Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy benzene trên địa bàn thành phố đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

NGÔ THỊ VÂN KIỀU

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG
PHÂN HỦY BENZENE TRÊN ĐỊA BÀN
THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Đà Nẵng – Năm 2017


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

NGÔ THỊ VÂN KIỀU

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG
PHÂN HỦY BENZENE TRÊN ĐỊA BÀN
THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn: TS. PHẠM THỊ MỸ

Đà Nẵng – Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng
được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Đà Nẵng, tháng 5 năm 2017
Tác giả luận văn

NGÔ THỊ VÂN KIỀU


LỜI CẢM ƠN
Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo hướng dẫn –
TS. Phạm Thị Mỹ đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt nhiều kiến thức, kinh
nghiệm quý báu cho em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Sinh – Môi trường, Đại học Sư
phạm, Đại học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em
trong 4 năm học.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ,
động viên em trong suốt thời gian làm khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn!
Ngơ Thị Vân Kiều


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài........................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................................2

3. Ý nghĩa của đề tài ..................................................................................................2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ BENZENE ...........................................................................3
1.1.1. Khái quát về benzene ...............................................................................3
1.1.2. Các nguồn phát thải benzene ...................................................................5
1.1.3. Nồng độ benzene trong môi trường ........................................................6
1.1.4. Độc tính của benzene ................................................................................7
1.2. TỔNG QUAN VỀ BIỆN PHÁP XỬ LÝ Ô NHIỄM BENZENE ...................8
1.2.1. Phương pháp trích ly bay hơi (soil vapor extraction - SVE).................8
1.2.2. Phương pháp phân hủy sinh học .............................................................9
1.3. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC BIỆN PHÁP SINH HỌC
XỬ LÝ DUNG MÔI HỮU CƠ ...............................................................................11
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .......................................................11
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .........................................................12
1.4. ĐẶC ĐIỂM TỰ NHIÊN KHU VỰC NGHIÊN CỨU ...................................13
1.4.1. Vị trí địa lý, địa hình ..............................................................................13
1.4.2. Đặc điểm khí hậu ....................................................................................13
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
…………………………………………………………………………………15


2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .........................................................................15
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................15
2.3. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ............................15
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................16
2.3.1. Phương pháp thu mẫu ...........................................................................16
2.3.2. Phương pháp phân lập ...........................................................................17
2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng benzene .........................................18
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm ni cấy và hình thái của các
chủng vi khuẩn tuyển chọn được ....................................................................20

2.3.5. Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh
trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn được .........................................21
2.3.6. Khảo sát đường cong sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
được………….. .................................................................................................23

2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu............................................................23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...........................................................24
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY BENZENE TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ
NẴNG .......................................................................................................................24
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NI CẤY VÀ HÌNH THÁI CỦA
CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƯỢC ........................................................................31
3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG VÀ XÂY
DỰNG ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA 6 CHỦNG VI KHUẨN
TUYỂN CHỌN ĐƯỢC ...........................................................................................34
3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ benzene ........................34
3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ .......................................35
3.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH ...............................................36


3.3.4. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của 6 chủng vi khuẩn
tuyển chọn được ................................................................................................37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................41
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BTEX:

Benzene, toluene, ethylbenzene, xylene

CFU

Colony Forming Unit

GC/MS:

Gas Chromatography/Mass Spectrometry

MSM:

Mineral Salt Medium

PAHs:

Polycyclic aromatic hydrocarbons

OD:

Optical density

SVE:

Soil vapor extraction

VK:

Vi khuẩn

VOCs:

Volatile Organic Compounds

VSV:

Vi sinh vật


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Tên bảng

Số hiệu bảng

Các thông số kỹ thuật của phương pháp xây dựng
2.1.

đường chuẩn

2.2.

Các thông số kỹ thuật của chương trình nhiệt độ lị
Sự hiện diện của các chủng VK phân lập được trong

3.1.

3.2.

19
19

24-25

các mẫu đất nhiễm dầu
Kí hiệu và địa điểm lấy mẫu của 6 chủng VK tuyển
chọn được
Bảng tổng hợp đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của 6

3.3.

Trang

chủng VK tuyển chọn được

29

33


DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Số hiệu

Tên hình vẽ

hình vẽ

Trang

1.1.

Cấu trúc hóa học của benzene

4

1.2.

Phản ứng thế trong nhân thơm

5

1.3.

Cơ chế phân hủy benzene nhờ enzyme dioxygenase

10

2.1.

3.1.

3.2.
3.3.
3.4.

3.5.

3.6.

Mẫu đất nhiễm dầu tại các cây xăng (A) và tiệm sửa
xe (B)
Tỉ lệ % số chủng VK phân lập từ các tiệm sửa xe và

trạm xăng
Biểu đồ thể hiện sự phân bố VK phân lập được theo
mùa
46 chủng VK phân lập được từ các mẫu đất nhiễm dầu
Độ đục môi trường thay đổi sau 4 ngày nuôi (A: ngày
thứ 1, B: ngày thứ 4)
Mật độ tế bào sau 4 ngày nuôi VK trong mơi trường
chứa 1% benzene.
Hàm lượng benzene cịn lại sau 4 ngày ni cấy
(%v/v)

15

25

26
27
28

28

30

Hình thái khuẩn lạc và kết quả nhuộm Gram của các
3.7.

chủng T2, T4, T7, T10 sau 2 ngày nuôi cấy và chủng
T6, T9 sau 4 ngày nuôi cấy trên mơi trường MSM có

32

bổ sung 1% glucose, 1% cao nấm men
3.8.

3.9.

Ảnh hưởng của nồng độ benzene lên sự sinh trưởng
của 6 chủng VK tuyển chọn được
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của 6
chủng VK tuyển chọn được

34

36


3.10.

3.11.

Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của 6 chủng
VK tuyển chọn được
Đường cong sinh trưởng của 6 chủng VK trong thời
gian 120h

37

38

1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Tốc độ phát triển nhanh chóng của xã hội cùng với sự bùng nổ dân số đã
làm cho nhu cầu về nguồn nguyên, nhiên liệu của quốc gia ngày một gia tăng.
Việc mở rộng các ngành công nghiệp khai thác, chế biến như công nghiệp
dầu mỏ, sản xuất sơn, sản xuất giấy, công nghiệp dệt nhuộm hay sản xuất các
hóa chất tẩy rửa… đã góp phần giải quyết nhu cầu về nguyên, nhiên liệu cho
con người. Song, chính điều này là nguyên nhân gây ra tình trạng ơ nhiễm
mơi trường. Theo nghiên cứu của các nhà khoa học, ô nhiễm do chất thải
công nghiệp, cụ thể là dung môi hữu cơ, không những ảnh hưởng đến hệ sinh
thái mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người [22].
Các dung môi hữu cơ thường được sử dụng phổ biến bao gồm VOCs
(Volatile Organic Compounds), benzene và toluene [8]. Trong đó, benzene
được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất các chất hữu cơ, dùng làm
dung mơi hồ tan mỡ, cao su, vecni, tẩy da, vải sợi, lau khô, tẩy dầu mỡ bám
trên các dụng cụ, vật liệu, phương tiện. Chất thải từ các nhà máy thuộc da, dệt
nhuộm cơ khí, các xưởng sửa chữa tân trang xe máy, đóng tàu cũng là những
nguồn phát thải benzene. Năm 1997, Chính phủ nước ta đã có quyết định cấm
dùng benzene làm dung mơi pha chế sơn. Những ngành khác cần sử dụng
benzene thì phải được sự cho phép của cơ quan có thẩm quyền. Điều này cho
thấy benzene cực kỳ độc hại [34].
Các phương pháp xử lý truyền thống đối với những vùng bị nhiễm độc
dung môi hữu cơ hay hydrocarbon bao gồm tách lớp đất đã bị ô nhiễm, cách
ly vùng bị ô nhiễm [31]. Tuy nhiên, những phương pháp này không hiệu quả
vì khơng giải quyết được triệt để nguồn ơ nhiễm. Ngồi ra, phương pháp đốt
hoặc dùng hóa chất cũng được sử dụng, nhưng lại có nhiều nhược điểm và địi
hỏi kinh phí cao. Trong những năm gần đây, việc xử lý ô nhiễm dung môi
hữu cơ bằng các chủng vi sinh vật (VSV) được nhiều nhà khoa học quan tâm.

2

Phương pháp phân hủy sinh học xuất hiện như một giải pháp tích cực giúp xử
lý ơ nhiễm hydrocarbon với những ưu điểm như giá thành thấp, khơng địi hỏi
kỹ thuật cao và tận dụng được quá trình phân hủy tự nhiên của VSV [8].
Hướng đi này đang được khám phá là có giá trị tiềm năng ứng dụng rất cao do
hiệu quả mà nó mang lại.
Bên cạnh đó, Đà Nẵng với những quần thể VSV phong phú sinh sống tại
những nơi có nguồn thải benzene lớn, có tiềm năng để có thể phân lập được
những dịng vi khuẩn (VK) có khả năng phân hủy benzene với hiệu quả cao.
Đây chính là tiền đề khoa học, là cơ sở để nghiên cứu thành công đề tài:
“Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng
phân hủy benzene trên địa bàn thành phố Đà Nẵng”.
2. Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn một số chủng VK có khả năng phân hủy
benzene, từ đó tạo các dữ liệu khoa học về việc sử dụng các chủng phân lập
được cho việc chế tạo chế phẩm sinh học, ứng dụng vào thực tiễn tại địa
phương.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Tuyển chọn và lưu giữ được chủng VK có khả năng phân hủy benzene.
Đây là nguồn gen cung cấp cho các hướng nghiên cứu sâu hơn về sinh lí, sinh
hóa, di truyền...
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Các chủng có hoạt tính phân lập được sẽ làm tiền đề cho việc nghiên cứu
các biện pháp xử lý dung môi hữu cơ, giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ BENZENE
1.1.1. Khái quát về benzene
Benzene được biết đến dưới công thức hố học C6H6, hay cịn được viết
tắt là PhH, hoặc benzol, là một hợp chất hữu cơ thơm. Benzene được nhà vật
lý người Anh - Michael Faraday phát hiện ra năm 1825, khi ơng ngưng tụ khí
thắp. Năm 1833, nhà hoá lý người Đức - Eilhard Mitscherlich đã điều chế
được benzene từ kali benzoate (C7H5KO2). Đến năm 1845, Charles Mansfield,
trợ lý của August Wilhelm Hoffmann điều chế được benzene bằng cách
chưng cất nhựa than đá. Tuy nhiên phải đến năm 1861, August Kekulé người
Đức mới đưa ra công thức cấu tạo của benzene là vịng 6 cạnh đều có 3 liên
kết đôi và 3 liên kết đơn [35].
a. Cấu tạo hóa học
Phân tử benzene có cấu tạo vịng 6 cạnh đều. Mỗi nguyên tử C trong
phân tử benzene tham gia 3 liên kết δ với 2C bên cạnh và H, nhờ 3 orbital lai
hóa nên tất cả các nguyên tử C và H đều nằm trên cùng mặt phẳng. Còn mối
liên kết thứ 4 (liên kết π) được tạo nên nhờ orbital 2p có trục vng góc với
mặt phẳng phân tử. Khoảng cách giữa các nguyên tử C trong phân tử là bằng
nhau nên mây electron p của nguyên tử C xen phủ đều với 2 mây electron 2p
của 2 nguyên tử C bên cạnh. Do đó trong phân tử benzene khơng hình thành 3
liên kết π riêng biệt mà là một hệ liên kết π thống nhất gọi là hệ liên hợp
thơm, quyết định những tính chất thơm đặc trưng của nhân benzene, vừa thể
hiện tính chất chưa no [6].


4

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của benzene [33]

b. Tính chất vật lý [30], [33], [35]
- Trong điều kiện bình thường, benzene là một chất lỏng, không màu,
mùi dịu ngọt dễ chịu, dễ bay hơi, dễ cháy.
- Khối lượng phân tử: 78,11 g/mol
- Điểm sôi ở 760 mmHg: 80,1°C
- Điểm nóng chảy: 5,5°C
- Tỷ trọng ở 15°C: 0,8787 g/cm3
- Độ tan:
+ Tan trong alcohol, choloroform, ether, carbon disulfide, acetone,
carbon tetrachloride, acid acetic.
+ Tan trong nước: 0,188% (w/w) ở 25°C
- Áp suất hơi: 75 mmHg ở 20°C.
c. Tính chất hóa học [35]
Benzene tham gia vào một số phản ứng như sau:
- Phản ứng cộng: với hydro trong điều kiện xúc tác niken ở nhiệt độ cao,
với clo khi có chiếu sáng.
- Phản ứng Friedel – Crafts: benzene phản ứng với methylclorua khi có
acid Lewis.
- Phản ứng thế electrophyl theo quy tắc:


5

Hình 1.2. Phản ứng thế trong nhân thơm [35]
1.1.2. Các nguồn phát thải benzene
Benzene phát thải vào môi trường từ hai nguồn: tự nhiên và nhân tạo
(cơng nghiệp), trong đó nguồn nhân tạo là chủ yếu và gây ảnh hưởng nghiêm
trọng nhất.
Các nhóm xí nghiệp hoạt động và sinh ra nước thải có ơ nhiễm benzene

đặc trưng là:
- Benzene là nguyên liệu chính để sản xuất các loại thuốc trừ sâu, thuốc
kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng, sản xuất cao su… Ngoài ra người ta
sử dụng benzene sản xuất nước hoa, phẩm nhuộm, keo dán... [6].
- Benzene là một một ngun liệu rất quan trọng trong cơng nghiệp hố
chất. Những nguyên tử hydro trong benzene dễ bị thay thế bằng clo và các
halogen khác, bằng các nhóm sunfo-, amino-, nitro- và các nhóm định chức
khác. Clobenzene, hexaclobenzene, phenol, anilin, nitrobenzene… là một số
dẫn xuất của benzene dùng trong công nghiệp hoá chất để sản xuất chất dẻo
và thuốc nhuộm, bột giặt và dược phẩm, sợi nhân tạo, chất nổ, hoá chất bảo
vệ thực vật… [6].
- Benzene là một thành phần trong dầu thơ, là một sản phẩm của q
trình chưng cất dầu mỏ. Tuy nhiên người ta thường tổng hợp benzene từ các
chất trong dầu mỏ hơn là thu trực tiếp [6].
- Benzene còn được sử dụng chế tạo tơ nhân tạo, nilon, thủy tinh tổng
hợp hữu cơ, đồ chống cháy [6].
Benzene được thải vào môi trường, nước, không khí từ các chất thải
cơng nghiệp, bãi rác, xăng dầu… Khi vào mơi trường chúng bắt đầu q trình


6

hết sức phức tạp, các biến đổi hóa học tạo nên những gốc hydrocarbon, các
hợp chất khác nhau. Trong khí quyển, benzene chỉ tồn tại vài ngày, thậm chí
vài giờ sau đó biến đổi thành những hợp chất khác. Benzene xâm nhiễm trong
môi trường đất, nước sẽ bốc hơi, bị phản ứng quang hóa và bị phân hủy bởi
VSV. Quá trình phân hủy bởi VSV chủ yếu xảy ra trong điều kiện hiếu khí,
q trình này rất quan trọng trong quá trình làm sạch benzene [30].
Benzene phát tán khắp nơi trong khơng khí và có sự khác nhau giữa khí
quyển thành thị, nông thôn và trong nhà. Mặc dù lượng benzene phát thải vào

môi trường là rất lớn, nhưng môi trường vẫn có khả năng chịu đựng bởi nó có
quá trình di chuyển và phân hủy. Phần lớn benzene bay hơi vào khơng khí và
ảnh hưởng đến cơ thể sống trong đó có con người bởi các q trình phơi
nhiễm qua đường hô hấp. Theo Hattermer – Frey (năm 1990), trong tổng
lượng benzene đưa vào cơ thể có đến 90% do hít phải. Có thể là do hút thuốc
lá (cả người hút và người không hút đều bị ảnh hưởng), do sống trong mơi
trường khơng khí bị ơ nhiễm. Cịn lại là do ăn, uống hay tiếp xúc với thực
phẩm nước uống có chứa benzene [30].
1.1.3. Nồng độ benzene trong môi trường
Nồng độ benzene trong dầu thô đạt đến 4 g/l.
Nồng độ benzene trong môi trường dao động từ 0,2 μg/m3 (0,06 ppb) ở
vùng nông thôn xa xôi, đến 349 μg/m3 (107 ppb) ở các trung tâm công nghiệp
với mật độ xe cộ lưu thông cao. Tỷ lệ benzene trong xăng khơng chì khoảng
1-2%. Lái xe một giờ mỗi ngày ước tính thêm 40 μg benzene vào một cơ thể
con người hàng ngày. Mức độ lên đến 10.000 μg/m3 (3.000 ppb) đã được đo
tại các trạm xăng.
Benzene đã được phát hiện ở mức cao nhất là 500 μg/m3 (154 ppb) trong
khơng khí trong nhà. Khói thuốc lá góp một lượng đáng kể benzene đối với
khơng khí trong nhà, với người hút thuốc hít khoảng 1.800 μg benzene/ngày
so với 50 μg/ngày của người khơng hút thuốc. Benzene cũng có trong thực


7

phẩm và đồ uống như một sản phẩm của một phản ứng giữa benzoate và acid
ascorbic, và đã được tìm thấy trong nước giải khát ở Anh với nồng độ cao như
28 ppb (μg/l) [16].
 Giới hạn cho phép của benzene trong môi trường
- Nồng độ giới hạn cho phép, tại nơi làm việc: 0,02 mg/l.
- Nồng độ benzene cho phép trong thời gian ngắn: 0,5 mg/l trong 30 phút

- Nồng độ benzene nguy hiểm cho sự sống: 4 mg/l trong 10 phút [2].
- Nồng độ benzene tối đa cho phép trong nước ăn uống: 10.10-6 g/l [5].
1.1.4. Độc tính của benzene
Đối với con người: Benzene được biết đến là chất gây ung thư. Benzene
được hấp thu nhanh chóng và phân bố rộng rãi khắp cơ thể. Tiếp xúc với nồng
độ rất cao trong khơng khí (10.000.000 ppb trở lên) có thể gây tử vong. Mức
thấp hơn (700.000 - 3.000.000 ppb) có thể gây buồn ngủ, chóng mặt, nhịp tim
nhanh, nhức đầu, run, rối loạn, bất tỉnh. Ăn thực phẩm hoặc uống chất lỏng
chứa hàm lượng benzene cao có thể gây nơn, kích ứng dạ dày, chóng mặt,
buồn ngủ, co giật, nhịp tim nhanh, hôn mê, và tử vong [16]. Nếu con người
sống và làm việc lâu dài trong môi trường khơng khí nhiễm benzene thì khả
năng tạo ra huyết cầu của tuỷ xương sẽ bị tổn hại, dẫn đến bệnh thiếu máu,
thậm chí dẫn đến bệnh máu trắng. Gần đây, các nhà khoa học cảnh báo về khả
năng benzene thoát ra từ vật liệu, chất dẻo và nhựa vinyl cịn mới của xe hơi,
máy móc gia dụng... gây ra chứng nhức đầu, uể oải, buồn nơn và có thể gây ra
ung thư. Ngay cả khi sử dụng bột giặt tổng hợp trong đó có dẫn chất của
benzene: chất natri dodecyl benzene sulfonate - chất hoạt tính bề mặt - thường
có trong bột giặt với tỷ lệ từ 10% đến 35% tùy loại bột giặt. Nếu khi giặt
không sạch, chất này cịn bám lại trên quần áo, khơng chỉ gây kích thích làm
mẩn ngứa da mà cịn thẩm thấu qua da ngấm vào cơ thể, ảnh hưởng đến sức
khỏe (nhất là khi giặt tã lót cho trẻ nhỏ, giặt cịn sót chất trên gây viêm da, có
thể ảnh hưởng tới chức năng của cơ quan hô hấp và gan) [6].


8

Đối với sinh vật: Thử nghiệm độc tính benzene cũng đã được tiến hành
đối với sinh vật dưới nước. Thông thường nồng độ nước vượt quá 1 mg/l có
thể tạo ra các tác động cấp tính độc hại trong các sinh vật như tảo và cá. Do
nồng độ thấp của các chất này trong nước, các quá trình bay hơi nhanh nên

nguy cơ tổng thể đối với môi trường thủy sinh được coi là thấp [16].
Tóm lại, sự ơ nhiễm bởi benzene là hình thức khó nhận thấy nhưng lại có
ở nhiều nơi và gây những tác hại đáng kể đến mơi trường sống của nhiều lồi
sinh vật cũng như mơi trường. Vì vậy cần có những biện pháp hữu hiệu để
hạn chế sự có mặt của chúng trong mơi trường.
1.2. TỔNG QUAN VỀ BIỆN PHÁP XỬ LÝ Ô NHIỄM BENZENE
Khi benzene nhiễm vào đất, nó phân chia thành các pha sau: lỏng tự do,
hơi, hấp phụ vào các hạt đất hoặc hòa tan trong nước. Kết cấu đất, độ xốp đất
và thời gian ô nhiễm ảnh hưởng đến sự phân bố của các pha. Khoảng 60%
benzene có xu hướng tách ra thành pha hơi, 35% vào trong dung dịch nước, và
5% hấp phụ vào các hạt đất. Pha hơi xảy ra trong vùng vadose (tức là vùng
khơng bão hịa). Các hydrocacbon nhẹ như benzene có thể hịa tan trong nước
so với các hydrocarbon thơm đa vòng (PAHs) mà thường là các thành phần
của dầu diesel (ví dụ: napthalen, anthracene, hoặc pyrene). Ngoài ra, benzene
dễ dàng bị hấp phụ lên các hạt đất và đặc biệt hấp phụ mạnh bởi đất sét hơn là
cát hoặc đất bùn. Sự dao động giữa các pha phức tạp làm phức tạp việc khắc
phục các hydrocarbon [19].
Nhiều phương pháp xử lý tại chỗ đã triển khai để làm sạch ô nhiễm
benzene. Hai phương pháp phổ biến tại chỗ là trích ly bay hơi và tăng cường
phân hủy sinh học của benzene [19].
1.2.1. Phương pháp trích ly bay hơi (soil vapor extraction - SVE)
Kỹ thuật SVE được áp dụng đối với tầng đất chưa bão hòa (nằm trên tầng
nước ngầm) hoặc đối với đất bị ô nhiễm đã được đảo lên. SVE bao gồm một
hệ thống các giếng trích ly theo chiều dọc và liên kết với đường ống kết thúc


9

bằng một máy bơm chân không ở đầu giếng khoan. SVE hoạt động bằng cách
tạo gradient áp suất âm trong một loạt các vùng trong đất khơng bão hịa, áp

suất âm này gây ra một luồng khơng khí ngầm. Khơng khí trong đất được thay
thế bằng khơng khí khác tách dải hydrocacbon trong không gian giữa các hạt
đất trong vùng vadose. SVE thay đổi trạng thái cân bằng để benzene trong pha
nước hoặc hấp phụ chuyển sang pha hơi [19].
Sự thành công của phương pháp SVE phụ thuộc vào các yếu tố sau: độ
ẩm đất, độ sâu của mực nước, độ xốp đất, tính chất của chất gây ơ nhiễm, và
nhiệt độ. Các chất gây ô nhiễm nhẹ, dễ bay hơi hơn như hóa chất BTEX được
tách dễ dàng hơn các chất gây ô nhiễm nặng hơn như dầu diesel, dầu sưởi,
hoặc dầu nhiên liệu. SVE không hoạt động nếu hầu hết benzene nằm trong
nước ngầm trải qua sự biến động của mực nước theo mùa. SVE cũng không
làm việc tốt trong đất sét khơng xốp. Khơng khí phun có thể phải được nung
nóng trong điều kiện thời tiết lạnh hơn, độ xốp đất có ảnh hưởng lớn hơn đến
tốc độ phục hồi. Các hơi chiết xuất từ SVE phải được xử lý trước khi thải vào
khí quyển. Việc hấp phụ than hoặc xúc tác thường được sử dụng để xử lý sự
bốc hơi đất. Các bộ lọc than có hiệu quả làm sạch hơi nhưng các bộ lọc phải
được thay thế thường xuyên và tốn kém. Các chất xúc tác chuyển đổi oxy hóa
hơi benzene thành carbon dioxide và nước nhưng phương pháp này có chi phí
bảo trì cao [19].
1.2.2. Phương pháp phân hủy sinh học
Benzene thường không được loại bỏ hồn tồn khỏi đất bằng SVE vì
phần cịn lại trong dung dịch (dung dịch nước) hoặc hấp phụ vào các hạt đất.
Phương pháp phân hủy sinh học được sử dụng để loại bỏ các chất ô nhiễm dư
thừa mà không dễ dàng di chuyển vào pha hơi. Phân hủy sinh học là một quá
trình mà các VSV, bao gồm VK hoặc nấm, phân huỷ các hydrocarbon, tạo ra
CO2 và nước. Hầu hết hoạt động của VSV xảy ra trong lớp nước trên bề mặt
của các hạt đất [19].


10

 Cơ chế phân hủy benzene
Benzene cũng như các hợp chất hữu cơ vịng thơm khác rất khó bị phân
hủy do cấu trúc của chúng tồn tại dạng cộng hưởng rất bền. Năng lượng cộng
hưởng do liên kết л tạo ra trên vịng [24].

Hình 1.3. Cơ chế phân hủy benzene nhờ enzyme dioxygenase [29]
Phân hủy benzene trong điều kiện hiếu khí bởi VK đã được nghiên cứu
từ rất sớm. Oxy khơng chỉ có nhiệm vụ là nhận điện tử như trong q trình hơ
hấp tế bào bình thường mà cịn có vai trị là hoạt hố cho enzyme mono hay
dioxygenase để phân hủy vòng thơm. Một số con đường trao đổi chất hiếu khí
cho sự phân hủy của benzene, toluene, ethylbenzene và xylene (BTEX), được
cung cấp bởi hai hệ thống enzyme (dioxygenases và monooxygenases) đã
được nghiên cứu. Các monooxygenase tấn cơng các nhóm metyl hoặc etyl của
vịng thơm, sau đó được chuyển đổi bởi một số q trình oxy hóa tương ứng
với các pyrocatechols hoặc phenylglyoxal tương ứng. Ngoài ra, một ngun
tử oxy có thể được kết hợp vào vịng thơm trong khi nguyên tử thứ hai của
phân tử oxy được sử dụng cho q trình oxy hóa một trong hai vòng thơm


11

hoặc một nhóm methyl vào tương ứng với pyrocatechols hoặc axit
protocatechuic tương ứng. Các dioxygenase tấn cơng vịng thơm với sự hình
thành của các hợp chất 2-hydroxy-thay thế. Các chất trung gian của con
đường trên sau đó sẽ được khống hóa bởi sự phân tách ortho hoặc meta [24].
1.3. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC BIỆN PHÁP
SINH HỌC XỬ LÝ DUNG MƠI HỮU CƠ
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trong những giai đoạn đầu tiên, chủng VK Pseudomonas putida đã được
phát hiện có khả năng phát triển ở trong môi trường nuôi cấy chứa hơn 50%

(v/v) toluene hoặc nồng độ cao của cyclohexane, xylene, styrene và heptanol
[17], [18]. Tiếp theo đó, nghiên cứu của Aono chỉ ra VK Pseudomonas
aeruginosa cũng có khả năng kháng toluene [13].
Năm 2002, Lee EY cùng cộng sự đã nghiên cứu về khả năng phát triển
của Stenotrophomonas maltophilia T3-c trong mơi trường muối khống chứa
toluene, benzene (các chất này là nguồn carbon duy nhất). Lee EY đã khảo sát
các yếu tố ảnh hưởng như khối lượng cơ chất ban đầu, pH và nhiệt độ. Kết
quả thu được, trong phạm vi khối lượng toluene ban đầu (từ 23 đến 70pmol),
nồng độ toluene suy giảm ở khoảng pH rộng từ 5 đến 8. Tỷ lệ suy giảm ở 20
và 40°C lần lượt là 43%, ở 30°C là 83% [23].
Năm 2004, kết quả nghiên cứu của Carla A. N. cho thấy benzene còn bị
phân hủy sinh học bởi những VK ưa mặn và có khả năng chịu mặn ở điều
kiện hiếu khí như chi Marinobacter spp. [15].
Năm 2008, Ajiraporn Kongpol đã phân lập và xác định đặc điểm của
Deinococcus geothermelis T27, là dịng VK ưa nhiệt có khả năng kháng với
dung môi hữu cơ và tồn tại với sự hiện diện nồng độ cao của các chất này
[21].


12

Năm 2013, Zhang và cộng sự đã công bố về khả năng phân hủy benzene,
toluene, ethybenzene và 0-xylene bởi VK Mycobacterium cosmeticum byf-4
[32].
Năm 2016, Padhi và Gokhle đã cho thấy Enterobacter cloacae SG208 có
khả năng phân hủy benzene. Với pH tối ưu là 7,05, nồng độ benzene 332,82
mg/l. Tỉ lệ tăng trưởng và tốc độ phân hủy ước tính tối đa là 0,05 l/giờ và 6,01
mg/l [26].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 2010, Vũ Thành Công đã phân lập được 20 dịng VK có khả năng

kháng 1% benzene trở lên. Trong đó có 4 dịng cho hoạt tính enzyme
protease, amylase, cellulase và lipase rất mạnh so với đối chứng dương là
Bacillus subtilis [3].
Cùng năm đó, Huỳnh Thị Thanh Lan đã nghiên cứu bố trí hệ thống xử lý
liên tục, yếm khí, có sự tham gia của màng sinh học. Kết quả chỉ ra rằng với
mật độ VSV dị dưỡng từ 105 đến 106 CFU/ml, thời gian lưu của nước thải
trong hệ thống là 8 giờ và lưu tốc của hệ thống là 0.006m/ngày thì VSV đã sử
dụng nguồn C từ benzene có COD đầu vào khoảng 52.8 mg/l, tương đương
với 0.026ml benzene nguyên chất trong 1 lít nước [6].
Năm 2013, Võ Ngọc Thảo Nguyên phân lập được 9 dòng VK có khả
năng chịu nhiệt và sử dụng toluene như nguồn carbon duy nhất. Trong đó, 03
dịng với khả năng phân hủy nổi trội cũng như có khả năng tạo ra các enzyme
protease, lipase, amylase, cellulase trong 09 dòng VK đó đã được tuyển chọn
để giải trình tự gen 16S rRNA đã định danh là ba dòng VK là Bacillus
licheniformis, Bacillus subtilis, Acinetobacter sp. [8].
Các nghiên cứu về phân hủy dung môi hữu cơ của nước ta hiện nay vẫn
chưa nhiều. Từ những luận giải khoa học trên đây cho thấy rằng việc nghiên
cứu phân lập và tuyển chọn ra các chủng VSV có khả năng phân hủy benzene
là việc mang tính thời sự.


13

1.4. ĐẶC ĐIỂM TỰ NHIÊN KHU VỰC NGHIÊN CỨU
1.4.1. Vị trí địa lý, địa hình
Vị trí địa lý: Tọa độ phần đất liền của thành phố Đà Nẵng từ 15°15' đến
16°40' vĩ độ Bắc và từ 107°17' đến 108°20' kinh độ Đơng. Phía Bắc giáp tỉnh
Thừa Thiên - Huế, phía Tây và Nam giáp tỉnh Quảng Nam, phía Đơng giáp
biển Đông.
Thành phố Đà Nẵng nằm trên trục giao thông Bắc – Nam về đường bộ,

đường sắt, đường biển và đường hàng không, là một trong những cửa ngõ
quan trọng ra biển của Tây Nguyên và các nước Lào, Đông Bắc Campuchia,
Thái Lan và Myanma [36].
Địa hình: Địa hình thành phố Đà Nẵng vừa có đồng bằng duyên hải, vừa
có đồi núi. Vùng núi cao và dốc tập trung ở phía tây và tây bắc, từ đây có
nhiều dãy núi chạy dài ra biển, một số đồi thấp xen kẽ vùng đồng bằng ven
biển hẹp. Địa hình đồi núi chiếm diện tích lớn, độ cao khoảng từ 700 – 1500
m, độ dốc lớn (>40o), là nơi tập trung nhiều rừng đầu nguồn và có ý nghĩa bảo
vệ mơi trường sinh thái của thành phố. Đồng bằng ven biển là vùng đất thấp
chịu ảnh hưởng của biển bị nhiễm mặn, là vùng tập trung nhiều cơ sở nông
nghiệp, công nghiệp, dịch vụ, quân sự, đất ở và các khu chức năng của thành
phố [36].
1.4.2. Đặc điểm khí hậu
Đà Nẵng nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa điển hình, nhiệt độ
cao và ít biến động. Khí hậu Đà Nẵng là nơi chuyển tiếp đan xen giữa khí hậu
cận nhiệt đới ở miền Bắc và nhiệt đới xavan miền Nam, với tính trội là khí
hậu nhiệt đới ở phía Nam. Mỗi năm có 2 mùa rõ rệt: mùa mưa kéo dài từ
tháng 8 đến tháng 12 và mùa khô từ tháng 1 đến tháng 7, thỉnh thoảng có
những đợt rét mùa đơng nhưng khơng đậm và khơng kéo dài. Nhiệt độ trung
bình hàng năm khoảng 25,9°C; cao nhất vào các tháng 6, 7, 8, trung bình 28 –


14

30°C; thấp nhất vào các tháng 12, 1, 2, trung bình 18 - 23°C. Độ ẩm khơng
khí trung bình là 83,4%. Lượng mưa trung bình hàng năm là 2504,57 mm
[36].