Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme ngoại bào từ đất trồng rau cải ở chương mỹ hà nội

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP
-------------------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ

CHỦNG BACILLUS SUBTILIS CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI
BÀO TỪ ĐẤT TRỒNG RAU CẢI Ở CHƢƠNG MỸ - HÀ NỘI

NGÀNH

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ

: 7420201

Giáo viên hướng dẫn

: ThS. Nguyễn Thị Minh Hằng

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Phượng Chiến

Mã sinh viên

: 1453070468

Lớp

: 59B - CNSH

Khóa học

: 2014 - 2018

Hà Nội, 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, cá nhân tôi đã nhận
đƣợc rất nhiều sự động viên, khích lệ cùng với sự hƣớng dẫn nhiệt tình và chu
đáo của các thầy, cô giáo Bộ môn Công nghệ Vi sinh Hóa sinh, thuộc Viện
Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam.
Nhân dịp ngày này tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Thạc sỹ
Nguyễn Thị Minh Hằng - Giảng viên Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp,
Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn và giúp
đỡ tơi trong suốt q trình làm khóa luận tốt nghiệp.
Tôi cũng chân thành cảm ơn tập thể cán bộ, các thầy cô giáo Viện Công
nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam đã tạo điều
kiện thuận lợi để tơi có thể hồn thành báo cáo một cách tốt nhất.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã ln ln
giúp đỡ, động viên tơi trong suốt q trình thực hiện.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Phƣợng Chiến

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
D NH MỤC C C

HIỆU, C C CH

VI T TẮT

D NH MỤC HÌNH
D NH MỤC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QU N ............................................................................. 2
1.1. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................................... 2
1.1.1. Lịch sử phát hiện ..................................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis .......... 2
1.1.3. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 3
1.1.4. Đặc điểm ni cấy .................................................................................. 3
1.1.5. Đặc điểm sinh hoá ................................................................................... 3
1.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ................ 4
1.1.7.Tính chất đối kháng .................................................................................. 5
1.1.8. Giới thiệu về amylase và protease ......................................................... 5
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU................................................................... 15
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu............................................................. 15
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................. 15
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 15

2.2. Đối tƣợng và vật liệu ................................................................................ 15
2.2.1. Đối tƣợng .............................................................................................. 15
2.2.2. Vật liệu .................................................................................................. 15
2.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu................................................................... 17
2.3.1.Phƣơng pháp lấy mẫu ............................................................................. 17
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập ........................................................................... 17
2.3.3. Một số phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của các chủng vi
khuẩn phân lập đƣợc ....................................................................................... 18
2.3.4. Nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus
subtilis phân lập đƣợc...................................................................................... 19
2.3.5. Xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng Bacillus subtilis phân
lập đƣợc ........................................................................................................... 19
CHƢƠNG 3:
3.1.

T QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 22

ết quả phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

từ đất trồng rau cải .......................................................................................... 22
3.1.1. ết quả phân lập và quan sát khuẩn lạc ................................................ 22
3.1.2. ết quả nhuộm gram các chủng phân lập đƣợc .................................... 23
3.2.

ết quả xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng phân

lập đƣợc ........................................................................................................... 24
3.2.1. ết quả khả năng sinh enzyme protease của các chủng phân lập đƣợc 24
3.2.2. ết quả khả năng sinh enzyme amylase của các chủng phân lập đƣợc 25

3.3. ết quả xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng phân lập đƣợc........ 26
3.3.1. ết quả xác định hoạt tính catalase ....................................................... 26


3.3.2. Phản ứng M.R. (Methyl đỏ - Methyl Red)............................................ 27
3.3.3. Phản ứng V.P. (Voges-Proskauer) ....................................................... 28
3.3.4. Phản ứng thử urea ................................................................................. 29
3.3.5. Kết quả phản ứng khử nitrate ................................................................ 30
T LUẬN VÀ I N NGHỊ......................................................................... 32
TÀI LIỆU TH M HẢO


NH MỤC C C

HIỆU C C CH

VI T TẮT

CFU

Colony Forming Unit

LB

LURIA- BERTANI

DC

Đối chứng

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1. Nhuộn Gram các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc ............................ 23
Hình 3.2. ết quả khả năng sinh enzyme protease của các chủng phân lập đƣợc ...... 25
Hình 3.3. ết quả khả năng sinh enzyme amylase của các chủng phân lập đƣợc ...... 26
Hình 3.4. Xác định hoạt tính catalase ............................................................. 27
Hình 3.5. Phản ứng M.R. (Đỏ Methyl - Methyl Red) ..................................... 28
Hình 3.6. ết quả phản ứng V.P. (Voges-Proskauer) .................................... 29
Hình 3.7. Phản ứng thử urea ........................................................................... 30


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Kết quả các phản ứng sinh hóa của Bacillus sutillis ........................ 4
Bảng 3.1. Đặc điểm hình dạng của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc ......... 22
Bảng 3.2. Kết quả khả năng sinh enzyme protease......................................... 24
Bảng 3.3. Kết quả khả năng sinh enzyme amylase ......................................... 25
Bảng 3.5. Kết quả phản ứng M.R. (Methyl đỏ - Methyl Red) ........................ 27
Bảng 3.6. ết quả phản ứng V.P. (Voges-Proskauer) ................................... 29
Bảng 3.7. ết quả phản ứng thử urea.............................................................. 30
Bảng 3.8. Kết quả phản ứng khử nitrate ......................................................... 31


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, cuộc sống của con ngƣời đang đƣợc nâng cao và cải thiện rõ
ràng, những suy nghĩ về việc sử dụng các sản phẩm sinh học ngày càng trở
nên phổ biến. Chính vì vậy, các sản phẩm ứng dụng công nghệ sinh học ngày
càng đƣợc ƣa chuộng và sử dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực của đời sống
nhƣ: Y học, dƣợc phẩm, xử lý môi trƣờng…. Các chế phẩm sinh học đang
dần tìm đƣợc chỗ đứng vững chắc trên thị trƣờng nhờ vào những lợi ích to lớn

mà nó đem lại: Dễ sử dụng, giá thành rẻ, không độc hại đến con ngƣời và môi
trƣờng xung quanh. Trong số đó, các chế phẩm sinh học mang các chủng vi
khuẩn Bacillus subtilis có lợi đang đƣợc sử dung rất rộng rãi, có thể kể đến
nhƣ: Chế phẩm xử lý môi trƣờng ao nuôi, môi trƣờng, men vi sinh…Bacillus
subtilis là loại vi khuẩn hiệu quả và an toàn nhất sử dụng ở ngành công nghệ
sinh học. Bacillus subtilis có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe nhƣ kích
thích hệ miễn dịch, đơng máu, phịng nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu ở ngƣời
cao tuổi. Bacillus subtilis có thể sản sinh ra các enzyme tiêu hóa:

mylase,

Protease, Cellulose … giúp cải thiện tiêu hóa và tăng cƣờng hấp thụ chất dinh
dƣỡng.
Việc bổ sung lợi khuẩn Bacillus subtilis trong các loại men vi sinh sẽ
giúp tạo ra hệ vi khuẩn có lợi cho hệ tiêu hóa, cung cấp thêm chất dinh dƣỡng
và giúp hệ miễn dịch khỏe mạnh. Có khả năng đồng hóa một vài vitamin nhƣ
B2 (Riboflavin) có trị quan trọng đối với hoạt động sống cơ thể động thực
vật, có mặt trong các tế bào, tham gia vào quá trình dinh dƣỡng cũng nhƣ hô
hấp của sinh vật.
Từ những thực tế trên, dƣới sự hƣớng dẫn của Th.S. Nguyễn Thị Minh
Hằng, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng
Bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme ngoại bào từ đất trồng rau cải ở
Chương Mỹ - Hà Nội ”.
1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis
1.1.1. Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis đƣợc phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi
tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu đƣợc sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh
lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến
những năm 1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách đƣợc chủng thuần
khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc
subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong
rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, đƣợc sử
dụng rộng rãi trong y học, chăn ni, thực phẩm (trích Lý im Hữu, 2005).
1.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
Đặc điểm phân loại:
Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis
Thuộc: Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Lồi: Bacillus subtilis

Hình 2.1. Vi khuẩn Bacillus Subtillis
/>
2


Đặc điểm phân bố:
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng đƣợc
phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cƣ trú trong đất, thông thƣờng
đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dƣỡng ở
vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nƣớc và
bùn cửa sơng cũng nhƣ ở nƣớc biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus
subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996).
1.1.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dƣơng, đứng

đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lơng, sinh
bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thƣớc
từ 0,8 - 1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử,
khơng kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ
(Tơ Minh Châu, 2000).
1.1.4. Đặc điểm ni cấy
Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ƣu là 370C
Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhƣng lại có khả
năng phát triển yếu trong mơi trƣờng thiếu oxy.
Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4.
1.1.5. Đặc điểm sinh hoá
Lên men các loại đƣờng: glucose, maltose, mannitol, saccharose,
xylose, arabinose.
Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+),
casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+).

3


Bảng 1.1. Kết quả các phản ứng sinh hóa của Bacillus sutillis
Phản ứng sinh hố

ết quả

Hoạt tính catalase

+

Sinh indol

-

MR

+

VP

+

Sử dụng citrate

+

hử nitrate

+

Tan chảy gelatin

+

Di động

+

Phân giải tinh bột

+

Arabinose

+

Xylose

+

Saccharose

+

Mannitol

+

Glucose

+

Lactose

-

Maltose

+

( Lý Kim Hữu, 2005)
1.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis

1.1.6.1. Cấu tạo bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dƣới lớp màng là vỏ. Vỏ bào
tử có nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của
nƣớc và các chất hoà tan trong nƣớc. Dƣới lớp vỏ là lớp màng trong của bào
tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do
khơng tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều
năm (Lê Đỗ Mai Phƣơng, 2004).
Bào tử khác tế bào dinh dƣỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất
sinh lý.
4


1.1.6.2. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng
tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình
thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều
kiện bất lợi (dinh dƣỡng trong môi trƣờng bị cạn kiệt) (Tô Minh Châu, 2000).
Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn
tất. Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào đƣợc sử dụng. Tế bào chất và
nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc
lại và tạo thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu đƣợc bao bọc dần
bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử.

hi bào tử

trƣởng thành, tế bào dinh dƣỡng tự phân giải và bào tử đƣợc giải phóng khỏi
tế bào mẹ.

hi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nƣớc và bị trƣơng ra.

Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào
mới. Mỗi tế bào dinh dƣỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phƣơng, 2004).
1.1.7.Tính chất đối kháng
Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở
điều kiện mơi trƣờng khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi
trƣờng hoặc các yếu tố môi trƣờng bất lợi là làm thay đổi điều kiện sống, làm
hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi môi trƣờng nuôi
cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lƣợng lớn sẽ
xảy ra sự cạnh tranh dinh dƣỡng. Cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi
khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng
phần lớn các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng, đồng thời tạo ra một số loại
kháng sinh nên sự sinh trƣởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và
Hoàng Đức Thuận, 1976).
1.1.8. Giới thiệu về amylase và protease
1.1.8.1. Enzyme amylase
a. Lịch sử nghiên cứu
Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về
5


enzyme amylase nói riêng đƣợc bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những
nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học ngƣời Nga – Viện sĩ .S
Kirhof. Nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dƣới tác dụng của dịch chiết đại
mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải
tinh bột thành đƣờng.
Các enzyme amylase có trong nƣớc bọt, dịch tiêu hóa của ngƣời và
động vật, trong hạt nẩy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Theo tính chất
và phƣơng pháp tác dụng lên tinh bột ngƣời ta phân biệt α-amylase, βamylase, gluco-amylase (γ-amylase), oligo- 1,6 -glucoxydase (dextrinase).
b. Vi sinh vật tạo amylase
Vi sinh vật tạo amylase đƣợc dùng nhiều hơn cả đó là nấm mốc, nấm

men và vi khuẩn, cịn xạ khuẩn thì ít hơn. Để thu amylase ngƣời ta thƣờng
dùng các giống vi sinh vật sau:
Nấm mốc: Aspergillus, Rhizopus.
Vi khuẩn: Bacillus mesentericus, B. subtilis, B. macecassavanum,
Clostridium acetobutylium, Penicillium saccharophila,… Các vi khuẩn ƣa nhiệt có
khả năng sinh trƣởng nhanh (4 – 6 lần so với vi khuẩn ƣa ẩm) và phát triển tốt
ở nhiệt độ tƣơng đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi
sinh vật khác. Trong số vi khuẩn ƣa ấm tạo amylase mạnh, thì Bacillus
subtilis đƣợc nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất. Riêng ở Nhật, hàng năm
ngƣời ta sản xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ
loài vi khuẩn ƣa ấm và hiếu khí này. Nhiệt độ sinh trƣởng tối thích của
Bacillus subtilis là 370C.
c. Đặc tính của amylase
Hiện nay ngƣời ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó αamylase, β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase) thủy phân các liên kết α – 1,4
- glucoside của tinh bột và các polysaccharide; 3 amylase còn lại (dextrine – 6
- glucanhidrolase, amylopectin - 6 - glucanhidrolase, oligodexin - 6 glucanhidrolase hay dextrinase) thuỷ phân các liên kết α – 1,6 - glucoside
6


trong polysaccharide và các dextrin cuối.
Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì thƣờng khác nhau về
tính chất, cơ chế tác dụng cũng nhƣ sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân.
α-amylase:
α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α – 1,4 - glucoside nằm ở
phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một
cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào.

hi tác dụng lên tinh bột,

enzyme này giải phóng ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924

uhn

gọi nó là α-amylase.
α-amylase khơng chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh
bột còn nguyên, song với tốc độ rất chậm. Dƣới tác dụng của α-amylase, tinh
bột có thể chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp.
Tuy nhiên, α-amylase thƣờng thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp
không cho màu với iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm
giảm độ nhớt của hồ tinh bột rất mạnh (dịch hoá).
Tinh bột => α-amylase

=> α- dextrin + maltose +

glucose (hoặc glucogen)

( nhiều) (ít)

α-amylase dễ tan trong nƣớc, trong các dung dịch muối và rƣợu
loãng, α -amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả các αamylase đều bị kiềm hãm bởi kim loại nặng nhƣ: Cu 2+, Ag+, Hg2+. So với αamylase của nấm mốc, amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hố trội hơn
hoạt lực đƣờng hóa.
α-amylase của nấm mốc hầu nhƣ chỉ tấn cơng những hạt tinh bột bị vỡ,
cịn α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột còn nguyên
lẫn hồ tinh bột (Popadicts và cộng sự, 1971). Amylase của Bacillus subtilis
phân giải tinh bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của
nấm mốc (Lixiuk và Popadicts, 1969) (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005).
Vận tốc phân hủy tinh bột bởi α amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao
hơn α–amylase của Aspergillus oryzae tới 25%.
7

pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5 – 4,8;
của vi khuẩn là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH: 5,8 – 7,0).
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α–amylase là 500C.
mylase của vi khuẩn có thể chịu đƣợc nhiệt độ 920C, trong khi đó
amylase của nấm mốc bị vơ hoạt ở 700C. Tính bền nhiệt cao của α–amylase vi
khuẩn là một ƣu điểm lớn: đƣợc sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn
phải dùng nhiệt cao.
β-amylase
β-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh
bột. β-amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 - glucan trong tế bào.
β-amylase chỉ phổ biến trong giới thực vật (có nhiều trong các hạt nảy
mầm). Vi khuẩn khơng có β-amylase.
Glucoamylase
Glucoamylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 và α – 1,6 glucan trong polysaccharide.
Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hịan tồn tinh bột, glucogen,
amylopeptin, panose, isomantose và mantose tới glucose.
Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid, thể hiện hoạt lực tối
đa ở vùng pH 3,5 – 5.
Glucoamylase bền với acid nhƣng lại kém bền với tác dụng của rƣợu
etylic, aceton.
d. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật
hi ni vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với
nhau: Quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và q trình tích tụ enzyme
trong tế bào hay ngồi mơi trƣờng.
mylase của Bacillus subtilis đƣợc tạo thành ở vi khuẩn trong giai
đoạn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trƣởng. Cả trong môi trƣờng nuôi
cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “ trẻ ” đều khơng tìm thấy amylase.
mylase ngoại bào đƣợc tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân.
8

e. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase
Ảnh hưởng của thành phần môi trường:
Ảnh hƣởng của nguồn cacbon dinh dƣỡng: Các nguồn cacbon và năng
lƣợng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh
bột tối thích trong ni cấy chìm là 0,5 – 0,7%. Để có hoạt lực α–amylase cao
cần 6% tinh bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2% tinh bột.
Ảnh hƣởng của nguồn nitơ dinh dƣỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào
mơi trƣờng có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp
amylase khác. Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nƣớc chiết ngô.
Ảnh hƣởng của acid amin: cid amin có ảnh hƣởng tốt tới sinh lí của vi
sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn
cacbon, nitơ, vừa là nguồn năng lƣợng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trị
quan trọng trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong q trình
chuyển hố amin.
Ảnh hƣởng của nguồn khoáng dinh dƣỡng: Các nguyên tố đa lƣợng và
vi lƣợng có ảnh hƣởng lớn đến sinh trƣởng và tổng hợp các enzyme amylase
của vi sinh vật.
Mg2+ ảnh hƣởng đến độ bền của enzyme.
Photpho ảnh hƣởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật
khác.
Ca2+ cần cho tổng hợp và ổn định α–amylase hoạt động bảo vệ
amylase khỏi tác động của protease.
Lƣu huỳnh kích thích sự tạo amylase. Coban kích thích tổng hợp
amylase.
Mangan, đồng, thuỷ ngân kiềm hãm sinh tổng hợp amylase ở vi sinh
vật.
Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp amylase:
Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng: pH ban đầu của môi trƣờng có ảnh

hƣởng khơng nhỏ tới sự tạo thành amylase. Việc lựa chọn giá trị pH ban đầu
9


căn cứ vào đặc tính của chủng vi sinh vật. pH môi trƣờng để nuôi Bacillus
subtilis nhằm thu α– amylase thích hợp nhất là 6,8 – 7,5 cịn để tổng hợp
protease là 7,0 – 7,8.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cũng là yếu tố quan trọng đối
với sinh trƣởng của vi sinh vật và tạo thành các enzyme amylase.
Độ thơng khí: việc sục khí và khuấy đảo mơi trƣờng có tác dụng tốt tới
sự sinh trƣởng và tích lũy sinh khối cũng nhƣ tổng hợp các enzyme của vi
sinh vật.
f. Ứng dụng amylase vi sinh vật
Các amylase vi sinh vật đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
khác nhau nhƣ: công nghiệp rƣợu bia (thay thế một phần mầm đại mạch),
công nghiệp nƣớc chấm, công nghiệp sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ tiêu hố
tinh bột, cơng nghiệp bánh mì (nâng cao chất lƣợng bánh), cơng nghiệp chế
biến rau quả, bổ sung vào khẩu phần chăn nuôi.
1.1.8.2. Enzyme protease
a. Nguồn thu nhận enzyme protease
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme
này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào môi trƣờng nuôi cấy
(protease ngoại bào). Cho đến nay protease ngoại bào đƣợc nghiên cứu kỹ
hơn nhiều so với protease nội bào. Một số protease ngoại bào đƣợc sản xuất
trong quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp
khác nhau, trong nông nghiệp, y học.
Các lồi vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease nhƣ: Bacillus
subtilis, Bacillus cereus, xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces
rimosus,…và một số loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger…
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).

b. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật
Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nịi
vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng,
10


pH hoạt động thích hợp, … các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh
vật thành bốn nhóm nhƣ sau:
Protease – xerin Protease -tiol Protease – kim loại Protease – acid
Một số tác giả khác chia protease ra làm ba nhóm dựa vào pH hoạt
động của chúng bao gồm:
Protease acid: pH < 3 đƣợc ứng dụng trong sản xuất bia và cơng nghiệp
bánh kẹo.
Protease trung tính: protease trung tính là metalloenzyme, chúng có pH
hoạt động 6 – 7, chúng thƣờng đƣợc sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus
thermoproteolyticus.
Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 – 11, trong trung tâm
hoạt động của chúng có serin.
Trong bốn nhóm kể trên, các protease - serin và protease – tiol có khả
năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino
acid. Ngƣợc lại các protease kim loại, protease acid thƣờng khơng có hoạt
tính esterase và amidase đối với dẫn xuất của aminoacid.
Các protease – serin có trọng lƣợng phân tử vào khoảng 20000 – 27000
dalton, trọng lƣợng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease
–serin vào khoảng 33800 – 48400 dalton. Protease – tiol và nhiều protease –
acid cũng có trọng lƣợng phân tử vào khoảng 30000 – 40000 dalton.
Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid
đặc trƣng cho từng nhóm cịn có một gốc amino acid khác. Ví dụ histidin
thƣờng tham gia trong trung tâm hoạt động của các protease – serin, protease
– tiol còn tyrosin là trung tâm hoạt động của các protease kim loại. Mặc dù

trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhƣng các
enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết peptide theo cùng
một cơ chế chung
c. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật
Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh
11


vật có thể có những vai trị khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật.
Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác
có trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng
hấp thụ.
Protease nội bào: cho đến nay các protease nội bào còn đang đƣợc
nghiên cứu và cũng chƣa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi
(1976), các protease nội bào có thể có vai trị quan trọng hơn protease ngoại
bào, chúng có thể hồn thành một số chức năng sau:
Phân giải các peptide đƣợc đƣa từ mơi trƣờng ngồi vào thành các
acid amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C,
N, S.
Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hồn thiện chuỗi
polypeptide đã đƣợc tổng hợp (Waller, 1963; Pine, 1969). Ngoài ra, protease
nội bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai
do đột biến, hoặc cũng có thể tham gia vào q trình sinh trƣởng của vi sinh
vật (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005).
d. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi
sinh vật
Q trình tổng hợp enzyme nói chung cũng nhƣ tổng hợp protease ở vi
sinh vật chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố khác nhau nhƣ: Ẩm độ, nhiệt độ,
pH, độ thơng thống, thành phần mơi trƣờng...
Ảnh hƣởng của nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hƣởng đến sự phát triển, khả

năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng nhƣ tính chất của enzyme
đƣợc tổng hợp. Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Tuy
nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và
bị kiềm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp.
Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng: Khi dùng phƣơng pháp nuôi cấy bề
mặt, pH mơi trƣờng ít ảnh hƣởng đến q trình tổng hợp enzyme ở vi sinh
vật, hơn nữa pH mơi trƣờng hầu nhƣ khơng thay đổi trong q trình phát triển
12


của vi sinh vật. Ngƣợc lại, trong phƣơng pháp bề sâu pH mơi trƣờng ảng
hƣởng rất lớn đến sự tích luỹ protease trong mơi trƣờng.
Độ thơng khí: Độ thơng khí trong mơi trƣờng có ảnh hƣởng lớn đến
q trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hƣởng này có khác nhau tuỳ
theo giống vi sinh vật.
Ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng: Thành phần mơi trƣờng có ảnh
hƣởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Để tăng lƣợng enzyme
trong mơi trƣờng cần lựa chọn nguồn C, N, muối khống thích hợp.
e. Ứng dụng protease vi sinh vật
Trong cơng nghiệp: Protease đƣợc sử dụng trong nhiều ngành công
nghiệp thực phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ nhƣ : Ngành
chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì, nƣớc giải khát, thuộc gia, dệt, phim ảnh....
Ngồi ra protease cịn đƣợc sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem
đánh răng, kem bơi mặt, ...có tác dụng lọai bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho
da mịn hoặc làm sạch cao răng chữa viêm lợi.
Trong công nghiệp dƣợc phẩm và y học: Protease đƣợc sử dụng để sản
xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein cho những ngƣời bị bệnh
tiêu hoá kém do dạ dày, tuỵ tạng hoạt động khơng bình thƣờng, thiếu enzyme,
chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch. Protease cũng đƣợc dùng làm tiêu mủ ở các vết
thƣơng, các ổ viêm, làm thông đƣờng hô hấp và thuỷ phân sơ bộ protein làm

môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật.
Trong chăn nuôi: Sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong
thức ăn, làm tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thuỷ
phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus
subtilis
Trong nơng nghiệp:
Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus
subtilis trong nông nghiệp đƣợc tiến hành nhƣ sau
13


Chăn nuôi:
Viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản xuất chế
phẩm Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con.
Từ năm 1983 đến nay Viện Vaccin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc
Biosubtyl dạng bột khơ rất thuận tiện cho ngƣời sử dụng.
Ngồi ra, Bacillus subtilis còn đƣợc phối trộn với một số chủng nấm
mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic.
Trồng trọt:
Bacillus subtilis đƣợc ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh nhƣ
nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae... ngồi ra cịn ứng
dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch.
Nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do
trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất, Bộ Nông Nghiệp tại
TPHCM trừ các loại nấm bệnh trên rau cải.
Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học
Hà Nội đã sản xuất chế phẩm subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh
Ostrinia furnacalis trên bắp.
Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm

kumura từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của
chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus.
Kháng sinh:
Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tạo kháng sinh subtilin và bacitracin
có tác dụng ức chế vi khuẩn Gr+ và Gr- (Nguyễn Vĩnh Phƣớc, 1977).

14


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus subtilis từ đất trồng rau
cải.
Đánh giá khả năng sinh tổng hợp hai loại enzyme amylase và protease
của các chủng vi khuẩn phận lập đƣợc.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus từ đất trồng rau cải.
Nghiên cứu khả năng sinh enzyme protease và enzyme amylase của các
chủng tuyển chọn đƣợc.
Tuyển chọn và định danh sơ bộ các chủng Bacillus thông qua các phản
ứng sinh hóa.
2.2. Đối tƣợng và vật liệu
2.2.1. Đối tượng
Các chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất trồng rau cải.
2.2.2. Vật liệu
2.2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu đất trồng rau cải lấy tại Chƣơng Mỹ, Hà Nội
2.2.2.2. Thiết bị

Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc
(vortex), lị vi sóng, kính hiển vi, tủ ấm, …
2.2.2.3. Dụng cụ
Lam kính, đèn cồn, que cấy, que trang, đũa thuỷ tinh, ống nghiệm, đĩa
petri, micropipete, giá ống nghiệm, …
Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong thí nghiệm đều phải đƣợc rửa
15


sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C /15 phút.
2.2.2.4. Môi trƣờng
Môi trƣờng thử khả năng sinh enzyme protease:
Agar

20g/l

Casein

10g/l

Nƣớc cất

1000ml

Môi trƣờng thử khả năng sinh enzyme amylase:

Agar

20g/l

Tinh bột

10g/l

Nƣớc cất

1000ml

Môi trƣờng Clark-Lubs:
Pepton

3g

K2HPO4

5g

Glucose

5g

pH = 7,5
Môi trƣờng thử Urea
Pepton

1g/l

NaCl

5g/l

Glucose

1g/l

KH2PO4

2g/l

Phenol red

0.01g/l

Ure

0.04g/l

Môi trƣờng khử nitrate
Pepton

1g/l

KNO3

1g/l

16


2.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1.Phương pháp lấy mẫu
Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất
ở độ sâu 5-20cm.
Thu lấy mẫu đất sau khi đƣợc xử lý, khô, loại bỏ rác thải sau đó đựng
vào túi nilon đã khử trùng.
Bên ngồi túi ghi rõ tên mẫu, ngày lấy và địa điểm lấy.
Sau khi lấy về mẫu đƣợc bảo quản ở nơi khô ráo, thống mát.
2.3.2. Phương pháp phân lập
Chuẩn bị 2 bình nón có dung tích 250ml: bình 1 chƣa 9ml nƣớc cất vơ
trùng; bình 2 đã vơ trùng và khơng chƣa gì
hử trùng cối chày sứ bằng cách cho một ít cồn và đốt lên. Sau đó để
nguội. Cân 1g mẫu cho vào cối chày sứ và nghiền nát mẫu. Dùng tồn bộ
nƣớc ở bình 1 để chuyển tồn bộ mẫu sang bình 2. Lắc 5 phút, để lắng 30 giây
rồi pha loãng mẫu: Dùng pipetman hút 1ml dịch pha loãng cho sang ống
nghiệm mới chứa 9ml nƣớc cất vô trùng, trộn đều dịch ta đƣợc độ pha loãng
10-1, tiếp tục pha loãng tới nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, …Chọn 3 nồng độ
pha lỗng thích hợp nhất (liên tiếp nhau), dùng pipetman hút 0,1ml dịch pha
loãng cấy trải trên đĩa petri có chƣa mơi trƣờng LB. Ghi rõ ngày cấy, nồng độ,
tên mẫu, …, bọc kín đĩa sau đó chuyển vào tủ ấm nuôi ở nhiệt độ 30 0C, sau
24 giờ theo dõi sự hình thành khuẩn lạc. Dựa vào hình thái khuẩn lạc, màu sắc
để phân lập sơ bộ từng chủng vi khuẩn. Dùng que cấy móc, cấy ria riêng rẽ
từng chủng để tinh sạch. Nuôi trong 24 giờ trong tủ ấm để theo dõi sự hình
thành khuẩn lạc.

17