Cải biến và thiết kế vector biểu hiện các gen cry1Ia có hoạt tính kháng sâu đục quả đậu tương etiella zinkenella

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

CẢI BIẾN VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CÁC GEN
cry1Ia CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG SÂU ĐỤC QUẢ ĐẬU
TƯƠNG Etiella zinkenella
Nguyễn Hữu Kiên1, Nguyễn Thị Hòa1, Lê Thị Mai Hương1,
Nguyễn Trung Anh1, Nguyễn Tuấn Minh1, Đinh Thị Mai Thu1,
Tống Thị Hường1, Đinh Thị Thu Ngần1, Nguyễn Nhất Linh1,
Nguyễn Anh Vũ1, Lê Thị Thu Hiền2, Nguyễn Văn Đồng1*
TÓM TẮT
Đậu tương (Glycine max L.) là một trong những cây trồng quan trọng có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, năng
suất và chất lượng đậu tương bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi sự gây hại của sâu đục quả Etiella zinkenella
Treitschke. Hiện nay, mặc dù có nhiều nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của độc tố Cry tới sâu đục quả
trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau, nhưng trên cây đậu tương còn hạn chế. Trong nghiên cứu này,
đã cải biến thành công gen cry1Ia đồng thời thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện gen cry1Ia dạng dại và cải
biến từ chủng Bacillus thuringiensis TH19 phân lập ở Việt Nam. Nghiên cứu này cung cấp các vật liệu phục
vụ cho việc chuyển gen cry1Ia dạng dại và cải biến vào cây đậu tương nhằm tăng khả năng kháng sâu đục
quả Etiella zinkenella.
Từ khóa: Bacillus thuringiensis, cry1Ia, đậu tương, Etiella zinkenella, vector pZY101-Asc.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ 4
Đậu tương ( Glycine max L.) là cây trồng
ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Hạt đậu tương có
hàm lượng dầu và protein cao là nguồn cung cấp
nguyên liệu cho công nghiệp chế biến thực phẩm và
thức ăn chăn ni. Ngồi ra, cây đậu tương cịn có
khả năng cải tạo đất hiệu quả nên được ưu tiên trong
các công thức luân canh với các cây trồng khác
(Erickson, 2008; Morrison et al., 2017; Mourtzinis et
al., 2017). Tại Việt Nam, đậu tương là cây thực phẩm
có vai trị quan trọng nhưng năng suất còn thấp, chưa

thể đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước.
Những năm gần đây, diện tích cũng như sản lượng
đậu tương của nước ta có xu hướng giảm mạnh
(Gain, 2018; FAOSTAT, 2019). Một trong những
nguyên nhân làm ảnh hưởng đến năng suất và chất
lượng đậu tương là do sự phá hoại của sâu, bệnh hại.
Trong đó, sâu đục quả Etiella zinkenella Treitschke là
côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera) được biết
tới là đối tượng phân bố rộng khắp trên thế giới và gây
hại trên nhiều loài cây trồng khác nhau, đặc biệt quả

1

Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp
Việt Nam
2
Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam
Email:

đậu tương non là nguồn thức ăn ưa thích của chúng
(Berg et al., 1998).
Để đối phó với sâu đục quả gây hại trên cây trồng,
các phương pháp phòng trừ sâu hại như sử dụng thuốc
trừ sâu hóa học, sinh học và cơn trùng thiên địch được
áp dụng phổ biến trên thế giới (Kumar et al., 2008;
Tabata et al., 2008; USDA, 2012). Trong đó, việc tạo ra
các giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu nói
chung và kháng sâu đục quả nói riêng bằng các kỹ
thuật di truyền và chuyển gen thực vật đã và đang

được đặc biệt quan tâm nhằm nâng cao năng suất, chất
lượng hạt và giảm mức độ thiệt hại do côn trùng; đồng
thời khắc phục được những hạn chế khi sử dụng các
biện pháp trừ sâu hóa học cũng như các biện pháp sinh
học truyền thống.
Hiện nay, có rất nhiều các gen kháng sâu có giá trị
để chuyển vào cây trồng có nguồn gốc từ động vật, thực
vật và vi sinh vật. Trong đó, các gen cry được phân lập từ
các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) là đối
tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân
gây độc tố đối với cơn trùng. Nhóm các gen cry1 mã hóa
cho protein Cry1 được biết tới là một trong 6 nhóm gen
cry chính có hoạt tính diệt cơn trùng bộ cánh vảy
(Crickmore et al., 2013).
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi (số liệu chưa
công bố) đã chỉ ra rằng, protein Cry1Ia thu được khi
biểu hiện gen cry1Ia trong vi khun Escherichia coli

Nông nghiệp và phát triển nông thôn - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020

29


KHOA HỌC CƠNG NGHỆ
(E. coli) có khả năng diệt sâu đục quả đậu tương ở điều
kiện nhân tạo. Trên cơ sở đó, nghiên cứu này đã tiến
hành sửa đổi gen cry1Ia dạng dại nhằm tạo sự tương
thích với hệ gen của cây đậu tương và thiết kế các cấu
trúc vector biểu hiện thực vật mang gen cry1Ia dạng
dại và cải biến để phục vụ cho việc tạo cây chuyển gen

đậu tương có khả năng kháng sâu đục quả bằng
chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu

Hình 1. Các vector sử dụng

Chú thích: A, Cấu trúc vector pRTL2; B, Cấu trúc
vector biểu hiện thực vật pZY101-Asc
Gen cry1Ia dạng dại được nhóm nghiên cứu của
Viện Nghiên cứu Hệ gen phân lập từ chủng vi khuẩn
Bt TH19 của Việt Nam và nhân dịng trong vector
pJET1.2. Vector pRTL2 và pZY101-Asc (Hình 1) do
Trung tâm Quốc gia Công nghệ sinh học – Trường
Đại học Missouri, Hoa Kỳ cung cấp. Các cấu trúc
vector tách dòng, vector biểu hiện và chủng vi khuẩn
E. coli Top10 được lưu giữ tại Phịng thí nghiệm
Trọng điểm Cơng nghệ tế bào thực vật – Viện Di
truyền nông nghiệp.

2.2.1. Cải biến gen cry1Ia
Tỷ lệ phần trăm các bộ ba mã hóa tối ưu cho các
gen trong cây đậu tương trên trang web
( được sử dụng cho
sửa đổi các bộ ba mã hóa của gen cry1Ia trên cơng cụ
OPTIMIZER
( />
2.2.2. Tổng hợp nhân tạo và tách dòng gen
cry1Ia cải biến

Gen cry1Ia cải biến có kích thước 2160 bp được
chia thành những đoạn ngắn ~75 nucleotide và được
tổng hợp trên nền frit tổng hợp gen theo cơng nghệ
của Cơng ty Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam).
Tiếp theo, đoạn DNA của gen cry1Ia cải biến được
khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi 1Iacb-SytF/1Iacb-Syt-R trong đó có 25 nucleotide tương đồng
với 2 đầu biên của vector pUC19 (Bảng 1) bằng
enzyme Phusion™TM High-Fidelity DNA Polymerase
(Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) với điều kiện
phản ứng và chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà
sản xuất. Sản phẩm PCR được tinh sạch trực tiếp
bằng kít PCR Purification (Jena Bioscience, Đức) và
sử dụng cho phản ứng nối vào vector pUC19 (đã xử
lý bằng enzyme giới hạn SmaI trước đó) theo quy
trình eClone của Cơng ty Sinh hóa Phù Sa, với thành
phần phản ứng: Vector pUC19 100 ng, sản phẩm PCR
300 ng, dung dịch đệm eClone 1,5 µlL enzyme
eClone 1,0 µL và nước cất 2 lần với tổng thể tích 15
µL. Phản ứng được ủ ở 37oC 15 phút và đặt trên đá để
sử dụng cho biến nạp vào vi khuẩn E. coli Top10 theo
phương pháp sốc nhiệt đã được trình bày trước đó
(Froger và Hall, 2007).

2.2. Phương pháp nghiên cứu
Bảng 1. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu
STT
1

30

Tên mồi
1Iacb-Syt-F

Trình tự (5’-3’)

2

1Iacb-Syt-R

3
4
5

pUC19-F
pUC19-R
1Iacb-Seq

CCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCTAATAGCGG
CCGCATGAAGCTTAAGA
TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCATAACTCG
AGCTACATATTTCTTTCTATGTGT
CAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC
ATTTCACACAGGAAACAGCTATGA
GCGTCCATTTTTGGCAAAGAATG

6
7
8

1Iawt-NcoI-F

1Iawt-SmaI-R
1Iacb-NcoI-F

GTGCAG CCATGG ATGAAACTAAAGAATC
ATATT CCCGGG CTACATGTTACGCTC
AATA CCATGG ATGAAGCTTAAGAATC

Vai trò
Cặp mồi sử dụng cho tổng hợp gen

cry1Aa cải biến

Cặp mồi của vector tách dòng
pUC19
Mồi sử dụng cho giải trình tự của
gen cry1Ia cải biến
Cặp mồi cho tách dòng gen cry1Ia
dạng dại
Cặp mồi cho tách dòng gen cry1Ia

Nông nghiệp và phát triển nông thôn - K 1 - TH¸NG 11/2020


KHOA HỌC CƠNG NGHỆ
9
10
11

1Iacb-SmaI-R AA CCCGGG CTACATATTTCTTTCTATG
35S-F

CTTCGCAAGACCCTTCCTC
pRTL2-R
ACTGGTGATTTTTGCGGACT

cải biến
Mồi xi từ vùng promoter 35S và
mồi ngược từ vùng kết thúc pRTL2
được sử dụng cho giải trình tự
TTCGCATTGCTAGAAAAACTTTGATGCTTA
Cặp mồi cho giải trình tự gen cry1Ia
dạng dại
ATAGTTAAATACGCGAAGCAACTCCA
GCGTTAGAGGAAAAACTCTGATGTTTATCTTGA Cặp mồi cho giải trình tự gen cry1Ia
cải biến
AAGTACGCGAAGCAACTACACATAGAA

12
13
14
15

Seq_1Iawt-R
Seq_1Iawt-F
Seq_1Iacb-R
Seq_1Iacb-F

Sau đó, dịch khuẩn được cấy trải lên đĩa mơi
trường LB đặc có bổ sung 100 mg/L kháng sinh
Ampicillin và nuôi qua đêm ở 37oC. Các khuẩn lạc
của vector tái tổ hợp pUC19:cry1Ia cải biến mọc trên

đĩa môi trường có chứa kháng sinh được lựa chọn để
kiểm tra bằng PCR bằng cặp mồi pUC19-F/R (Bảng
1) sử dụng kít PCR EZ mix-tracking dye (Cơng ty
Sinh hóa Phù Sa, Việt Nam) theo hướng dẫn nhà sản
xuất. Các khuẩn lạc dương tính với PCR được lựa
chọn đem ni tăng sinh khối trong mơi trường LB
lỏng có bổ sung 100 mg/L Ampicillin ở 37oC qua
đêm và tách chiết DNA plasmid sử dụng kít Fast-nEasy Plasmid Mini-Prep (Jena Bioscience, Đức).
DNA plasmid của các khuẩn lạc được sử dụng để giải
trình tự với các mồi pUC19-F/R và 1Iacb-Seq (Bảng
1).

2.2.3. Tạo vector biểu hiện thực vật mang gen
cry1Ia dạng dại và cải biến
2.2.3.1. Gắn đoạn gen cry1Ia dạng dại và cải biến
vào vector pRTL2
Để tiến hành thiết kế vector chuyển gen mang
gen cry1Ia dạng dại và cải biến quan tâm, các đoạn
gen cry1Ia dạng dại và cải biến được nhân lên bằng
PCR từ DNA plasmid của các vector tách dịng có
chứa các đoạn gen Cry1Ia quan tâm sử dụng
PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase với các
cặp mồi đặc hiệu cho gen cry1Ia dạng dại 1IawtNcoI-F/1Iawt-SmaI-R và cải biến 1Iacb-NcoI-F/1IacbSmaI-R (Bảng 1) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sản phẩm PCR được cắt với 2 enzyme giới hạn NcoI
và SmaI (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) và kiểm
tra bằng điện di trên gel agarose 1 , sau đó được tinh
sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen,
Đức). Sản phẩm tinh sạch của các đoạn gen cry1Ia
dạng dại và dạng cải biến được sử dụng cho phản
ứng ghép nối với vector pRTL2 (đã xử lý với 2

enzyme giới hạn NcoI và SmaI) bằng T4 DNA ligase
(Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn
của nhà sản xuất.

2.2.3.2. Chọn lọc các dòng tế bào tái tổ hợp mang
gen cry1Ia dạng dại và cải biến bằng PCR
Sản phẩm của phản ứng ghép nối được sử dụng
để biến nạp vào vi khuẩn E. coli Top10 bằng phương
pháp sốc nhiệt. Tiếp theo, dịch khuẩn được cấy trải
lên đĩa mơi trường LB đặc có bổ sung 100 mg/L
kháng sinh Ampicillin và nuôi ở 37oC qua đêm. Các
khuẩn lạc của vector tái tổ hợp pRTL2:cry1Aa dạng
dại và cải biến mọc trên đĩa mơi trường có chứa
kháng sinh được lựa chọn để kiểm tra trực tiếp bằng
PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho gen cry1Ia dạng
dại (1Iawt-NcoI-F/1Iawt-SmaI-R) và cải biến (1IacbNcoI-F/1Iacb-SmaI-R) (Bảng 1) sử dụng kit PCR EZ
mix-tracking dye. Sản phẩm PCR được chạy điện di
kiểm tra trên gel agarose 1  .

2.2.3.3 Giải trình tự gen
Các khuẩn lạc dương tính với các cặp mồi đặc
hiệu cho gen cry1Ia dạng dại và cải biến được lựa
chọn đem nuôi tăng sinh khối trong mơi trường LB
lỏng có bổ sung 100 mg/L Ampicillin ở 37oC qua
đêm và tách chiết DNA plasmid sử dụng kit Fast-nEasy Plasmid Mini-Prep. DNA plasmid của các cấu
trúc vector tái tổ hợp pRTL2:cry1Ia dạng dại và cải
biến được sử dụng giải trình tự với cặp mồi 35SF/pRTL2-R; thêm vào đó, đối với cấu trúc của dạng
dại sử dụng thêm cặp mồi Seq_1Iawt-F/Seq_1Iawt-R
và dạng cải biến sử dụng cặp mồi Seq_1Iacb-F/
Seq_1Iacb-R (Bảng 1).

2.2.3.4. Gắn đoạn gen cry1Ia dạng dại vào vector
biểu hiện thực vật pZY101-Asc
DNA plasmid của vector pRTL2: cry1Ia dạng dại
và cải biến sau khi giải trình tự kiểm tra được cắt với
enzyme giới hạn HindIII. Sản phẩm cắt của cấu trúc
35S:cry1Ia dạng dại và cải biến được xử lý tạo đầu
bằng với T4 DNA polymerase. Tiếp theo, sản phẩm
tinh sạch của các cấu trúc 35S:cry1Ia dạng dại và cải
biến được sử dụng cho phản ứng ghép nối với vector
pZY101-Asc (đã được cắt với enzyme giới hạn HindIII
và xử lý đầu bằng) bằng enzyme T4 DNA ligase. Sản
phẩm ghộp ni ca vector pZY101-Asc v cỏc on

Nông nghiệp và phát triển nông thôn - K 1 - THáNG 11/2020

31


KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

35S:cry1Ia dạng dại và cải biến được sử dụng để biến
nạp vào vi khuẩn E. coli Top10 bằng phương pháp
sốc nhiệt. Dịch khuẩn được cấy trải lên đĩa mơi
trường LB đặc có bổ sung kháng sinh Spectinomycin
50 mg/L và Streptomycin 50 mg/L và nuôi ở 37oC
qua đêm. Các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp
pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải biến mọc trên đĩa
mơi trường LB có chứa kháng sinh được lựa chọn để
kiểm tra trực tiếp bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu

cho gen cry1Ia dạng dại (1Iawt-NcoI-F/1Iawt-SmaIR) và cải biến (1Iacb-NcoI-F/1Iacb-SmaI-R) (Bảng 1)
sử dụng kít PCR EZ mix-tracking dye. Cuối cùng, sản
phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel
agarose 1 .
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Cải biến gen cry1Ia

thể khác nhau đáng kể giữa các sinh vật. Điều này
thực tế là do các bộ ba ưa thích có liên quan tới sự dư
thừa của các tRNA nhận diện có sẵn trong tế bào.
Khi một gen ngoại lai được biểu hiện trong một sinh
vật khơng phải là vật chủ, các trình tự có thể chứa
các yếu tố hạn chế sự biểu hiện và các bộ ba có tần
suất thấp trong sinh vật sẽ bị loại bỏ. Có một mối
tương quan nhất định giữa tần số của các bộ ba hiếm
và mức độ biểu hiện protein ngoại lai. Do đó, chúng
ta có thể hiểu rằng sự xuất các bộ ba hiếm, đặc biệt
tại đầu N- của protein nên được tránh trong việc thiết
kế các gen ngoại lai. Như vậy, một gen quan tâm có
thể được tổng hợp bằng cách thay thế các bộ ba
không được sử dụng thường xuyên bằng các bộ ba
được ưa thích trong cây đậu tương mà khơng làm
thay đổi trình tự axit amin của protein chức năng
(Hudson et al., 2011; Murray et al., 1989; Zhang et al.,
2011).

Trên thực tế, việc biểu hiện một protein chức
năng ở bên ngoài vật chủ tự nhiên của nó gặp rất
Trong nghiên cứu này, để có thể cải biến gen
nhiều trở ngại. Trong đó, thơng tin di truyền được

cry1Ia thích hợp cho việc chuyển gen vào cây đậu
mã hóa trong khung đọc mở khơng đơn giản chỉ là
tương, đã sử dụng công cụ OPTIMIZER
thứ tự của các axit amin trong protein và các sinh vật
( kết hợp với
khác nhau thường thể hiện sự ưa thích đặc biệt với
tỷ lệ phần trăm các bộ ba mã hóa tối ưu cho các gen
một số bộ ba khác nhau mã hóa cho cùng một axit
trong
cây
đậu
tương
amin khi tạo ra protein chức năng. Hiện tượng này
( là sự sai lệch về bộ ba mã hóa và được xác định là
bin/showcodon.cgi?species=3847) để tiến hành
một yếu tố quan trọng trong biểu hiện gen. Mức độ
chỉnh sửa gen cry1Ia dạng dại ban đầu.
các bộ ba nhất định xuất hiện trong mã di truyền có
Bảng 2. Kt qu ci bin gen cry1Ia

32

Nông nghiệp và phát triển nông thôn - K 1 - THáNG 11/2020


KHOA HC CễNG NGH

Nông nghiệp và phát triển nông thôn - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020

33

KHOA HC CễNG NGH

34

Nông nghiệp và phát triển nông thôn - KỲ 1 - TH¸NG 11/2020


KHOA HỌC CƠNG NGHỆ

(Chú thích: *: thay đổi Purines <-> Pyrimidines; #: thay đổi Purine <-> Purine hoặc Pyrimidine <->
Pyrimidine; aa: amino acid; 1Ia-wt: cry1Ia dạng dại; 1Ia-cb: cry1Ia cải biến)
Kết quả cho thấy, gen cry1Ia cải biến có sự thay của gen cry1Ia cải biến tăng lên 43,9  so với 36,6 
đổi về nucleotide ở một số bộ ba mã hóa axit amin của gen cry1Ia dạng dại ban đầu (Bảng 2).
trong chuỗi trình tự DNA nhưng khơng có sự thay
Sự thay đổi về các nucleotide của các bộ ba mã
đổi về chiều dài trình tự DNA so với gen cry1Ia dạng hóa đã dẫn tới sự thay đổi về số lượng các bộ ba mã
dại (2160 bp) và cùng mã hóa cho 720 axit amin hóa giữa gen cry1Ia cải biến so với dạng dại ban đầu
giống nhau. Cụ thể, gen cry1Ia cải biến đã có 264 sự trong tổng số 64 bộ ba mã hóa cho 20 axit amin. Cụ
tráo đổi vị trí của Purines cho Pyrimidines và ngược thể, bộ ba CTC mã hóa cho Leucine (L) đã tăng
lại so với dạng dại, trong khi đó có 255 sự thay đổi nhiều nhất với 15 lần, từ có 3 ở cry1Ia dạng dại lên 18
giữa các Purine với Purine hoặc Pyrimidine với ở cải biến, ngược lại bộ ba GTA mã hóa cho Valine
Pyrimidine với nhau ở gen cry1Ia cải biến so với (V) giảm nhiều nhất với 20 lần từ có 22 ở dạng dại
dạng dại ban đầu. Sự thay đổi này diễn ra ở tất cả các xuống 2 ở cải biến; trong khi đó, có bộ ba ATG mã
vị trí của bộ ba (vị trí nucleotide đầu tiên, thứ hai, hóa cho Methionine (M), GGG mã hóa cho Glycine
hoặc thứ ba); ngồi ra, có trường hợp sự thay đổi (G), TGG mã hóa cho Trytophan (W) và bộ ba kết
nucleotide xảy ra ở cả 2 hoặc 3 vị trí của bộ ba mã thúc TAG là khơng có sự thay đổi giữa dạng dại và
hóa. Chính sự thay đổi này, đã dẫn đến tỷ lệ   GC cải biến (Bảng 3).
Bảng 3. Các bộ ba mã hóa cho gen cry1Ia ở dạng dại và cải biến

Các bộ
Các bộ ba cry1I cry1I Các bộ ba cry1 cry1Ia- Các bộ ba cry1 cry1Iacry1Ia cry1Iaba
mã
mã hóa a-wt a-cb mã hóa
Ia-wt cb
mã hóa
Ia-wt cb
-wt
cb
hóa
GCA (A) 22

10

GCC (A)

6

12

GCG (A)

4

5

GCT (A) 12

17

TGC (C) 0

1

TGT (C)

2

1

GAC (D)

8

13

GAT (D) 26

21

GAA (E) 28

25

GAG (E)

15

18

TTC (F)

13

19

TTT (F) 24

18

GGA (G) 21

10

GGC (G) 2

12

GGG (G) 7

7

GGT
(G)

15

CAC (H) 0

9

CAT (H)

19

10

ATA (I)

12

11

ATC (I) 7

11

ATT (I)

20

AAA (K)

23

21

AAG (K)

8

10

TTA (L) 27

8

23

Nông nghiệp và phát triển nông thôn - K 1 - TH¸NG 11/2020

14

35


KHOA HỌC CÔNG NGHỆ
TTG (L) 8

10

CTA (L)

CTT (L)

8

CTC (L)

3

18

CTG (L) 3

5

13

ATG (M) 11

11

AAC (N)

10

21

AAT (N) 37

26

CCA (P) 14

9

CCC (P)

0

8

CCG (P)

7

3

CCT (P) 8

9

CAA (Q) 24

18

CAG (Q)

5

11

AGA (R)

13

12

AGG (R) 6

10

CGA (R) 8

4

CGC (R)

2

4

CGG (R)

0

2

CGT (R) 6

3

AGC (S) 7

6

AGT (S)

14

14

TCA (S)

17

8

TCC (S) 1

11

TCG (S) 2

7

TCT (S)

20

15

ACA (T)

31

18

ACC (T) 4

16

ACG (T) 8

4

ACT (T)

15

20

GTA (V)

22

2

GTC (V) 5

11

GTG (V) 6

16

GTT (V)

14

18

TGG (W) 12

12

TAC (Y) 3

13

TAT (Y)

19

TAA (.)

0

0

TGA (.)

0

TAG (.) 1

1

7

29

14

Ngồi ra, khi phân tích các vùng bảo thủ
(conserved domains) của cả gen cry1Ia dạng dại và
cải biến đều cho thấy sự tương đồng về vùng bảo thủ
endotoxin_N, endotoxin_M, và delta_endotoxin_C
của chúng (Hình 2). Điều này cho thấy, gen cry1Ia

0

dạng dại và cải biến tuy có sự sai khác về các bộ ba
mã hóa nhưng trình tự và đặc tính của protein cry1Ia
khơng thay đổi. Gen cry1Ia dạng dại và cải biến được
sử dụng để thiết kế các vector biểu hiện thực vật
phục vụ công tác chuyển gen vào cây đậu tương.

Hình 2. Kết quả phân tích các vùng bảo thủ của gen cry1Ia dạng dại và cải biến
3.2. Tổng hợp nhân tạo và tách dòng gen cry1Ia lần lượt vào phía trước đầu 5’ và 3’ được tổng hợp
nhân tạo theo quy trình và phương pháp của Cơng ty
cải biến
Sinh hóa Phù Sa. Sản phẩm khuếch đại của gen
cry1Ia cải biến sau khi tổng hợp nhân tạo được gắn
vào vector pUC19. Tiếp theo, vector tách dòng
pUC19 có chứa đoạn gen cry1Ia cải biến được biến
nạp vào E. coli. Các khuẩn lạc mọc trên đĩa môi
trường LB đặc có chứa 100 mg/L kháng sinh
Ampicillin được lựa chọn để kiểm tra bằng PCR với

cặp mồi pUC19-F/R (Bảng 1).

Hình 3. Kết quả tách dịng gen cry1Ia cải biến

Chú thích: (A) Kết quả PCR khuẩn lạc của
vector tách dòng pUC19 chứa gen cry1Ia cải biến. M,
PSA DNA Ladder; 1-12: sản phẩm PCR của 12 khuẩn
lạc
Gen cry1Ia sau khi cải biến thành cơng và bổ
sung thêm vị trí của enzyme giới hạn NcoI và SmaI

36

Kết quả PCR khuẩn lạc cho thấy, trong tổng số
12 khuẩn lạc đã được lựa chọn có 3 khuẩn lạc cho kết
quả dương tính với cặp mồi của vector pUC19 và có
kích thước khoảng 2100 bp tương ứng với kích thước
dựa đốn của gen cry1Ia cải biến ban đầu (Hình 3).
Các khuẩn lạc dương tính với PCR được sử dụng để
giải trình tự. Kết quả cho thấy, cả 3 khuẩn lạc có
chứa plasmid tái tổ hợp với vựng trỡnh t hon ton

Nông nghiệp và phát triển nông thôn - K 1 - THáNG 11/2020


KHOA HỌC CƠNG NGHỆ
chính xác của gen cry1Ia cải biến đã thiết kế ban đầu
(Bảng 2).
3.3. Thiết kế vector biểu hiện mang gen cry1Ia
dạng dại và cải biến

Để thiết kế vector biểu hiện mang các gen

cry1Ia quan tâm, đoạn gen cry1Ia dạng dại và cải
biến được nhân lên bằng kỹ thuật PCR từ DNA
plasmid của vector tách dịng có chứa các đoạn gen
tương ứng. Sản phẩm PCR của các đoạn gen cry1Ia
dạng dại và cải biến được xử lý với enzyme giới hạn
NcoI và SmaI và ghép nối vào vector pRLT2 (đã được
xử lý với enzyme giới hạn tương ứng) (Hình 1A và
4B). Sản phẩm của vector tái tổ hợp pRTL2:cry1Ia
dạng dại và cải biến được biến nạp vào E. coli và nuôi
qua đêm ở 37oC trên đĩa môi trường LB có bổ sung
100 mg/L kháng sinh Ampicillin. Các khuẩn lạc mọc
trên đĩa LB được lựa chọn để kiểm tra PCR với các
cặp mồi đặc hiệu cho gen cry1Ia dạng dại và cải biến
(Bảng 1).

PCR gen cry1Ia cải biến từ DNA plasmid
pUC19:cry1Ia cải biến. (C) Kết quả cắt vector pRTL2
bằng 2 enzyme giới hạn NcoI và SmaI. (D) Kết quả
PCR gen cry1Ia dạng dại từ khuẩn lạc của vector
pRTL2:cry1Ia dạng dại. (E) Kết quả PCR gen cry1Ia
cải biến từ khuẩn lạc của vector pRTL2:cry1Ia cải biến.
(F) Cấu trúc cassette của 35S:cry1Ia dạng dại và cải
biến. p1, DNA plasmid của vector pJET1.2:cry1Ia dạng
dại; -, đối chứng âm H2O; M1, GeneRuler 1kb DNA
ladder; M2, 1Kb DNA Ladder; p2, DNA plasmid của
vector pUC19:cry1Ia cải biến; p3, Vector pRTL2; 1-4,
Khuẩn lạc của vector pRTL2:cry1Ia dạng dại; +1, Đối
chứng dương từ DNA plasmid của vector

pJET1.2:cry1Ia dạng dại; +2, Đối chứng dương từ DNA
plasmid của vector pUC19:cry1Ia cải biến; 5-8, Khuẩn
lạc của vector pRTL:cry1Ia cải biến.
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, các
khuẩn lạc đều cho kết quả dương tính với gen cry1Ia
dạng dại và cải biến (Hình 4D-E). Như vậy, việc nối
đoạn gen cry1Ia dạng dại và cải biến vào vector
pRTL2 bước đầu đã thành công. Để kiểm tra lại sản
phẩm ghép nối vào vector pRTL2, các khuẩn lạc
dương tính được ni tăng sinh khối, tách chiết DNA
plasmid và giải trình tự.
Kết quả giải trình tự các khuẩn lạc của vector tái
tổ hợp pRTL2:cry1Ia dạng dại và cải biến cho thấy,
trình tự của gen cry1Ia dạng dại và cải biến hồn
tồn khơng có sự sai khác so với trình tự ban đầu và
các gen này cùng chiều và được điều khiển bởi
promoter 35S (Bảng 2; hình 4F).

Hình 5. Kết quả thiết kế vector pZY101:35S:cry1Ia
dạng dại và cải biến
Hình 4. Kết quả khuếch đại gen cry1Ia dạng dại và cải
biển và xử lý vector pRLT2 bằng enzyme giới hạn

Chú thích: (A) Kết quả PCR gen cry1Ia dạng dại
từ DNA plasmid pJET1.2:cry1Ia dạng dại. (B) Kết quả

Chú thích: (A) Kết quả cắt vector pZY101-Asc
bằng enzyme giới hạn HindIII. (B) Kết quả PCR gen
cry1Ia dạng dại từ khuẩn lạc của vector
pZY101:35S:cry1Ia dạng dại. (C) Kết quả PCR gen

Nông nghiệp và phát triển nông thôn - K 1 - TH¸NG 11/2020

37


KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

cry1Ia cải biến từ khuẩn lạc của vector
pZY101:35S:cry1Ia cải biến. M, GeneRuler 1kb DNA
ladder; P, vector pZY101-Asc cắt; (-), Đối chứng âm
H2O; 1, Đối chứng dương từ DNA plasmid của vector
pJET1.2:cry1Ia dạng dại; 2-5, Khuẩn lạc của vector
pZY101:35S:cry1Ia dạng dại; 6, Đối chứng dương từ
DNA plasmid của vector pUC19:cry1Ia cải biến; 7-10,
Khuẩn lạc của vector pZY101:35S:cry1Ia cải biến.

biểu hiện của gen cry1Ia trong cây bông chuyển gen

Sau khi chuyển thành công đoạn gen cry1Ia

trong nghiên cứu này đã tiến hành cải biến gen

dạng dại và cải biến vào vector pRTL2, các cấu trúc

35S:cry1Ia dạng dại và cải biến được cắt từ từ vector

cry1Ia từ dạng dại ban đầu được phân lập từ chủng
Bt TH19 ở Việt Nam và thiết kế thành công các

tái tổ hợp pRTL2:cry1Ia dạng dại và cải biến bằng

vector biểu hiện pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải

enzyme giới hạn HindIII và ghép nối vào vector biểu

biến. Với việc thiết kế thành công vector biểu hiện

hiện thực vật pZY101-Asc (cũng đã cắt mở vòng và

pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải biến này, hy vọng

xử lý ở cùng vị trí enzyme giới hạn) (Hình 1B và 5A)

rằng có thể sử dụng các cấu trúc véc tơ này để tạo

bằng enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm nối của

các giống đậu tương chuyển gen không chỉ được

vector tái tổ hợp pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải

tăng cường khả năng tiêu diệt sâu đục quả mà còn cả

biến được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10

với các đối tượng sâu hại khác.

và nuôi qua đêm trên đĩa môi trường LB có bổ sung
kháng sinh Spectinomycin 50 mg/L và Streptomycin

50 mg/L ở 37oC. Các khuẩn lạc mọc trên mơi trường
LB có bổ sung kháng sinh được lựa chọn để kiểm tra
bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu 1Iawt-NcoIF/1Iawt-SmaI-R và 1Iacb-NcoI-F/1Iacb-SmaI-R cho
gen cry1Ia dạng dại và cải biến (Bảng 1).

đã giúp cho chúng có khả năng tiêu diệt một số lồi
sâu bọ cánh cứng đục quả và sâu keo mùa thu trên
cây bông (de-Oliveira et al., 2016; Silva et al., 2016;
Tounsi et al., 2003). Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu
đánh giá chức năng của độc tố do gen cry1Ia mã hóa
trên đối tượng sâu đục quả ở cây đậu tương. Do vậy,

4. KẾT LUẬN
Các kết quả trong nghiên cứu cho thấy, gen

cry1Ia dạng dại đã được cải biến bằng việc chỉnh sửa
các bộ ba mã hóa của các axit amin nhưng không
làm thay đổi cấu trúc và chức năng của protein
Cry1Ia dạng dại ban đầu. Các cấu trúc vector biểu
hiện pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải biến đã được

Kết quả cho thấy, hầu hết các khuẩn lạc đều cho

thiết kế thành công sẽ thích hợp cho biến nạp gen

kết quả dương tính với các cặp mồi đặc hiệu của gen

vào cây đậu tương nhằm tăng cường khả năng diệt

cry1Ia dạng dại và cải biến (Hình 5B-C). Như vậy, đã

sâu đục quả.

bước đầu thiết kế thành công vector biểu hiện

pZY101:35S:cry1Ia dạng dại và cải biến. Sau đó, các

LỜI CẢM ƠN

vector tái tổ hợp này tiếp tục được kiểm tra và biến

Cơng trình nghiên cứu được thực hiện trong

nạp vào các chủng vi khuẩn A. tumefaciens nhằm

khuôn khổ đề tài “Phân lập thiết kế gen kháng sâu

phục vụ cho công tác chuyển gen vào đậu tương.

tạo giống đậu tương biến đổi gen” theo Quyết định
số 4495/QĐ-BNN-KHCN ngày 31/10/2016 của Bộ

Hiện nay, sâu đục quả được biết tới là một trong
những loại côn trùng gây hại ảnh hưởng nghiêm
trọng tới các cây trồng quan trọng nói chung và cây
đậu tương nói riêng. Để đối phó với tình hình sâu hại
này, cho đến nay đã có nhiều các cơng trình nghiên

trưởng Bộ Nơng nghiệp và PTNT về việc Phê duyệt
danh mục các nhiệm vụ khoa học và cơng nghệ thực

hiện từ năm 2017 thuộc Chương trình CNSH Nông
nghiệp – Thủy sản.

cứu cho thấy các gen được phân lập từ các chủng vi

TÀI LIỆU THAM KHẢO

khuẩn Bt có khả năng diệt được loại sâu tương đối đa

1. Berg V. D., Shepard B. M., Nasikin (1998).

dạng. Trong đó, mt s nghiờn cu ch ra rng, s

38

Response

of

soybean

to

attack

by

stemfly

Nông nghiệp và phát triển nông thôn - K 1 - THáNG 11/2020

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ
Melagagromyza sofiae in farmers’ fields in Indonesia.

environment

friendly

insectpest

Journal of Applied Ecology, 35: 514-522.

strategy. J Environ Biol, 29(5):64-153.

management

2. Crickmore N., Zeigler D. R., Schnepf E., van

10. Morrison M. J., Cober E. R., Gregorich E. G.,

Rie J., Lereclus D., Baum J., Bravo A., Dean D. H.

Voldeng H. D., Ma B., Topp G. C. (2017). Tillage and

(2013). Bacillus thuringiensis Toxin Nomenclature.

crop rotation effects on the yield of corn, soybean,

Available

and wheat in eastern Canada. Can. J. Plant Sci, 98:

online:

esci.

183-191.

sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/.
3. de-Oliveira R. S., Oliveira-Neto O. B., Moura

11. Mourtzinis S., Marburger D., Gaska J., Diallo

H. F., de Macedo L. L., Arraes F. B., Lucena W. A.,

T., Lauer J. G., Conley S. (2017). Corn, soybean, and

Lourenco-Tessutti I. T., de Deus Barbosa A. A., da

wheat yield response to crop rotation, nitrogen rates,

Silva M. C., Grossi-de-Sa M. F. (2016). Transgenic

and foliar fungicide application. Crop Sci, 57: 983-992.

Cotton Plants Expressing Cry1Ia12 Toxin Confer

12. Murray E. E., Lotzer J., Eberle M. (1989).

Resistance

to

Fall

Armyworm

(Spodoptera

frugiperda) and Cotton Boll Weevil (Anthonomus

Codon usage in plant genes. Nucleic Acids Res,
17(2): 477-498.

grandis). Front Plant Sci, 7: 165.

13. Silva C. R., Monnerat R., Lima L. M., Martins

4. Erickson B (2008). Corn/soybean rotation

E. S., Melo Filho P. A., Pinheiro M. P., Santos R. C.

literature summary. Purdue Univ West Lafayetter IN.

(2016). Stable integration and expression of a cry1Ia

5. FAOSTAT (2019). Food and agriculture

gene conferring resistance to fall armyworm and boll

organization of the United Nations (FAO) statistical

weevil in cotton plants. Pest Manag Sci, 72(8): 1549-

databases,

1557.

Available

,

at:

Retrieved 10 august 2019.
6. Froger

(2007).

M., Noguchi H., Sugie H. (2008). Sex attractant

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the

pheromone of the limabean pod borer, Etiella

heat

shock

A.

14. Tabata J., Yokosuka T., Hattori M., Ohashi

and

Hall

J.

Journal

method.

E

of

visualized

zinckenella (Treitschke) (Lepidoptera: Pyralidae), in
Japan. Appl. Entomol. Zool, 43 (3): 351–358.

Vietnam—oilseeds and

15. Tounsi S., Zouari N., Jaoua S. (2003). Cloning

experiments, JoVE(6): 253-253.
7. Gain U

products

(2018).

annual

2018,

agricultural

and study of the expression of a novel cry1Ia-type

information network (Gain) report VM8018, USDA

gene from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. J

Gain, Hanoi, Vietnam.

Appl Microbiol, 95(1): 23-28.

Global

8. Hudson L., Bost K., Piller K. (2011).

16. USDA (2012). Field Release of Aphelinus

Optimizing Recombinant Protein Expression in

glycinis (Hymenoptera: Aphelinidae) for Biological

Soybean, Soybean - Molecular Aspects of Breeding,

Control of the Soybean Aphid, Aphis glycines

Aleksandra

DOI:

(Hemiptera: Aphididae), in the Continental United

from:

States. Environmental Assessment.

10.5772/15111.

Sudaric,

IntechOpen,
Available

/>
17. Zhang L., Guo Y., Luo L., Wang Y. P., Dong

molecular-aspects-of-breeding/optimizing-

Z. M., Sun S. H., Qiu L. J. (2011). Analysis of Nuclear

recombinant-protein-expression-in-soybean

Gene Codon Bias on Soybean Genome and

9. Kumar S., Chandra A., Pandey K. C. (2008).

Bacillus thuringiensis (Bt) transgenic crop: an

Transcriptome. Acta Agronomica Sinica, 37(6): 965974.

N«ng nghiƯp và phát triển nông thôn - K 1 - THáNG 11/2020

39


KHOA HỌC CÔNG NGHỆ
MODIFICATION AND CONSTRUCTION OF EXPRESSION VECTOR CARRYING cry1Ia
GENES CONFERRING RESISTANCE TO SOYBEAN POD BORER Etiella zinkenella
Nguyen Huu Kien1, Nguyen Thi Hoa1 , Le Thi Mai Huong1,
Nguyen Trung Anh1, Nguyen Tuan Minh1, Dinh Thi Mai Thu1,
Tong Thi Huong1, Dinh Thi Thu Ngan1 , Nguyen Nhat Linh1,
Nguyen Anh Vu1, Le Thi Thu Hien2 , Nguyen Van Dong1*
1
2

Agricultural Genetics Institute, Vietnam Academy of Agricultural Sciences

Institute of Genome Research, Vietnam Academy of Science and Technology
Email:
Summary

Soybean (Glycine max L.) is one of the most economically important crops. However, the yield and quality

of soybean are seriously affected by the infestation of pod borer Etiella zinkenella Treitschke. Recently,
numerous studies have evaluated effects of Cry toxin on pod borer Etiella zinkenella on different crops but
studying on soybean is still limited. In this study, we modified the cry1Ia gene and constructed the
expression vectors carrying the wild- and modified-cry1Ia genes from the isolated Bacillus thuringiensis
strain TH19 in Vietnam. Our present study provides materials for transforming the wild- and modifiedcry1Ia genes into soybean to increase resistance to pod borer Etiella zinkenella.
Keywords: Bacillus thuringiensis, cry1Ia, Etiella zinkenella, pZY101-Asc vector, soybean.

Người phản biện: PGS.TS. Hà Viết Cường
Ngày nhận bài: 19/5/2020
Ngày thơng qua phản biện: 19/6/2020
Ngày duyệt đăng: 26/6/2020

40

N«ng nghiƯp và phát triển nông thôn - K 1 - THáNG 11/2020