Giải mã gen kháng nguyên h, phân tích đặc điểm phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của canine distemper virus gây bệnh care ở chó tại hà nội

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ ĐỨC THÀNH

GIẢI MÃ GEN KHÁNG NGUYÊN H, PHÂN TÍCH
ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÀ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ
NGUỒN GỐC CỦA CANINE DISTEMPER VIRUS
GÂY BỆNH CARE Ở CHĨ TẠI HÀ NỘI

•••
Ngành: Thú y
Mã số ngành: 8.64.01.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y
••
Ng ườ i h ướ ng d ẫ n khoa họ c:
1. TS. Đặng Thị Mai Lan - Đạ i h ọ c Nông Lâm Thái Nguyên
2. TS. Đoàn Th ị Thanh H ươ ng - Vi ệ n Công ngh ệ sinh h ọc


Thái Nguyên - 2020


3

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi được thực
hiện với sự giúp đỡ của:
- Ths. Đỗ Thị Roan, Ths. Nguyễ n Th ị Khuê, Ths. Ph ạ m Th ị Khánh
Linh, KS. Nguyễn Thị Thu Hiền cùng các anh, chị, em Phòng Miễn dịch học Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

- Chủ các Phịng khám Thú y tại quận Hà Đông, Nam Từ Liêm, Cầu
Giấy - Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất để tơi hồn thành luận văn.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được
ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tơi xin cam đoan rằng các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều đã
được chỉ rõ nguồn gốc.
Thái Nguyên, ngày tháng n ă m 2020 Tác
giả

Đỗ Đức Thành


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, cùng với sự nỗ lực, cố gắng của bản thân,
tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cơ giáo: TS. Đặng Thị Mai
Lan và TS. Đồn Thị Thanh Hương, người đã trực tiếp hướng dẫn và truyền
đạt nhiều kinh nghiệm q báu cho tơi trong q trình nghiên cứu và hồn
thành luận văn.
Tơi xin được chân thành cảm ơn tới Ths. Đỗ Thị Roan, Ths. Nguyễn Thị
Khuê, Ths. Phạm Thị Khánh Linh, KS. Nguyễn Thị Thu Hiền cùng các anh,
chị, em Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tơi trong q trình
nghiên cứu và hồn thành luận văn này.
Nhân dịp này tôi c ũ ng xin trân tr ọng c ả m ơ n Ban Giám hi ệ u nhà
trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi Thú y, các thầy cô, các anh chị em
đồng nghiệp khoa Chăn ni Thú y, Chủ các Phịng khám Thú y tại quận Hà
Đông, Nam Từ Liêm, Cầu Giấy - Hà Nội đã ln tạo điều kiện tốt nhất để tơi
hồn thành luận văn.
Lời sau cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người
bạn, người thân trong gia đình và nhất là bố, mẹ đã ln kịp thời động viên và

tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tơi hồn thành luận văn.
Xin trân trọng cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này.
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020

Đỗ Đức Thành
MỤC LỤC



DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CDV:
bp:
DNA:

Canine Distemper Virus
base pair (cặp base)
Deoxyribonucleic acid

RNA:

Ribonucleic acid

CPE

Cyto pathogenic Effect

ELISA

Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

IHC

Immunohistochemistry

IF

Immuno Fluorescent test

RT-PCR
RT

Reverse Transcription Polymesase Chain
Reaction
Reverse Transcriptase

msf

multiple sequence file

dNTPs:

deoxynucleotide triphosphate

MEGA

Molecular Evolutionary Genetics Analysis

Epp:
NCBI:

Eppendorf
Ngân hàng gen

PCR:

Polymerase Chain Reaction


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU


DANH MỤC CÁC HÌNH


9

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh Care hay cịn được gọi là bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền
nhiễm cấp tính do virus Canine Distemper (Canine Distemper Virus - CDV)
gây ra. Đặc trưng của bệnh là sốt cấp tính, rối loạn tiêu hóa, hơ hấp và rối loạn
hệ thần kinh, đặc biệt bệnh có tỷ lệ chết rất cao (Nguyễn Như Pho, 2003).
Bệnh Care được phát hiện lần đầu tiên ở Peru từ thế kỷ XVIII và sau đó
lan ra tồn thế giới như Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi và nhiều nước
châu Âu. Ở châu Á, bệnh được ghi nhận tại Nhật Bản (Lan và cs., 2006), Thái
Lan (Kubo và cs.,2007), Hàn Quốc (Cha và cs.,2013) và Ấn Độ (Swati và
cs.,2015). Tại Việt Nam, bệnh xảy ra tương đối phổ biến và là một trong những
bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất ở chó. Chó mắc bệnh Care bao gồm chó chưa
được tiêm vaccine và cả những chó đã được tiêm vaccine (theo ghi nhận của

các phịng khám thú y).
Virus gây bệnh Care có hệ gen là RNA sợi đơn âm, có kích thước
khoảng 15.7kb, thuộc loài Canine morbillivirus, họ Paramixoviridae, chi
Morbillivirus. Hệ gen mã hóa cho 8 protein, gồm 2 protein khơng cấu trúc
(protein C và V) và 6 protein cấu trúc là nucleocapsid (N), matrix (M), fusion
(F), hemagglutinin (H), phospho (P) và large (L) protein. Trong đó, protein H
và protein F là 2 protein kháng nguyên, quyết định tính độc lực của virus. Đây
là các gen có nhiều biến đổi nhất giữa các chủng và giữa các genotype nên
được chọn là đối tượng chính cho nghiên cứu dịch tễ phân tử và nguồn gốc phả
hệ (Ke và cs.,2015).
Có ít nhất 14 genotype khác nhau của CDV đã được công bố, bao gồm:
Asia-1, Asia-2, Asia-3, Asia-4, Europe, European wildlife, Arctic, Rockbornlike, America-1, America-2, Africa, South America-1, South America-2 và
South America-3 (Espinal và cs., 2014; Guo và cs., 2013).


10

Ở châu Á, một số nước đã tiến hành nghiên cứu về đặc điểm phân tử và
xác định được nguồn gốc, genotype của các chủng CDV đang lưu hành. Một số
nghiên cứu cho thấy, các chủng CDV của Trung Quốc thuộc genotype Asia-1,
các chủng của Hàn Quốc thuộc về hai genotype Asia-1 và Asia-2 (An và cs.,
2008), trong khi các chủng CDV phân lập tại Ấn Độ lại tách riêng khỏi nhóm
Asia-1 và Asia-2, gần gũi với các chủng của Thụy Điển, Hungary và Đức
(Cheng và cs., 2015; Swati và cs., 2015). Gần đây đã phát hiện genotype Asia4 tại Trung Quốc và Thái Lan.
Gen H (mã hóa protein H) là một trong những gen biến đổi nhất được
dùng để xác định mối liên hệ di truyền giữa các chủng (Gámiz và cs., 2011).
Gen H có khả năng biến đổi cao, quyết định tính dinh dưỡng của tế bào và vật
chủ bằng cách liên kết với phân tử hoạt hóa tế bào lympho báo hiệu (SLAM)
và các thụ thể hoại tử -4 của vật chủ.
Tuy nhiên, nhiều sự kiện tiến hóa có thể đã tạo điều kiện cho CDV thích

nghi với các vật chủ khác nhau và phải được đánh giá bằng cách giải trình tự
bộ gen hồn chỉnh mới có khả năng xác định được (Duque-Valencia
J. và cs., 2019).
Xuất phát từ những điều kiện thực tiễn trên, tôi đã tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Giải mã gen kháng nguyên H, phân tích đặc điểm phân tử và
xác định phả hệ nguồn gốc của Canine Distemper virus gây bệnh Care ở
chó tại Hà Nội”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định được tình hình mắc bệnh Care trên chó tại một số quận trên địa
bàn Hà Nội.
- Nghiên cứu và xác định được gen kháng nguyên H, phân tích được các
đặc điểm phân tử, xác định được phả hệ nguồn gốc của virus CDV, xác
định genotype của chủng virus gây bệnh Care trên chó tại địa bàn Hà
Nội.


11

3. Ý nghĩa của đề tài
3.1.

Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp tư liệu khoa học về gen kháng nguyên H, đặc điểm phân tử và
phả hệ nguồn gốc của virus CDV gây bệnh Care trên chó.
- Cung cấp thêm thơng tin về thành phần, đặc điểm, cấu trúc gen kháng
nguyên H của virus CDV nhằm phát triển vắc xin tái tổ hợp.
3.2.

Ý nghĩa thực tiễn

- Bổ sung thêm tư liệu về tình hình mắc bệnh Care trên chó tại Hà Nội
hiện nay.

Là cơcó
sởhiệu
khoaquả
họcnhất.
để từ đó có thể lựa chọn vắc xin phòng, bệnh
Care


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu

Bệnh Care được coi là bệnh cổ điển và phổ biến ở chó trên thế giới cũng
như tại Việt Nam. Bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế và là mối lo ngại cho các
nhà chăn nuôi và người ni chó. Ở Việt Nam trước đây, có thể nói các bệnh về
chó chưa được quan tâm đúng mức, ngoại trừ ở các trại nuôi và huấn luyện chó
nghiệp vụ. Tuy nhiên ngày nay, các bệnh này ngày càng được quan tâm nhiều hơn
do tầm ảnh hưởng của nó trong đời sống xã hội. Có rất nhiều loại chó quý, đắt
tiền đã được nhập về Việt Nam; nhiều bệnh viện, bệnh xá thú y, phòng khám và
các cơ sở chăm sóc chó mèo đặc biệt đã mọc lên trên cả nước.
1.1.1.

Nguyên nhân gây bệnh

Virus gây bệnh Care là một siêu virus có cấu trúc rất tinh vi thuộc nhóm
paramyxovirus.
Bệnh gây hại cho chó ở tất cả mọi lứa tuổi. Chó một tuổi trở xuống (2 - 6
tháng tuổi) dễ cảm thụ nhất, tỷ lệ mắc bệnh lên đến 70%. Chó đang bú mẹ ít mắc
bệnh, nếu chó mẹ có miễn dịch thì chó mẹ có thể truyền miễn dịch thụ động cho
chó con qua sữa đầu cho tới hơn 1 tháng, có khi tới 3 tháng.
1.1.2.

Con đường xâm nhập và cách lây lan

1.1.2.1. Con đường xâm nhập
Virus CDV xâm nhập vào chó qua đường hơ hấp, tiêu hóa và da. Chó
thường bài thải virus sau 7 ngày cảm nhiễm, virus lẫn vào các hạt bụi trong khơng
khí và có thể tồn tại từ 6 - 22 ngày hoặc lâu hơn ngồi mơi trường. Dịch chảy từ
mắt, mũi trong cơn sốt đầu tiên của bệnh chứa rất nhiều virus. Mầm bệnh được
thải qua dịch tiết mắt, mũi, nước bọt, phân, nước tiểu...
1.1.2.2. Cách lây lan
B ệ nh lây do ti ế p xúc tr ực ti ế p vớ i con b ệnh, con mắ c th ể ẩn tính, con
mang trùng hoặc gián tiếp do thức ăn, nước uống bị nhiễm những chất bài tiết của


con bệnh. Sự lây nhiễm nhanh hay chậm phụ thuộc vào mật độ chó ni tại vùng
đó và tỷ lệ chó được tiêm phịng. Đặc biệt, virus có thể xâm nhập vào cơ thể qua
da qua các vết thương hở (Nguyễn Vĩnh Phước và cs.,1978).
M ặ c dù virus đượ c bài ti ế t qua môi tr ườ ng thông qua h ầ u h ế t các ch
ấ t dịch cơ thể, bệnh này ít có khả năng lây lan qua nước tiểu. Chất bài tiết qua
đường hô hấp từ chó bị ho có thể gây bệnh (Hồ Đình Chúc và cs., 1993).
Thời gian ủ bệnh của CDV có thể thay đổi từ 1 đến 4 tuần. Ban đầu, CDV
lây nhiễm qua mô lympho đường hô hấp. Giai đoạn đầu virus nhân lên và phân bố
khắp các mô bạch huyết của toàn thân, dẫn đến ức chế miễn dịch và sốt. Giai

đoạn thứ hai xảy ra từ 6 - 9 ngày sau khi nhiễm bệnh, các tế bào nhu mô và biểu
mô trên khắp cơ thể bị nhiễm trùng (Pope và cs., 2016).
1.1.3.

Cơ chế gây bệnh

Khi vào cơ thể vật chủ, đầu tiên, virus nhân lên trong mô lymphoid của hệ
thống hô hấp, trong 24 giờ virus sẽ nhân lên ở đại thực bào và phát tán bởi hệ
lymphocyte tới hạch amydal và các hạch bạch huyết. 2 - 4 ngày sau số lượng
virus tăng lên nhanh chóng và xuất hiện trong máu, amydal, tuyến ức, lá lách,
hạch bạch huyết, tủy xương, mô bạch huyết. Trong 4 - 6 ngày tiếp theo, lượng
virus sẽ tăng lên nhiều lymphocyte ở lá lách, biểu mô dạ dày và ruột, niêm mạc
ruột và tế bào Kuffer trong gan. Sự lan truyền của virus trong hệ bạch huyết gây
ra cơn sốt đầu tiên, cùng lúc đó, virus tiếp tục phá hủy các lympho bào (bạch cầu
lymphô bào, bạch cầu lympho T) dẫn đến suy giảm bạch cầu (Carter và cs.,
1992).
Vào ngày 8 - 9 sau khi bị nhiễm, virus theo máu đến hệ thống thần kinh
trung ương và chó có biểu hiện thần kinh hay không phụ thuộc vào hệ miền dịch
dịch thể và miễn dịch tế bào cua vật chủ.
Ngày thứ 9 - 14 sau khi nhiễm trùng, hệ miễn dịch của chó bị suy giảm, sức
đề kháng kém, virus sẽ lan tràn trong các mô kể cả da, tuyến nội - ngoại tiết, trong
mô dạ dày, ruột, đường hô hấp, niệu quản. Virus tồn tại lâu dài khiến triệu chứng
lâm sàng của bệnh trở nặng tới khi con bệnh chết.


1.1.4.

Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

1.1.4.1. Triệu chứng lâm sàng

Canine distemper virus (CDV) là một bệnh rất dễ lây lan, chủ yếu liên quan
đến chó non và các động vật ăn thịt nhạy cảm khác với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong
cao. Nhiễm trùng CDV được đặc trưng bởi tính chất dinh dưỡng lympho, thần
kinh và biểu mơ dẫn đến nhiễm trùng toàn thân với các dấu hiệu lâm sàng nghiêm
trọng và tử vong (Alessia Peserico và cs., 2019).
Biểu hiện bệnh và phụ thuộc vào độ tuổi của chó mắc bệnh, giống chó, tình
trạng sức khỏe, chế độ chăm sóc, ni dưỡng cũng như độc lực của mầm bệnh
(Greene và Appel, 1987).
Thời gian ủ bệnh chó mệt mỏi, ủ rũ, ít vận động, sốt cao 40 - 41°C kéo dài
1 - 2 ngày, chó bỏ ăn, mắt đỏ, sau đó thân nhiệt trở về 38,5 - 39,5 °C; chó tỉnh táo
hơn. 3 - 4 ngày sau, xuất hiện đợt sốt thứ 2 kèm theo chảy nước mắt, nước mũi
ban đầu lỗng sau đặc dần, đơi khi kèm mủ xanh hoặc máu đen. Viêm niêm mạc
miệng và hạch amidan. Chó ho do viêm thanh quản, viêm phế quản rồi viêm phổi,
ban đầu ho khan, sau ho ướt dẫn đến khó thở, nhịp thở tăng rõ, suy nhược cơ thể,
bỏ ăn, bạch cầu (lympho bào) giảm.
Chó có biểu hiện nơn khan, nơn liên tục, mệt lả, háo nước. Sau đó ỉa chảy,
lúc đầu phân lỏng có màu xám vàng lẫn bọt và niêm mạc dạ dày, ruột lầy nhày
kèm lẫn máu màu cà phê hoặc màu hồng nhớt như máu cá, có mùi tanh khẳm điển
hình, giai đoạn cuối phân sẽ gần như nước do virus CDV đã làm hỏng hệ tiêu hóa.
Chó mất nước và mất chất điện giải nên gầy sút nhanh, mắt trũng, bụng hóp, đi lại
khơng vững, nằm liệt một chỗ, nhiệt độ hạ, loạn nhịp tim.
Gương mũi khơ và bong tróc, chảy nước mũi có màu xanh, thở khó, thở
khị khè. Da dầy lên, nổi các nốt chấm đỏ to bằng hạt đỗ xanh, hạt gạo ở những
vùng da mỏng, có thể loét, chảy mủ (gọi là các nốt sài) làm lông bết lại, hôi hám,
vết thương nhanh chóng lành, khơng hình thành sẹo. Màng kết mạc sung huyết,
mắt có nhiều ghèn, bị đục, có thể kèm thêm viêm giác mạc mắt. Sau khi bị bệnh
từ 10 đến 15 ngày, ở khoảng 80 - 90% số con bị bệnh, da ở gan bàn chân, mõm có


hiện tượng tăng sinh dày lên và cứng lại, có khi bị nứt ra làm cho chó đi khập

khiễng.
Một số trường hợp chó chạy lung tung khơng định hướng, sủa rống lên,
miệng chảy rãi rớt, ngã và dãy dụa, sau đó chó tỉnh táo lại nhưng rất mệt, chệch
choạng, co giật và run rẩy liên tục. Chó bài tiết tiểu tiện và đại tiện không tự chủ.
Cuối cùng nằm bệt, loạn nhịp tim, thân nhiệt hạ dẫn đến liệt chân rồi chết.
Từ khi ủ bệnh cho tới khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng khoảng 14 18 ngày, chó thường sốt cao từ 3 - 6 ngày sau khi nhiễm. Carre thể thần kinh khi
chữa khỏi vẫn để lại di chứng (đi xiêu vẹo, mù và điếc, gầy còm....)
1.1.4.2. Bệnh tích
Theo Appel và Gillespie (1972), bệnh tích đại thể có thể gặp bao gồm sừng
hố da ở mõm và gan bàn chân. Tuỳ theo mức độ kế phát các loại vi khuẩn mà có
thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột hay mụn mủ ở da...
Tế bào thượng bì đường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến nước bọt
có thể tìm thấy tiểu thể Lenst trong ngun sinh chất tế bào. Chó mẹ có thai thời
kỳ cuối mắc bệnh thì chó con sau khi sinh thường xuất hiện triệu chứng tồn thân,
tổn thương đường hơ hấp trên, viêm mũi, viêm phế quản, viêm kết mạc mắt
(Carter và cs., 1992). Viêm kẽ phổi lan toả mà đặc trưng là sự tăng sinh và dày lên
của biểu mô vách phế nang, lòng phế nang bao gồm các tế bào long vách phế
nang và đại thực bào.
Xác chết thường gầy, mắt trũng sâu, niêm mạc mũi, miệng viêm cata đỏ
mọng, sưng dầy lên, có nhiều chất nhớt. Phổi viêm, sung to, mầu đỏ thẫm, khí
quản - phế quản có nhiều bọt, nhiều vùng phổi chắc đặc, hạch lympho sung và
xuất huyết, trên vùng da mỏng có nốt sài, xoang bao tim, xoang ngực, xoang bụng
tích nước và não sung huyết. Ruột viêm cata xuất huyết khiến thành niêm mạc
bong ra lẫn máu với phân. Đây chính là nguyên nhân khiến phân có mùi đặc trưng
(Nguyễn Thị Huyền và cs., 2018).
Các biến đổi bệnh tích đại thể của chó nghi mắc Care chủ yếu thể hiện ở hệ
hô hấp (ph ổi, họ ng), ở hệ tiêu hóa (ruột non), hạch là nhiều nh ất. Các bệnh tích


đặc trưng của bệnh Care trên chó Phú Quốc như sau: Phổi có hiện tượng viêm

xuất huyết ở chó C1, C3, C4, sưng hay xốp dai, có trường hợp phổi viêm dính với
thành ngực. Bên cạnh đó, sung huyết mạch máu ruột và xuất huyết ruột non ở hầu
hết các chó nghiên cứu. Hạch lympho sưng to, xuất huyết, mặt cắt của hạch lồi có
dịch màu hồng chảy ra. Các cơ quan còn lại, sung huyết, xuất huyết ở mạch máu,
não, lách nhồi huyết, dạ dày sung huyết, gan hơi sưng, túi mật sưng to, thận sưng
và màng thận khó bóc (Nguyễn Thị Lan và Khao Keonam, 2012).
1.1.5.

Chẩn đốn và phịng, trị bệnh

1.1.5.1. Chẩn đốn bệnh
* Chẩn đốn dựa vào triệu chứng lâm sàng
Sốt cao, chán ăn hay bỏ ăn, chảy nước mũi, ho, khó thở, có gỉ mắt, nơn
mửa và ỉa chảy nặng đối với chó con, xuất hiện các triệu chứng thần kinh trong
thời kỳ cuối của bệnh, co giật cơ chân, cơ mắt, không đi được hoặc đi lại khó
khăn, lắc đầu, ho ở chó trưởng thành, có các nốt sài ở bụng, bẹn, ngực, phía trong
đùi có các triệu chứng trên đường tiêu hóa hoặc triệu chứng thần kinh thì khả
năng chó mắc bệnh Care là rất cao (Hồ Đình Chúc, 1993).
Chẩn đốn ban đầu chủ yếu dựa vào các dấu hiệu lâm sàng liên quan đến
nhiễm trùng. Tuy nhiên, hình thức chẩn đốn này cịn gặp nhiều khó khăn vì cần
tiến hành phân biệt với các bệnh khác có dấu hiệu hơ hấp, thần kinh và/hoặc tiêu
hóa, chẳng hạn như bệnh dại, giảm bạch cầu ở mèo, coronavirus, toxoplasmosis,
vi khuẩn enteritides và parvovirus (Angelika K Loots và cs., 2017).
* Ch ẩ n đ oán trong phịng thí nghi ệm
Bằng xét nghiệm sinh hóa và phân tích nước tiểu.
Xét nghiệm huyết thanh học có thể xác định các, kháng thể dương tính,
nhưng xét nghiệm này khơng thể phân biệt giữa các kháng thể tiêm chủng và
kháng thể được cơ thể con vật sản sinh ra khi tiếp xúc với virus độc hại.
Chụp X-Quang để xác định con vật có mắc bệnh viêm phổi hay khơng.
Chụp cắt lớp vi tính (CT) và chụp cộng hưởng từ (MRI) có thể được sử dụng để

kiểm tra não đối với bất kỳ tổn thương nào có thể phát triển.


Xét nghiệm tế bào để phát hiện sự hiện diện protein đặc hiệu của virus hàm
trong nguyên sinh chất, chủ yếu trên lớp tế bào biểu mơ (Chó cịn sống lấy lớp
màng nhầy biểu mô màng sinh dục hoặc niệu đạo. Chó đã chết lấy mẫu sớm nhất
ở các cơ quan: phổi, bàng quang, thận, não, hạch lâm ba...)
* Chẩn đoán virus học
Phân lập virus: bệnh phẩm máu, lách, phổi, nước và chất bài tiết của con
vật.
* Chẩn đoán bằng phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào
Mẫu bệnh phẩm đem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly tâm lấy
nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi đem gây nhiễm lên môi trường tế
bào một lớp Vero-DST (tế bào thận khỉ xanh châu Phi có gắn receptor đặc hiệu
cho virus CDV), virus CDV chỉ có thể nhân lên và gây bệnh tích tế bào (Cyto
pathogenic Effect - CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp. Bệnh tích tế bào do
CDV gây ra có thể quan sát được là những thể hợp bào. Tế bào bị phá hủy màng
và xuất hiện nhiều thể vùi. Ở trung tâm vùng tế bào xuất hiện CPE. Sự xuất hiện
nhiều hay ít, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc vào số lượng, độc lực của virus
và “tuổi” tế bào. Tế bào mới ni cấy thì virus gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất
hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào đã nuôi cấy nhiều ngày (Lan và cs.,
2005).
* Chẩn đoán bằng phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym (ELISA)
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) là một phương pháp xét
nghiệm miễn dịch dựa trên cơ chế liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng
thể. Trên kháng thể có có gắn enzyme và chất phát quang nhằm phát hiện ra sự
kết hợp kháng nguyên-kháng thể (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương,
2009).
* Chẩn đoán bằ ng phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch
Nhuộm hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là phương pháp

có độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức.
Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết họp giữa kháng


nguyên và kháng thể đặc hiệu và được phát hiện bằng chất chỉ thị màu (Nguyễn
Hữu Nam, 2010).
* Chẩn đoán bệnh bằ ng phươ ng pháp miễ n dịch huỳnh quang
Phản ứng miễn dịch huỳnh quang IF (Immuno Fluorescent test) có độ sáng
của bước sóng nhất định sẽ phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn. Phương pháp
này được thực hiện dựa trên nguyên lý: dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể đã
được nhuộm bằng chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp với kháng nguyên kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng (Nguyễn Bá Hiên
và Trần Thị Lan Hương, 2010).
* Chẩn đoán bằ ng phươ ng pháp RT-PCR/PCR
Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction)
là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp PCR. Phương
pháp này có thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp mà khó có thể phát
hiện bằng phương pháp khác. Do Taq polymerase sử dụng trong PCR không hoạt
động trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA thành cDNA, nhờ enzyme phiên
mã ngược Reverse Transcriptase (RT). Sau đó, cDNA này sẽ được khuếch đại nhờ
Taq polymerase. Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gen đặc
hiệu của virus. Sự hiện diện của sản phấm này thường được nhận biết qua điện di
trên gel agarose (Lan và cs., 2008).
Bên cạnh phương pháp RT-PCR, ngày nay phương pháp chuyển đổi cDNA
được sử dụng rất rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu giải mã gen. Hệ gen của
virus RNA trước tiên được chuyển đổi thành DNA bổ sung (cDNA) sử dụng mồi
xác suất hecxamer, bộ hóa chất sinh phẩm của Hãng Fermentas. Tiếp theo sản
phẩm cDNA được sử dụng làm khn cho phản ứng PCR. Phương pháp này có
ưu điểm là tiết kiệm được lượng khuôn ban đầu và đỡ tốn kém hơn.
So với các phương pháp chẩn đoán khác, chẩn đoán bằng phương pháp
sinh học phân tử cho độ chính xác tuyệt đối, ngồi ra bằng giải trình tự gen có thể

xác định chính xác các type/genotype của virus gây bệnh.
* Chẩn đoán phát hiệ n bệnh Care bằng kit chẩn đoán nhanh


Về bản chất, đây là phương pháp xét nghiệm ELISA để phát hiện kháng
nguyên của virus Care trong máu, gỉ mắt và nước mũi của chó. Hai kháng thể đơn
dịng trong thiết bị sẽ kết hợp đặc hiệu với các nhóm quyết định kháng nguyên
khác nhau của virus Care. Sau khi cho bệnh phẩm vào vị trí đệm cellulose của
thiết bị, virus Care sẽ kết hợp với kháng thể đơn dòng thứ nhất. Rồi phức hợp này
kết hợp với kháng thể đơn dòng khác trong màng nitơ - cellulose của thiết bị để
tạo thành hợp chất kép hoàn chỉnh. Kết quả xét nghiệm được biểu hiện qua các
vạch do thiết bị sử dụng theo phương pháp “sắc ký miễn dịch”.
Ưu điểm: có độ nhạy cao, có thế chẩn đốn bệnh sớm trong thời gian đầu
của bệnh, dễ dàng thực hiện với nhiều loại mẫu bệnh phẩm như huyết tương,
huyết thanh, gỉ mắt và nước mũi. Có thể đọc kết quả phản ứng sau 510 phút.
1.1.5.2. Phòng và trị bệnh
* Phòng bệ nh
Tiêm v ắ c xin là bi ệ n pháp phòng b ệnh ph ổ bi ế n đố i v ới các b ệ nh do
virus gây ra nói chung, trong đó có bệnh Care. Vắc xin được tiêm lần đầu cho chó
lúc 2 tháng tuổi. Mũi thứ 2 nhắc lại sau mũi đầu tiên 3 tuần, mũi thứ 3 nhắc lại
sau mũi thứ 2 là 3 tuần. Sau đó, tiêm nhắc lại mỗi năm một lần đề đảm bảo khả
năng bảo hộ.
Thị trường thuốc thú y Việt Nam hiện nay, vắc xin phịng bệnh Care cho
chó khá phong phú về chủng loại do doanh nghiệp trong nước sản xuất và nhập
khẩu từ nước ngoài như Intervet - Hà Lan, Merial - Pháp, Biocan - Cộng hòa Séc,
Pfizer - Mỹ, Fort Dodge Animal Health - Mỹ. Thống kê từ danh mục vắc xin và
chế phẩm sinh học được phép nhập khẩu năm 2008 cho thấy có tới 17 loại vắc xin
phòng Care và 1 loại kháng huyết thanh (Homoserum - Merial, Pháp) để phịng và
điều trị bệnh này.
Xí nghiệp thước thú y Trung ương (Vetvaco) đã chế tạo được vaccine

phịng bệnh Care từ chủng virus nhược độc đơng khô, sản xuất qua môi trường tế
bào xơ phôi gà một lớp, mỗi liều chứa tối thiểu 103 TCID50 virus.
Khi phát hi ện chó nghi mắ c b ệ nh Care phả i cách ly tri ệt để , đ iều trị


bằng kháng huyết thanh hoặc xử lý đúng quy trình để tránh lây lan cho chó khỏe
mạnh. Chó chết do mắc bệnh phải được chôn sâu, rắc vôi bột. Chuồng trại và môi
trường nuôi thả phải được vệ sinh sạch sẽ, phun sát trùng đầy đủ bằng Vim iodin
hoặc Han iodin 5% hoặc nước vôi 10%.
* Tr ị bệ nh
Hiện nay, chưa có loại thuốc kháng virus CDV nào đặc hiệu. Chủ yếu là
điều trị triệu chứng và chống phụ nhiễm, hỗ trợ mất nước và chất điện giải. Nếu
con vật chán ăn hoặc bị tiêu chảy, có thể dùng chất hỗ trợ tiêm, truyền tĩnh mạch.
Cầm ỉa chảy bằng cách cho uống thuốc đặc trị tiêu chảy Imodium uống I
viên/con, sau 12h mà con vật vẫn bị tiêu chảy thì uống tiếp viên thứ 2; Bisepton:
uống nửa viên đối với chó nhỏ, chó to uống 1 viên, uống cho tới khi khỏi tiêu
chảy; Hampiseptol: tiêm bắp 1ml/ 10kgP. Dùng kháng huyết thanh: liều 15 30ml/con, tiêm sớm. Khi con vật đã có triệu chứng viêm phổi hay triệu chứng
thần kinh thì kháng huyết thanh khơng có tác dụng. Lấy gỉ khỏi mắt và mũi con
vật, sau đó làm sạch mắt mũi thường xuyên bằng cách nhỏ nước muối sinh lý
0,9%. Giảm tình trạng con vật bị nơn bằng cách tiêm Atropin hay Primeran tiêm
dưới da. Bổ sung nước và chất điện giải bằng cách cho uống Ozeron 5%, tiêm
nước muối sinh lý 0,9% hay nước đường Glucoza 5% vào tĩnh mạch khoeo của
chó.
Thuốc kháng sinh được sử dụng để kiểm soát các triệu chứng do nhiễm
khuẩn thứ phát, gentamycin (tiêm bắp) 8 - 10 mg/kg, 2 lần/ngày, streptomycin
(tiêm bắp) 10 - 20mg/kg, 2 lần/ngày. Meprobamat (an thần) cho chó nhỏ uống 1
viên/ngày, chó to 2 viên/ngày trong 3 ngày. Ngồi ra, phenobarbital và
kalibromua có thể được sử dụng để kiểm soát các cơn co giật.
Điều trị nhiễm CDV thường điều trị triệu chứng và hỗ trợ vì khơng có loại
thuốc kháng virus cụ thể nào. Các nghiên cứu về tác dụng in vitro của các hợp

chất kháng virus trong điều trị CDV đang được tiến hành nhằm xác định tính an
tồn và hiệu quả của chúng trong việc điều trị (Angelika K Loots và cs., 2017).
Krumm S. A. và cs. (2014) đã đánh giá một chất ức chế virus pan-


morbillivirus có sẵn bằng đường uống, ổn định trong thời hạn sử dụng khi điều trị
cho chồn bị nhiễm CDV bằng thuốc ức chế và nhận thấy những con chồn này
giảm lượng virus trong máu, khơng có triệu chứng và sẽ hồi phục sau khi nhiễm
bệnh trong khi các con chồn đối chứng không qua khỏi.
Các hợp chất khác như fucoidan, một polysaccharide sulfat được tìm thấy
trong tảo nâu, cũng đã được đánh giá về khả năng hoạt động như thuốc kháng
virus chống lại CDV (Trejo-Avila và cs., 2014). Kết quả in vitro cho thấy
fucoidan có thể ức chế các bước ban đầu của chu trình nhân lên của virus, ngăn
chặn mạnh sự hình thành hợp bào trong các tế bào bị nhiễm bệnh.
Carvalho O. V. và cs. (2013) đã đánh giá hoạt tính kháng virus của một số
flavonoid (quercetin, morin, rutin và hesperidin) và các axit phenolic (axit
cinnamic, trans - cinnamic và ferulic), tập trung vào khả năng in vitro của chúng
để ức chế các giai đoạn của chu trình sao chép CDV. Tất cả các flavonoid và axit
phenolic đã chứng minh tác dụng kháng virus chống lại sự lây nhiễm của CDV.
Ngoài ra, các phương pháp điều trị nhiễm CDV khác đã được xác định bao
gồm liệu pháp tế bào gốc trung mô và sử dụng chế phẩm dược phẩm thú y chứa
các hạt nano bạc (Angelika K Loots và cs., 2017).
1.2.

Cơ sở pháp lý của vấn đề nghiên cứu

1.2.1.

Đặc điểm sinh học của virus Canine Distemper (CDV)

1.2.1.1. Đặc điểm cấu trúc hệ gen của virus CDV
Virus CDV được bao phủ bởi các gai glycoprotein có kích thước 8 - 14 nm
và chứa một nucleocapsid đối xứng xoắn ốc, có chiều dài 1 pm và đường kính
18nm (MacLachlan và Dubovi, 2011).
Hệ gen CDV là phân tử RNA sợi đơn âm, có kích thước khoảng 15.7 kb,
khơng chứa đầu 5'-UTR và khơng có chuỗi poly (A) ở đầu 3'-UTR, nhưng có các
phân tử mã hóa thực hiện chức năng của vùng 5'-UTR và vùng 3'- UTR. Hệ gen
của virus mã hóa cho hai protein khơng cấu trúc (là C và V protein) và 6 protein
cấu trúc, gồm: large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P),
nucleocapsidprotein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M) (Diallo, 1990).


c
V

Hình 1.1. Mơ hình cấu trúc của virus Canine Distemper (CDV)
(Nguồn: www.veteriankey.com)
Protein khơng cấu trúc (C) được mã hóa từ một khung đọc mở khác ở gen P
(Lamb và Kolakofsky, 2001). Chức năng của protein C cho đến nay vẫn chưa
được xác định rõ ràng.
Protein N: là nucleocapsid, có khối lượng phân tử 58 kDa bao quanh và bảo
vệ cho hệ gen của virus. Protein này rất nhạy cảm với những chất phân giải
protein.
Protein P: là phosphoprotein, có khối lượng phân tử 54,9 - 66 kDa, nhạy
cảm với những yếu tố phân giải protein, đóng vai trị quan trọng trong sự sao chép
của RNA (Sidhu và cs., 1993).
M: Matrix, khối lượng phân tử 34 - 39 kDa, đóng vai trị quan trọng trong
sự trưởng thành của virus và nối nucleocapsid với những protein vỏ bọc (Sidhu và
cs., 1993).
F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử 59 62 kDa, đóng vai trị trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn đến kết

hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (hợp bào).
H: Protein ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là
glycoprotein thứ hai của vỏ bọc virus, khối lượng phân tử 76 - 80 kDa, đóng vai
trị gắn virus vào tế bào đích, quyết định tính kháng nguyên của virus.
L: Large protein, có khối lượng phân tử lớn 180 - 200 kDa, do đó nó thể


hiện phần lớn các hoạt động của RNA polymerase (Diallo,1990).
Trong đó, protein H được mã hóa bởi gen H là protein kháng nguyên, quyết
định tính kháng nguyên và độc lực của virus. Độ dài gen H của các chủng virus
Care đã được công bố là 1824 bp. Đây là protein có vai trị quan trọng nhất trong
hệ gen của virus và thường được sử dụng trong phân tích xác định genotype và
nguồn gốc phả hệ của virus CDV.
1.2.1.2. Hình thái của virus CDV
Hình thái virus CDV quan sát đượ c d ưới kính hiển vi điện t ử có hình
vịng trịn, hình bán nguyệt do các sợi tóc cuộn trịn hình thành. Dạng vịng trịn
này có đường kính từ 115 - 230 nm. Màng cuộn kép có độ dày từ 75 - 85Ao với bề
mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy và cs., 1989).

Hình 1.2. Hình thái của virus Canine Distemper
(Nguồn: />1.2.1.3. Phân loại virus gây bệnh Care
Virus gây bệnh Care là Canine Distemper Virus - CDV, thuộc:
Lồi: Cannine morbilivirus
Họ: Paramixoviridae
Giống: Morbillivirus
Là một virus có kích thước tương đối lớn, đường kính 150 - 250nm, cấu
trúc xoắn, nhân là một RNA sợi đơn, có vỏ Lipoprotein. Virus này chỉ có một
serotype duy nhất nhưng có nhiều chủng được phân lập ở nhiều khu vực địa lý
khác nhau trên thế giới và có những đặc trưng riêng (Lê Thị Tài, 2006). Virus

CDV có mối liên quan gần gũi về tính kháng nguyên và sinh lý với virus gây bệnh
sởi ở người và virus dịch tả trâu bò (Lan NT và cs., 2005).
Nguyen Thi Lan và cs. (2008) đã mô tả cây phân loại dựa trên việc giải
trình tự gen mã hóa protein H. Kết quả nghiên cứu cho thấy: trên thế giới có 5
type virus lớn, phân lập tại những vùng địa lý khác nhau, đó là: genotype châu Âu
(Europe), cổ điển (classic type), Asia 1, Asia 2 và America. Chủng gây bệnh tiêu
chuẩn là chủng Snyderhill thuộc genotype cổ điển. Viện Thú y Việt Nam đã và
đang sử dụng chủng này để công cường độc, kiểm nghiệm hiệu lực của vaccine
phịng bệnh Care trên chó (Lê Thị Tài, 2006).
1.2.2.

Một số hiểu biết về gen H và tầm quan trọng của việc giải mã hệ

gen virus Care
B ộ gen c ủ a virus Care là s ợ i RNA đơ n kho ả ng 15,7kb, mã hóa cho 8
loại protein. Trong đó, protein H giữ vai trị quan trọng trong việc gắn virus vào tế
bào đích, có nhiệm vụ là kênh protein màng tế bào và cũng có thể giữ vai trị là
protein kháng ngun màng của virus. Gen mã hóa cho protein H có sự biến đổi
khá lớn giữa các chủng virus khác nhau. Chính vì vậy, trình tự nucleotide của
vùng gen H thường được lựa chọn để nghiên cứu về dịch tễ học phân tử và đánh
giá sự biến đổi di truyền giữa các chủng virus CDV (Hashimoto và cs., 2001;
Lednicky và cs., 2004).
Đo ạ n gen protein H này ch ứa mộ t khung đọ c mở mã hóa cho khoả ng
607 axid amin, trình tự nucleotide và axit amin dự đoán của gen H của CDV
Haku93 và Haku00 cho thấy sự tương đồng cao (Hirama K. và cs., 2004), do đó
việc nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus Care dựa trên trình
tự nucleotide của đoạn gen H là cần thiết để hiểu mối quan hệ di truyền giữa các
chủng virus nghiên cứu.
Có hai kiểu gen hemagglutinin riêng biệt đã được xác định trong virus gây

bệnh Care ở chó từ năm 1991 tại Nhật Bản. Một là kiểu gen KDK-1 bản địa,
chiếm ưu thế về mặt số lượng, trong khi kiểu kia là kiểu gen 98-002 có thể đã
phát triển ở Viễn Đơng bên ngoài biên giới giữa Nhật Bản và Hàn Quốc


(Hashimoto và cs., 2001).
Messling và cs. (2001) cho biết: protein H là yếu tố chính quyết định hiệu
quả dung hợp. Một hệ thống di truyền ngược để tạo ra các CDV tái tổ hợp đã
được thiết lập dựa trên một plasmid chứa trình tự kháng gen có chiều dài đầy đủ
của CDVOS. Các vùng mã hóa của protein H của tất cả các chủng CDV và MV Edm
đã được đưa vào nền tảng di truyền CDV và MV, và các vi rút tái tổ hợp rCDVH5804, rCDV-H

OL

, rCDV-HEdm, rMV-H5804, rMV-HOL và rMV-HOS đã được phục

hồi. Do đó, các protein H của hai morbillivirus có thể hốn đổi cho nhau và có
đầy đủ chức năng trong một phức hợp dị loại.
Gen H của CDV có sự biến đổi di truyền lớn nhất và được sử dụng rộng rãi
để khảo sát tính đa hình ở các chủng CDV. Dựa trên sự biến đổi của gen H, các
chủng CDV có thể được nhóm thành ít nhất 14 dịng di truyền liên quan đến vùng
địa lý: châu Á-1, châu Á-2, châu Á-3, châu Á-4, châu Âu, động vật hoang dã châu
Âu, giống Bắc Cực, Rockborn-like, America-1, America-2, Africa, South
America-1, South America-2 and South America-3 (Li W. và cs., 2018).
Trong số sáu protein cấu trúc được mơ tả cho CDV, protein H có sự biến
đổi di truyền lớn nhất và là protein quan trọng trong việc gắn virion vào các thụ
thể trên bề mặt tế bào chủ. Tính đặc hiệu mà CDV-H tương tác với SLAM và tiềm
năng của nó như một yếu tố quyết định phạm vi vật chủ đã được nghiên cứu. Các
gốc axit amin Y525, D526 và R529 của CDV-H đã được xác định bằng cách gây
đột biến hướng vào vị trí để tương tác với SLAM (Angelika K Loots và cs.,

2017).
Protein H phần lớn được biết đến là có sự biến đổi kháng nguyên và các
kháng thể đối với protein H rất quan trọng đối với khả năng miễn dịch bảo vệ
chống lại nhiễm trùng. Do tính chất biến đổi di truyền của nó, gen H đã được sử
dụng để xác định các dịng di truyền CDV có liên quan đến nguồn gốc địa lý mà
các dòng được phát hiện (Chutchai Piewbang và cs., 2019) [].
Các phân tích trình tự gen chỉ ra rằng protein H liên quan đến khả năng di
truyền ở các khu vực địa lý khác nhau, tập trung ở châu Mỹ 1 (bao gồm hầu hết