gen, hoặc để chứng minh sự có mặt của cấu trúc trong GMO hoặc để có sự kết
hợp dễ dàng của các thành phần khác nhau trong gen chèn. Cấu trúc của gen
phải được tương hợp với genome của cơ thể nhận để nó có sự ổn định về mặt di
truyền. Vì thế, genome của chính cơ thể nhận cũng là một thành tố quan trọng
trong quá trình chuyển nạp.
1.2. Tình hình sản xuất v t ƣơn mại hóa cây trồng biến đổi gen
Những cây trồng biến đổi gen vẫn giống những cây trồng truyền thống
nhưng chúng có thêm một số đặc điểm được cải thiện. Chúng khơng những có
lợi cho nơng dân mà cịn có lợi cho người tiêu dùng. Ngồi ra cây trồng biến
3


đổi gen cịn có tiềm năng bảo vệ mơi trường [11, 21]. Tuy nhiên do tính mới lạ

của các cơ thể được cải thiện về mặt di truyền và sự liên quan đến an tồn sinh
học đã buộc các chính phủ phải đề ra các quy định về cây trồng biến đổi gen. Vì
thế nhiều cuộc thử nghiệm ứng dụng của công nghệ gen đã và đang được diễn
ra trên toàn thế giới. Nhiều cây trồng chuyển gen để cải tiến tính trạng chất
lượng như:


Chống chịu bệnh



Chống thuốc diệt cỏ



Chống chịu côn trùng



Tăng thành phần dinh dưỡng



Tăng thời gian bảo quản
Từ năm 1996 đến năm 2007, sau 12 năm được đưa vào canh tác đại trà,

mang lại lợi ích ổn định và bền vững, cây trồng

NSH đang được trồng ngày

càng nhiều trên toàn thế giới. Năm 2007 là năm thứ 12 liên tiếp diện tích cây
trồng CNSH tiếp tục được mở rộng. Diện tích trồng tiếp tục tăng 2 con số, đạt
12% tương đương với 12,3 triệu héc-ta (30 triệu mẫu) – mức tăng cao thứ nhì
trong vịng 5 năm trở lại đây.

iện tích đất canh tác cây CNSH lên tới 114,3

triệu héc-ta. Mức tăng từ năm 2006 (117,7 triệu ha) tới năm 2007 (143,7 triệu
ha) là 22% (26 triệu ha), đây là mức tăng thực sự từ năm 2006 tới 2007, mức
tăng này gần gấp đôi so với mức tăng thể hiện bên ngoài chỉ là 12%, tương
đương 12,3 triệu ha khi chỉ được đo theo diện tích đơn thuần [2].
Năm 2007, đã có 23 quốc gia canh tác cây trồng CNSH, bao gồm 12
nước đang phát triển và 11 nước công nghiệp. ác nước này nếu xếp theo thứ tự
diện tích đất trồng cây CNSH từ lớn tới nhỏ gồm: Hoa Kỳ, Ác-hen-ti-na, Braxin, Canada, Ấn

ộ, Trung Quốc, Paraguay, Nam Phi, Uruguay, Phi-lip-pin,

Australia,Tây Ban Nha, Mê-hi-cô, Côlômbia, Chilê, Pháp, Honduras, Cộng hòa
Séc, Bồ ào Nha, ức, Slovakia, Rumani và a Lan. áng chú ý là 8 nước đầu
4


tiên trong danh sách trên, mỗi nước đều có diện tích trồng cây CNSH trên 1
triệu héc-ta tạo sự phát triển mạnh mẽ của cây trồng CNSH trên khắp các châu
lục và là nền tảng vững chắc cho sự phát triển của cây trồng CNSH trên khắp
thế giới trong tương lai. Hai nước bắt đầu canh tác cây trồng NSH trong năm
2007 là hilê và a Lan: hilê canh tác hơn 25000 héc-ta cây trồng NSH để
sản xuất hạt giống xuất khẩu, còn Ba Lan – nước thành viên khối EU – lần đầu
tiên trơng ngơ Bt. Tổng diện tích đất trồng cây CNSH từ năm 1996 đến năm
2007 đạt 690 triệu héc-ta (1,7 tỷ mẫu), tăng 67 lần so với năm 1996, đưa NSH

trở thành thành tựu được ứng dụng nhanh nhất trong nông nghiệp. Việc nông
dân đưa cây trồng CNSH vào canh tác với tốc độ tăng rất cao đã cho thấy cây
trồng NSH đang phát triển rất tốt, mang lại lợi ích về kinh tế, mơi trường, sức
khỏe và xã hội cho người nông dân ở các nước phát triển và đang phát triển
[2]

Hình 1.1 : Di n tích cây trồng chuyển gen trên thế giớ
1996- 2007

5

a đoạn


Bảng 1.1:Di n tích cây trồng cơng ngh sinh học một số nƣớc năm 2007
Thứ tự

ƣớc

Di n
tích Cây trồng CNSH
(tri u héc-ta)

1*

USA*

57.7

ậu tương, cải canola, bí, đu đủ,

2*

Argentina*

19.1

ậu tương, ngơ, bông

3*

Brazil*

15.0

ậu tương, bông

4*

Canada*

7.0

Cải canola, ngô, đậu tương

5*

India*

6.2

Bông

6*

China*

3.8

ông, cà chua, cây dương

7*

Paraguay*

2.6

ậu tươn

8*

South Africa*

1.8

9*

Uruguay*

0.5

10*

Philippines*

0.3

Ngô

11*

Australia*

0.1

Bông

12*

Spain*

0.1

Ngô

13*

Mexico*

0.1

ông, đậu tương

14

Colombia

<0.1

Bông, cẩm chướng

15

Chile

<0.1

Ngô, đậu tương, cải canola

16

France

<0.1

Ngô

17

Honduras

<0.1

Ngô

18

Czech Republic

<0.1

Ngô

19

Portugal

<0.1

Ngô

20

Germany

<0.1

Ngô

21

Slovakia

<0.1

Ngô

22

Romania

<0.1

Ngô

23

Poland

<0.1

Ngô

Ngô, đậu tương, bông
ậu tương, ngô

* 13 nước được coi là có diện tích trồng lớn, từ 50,000 héc-ta trở lên
Nguồn: Clive James, 2007.

Hoa Kỳ, Ác-hen-ti-na, Bra-xin, Canada, Ấn ộ và Trung Quốc tiếp tục là

các nước đưa cây trồng CNSH vào canh tác nhiều nhất. Hoa Kỳ vẫn dẫn đầu thế
6


giới với 57,7 triệu héc-ta (chiếm 50% diện tích đất trồng cây CNSH trên thế
giới), do nhu cầu ngày càng tăng của thị trường ngô dùng trong sản xuất cồn
ethanol, diện tích trồng ngơ NSH tăng tới 40% - mức tăng này đã phần nào bù
lại mức giảm đôi chút đối với diện tích trồng đậu tương và bơng NSH. Ấn ộ
là nước trồng bông nhiều nhất trên thế giới với hơn 60 triệu người sống phụ
thuộc vào cây bông. Năm 2002, ở Ấn ộ có 54.000 nơng dân trồng 50.000 hécta bơng Bt. ến năm 2007, diện tích trồng bông Bt tăng lên 6,2 triệu héc-ta, với
số lượng người trồng bông Bt là 3,8 triệu nông dân nhỏ và nghèo[2].
Trong số các cây trồng

NSH được đưa vào thương mại hóa từ năm

1996 đến năm 2007 tính trạng chịu thuốc trừ cỏ vẫn là tính trạng nổi trội. Năm
2007, tính trạng chịu được thuốc trừ cỏ được triển khai trên cây đậu tương, ngơ,
cải canola, cỏ alfalfa với diện tích trồng là 72,7 triệu héc-ta (chiếm 63% diện
tích đất trồng cây CNSH toàn cầu). Năm 2007, lần đầu tiên giống cây trồng
CNSH mang các đặc tính độn hai hay ba gen bắt đầu được trồng trên quy mô
lớn (21,8 héc-ta, chiếm 19% diện tích đất trồng) nhiều hơn so với các giống
kháng sâu bệnh (20,3 triệu héc-ta, chiếm 18%). Diện tích đất trồng các giống
cây CNSH mang các gen độn tổng hợp phát triển nhanh nhất, so với các nhóm
giống cây chỉ mang một đặc tính đơn lẻ (từ năm 2006 tới 2007, tỉ lệ tăng là
66%, so với mức tăng 7% của cây kháng sâu bệnh và 3% của cây chịu được
thuốc trừ cỏ)
Năm 2007, giá trị của thị trường cây trồng

NSH theo ước tính của

Cropnosis là 6,9 tỉ USD, bằng 16% giá trị của thị trường cây trồng được bảo hộ
trên toàn cầu (42,2 tỉ USD), bằng 20% giá trị của thị trường hạt giống thế giới
(34 tỉ USD). Trong số 6,9 tỉ USD, giá trị ngô CNSH là 3,2 tỉ USD (chiếm 42%
giá trị thị trường, tăng lên từ 39% năm 2006); giá trị đậu tương NSH là 2,6 tỉ
USD (chiếm 37%, giảm so với năm 2006), bông

NSH là 0,9 tỉ USD, chiếm

13% và cải canola là 0,2 tỷ USD, chiếm 3%. Trong tổng trị giá thị trường cây
7


trồng CNSH tồn cầu 6,9 tỷ USD, có 5,2 tỉ USD (76%) ở các nước công nghiệp
phát triển, 1,6 tỉ USD (24%) nằm ở các nước đang phát triển. Giá trị thị trường
được tính dựa trên giá bán của hạt giống CNSH cộng với phí cơng nghệ. Tổng
luỹ kế giá trị thị trường

NSH trong 11 năm đầu tiên cây trồng

NSH được

đưa vào thương mại hoá, từ năm 1996, ước đạt 42,4 tỉ USD. Giá trị thị trường
của cây trồng NSH trong năm 2008 dự đoán đạt khoảng 7,5 tỉ USD.
Tại Việt Nam, những nghiên cứu về GMC mới chỉ đạt được một số thành
cơng bước đầu trong phịng thí nghiệm. Các cây trồng biến đổi gen nhận được
thường sử dụng phương pháp biến nạp qua vi khuẩn Agrobacterium. Như cây
thuốc lá mang gen ngoại lai nptII và GUS [8]. Chuyển được gen kháng thuốc
diệt cỏ và kháng bệnh khô vằn vào hai giống lúa DT10 và DT13. Chuyển thành
công gen anti- ACO và một số dòng hoa cúc giúp hoa tươi lâu, dịng ngơ CG1,
CG2 chuyển gen Bt kháng sâu đục thân, đậu tương AR-02, 3950, 5409 chuyển

gen kháng thuốc diệt cỏ, bông Bt kháng sâu, khoai lang kháng bọ hà …[1].
1.3. ác động của cây trồng biến đổi gen và quản lý an toàn cây trồng biến
đổi gen.
1.3.1. Lợi ích của cây trồng biến đổi gen (GMC)
Thực trạng phát triển nhanh chóng của cây trồng biến đổi gen trong những
năm qua đã chứng tỏ chúng có những mặt mạnh nổi trội hơn hẳn những cây
trồng không biến đổi gen. Cây trồng biến đổi gen bao gồm những lợi ích cơ bản
sau [11, 12, 16]:
- Lợi ích nghiên cứu cơ bản: Việc sử dụng GM đã góp phần to lớn trong
việc phát hiện các gen quan trọng, xác định được chức năng của một gen bất kì.
- Lợi ích trong cải tạo giống cây trồng: Nhờ có cơng nghệ gen mà nhiều
giống cây trồng được tạo ra với các đặc tính khơng có ở cây trồng tự nhiên như
khả năng chống chịu các điều kiện ngoại cảnh, chống chịu sâu bệnh, chịu thuốc
diệt cỏ...
8




Thực vật với khả năng tự bảo vệ chống lại cơn trùng và cỏ dại có thể

giúp giảm liều lượng và nồng độ các thuốc trừ sâu được sử dụng, an tồn hơn
cho con người. Ví dụ: ở Trung Quốc bông Bt đã làm giảm thuốc diệt côn trùng
đến 40kg/ha.


Thực vật chịu thuốc diệt cỏ làm cho việc sử dụng các biện pháp không

cày đất – một yếu tố quan trọng trong việc bảo tồn đất đai – trở nên phổ biến.
Ví dụ: người trồng cải dầu ở Canada ít phải cày đất hơn so với trồng cải dầu

truyền thống.
 Thực vật chuyển gen làm tăng đáng kể sản lượng thu hoạch, do vậy
với diện tích đất canh tác ít hơn vẫn có thể thu được nhiều lương thực hơn.
- Lợi ích trong chăn ni gia súc: ơng nghệ chuyển gen thực vật đã tạo
ra các loại thức ăn gia súc chứa các kháng thể đặc hiệu hay văcxin tái tổ hợp,
làm tăng sức đề kháng của vật nuôi với bệnh tật, tạo ra các loại thức ăn có hàm
lượng dinh dưỡng cao.
- Lợi ích trong cơng nghệ thực phẩm: Rất nhiều loại thực phẩm mới có
chất lượng dinh dưỡng cao, mẫu mã đẹp, thời gian bảo quản lâu, làm thay đổi
hàm lượng axit béo trong dầu thực vật làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch đã
được tao ra nhờ cơng nghệ chuyển gen thực vật.
- Lợi ích trong công nghệ dược phẩm: Nhờ kĩ thuật ADN tái tổ hợp,
người ta có thể sản xuất các sản phẩm như kháng nguyên, các protein người ..từ
cây trồng biến đổi gen.
- Lợi ích về mơi trường:
 Năng suất của cây trồng biến đổi gen cao hơn rất nhiều so với các cây
trồng tự nhiên.

o đó sự phát triển của GMC sẽ làm giảm nhu cầu chuyển đổi

đất rừng và đất ở thành đất nông nghiệp. Làm giảm nhu cầu sử dụng thuốc trừ
sâu, thuốc trừ cỏ, bón đạm... như vậy sẽ làm giảm ô nhiễm nguồn nước và nguy
cơ gây hại cho sức khỏe con người .
9


 Hạn chế sự thay đổi khí hậu tồn cầu và giảm khí nhà kính (GHG):
Hạn hán lũ lụt và thay đổi nhiệt độ sẽ trở nên phổ biến và nghiêm trọng hơn, vì
thế cần phát triển các giống cây chịu được và thích nghi được với những điều
kiện này. Một vài công cụ trong ngành CNSH, bao gồm chuẩn đốn bệnh,

genomics, chọn lọc có sự trợ giúp của marker phân tử (MAS) và cây trồng
NSH được sử dụng để " ẩy nhanh việc chọn tạo giống" và làm giảm tác động
của sự thay đổi khí hậu. Cây trồng

NSH cũng góp phần làm giảm khí CO2,

bảo tồn đất và độ ẩm, giảm lượng thuốc trừ sâu và cô lập CO2.
- Lợi ích kinh tế: GM đã và đang mang lại cho người nơng dân nhiều
lợi ích kinh tế, làm giảm chi phí sản xuất, giảm sức lao động và tăng giá trị sản
phẩm.
- Lợi ích người tiêu dùng: Nhờ có cơng nghệ chuyển gen thực vật mà
người tiêu dùng có thể có được các sản phẩm thực phẩm có lợi hơn đối với con
người như các sản phẩm có chất lượng dinh dưỡng cao, có hương vị, có thời
gian bảo quản lâu, hay được bổ sung các chất như vitamin E, vitamin A... Ngoài
ra người ta đã chứng minh khả năng làm giảm tỷ lệ nhiễm độc tố do nấm bệnh
tạo ra và giảm mức độ tạo độc tố nấm trong thời gian bảo quản của hạt giống
ngô kháng sâu nhờ đó mà những độc tố này khơng thể gây hại đến sức khỏe của
con người và vật nuôi [17, 54].
1.3.2 . Những rủi ro có thể có của cây trồng biến đổi gen (GMC)
Bên cạnh những lợi ích to lớn mà GMC mang lại, người ta khơng thể khơng
tính đến những mặt có hại của nó và thường xem xét vấn đề này ở khía cạnh sau
[14, 15, 16]:
- Hiểm họa cỏ dại: Khả năng xảy ra lai chéo xa (lai không mong muốn
giữa một cây trồng với một cây có quan hệ họ hàng). Lo ngại chính của cây
chuyển gen là tạo ra lồi cỏ mới thơng qua lai chéo có khả năng kháng thuốc trừ
cỏ, hoặc sự phát triển khơng kiểm sốt được của GMF.
10


- Khả năng kháng sâu: ây trồng kháng sâu có khả năng tiêu diệt các lồi

sinh vật khơng phải là sinh vật cần diệt (ví dụ như những cơn trùng hữu ích)
làm ảnh hưởng đến chuỗi thức ăn tự nhiên, ảnh hưởng đến sự đa dạng sinh học.
- Nguy cơ phát sinh các mầm bệnh: Nguyên nhân này là do khả năng tái
tổ hợp của một gen virus có sẵn trong GMC với các gen từ một virus khác
nhiễm vào cây đó tạo các virus mới.
- Sự kháng kháng sinh:

o các GM

thường được chuyển các gen quy

định tính trạng kháng kháng sinh, vì thế gây ra mối lo lắng rằng liệu các gen
này có thể được phát tán từ các cây trồng chuyển gen kháng các vi sinh vật cư
trú trong ruột người và làm chúng tăng khả năng đề kháng đối với kháng sinh.
Tuy nhiên người ta thấy rằng mối nguy cơ này với xác suất vô cùng nhỏ và nếu
có xảy ra thì tác động này cũng khơng đáng kể .
- Nguy hiểm với sức khỏe con người: Trong số những rủi ro có thể có của
GMC với sức khỏe có 3 vấn đề các nhà khoa học xem xét nhiều nhất là [1, 6]:


Việc đưa các gen tương tự và hai loại tế bào khác nhau có thể sản

sinh ra 2 phân tử protein khác nhau.


Việc đưa và một số gen có nguồn gốc cùng lồi hoặc khác lồi

ln ln làm thay đổi đáng kể đến sự biểu hiện của tồn bộ gen vì vậy làm
thay đổi tế bào nhận phenotype.


Khả năng tạo ra các con đường hay nhờ enzyme đã được đưa vào

để tổng hợp các phân tử nhỏ như vitamin hay có thể tương tác giữa các quá
trình nội sinh để sinh ra các phân tử lạ.
Kết quả của tất cả sự lo lắng này là sản phẩm của sinh học phân tử được
sinh ra có thể là các protein độc tố hoặc là các chất gây ung thư hay chất gây dị
ứng. Các nhà khoa học cũng lo sợ rằng: chúng có thể tạo ra đột biến nếu có sự
sai sót trong ADN ở tế bào. Những biến đổi quy luật chức năng này có thể tạo

11


ra các thành phần mới hoặc làm thay đổi mức độ tồn tại của các thành phần
trong cơ thể.
1.4. Thực phẩm và thức ăn c ăn nu

b ến đổi gen

1.4.1. Tình hình thương mại hóa GM
Khi dân số tăng lên thì nhu cầu về các sản phẩm phục vụ cho chăn nuôi
cũng tăng lên. Hơn nữa, với sự phát triển đơ thị hố và mức thu nhập ngày càng
tăng ở nhiều nước đang phát triển dẫn đến nhu cầu về các sản phẩm từ thịt, sữa,
trứng tăng lên. Ước tính tăng khoảng 2% ( elgado và CS, 1999). Tính đến năm
2002, nhu cầu trên toàn thế giới đối với các sản phẩm từ thịt cũng sẽ tăng hơn
55% so với mức tiêu thụ hiện tại, phần lớn ở các nước đang phát triển
(Rosegrant và CS, 2001). Do vậy nhu cầu đối với các lọai thức ăn chăn nuôi sẽ
tăng 3%/năm ở các nước đang phát triển và 0,5%/năm ở các nước phát
triển.Với sự phát triển của kĩ thuật gen và các ngành công nghiệp nhiều GMC
đã được chế biến để tạo thành các sản phầm thực phẩm cho người và động vật.

Những GM đã được sử dụng để chế biến thức ăn cho chăn ni ngày một phổ
biến, điển hình là các loại cây như: Ngô, đậu tương, khoai tây, cải dầu. Những
giống này được biến đổi gen để biểu hiện tính trạng kháng thuốc diệt cỏ, kháng
cơn trùng, kháng virus, thay đổi hàm lượng Protein. Rõ ràng đây là cơ hơi mở
rộng diện tích canh tác, tăng năng suất mà không gây ra tác động bất lợi đối với
môi trường. ây là triển vọng lớn đối với thức ăn chăn nuôi từ GMC [19].
Hiện nay số lượng và chủng loại cây trồng chuyển gen phục vụ cho chăn
nuôi ngày càng tăng lên.

ặc biệt là ngô chuyển gen. Trên thế giới, diện tích

trồng ngơ chuyển gen là 10 triệu ha với sản lượng thu hoạch là 90 triệu tấn/năm,
75% ngô chuyển gen được dùng làm thức ăn chăn nuôi.

ối với đậu tương thì

có khoảng 70 triệu tấn bột đậu tương là có nguồn gốc từ đậu tương chuyển gen
được dùng làm thức ăn chăn nuôi hàng năm. Tỷ lệ phần trăm trong tổng số sản
lượng cây trồng được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi từ hạt ngũ cốc dao động từ
12


18% với lúa mì, 52% với cao lương, 70% với ngô, 75% cho yến mạch và 90%
cho thức ăn từ tinh dầu (Gilbert, 2000) [24].
Trong tương lai, các cây trồng phục cho chăn nuôi sẽ càng được nâng cao
về mặt dinh dưỡng: tăng hàm lượng protein, amino acid, hydrat cacbon…Ngoài
ra chúng còn phong phú hơn về chủng loại và gen chuyển.

13

Bảng 1.2: Các loại cây trồng chủ yếu đan đƣợc sử dụng làm thức ăn c ăn nu
Cây trồng

Tính trạng chuyển

Số giống
chuyển

Nƣớc sử dụng

Củ
cải Chống chịu thuốc diệt cỏ
đường

3

Canada, Nhật Bản, Hoa Kì

Cải dầu

19

Canada, Nhật Bản, Hoa Kì,

Chống chịu thuốc diệt cỏ

Philipin, Australia
Có hàm lượng acid béo

2

Canada, Hoa Kì

Chống chịu thuốc diệt cỏ

4

Nhật Bản, Mexico, Nam
Phi, Uruguay, Thụy Sĩ

Có hàm lượng acid béo
chuyển đổi

3

Canada, Nhật Bản, Hoa Kì

Kháng sâu bệnh

4

Nhật Bản, Mexico, Nam
Phi, Hoa Kì, Philipin

Kháng sâu bệnh/ kháng
thuốc cỏ

3

Nhật
Bản,
Australia, Hoa Kì

Kháng sâu bệnh

14

Philipin, Australia, Hoa Kì

Kháng sâu bệnh/ Kháng
virus

6

NhậtBản,
Australia, Hoa Kì

Lúa mỳ

Kháng thuốc cỏ

4

Canada

Ngơ

Kháng sâu bệnh

3

Australia, EU, Nhật Bản ...

Kháng thuốc cỏ

10

Hoa Kì, Thụy Sỹ, Anh Quốc
, EU, Nhật Bản.

Kháng sâu bệnh/ kháng
thuốc cỏ

13

Hoa Kì, Thụy Sỹ, Anh Quốc
, EU, Nhật Bản.

Kháng sâu hại rễ

2

Canada, Nhật Bản, Hoa Kì

Kháng thuốc cỏ

1

Canada

chuyển đổi
âu tương
Bông

Khoai tây

Hướng
dương

Nguồn dữ liệu cơ bản: Dữ liệu về GMC từ Agbios (2004 ) [52]

14

Philipin,

Philipin,


15


1.4.2. Lợi ích, rủi ro và các vấn đề đặt ra khi sử dụng thức ăn chăn nuôi
GM.
Các sản phẩm thức ăn GM mang lại nhiều lợi ích và được thương mại
hóa rộng khắp và chính vì vậy người ta cũng phải quan tâm đến tính an tồn của
nó. Các câu hỏi liên quan đến tính an tồn khi sử dụng chúng là: Các cây trồng
chuyển gen có an tồn khi sử dụng làm thức ăn chăn nuôi hay không? ộng vật
có bị ảnh hưởng hay khơng? Các vật liệu biến đổi gen có tích lũy vào trứng,
sữa, thịt hay khơng? [19].

o đó, việc đánh giá tính an tồn của sản phẩm này

phải được đánh giá ở mức độ phân tử, xem xét thành phần cấu tạo, độc tính và
đặc điểm dinh dưỡng để so sánh với các loại thức ăn gia súc truyền thống [6].
Ngồi ra tính an tồn của nó cịn được xem xét dựa và những hậu quả khơng
mong đợi sinh ra từ những biểu hiện tính trạng mới (ví dụ như hậu quả về sự
chuyển hóa liên quan đến sự biểu hiện của enzyme mới hoặc những thay đổi về
sự biểu hiện của enzyme nội sinh).
Ngoài những tác động trực tiếp lên các loài động vật khi chúng ăn các
khẩu phần ăn có chứa GMO, thì dư luận còn quan tâm đến những tác động gián
tiếp của nó:
- ADN của gen chèn (hoặc ADN của gen biến đổi) hay các sản phẩm
protein của chúng trong thức ăn chăn ni GM, có thể được chuyển tới hoặc
tích lũy trong sản phẩm thực phẩm của động vật (thịt, trứng, sữa).
- Việc tiêu thụ các sản phẩm thực phẩm này có thể dẫn tới những ảnh
hưởng có hại cho sức khỏe con người [6,19].
Mối quan tâm này được tính đến khi xem xét những điều không thể tránh
được khi tiêu hố ADN và protein có mặt trong tất cả các thực phẩm. Tổ chức
y tế thế giới (WHO) và FAO (WHO, FAO/WHO, 1991), cũng như cơ quan
quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (US FDA, 1992), US EPA đã khuyến cáo rằng
16


việc tiêu hóa ADN của tất cả các sản phẩm GM này đều an tồn. Mặc dù thật
khó khăn để cung cấp những đánh giá thực tế về lượng ADN bổ xung và thức
ăn hàng ngày của động vật là bao nhiêu. Theo đánh giá thì lượng ADN có trong
hầu hết các cây lương thực thấp hơn 0,02% và với tỷ lệ 0,005% ở một số cây
trồng khác (Waston và Thmpson, 1998). Nhìn chung, các sản phẩm dẫn xuất từ
động vật nuôi bằng thức ăn chứa GMO là sản phẩm có tính an tồn cao hơn các

sản phẩm dẫn xuất khác từ GMO khác. Tuy nhiên việc dán nhãn sản phẩm thức
ăn gia súc vẫn là một yêu cầu bắt buộc trong quy chế quản lý an toàn sinh học
các GMO và sản phẩm của chúng.
1.5. Vấn đề dán nhãn sản phẩm biến đổi gen
Những rủi ro và những lo ngại bất thường xung quanh quá trình biến đổi
di truyền mà việc bắt buộc dán nhãn các sản phẩm GMOs đã trở thành một yêu
cầu và là quy định của nhiều quốc gia. Việc dán nhãn sản phẩm cho phép người
tiêu dùng lựa chọn sản phẩm theo phong tục, tôn giáo, chế độ ăn hàng ngày của
họ vì nhiều tơn giáo khơng thích sử dụng các sản phẩm được tạo ra nhờ sự biến
đổi di truyền.
Bất kì một sản phẩm chuyển gen nào trước khi được đưa ra thị trường
phải được thử nghiệm toàn diện, được các nhà khoa học và giám định viên đánh
giá độc lập xem có an tồn hay khơng về mặt dinh dưỡng, độc tính và các khả
năng gây dị ứng và các khía cạnh thực phẩm khác. Những đánh giá này về an
toàn thực phẩm dựa trên quy định của từng quốc gia. Nhưng bao giờ cũng bao
gồm: Một hướng dẫn sử dụng sản phẩm, một thơng tin chi tiết về mục đích sử
dụng sản phẩm , một thông tin chi tiết và cách mục đích sử dụng sản phẩm, các
thơng tin về phân tử, hố sinh, độc tính, dinh dưỡng và khả năng gây dị ứng
[17].
ã có rất nhiều dự luật được đề xuất, ví dụ như dự luật HB No.1647
(Rep.Del de Guzman) chỉ ra rằng: tất cả GMOs nên nói rõ nguồn gốc của gen
17


ngoại lai đã được chuyển vào thực phẩm và chỉ rõ quy trình sản xuất đã sử
dụng. Dự luật HB 3395 (Rep.Emmylou J.Santos) cho rằng: phải có sự cưỡng
thúc, bắt buộc phải có sự tách biệt GMOs với Non- GMOs ở tất cả các siêu thị.
Dự luật H

2736 (Rep.Fank Rerez) đã cho rằng: tất cả các nhà hàng và các

công ty cũng phải cung cấp bảng thông báo rằng thực phẩm mà họ đang sử
dụng có chứa GMOs hay khơng ?
Khi các nhà khoa học đưa ra kiến nghị về việc dán nhãn sản phẩm GM
(Genatically Modified) thì một số chính phủ ủng hộ GM đã phản đối ý kiến
này. Mỹ và Canada là hai nước kịch liệt phản đối việc dán nhãn GMF trong khi
Châu Á và Châu Âu lại ủng hộ [6, 12]. Mới đây Mỹ và các nước EU đã đề xuất
những dự luật với việc dán nhãn sản phẩm GMOs: Dự luật HB No.1647 của Mỹ
cũng chỉ ra rằng tất cả GMOs nên nói rõ nguồn gốc của gen ngoại lai, dự luật
EEC 258/97 và EEC 49/2000 ở châu Âu cho phép sự có mặt của GMO trong
sản phẩm nhập khẩu ở mức thấp hơn 1% và nếu GMO có trong thành phần của
thực phẩm quá 1% thì sản phẩm đó phải dán nhãn là sản phẩm GM, ghi rõ nơi
sản xuất, nguyên liệu sản xuất, nguồn gốc của GMO [35]. Nhật Bản yêu cầu
dán nhãn ADN tái tổ hợp khi hàm lượng ADN hay protein công nghệ sinh học
chiếm từ 5% trở lên trong tổng lượng sản phẩm. Hàn Quốc yêu cầu dán nhãn
thực phẩm chế biến sử dụng ngô, đậu tương, mầm đậu tương chuyển gen, hay
khi ba loại nguyên liệu này có trong 5 thành phần chính của một sản phẩm thực
phẩm chuyển gen, mức cho phép lưu hành là dưới 3% [18, 19].
Ở Việt Nam, các nhà khoa học đang rất thận trọng trong công tác quản
lý các cây trồng biến đổi gen. Tuy nhiên, hạt giống các cây trồng biến đổi gen
đang được du nhập vào Việt Nam thông qua các con đường khơng chính thống
và được trồng trên các cánh đồng mà khơng có sự kiểm sốt chặt chẽ. Qua các
kết quả khảo sát đã phát hiện ngô, đậu tương, bông cùng một số loại cây biến
đổi gen khác đang được trồng ở nhiều nơi trong cả nước như: Hà Nội (Hà Tây),
18


Nam ịnh, Bình Thuận,

ắc Lăk, ình

ương,

ồng Nai. Dự thảo quy chế an

tồn sinh học được Bộ khoa học cơng nghệ và môi trường hợp tác với Viện Di
truyền Nông nghiệp soạn thảo năm 1999 nhưng hiện nay chưa được ban hành.
o đó hiện nay chưa có cơ quan nào được giao nhiệm vụ quản lý cây chuyển
gen. Theo nhận định của các nhà khoa học vướng mắc trong quản lý cây chuyển
gen nằm trong khâu tổ chức và phân công xã hội, chứ không phải ở khả năng
công nghệ. Các phịng thí nghiệm hiện nay ở Việt Nam có đủ khả năng để phát
hiện được các thành phần cây chuyển gen ở giống cây nhập khẩu với độ chính
xác cao [1, 6]. Tuy nhiên, hiện nay chúng ta cũng đang làm thủ tục để tham gia
thực hiện ông ước đa dạng Sinh học và Nghị định thư artagena liên quan đến
vấn đề vận chuyển GMO qua biên giới [12].
Như vậy vấn đề dán nhãn GMO đang được rất nhiều quốc gia nhất trí
(kể cả những nước ủng hộ hoặc khơng ủng hộ GMO). Việc này sẽ thúc đẩy các
nghiên cứu về các sản phẩm công nghệ sinh học và khai thác phát triển GMC ở
một quy mô mới. Và không bao xa nữa GMC sẽ là sản phẩm hàng hoá hữu ích
thực sự nếu như các nhà khoa học, đặc biệt là các công ty công nghệ sinh học
tuân theo các pháp chế một cách nghiêm ngặt theo những quy định về độ an
toàn của các sản phẩm này.
1.6. ác p ƣơn p áp p át

n GMO

Việc nhận biết các sản phẩm GMO có rất nhiều ứng dụng : Như để đánh
giá mức độ tinh sạch của hạt giống, an tồn thực phẩm, đảm bảo lợi ích của
người tiêu dùng. Có rất nhiều kĩ thuật đã và đang được phát triển để đáp ứng
nhu cầu này. Nhận biết GMOs và dẫn xuất của nó có thể được thực hiện nhờ sự

nhận biết phân tử mà những phân tử này có nguồn gốc từ gen chèn. ác phương
pháp xác định GMO thường là:

19


- Phương pháp khuyếch đại dựa trên cơ sở nucleotit: bao gồm kĩ thuật
PCR (Polymerase Chain Reaction), Phản ứng LCP (Ligase Chain Reaction), các
kĩ thuật RFLP, AFLP, RAPD....[7].
- Phương pháp dựa trên cơ sở protein: bao gồm điện di SDS một chiều,
hai chiều, lai Western, kĩ thuật ELISA [7].
- Phương pháp dựa trên sự phát hiện hoạt tính enzyme: Phương pháp này
khơng thích hợp với các sản phẩm đã qua chế biến vì protein đã qua chế biến có
thể sẽ mất hoạt tính [1].
- Tuy có nhiều kĩ thuật khác nhau để xác định GMO nhưng mỗi kĩ thuật
lại có tính đặc hiệu và mặt hạn chế riêng của nó:
+ Phương pháp dưa trên cơ sở protein: Nhờ sự liên kết đặc hiệu giữa
protien và kháng thể. Kháng thể chính là tác nhân bảo vệ cơ thể chống lại sự
xâm nhập của vi khuẩn và virus, khi kháng thể nhận ra phân tử lạ thì nó sẽ liên
kết với phân tử này và trong các phân tích nhận biết GMOs thì sự phức tạp của
mối liên kết lần lượt được nhận biết nhờ phản ứng hình thành sắc tố.

ây là kĩ

thuật ELISA. Tuy nhiên kháng thể có thể khơng được sinh ra khi protein tách
chiết khơng sạch, vì vậy kĩ thuật này đòi hỏi cơ sở vật chất và kĩ thuật cao.
+ Phương pháp dựa trên cơ sở nucleotit:


Dựa trên cơ sở ARN: Nhờ vào sự liên kết đặc hiệu giữa phân tử ARN và

ADN hoặc ARN tổng hợp. Thường thì sự liên kết giữa ARN và primer sẽ dẫn
đến sự chuyển hố phân tử ARN thành ADN thơng qua quá trình sao chép
ngược. Cuối cùng ADN lại được nhân lên nhờ kĩ thuật PCR


Dựa trên cơ sở ADN: Chủ yếu nhờ vào sự nhân đôi của A N đặc hiệu

với kĩ thuật P R.

ây là kĩ thuật được sử dụng phổ biến, có tính đặc hiệu cao

và rất nhạy ngay cả khi hàm lượng ADN thấp.
1.7. Kĩ t uật PCR và những nghiên cứu nghiên cứu sử dụn
định cây trồng biến đổi gen.
20

để xác


Phương pháp P R cho phép khuyếch đại, tạo một số lượng rất lớn bản
sao của gen (hay một đoạn ADN) trong một thời gian ngắn. Nguyên tắc PCR
dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của ADN và nguyên lý tổng hợp
A N. Trên cơ sở của đoạn A N khuôn, đoạn mồi (primer), các nucleotid tự do
(dNTPs) và enzym ADN polymerase có thể tổng hợp được đoạn ADN giới hạn
bởi các đoạn mồi. Lặp lại nhiều lần chu trình nhân gen, trong một thời gian
ngắn số lượng bản sao ADN tạo thành tăng theo cấp số nhân.
1.7.1. Nguyên lý chung của phương pháp
PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kì kế tiếp nhau, mỗi
chu kì gồm 3 giai đoạn [4, 10]

- Giai đoạn biến tính: Ở nhiệt độ cao 90-95° (cao hơn nhiệt độ biến tính
(Tm) của khn), làm đứt các liên kết hydro của phân tử ADN, hai mạch phân
tử ADN tách rời nhau.

oạn khn A N có các đoạn dài gồm nhiều nucleotid

giống nhau, hoặc tỉ lệ G-C càng cao, có nhiệt độ biến tính cao hơn. o vậy cần
căn cứ đặc điểm của ADN khuôn để lựa nhiệt độ biến tính phù hợp. Giai đoạn
này kéo dài 1-2 phút.
- Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ khoảng 55-56° để các mồi bắt cặp với
các mạch đơn A N khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lý hargaff. Giai đoạn này
khoảng 30-60 giây.
- Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ 70-72°C thích hợp với điều kiện hoạt
động của enzyme ADN polymerase. Enzyme ADN polymerase xúc tác hoạt
động tổng hợp gắn thêm các nucleotid vào cuối đoạn mồi, các mồi được kéo dài
trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn, tạo nên các mạch đơn A N mới, giai đoạn
này gọi là giai đoạn polymer hoá. Thời gian giai đoạn này từ 30 giây đến vài
chục phút, tuỳ thuộc vào kích thước của đoạn A N. Thông thường với thời
gian 2 phút, tổng hợp được những đoạn A N kích thước dưới 2 kb.

21


Hình 1.2. Các

a đoạn của phản ứng PCR

- Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kì liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu kì
trước lại được làm khn ở chu kì kế tiếp, nên số lượng bản sao tạo thành tăng
theo cấp số nhân. Một phản ứng P R thường thực hiện 20-40 chu kì, từ mỗi

đoạn ADN khn có thể tạo nên 220-240 bản sao ADN. Trong quá trình thực
hiện phản ứng PCR, cần lưu ý ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng, lượng mồi
và dNTPs tự do giảm, enzyme ADN polymerase hoạt động yếu dần. o đó, cần
tính tốn hàm lượng mồi, dNTPs, enzyme để bảo đảm phản ứng PCR có kết quả
tốt nhất.
1.7.2. Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR
- ADN khuôn: oạn khuôn ADN tinh sạch là một yếu tố quan trọng, đảm
bảo kết quả phản ứng PCR tạo được các sản phẩm P R chính xác. Kích thước
đoạn khn nhỏ hơn 3kb cho kết quả nhân gen tốt nhất. PCR có thể khuyếch
đại được ADN từ những mẫu sinh học đang bị phân huỷ như vết máu, vết tinh
dịch đó lâu ngày, tóc và xương của người chết....
- Các nucleotid tự do (dNTPs): Nucleotid tự do (dNTPs) cần thiết cho
22


phản ứng PCR bao gồm dATP, dTTP, dGTP và dTCP. Trong mỗi phản ứng
PCR cần chú ý đến tỉ lệ G- trong đoạn khuôn để xác định hàm lượng mỗi đoạn
ADN phù hợp. Nồng độ dNTPs mỗi loại, thường sử dụng trong các phản ứng
PCR khoảng 50-200M. Khi hàm lượng các loại dNTPs tự do quá ít, tạo sản
phẩm P R không đủ để phát hiện, ngược lại nồng độ dNTPs tự do q cao thì
phản ứng PCR khó thực hiện. o đó, tuỳ theo kích thước đoạn gen và số chu kì
PCR thực hiện để tính tốn nồng độ dNTPs thích hợp.
- Mồi: Mồi là các đoạn oligonucleotid ngắn khoảng 20-30 nucleotid, có
vai trị quan trọng quyết định thành công của phản ứng P R. ể thực hiện nhân
một đoạn ADN bằng phản ứng PCR, cần có một cặp mồi thích hợp. Một cặp
mồi trong PCR gồm mồi xi F (Foward) và mồi ngược R (Revers). Mồi có vai
trị tạo các nhóm 3’OH tự do, cần thiết cho phản ứng polymer hố. Mồi xi
phải có trình tự tương đồng với trình tự của mạch ADN mang mã di truyền, mồi
ngược bắt cặp với mạch ADN mang mã di truyền ở đầu 3’ của mạch.
- Emzyme ADN polymerase: Emzyme ADN polymerase là yếu tố quan

trọng, có vai trị quyết định hiệu quả của phản ứng PCR. Mỗi loại enzym ADN
polymerase có đặc tính và vai trị khác nhau trong phản ứng PCR, sử dụng các
loại enzym ADN polymerase khác nhau thu được sản phẩm P R có tính đặc
hiệu khác nhau.
- Hàm lượng enzyme A N polymerase cũng ảnh hưởng rất lớn đến hiệu
quả P R.

o đó, trong các phản ứng PCR, tuỳ theo mục đích cụ thể của các

nghiên cứu để lựa chọn loại enzym với hàm lượng thích hợp.
- Dung dịch đệm cho PCR: Dung dịch đệm cho PCR là một trong những
yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của phản ứng PCR.
Dung dịch đệm của phản ứng PCR cần đảm bảo thành phần các chất cần thiết
cho hoạt động của enzyme A N polymerase như Mg l2, KCl, Tris... Mg2+ ảnh
hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn.
23