Luận văn thạc sĩ nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm đông trùng hạ thảo tuyết (isaria tenuipes) phân bố ở việt nam

i
LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành chương trình đào tạo cao học tại trường Đại học Lâm
nghiệp, nhằm vận dụng kiến thức đã học vào thực tiễn, làm quen với công tác
nghiên cứu khoa học và khả năng tổng hợp phân tích vấn đề, tác giả tiến hành
thực hiện Luận văn tốt nghiệp cao học.
Trong q trình thực hiện và hồn thiện luận văn, tác giả đã nhận được
nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và đóng góp của cán bộ Phịng nghiên cứu Bảo vệ
Thực vật rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Khoa đào tạo sau Đại
học - Trường Đại học Lâm nghiệp, từ gia đình và bạn bè đồng nghiệp. Tác giả
xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ đó. Đặc biệt tác giả muốn gửi lời
cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phạm Quang Thu, người thầy trực tiếp hướng
dẫn khoa học đã tận tình quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi và truyền đạt
những kiến thức quý báu trong suốt quá trình thực hiện.
Luận văn được hoàn thiện trên cơ sở tham khảo nhiều tài liệu có liên
quan và ý kiến đóng góp của nhiều nhà chuyên môn và sự nỗ lực của tác giả.
Tuy nhiên do khả năng, điều kiện và thời gian cịn hạn chế, chủ đề nghiên cứu
hồn tồn mới nên luận văn khơng tránh khỏi những thiếu sót. Tác giả rất
mong nhận được ý kiến đóng góp, xây dựng của các nhà khoa học cũng như
của bạn bè đồng nghiệp để Luận văn được hoàn thiện.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 3 năm 2013
Tác giả


ii
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn...................................................................................................... ..i
Mục lục.............................................................................................................ii

Danh mục các bảng.........................................................................................iv
Danh mục các hình............................................................................................v
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU...................................... ..2
1.1. Nghiên cứu ở ngoài nước...........................................................................2
1.1.1. Nghiên cứu về phân loại nhóm nấm Đơng trùng hạ thảo và nấm Đông
trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes).................................................................2
1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của I. tenuipes................................ 2
1.1.3. Nghiên cứu về giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo...............4
1.1.4. Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối hệ
sợi......................................................................................................................6
1.2. Nghiên cứu ở trong nước........................................................................... 7
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần loài các lồi nấm ký sinh cơn trùng và nấm
đơng trùng hạ thảo............................................................................................7
1.2.2. Nghiên cứu về giá trị dược liệu...............................................................8
1.2.3. Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối hệ
sợi......................................................................................................................9
Chương 2 MỤC TIÊU - ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU................................................................................................11
2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................ 11
2.2. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................. 11
2.3. Nội dung nghiên cứu................................................................................11
2.3.1. Phân lập các chủng nấm Isaria tenuipes ở Việt Nam...........................11
2.3.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong ni cấy thuần khiết.................... 11
2.3.3. Nghiên cứu hoạt tính của các chủng nấm.............................................11


iii
2.3.4. Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo...........11
2.4. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................12

2.4.1. Phương pháp phân lập..........................................................................12
2.4.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết.................... 12
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bênḥ của
chủng nấm Isaria tenuipes..............................................................................14
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu khảnăng hiǹ h thành thểquảtrên giáthể
nhân taọ...........................................................................................................15
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................16
3.1. Nghiên cứu đặc điểm hiǹ h thái, giải phẫu vàđặc điểm sinh trưởng của
chủng nấm Isaria tenuipes.............................................................................. 16
3.1.1. Kết quảđiều tra, phân lâpp̣ vànghiên cứu đăcp̣ điểm sinh trưởng các
chủng nấm Isaria tenuipes taị vườn Quốc gia Ba Vi.̀ .........................................16

3.1.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu nấm Isaria tenuipes...........19
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi cấy
thuần khiết.......................................................................................................20
3.2.1. Nghiên cứu xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu cho nhân sinh khối
hệ sợi...............................................................................................................20
3.2.2. Nghiên cứu xác định nhiêt độ khơng khí tối ưu cho q trình nhân sinh
khối hệ sợi.......................................................................................................25
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi ..
29

3.3. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bênḥ của
chủng nấm Isaria tenuipes.............................................................................. 33
3.3.1. Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nấm Isaria tenuipes....33
3.3.2. Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng nấm của nấm Isaria tenuipes......36
3.4. Nghiên cứu đánh giá khả năng hình thành thể quả trên giáthểnhân taọ. .40
3.4.1. Nghiên cứu đánh giá khả năng hình thành thể quả trên giá thểlỏng . 40
3.4.2. Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Isaria tenuipes trên nhộng tằm ..
50

KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ..........................................................54


TÀI LIỆU THAM KHẢO


iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
TT
1.1

1.2

1.3
3.1
3.2

3.3

Thành phần sinh hoá và nguyên
tenuipes

Thành phần acid amin trong nấ
tenuipes
Thành phần
tenuipes

Đặc điểm và kết quả phân lập c

Kết quả xác định môi trường di

sợi nấm Isaria tenuipes

Xác định nhiệt độ không khítối ưu

nấm

Sinh trương cua nấm I. tenuipes
3.4

3.5

3.6

3.7

3.8

3.9

̉̉

nhau

Đường kính vịng ức chế khu
tenuipes

Đường kính vịng ức chế nấm F
tenuipes

Xác định môi trường dinh dưỡn

nấm Isaria tenuipes

Kết quả xác định nhiệt độ không k

thể quả

Kết quả xác định nhiệt độ không k

thể quả


3.10

Kết quả nghiên cứu khả năng h

Isaria tenuipes trên giá thể nhộ


v

DANH MỤC CÁC HÌNH
TT
3.1

Hệ sợi nấm BV2

3.2

Hệ sợi nấm BV4

3.3

Hệ sợi nấm BV5

3.4

Hệ sợi nấm BV6

3.5

Hệ sợi nấm BV11

3.6

Hệ sợi nấm BV16

3.7

Hệ sợi nấm BV17

3.8

Thể quả nấm

3.9

Bào tử vơ tính
Sinh trương hê

3.10

3.11

̉̉

nhau
Sư ̣khac nhau vềđô ̣dầy hê
̉́

Trọng lương ̣ tươi hê ̣sơị ơ cac m
3.12

nhau

Trong ̣ lương ̣ khô hê ̣sơị ơ cac m
3.13
3.14

nhau

Sinh trương cua nấm ơ thang nh
̉̉

3.15

Trong ̣ lương ̣ tươi hệ sơi ơ cac n

3.16

Trong ̣ lương ̣ khô hệ sợi ơ cac n

3.17

3.18

Hê s ̣ ơị nấm nuôi cấy trên môi tr
nhau

Hê s ̣ ơị nấm nuôi cấy trên môi tr


nhau
3.19

Trọng lượng tươi hệ sợi ởpH m

3.20

Trọng lượng khô hệ sợi ởpH mơ

3.21

Đường kính vịng ức chế khu
tenuipes


vi

3.22

3.23

3.24

Khả năng kháng khuẩn Bacillus
tenuipes

Khả năng kháng khuẩn của nấm
chứng

Đường kính vịng ức chế nấm F
tenuipes

3.25 Khả năng kháng nấm của nấm I
3.26 Thểquảnấm ởCT2,CT4
3.27 Thểquảnấm ởCT5
Trong ̣ lương ̣
3.28

khac nhau
̉́

Trong ̣ lương ̣ khô thể quả ơ cac
3.29

nhau

3.30 Thể quả nấm ở các thang nhiệt
Trong ̣ lương ̣
3.31

nhau
Trong ̣ lương ̣

3.32

nhau

3.33 Thể quả nấm I. tenuipes trên cá

3.34 Trọng lượng khô thể quả ởpH m

3.35 Trọng lượng khô thể quả ởpH m
3.36 Hê s ̣ ơị nấm I. tenuipes
3.37 Thểquảnấm I. tenuipes


3.38 Thể quả nấm sau 20 ngày
3.39 Thể quả nấm sau 30 ngày
3.40 Thể quả nấm sau 35 ngày
3.41 Thu hoạch thể quả nấm


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nấm đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes (Peck.) Samson), tên
trước đây là (Paecilomyces tenuipes Peck.) là một lồi nấm dược liệu được
ni trồng và sử dụng lâu đời ở Hàn Quốc. Trong tự nhiên, loại nấm này tồn
tại ở hai giai đoạn: giai đoạn hữu tính có tên là Cordyceps takaomontana
Yakushiji, cịn giai đoạn vơ tính có tên là Isaria tenuipes Peck. Đây là một
lồi nấm có giá trị dược liệu quý, tác dụng chủ yếu trong điều trị và hỗ trợ

điều trị bệnh ung thư nhờ tác dụng về dược lý và sinh học của chúng. Một hợp
chất hóa học có hoạt tính sinh học có giá trị dược liệu chứa trong thể quả
ở giai đoạn hữu tính và ở giai đoạn vơ tính của lồi nấm này là 4-acetyl12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol (Oh, G.S. et.al. 2001). Đây là hợp
chất đang được dùng để điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh máu trắng ở
các nước trên thế giới, đặc biệt được sử dụng rộng rãi ở Hàn Quốc (Eiji
Yokoyama et al., 2003). Đây là một loài nấm dược liệu quý và lần đầu tiên
được mô tả và được ghi nhận cóphân bố ở Việt Nam. Qua các đợt điều tra,
Trung tâm nghiên cứu bảo vệ rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã
thu được một số mẫu Đông trùng hạ thảo tại rất nhiều nơi như: Vườn Quốc
gia Ba Vì, Vườn quốc gia Tam Đảo, Khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử,...
vànguồn gen các lồi này đang đươc ̣ lưu giữbảo quản taịphịng.
Việc nhân ni và gây trồng nhân tạo thành cơng lồi nấm này có ý
nghĩa vơ cùng to lớn trong việc bảo tồn và phát triển loài này ở Việt Nam. Để
nhân ni nhân taọ thành cơng lồi nấm này thik̀ hơng thể không biết được đặc
điểm sinh học của chúng. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài nấm
Isaria tenuipes là cơ sở khoa học quan trọng được xem như yếu tố quyết định
đến sự thành bại của việc nuôi trồng thể quả nấm nhân tạo.
Với những lý do trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc
điểm sinh học của nấm Đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes) có phân
bố ở Việt Nam” nhằm góp phần bảo tồn, nghiên cứu ứng dụng và phát triển bền
vững các lồi Đơng trùng hạ thảo q hiếm. Thành cơng của đề tài sẽ có ý nghĩa
rất lớn trong nghiên cứu khoa học và y học nước nhà, đặc biệt là cơ sở để tiếp tục
nghiên cứu quy trình ni trồng nhân tạo loại nấm thần dược này.


2
Chương 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Nghiên cứu ở ngồi nước
1.1.1. Nghiên cứu về phân loại nhóm nấm Đơng trùng hạ thảo và nấm

Đông trùng hạ thảo tuyết (Isaria tenuipes)
Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm về cấu trúc phân tử, các
lồi nấm đơng trùng hạ thảo được xếp trong 162 đơn vị phân loại thuộc 2 họ
Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae [14].
Isaria tenuipes là một loài nấm phổ biến được tìm thấy tại nhiều khu
vực miền núi Hàn Quốc [21]. Hình dạng nấm có thể mọc riêng lẻ hay thành
cụm nhóm. Có thể mọc thẳng hoặc đột xuất nhánh, và có thể dài lên 45 mm,
thân cây nấm chủ yếu là màu vàng chanh và bên trên có bột màu trắng [13].
Theo hệ thống phân loại truyền thống loài nấm Isaria tenuipes được
xếp vào họ Clavicipitaceae [11]. Đây là một lồi nấm dược liệu được ni
trồng và sử dụng lâu đời ở Hàn Quốc. Trong tự nhiên, trên cùng một ký chủ,
rất dễ dàng thấy 2 dạng thể quả: dạng thể quả chứa bào tử hữu tính (stromata)
cótên goị làCordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa và dạng thể quả
chứa bào tử vơ tính (synnemata) chiń h làIsaria tenuipes.
1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của I. tenuipes
Nấm I. tenuipes xâm nhiễm nhộng hay sâu non và sau đó hình thành
các dạng thể quả màu vàng mọc thẳng hay phân nhánh ra bên ngồi mình của
vật chủ. Theo y học truyền thống của Trung Hoa, dạng thể quả của nấm I.
tenuipes có giá trị cao về mặt dược liệu do các tác dụng về dược lý và sinh
học của chúng. Các hoạt chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol
tách chiết từ nấm I. tenuipes ni cấy nhân tạo có khả năng ức chế các dòng tế
bào ung thư ở người như tế bào khối u dạ dày, tế bào ung thư gan, tế bào ung
thư ruột kết - ruột thẳng. Hoạt tính của Acetoxyscirpenediol mạnh hơn
Cisplatin là hoạt chất đang được dùng điều trị cho các bệnh nhân ung thư hiện


3

nay là 4 đến 6,6 lần [16] . Một hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học có giá
trị dược liệu chứa trong thể quả ở giai đoạn hữu tính và ở giai đoạn vơ tính

của lồi nấm Isaria tenuipes này là 4-acetyl-12,13-epoxyl-9-trichothecene3,15-diol [17]. Đây là hợp chất đang được dùng để điều trị bệnh ung thư, đặc
biệt là bệnh máu trắng ở các nước trên thế giới, đặc biệt được sử dụng rộng rãi
ở Hàn Quốc [10].
Trong dạng thể quả của nấm Isaria tenuipes còn chứa các hợp chất sinh
học và giá trị dược phẩm cao, chẳng hạn như adenosine và N6-(2hydroxyethyl) adenosine [13]. Có tác dụng tăng cường hệ thống miễn dịch và
lấy lại năng lượng, tương tự các chức năng bổ của nhân sâm.
Một số thành phần sinh hoá, nguyên tố khoáng, acid amin và các
vitamin trong nấm đông trùng hạ thảo I. tenuipes đã được xác định như sau
[30]:
Bảng 1.1: Thành phần sinh hoá và nguyên tố khoáng trong nấm I. tenuipes

STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12


4
Bảng 1.2: Thành phần acid amin trong nấm đông trùng hạ thảo I. tenuipes

TT

1
2
3
4
5
6
7
8
9

Bảng 1.3: Thành phần vitamin trong nấm Đông trùng hạ thảo I. tenuipes

STT
1
2
3
4
5
6
7
1.1.3. Nghiên cứu về giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo


Nấm Đông trùng hạ thảo là một loại nấm là loại dược liệu quý, rất tốt
cho sức khoẻ, phù hợp với mọi lứa tuổi. Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc
bồi bổ hết sức quý giá, có tác dụng tích cực với rất nhiều bệnh như rối loạn


5

tình dục, thận hư, liệt dương, di tinh, hay có tác dụng làm tăng cường công
năng của tuyến thượng thận, cải thiện được chức năng thận, nâng cao năng
lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư và chất phóng xạ.
Isaria tenuipes là một lồi nấm có giá trị dược liệu quý, tác dụng chủ
yếu trong điều trị và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư nhờtác dụng về dược lý và
sinh học của chúng. Những hợp chất có hoạt tính chống khối u hoặc tác động
đến hệ thống miễn dịch như: Leucinostatins A, D, Polygalactosamine,
Saintopin, Sphingofungins E và F, UCE1022, Paeciloquinones A, B, C, D, E
và F, Ergosterol peroxide, Acetoxyscirpenediol, … Đăc ̣ biêt, ̣ hoạt chất
Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol trong ni cấy nhân tạo có khả
năng ức chế các dòng tế bào ung thư ở người như khối u dạ dày, ung thư gan,
ung thư ruột kết - ruột thẳng được tách chiết và thử nghiệm trên lâm sàng.
Khơng chỉ vậy lồi nấm Isaria tenuipes cịn được phát hiện có hàm lượng
dinh dưỡng cao: giàu các vitamin D, vitamin B1, vitamin B6, và nhiều nguyên
tố khoáng như K, Fe, Mg, Cu... (Borchers et al., 1999; Liu et al., 1996; Lee et
al., 1996).
Trong thể quả của nấm Isaria tenuipes còn chứa các hợp chất sinh học
và giá trị dược phẩm cao, chẳng hạn như adenosine và N6-(2-hydroxyethyl)
adenosine [13]. Nấm này đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian truyền
thống hoặc như là một thực phẩm thành phần tăng cường hệ thống miễn dịch
và lấy lại năng lượng, tương tự như các chức năng bổ của nhân sâm.
Một kết quả thí nghiệm về sức sống của chuột cho thấy chuột uống dịch
nấm đông trùng hạ thảo chiết trong nước, chiết trong cồn và đối chứng (được
uống nước vơ trùng) đều sống khỏe mạnh trong 4 tuần thí nghiệm và biểu
hiện bình thường về hình thái, tập tính trong ăn, uống và các hoạt động khác
trong cả 2 lần thí nghiệm dù liều dùng cho chuột/ngày là rất cao so với thể
trọng của chuột. Điều này cho thấy với liều uống hàng ngày tương đương


6

890mg nấm đông trùng hạ thảo Isaria tenuipes/kg thể trọng là an toàn đối với
chuột bạch. Thời gian bơi của chuột được uống dịch chiết nấm trong nước và
trong cồn đều dài hơn so với đối chứng. Chuột đối chứng có thời gian bơi dao
động từ 3 đến 4 giờ, cịn ở các cơng thức được uống dịch chiết của nấm
thường là trên 5 giờ. Điều đó cho thấy nấm đã tăng cường khả năng vận động
của chuột.
1.1.4. Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối
hệ sợi
Trong những năm gần đây cùng với phương pháp nuôi cấy hệ sợi nấm
trong môi trường lỏng (Xu và cs, 2003; 2004; 2006) thì phương pháp ni cấy
nấm nhân tạo trên giá thể tằm - nhộng để sản xuất nấm ở qui mô lớn làm dược
liệu hoặc thức ăn bổ dưỡng rất phát triển tại các nước như Nhật Bản, Trung
Quốc và Hàn Quốc [22]; Kikuchi và cs, 2004.
Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được các tác giả tiến hành trên môi
trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau: 40 g/lít đường glucose, 10
g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH 2PO4, 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít
MgSO4.7H2O.
Ở

Hàn Quốc dạng bào tử vơ tính Isaria tenuipes đã được ni cấy trên

mơi trường có chứa nhộng tằm, kết quả cho thấy tỷ lệ sống cao nhất đạt
97,6% trên các giống tằm được thử nghiệm. Trọng lượng tươi của bào tử vơ
tính Isaria tenuipes khác nhau tùy theo từng mùa, dao động từ 1,44 ~ 0,94 g.
Đạt cao nhất khi nuôi cấy vào mùa xuân. Bào tử vơ tính của I. tenuipes sản
xuất trên nhộng là màu trắng hoặc màu trắng sữa, và tương tự về hình dạng và
màu sắc thể quả thu thập trong tự nhiên [20].
Trong những năm gần đây cùng với phương pháp nuôi cấy hệ sợi nấm
trong mơi trường lỏng thì phương pháp nuôi cấy nấm nhân tạo trên giá thể

nhộng tằm [15]. Ngồi ra nấm cũng được ni cấy trên mơi trường gạo và
nhộng tằm [20].


7

Thành phần môi trường nuôi cấy nấm luôn là đề tài để các nhà khoa
học nghiên cứu tìm ra mơi trường thích hợp nhất phù hợp với mục đích ni
cấy. Thành phần trong 1 lít mơi trường [9]: 50g glucose, 1.84g NH 4NO3,
0.39g KH2PO4, 1.42g Na2HPO4.12H2O, 0.60g MgSO4.7H2O, 0.1mg KCl,
2mg MnSO4.H2O, 10mg CoCl2.6H2O, 2mg Na2MoO4·2H2O, 20mg
ZnSO4.7H2O, 3mg of CuSO4·5H2O, 2mg of FeSO4.7H2O and 60mg of
EDTA. Trong thành phần này KH2PO4 phosphate làm ảnh hưởng đến sinh
khối của nấm tuy nhiên lại có khả năng kích thích làm tăng số lượng thể quả.
1.2. Nghiên cứu ở trong nước
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần lồi các lồi nấm ký sinh cơn trùng và
nấm đơng trùng hạ thảo
Các lồi nấm ký sinh cơn trùng như Beauveria bassiana, Metarhizium
anisopliae,... đã được nghiên cứu về những vấn đề khác nhau như điều tra
thành phần loài, lồi sâu bị ký sinh, phân lập và ni cấy trong phịng thí
nghiệm và đặc biệt là nhân sinh khối, tạo chế phẩm để phịng trừ một số lồi
sâu hại đối với cây nông nghiệp và cây lâm nghiệp. Phân lập và sử dụng nấm
Beauveria để phòng trừ mọt hại nông sản [2]. Nghiên cứu sản xuất với quy
mô công nghiệp và thử nghiệm trên diện rộng chế phẩm nấm ký sinh côn
trùng Beauveria và Metarhizium được thể hiện nhiều trong các cơng trình
nghiên cứu của [7].
Trong báo cáo tổng kết đề tài "Nghiên cứu xây dựng cơng trình ni
trồng nấm đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr.) có giá trị dược liệu
và thương mại cao" của PGS.TS Phạm Quang Thu [6] cho thấy đã điều tra
được rất nhiều mẫu nấm của Isaria tenuipes. Loài nấm I. tenuipes này lần đầu

tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam vào năm 2010 [4]. Loài nấm này
phân bố ở rừng tư ̣nhiên nhiệt đới lá rộng thường xanh ở độ cao từ 800 - 1000
m so với mực nước biển. Hiêṇ đa ̃phát hiêṇ đươc ̣ nhiều mâũ nấm Isaria


8

tenuipes ở các Vườn Quốc gia Ba Vì - Hà Nội và Vườn Quốc gia Tam Đảo Vĩnh Phúc, Vườn Quốc gia Tây Yên Tử - Quảng Ninh. Nấm mọc đơn lẻ hoặc
mọc thành cụm, chùm trên nhộng thuộc bộ Cánh vẩy [5].
1.2.2. Nghiên cứu về giá trị dược liệu
Tác dụng của đông trùng hạ thảo cũng được nhiều tác giả Việt Nam khẳng
định. Theo tài liệu tổng hợp của y học cổ truyền Việt Nam thì đơng trùng hạ thảo
có tác dụng bổ phế và thận, ích khí, chỉ huyết và trừ đờm. Chủ trị: trị ho lâu
ngày, yếu mệt, thổ huyết, nhiều mồ hôi, di tinh, đau lưng mỏi gối. Thận kém biểu
hiện như bất lực, xuất tinh và đau lưng dưới và đầu gối: Dùng đông trùng hạ thảo
với Sơn thù du, Sơn dược và Thỏ ti tử, hoặc dùng độc vị đông trùng hạ thảo. Ho
và hen mạn tính hoặc ho có đờm máu, do phế hư: Dùng đông trùng hạ thảo với
Sa sâm, A giao và Xuyên bối mẫu. Ra mồ hôi nhiều do cơ thể mệt, ốm: đông
trùng hạ thảo nấu với thịt gà, vịt hoặc heo [29].

Đỗ Tất Lợi (1977) [1] cho rằng Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bổ,
dùng để chữa trị thần kinh suy nhược, chữa ho, ho lao, bổ tinh khí, chữa đau
lưng, bổ thận. Liều dùng 6 - 12 g với hình thức ngâm rượu.
Một số sản phẩm từ nấm Đông trùng hạ thảo I. tenuipes [30]:
Nấm khô: Nấm tươi sau khi thu hoạch được sấy ở 600C trong 24 giờ
và bảo quản trong tùi nylon hàn kín.
-

Rượu Đơng trùng hạ thảo: phát triển sản phẩm rượu từ nấm Đơng

trùng hạ thảo nhằm mục đích tăng cường thể lực. Thành phần của rượu bao
gồm: Nấm khô được ngâm trong rượu nếp với tỷ lệ 20 gr nấm khơ trong 1lít
rượu. Rượu có màu vàng nâu, mùi vị thơm, ngon.
-

Viên nang Đông trùng hạ thảo: Bột nấm Đông trùng hạ thảo bổ sung

thêm chất phụ gia được trộn ướt bằng máy trộn siêu tốc rồi sấy tầng sôi ở
700C trong 20 phút. Sau đó trộn khơ, đóng viên nang, mỗi viên 400mg. Đóng
lọ 50 viên.


9

1.2.3. Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và ni cấy sinh khối
hệ sợi
Ở

Việt Nam thì các nghiên cứu về nuôi trồng thể quả nấm đông trùng

hạ thảo Isaria tenuipes có rất ít.
Quy trình sản xuất đơng trùng hạ thảo trên tằm dâu của tiến sỹ Nguyễn
Mậu Tuấn [30] tại Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông Lâm nghiệp
Lâm Đồng tại Bảo Lộc hoàn tất đã mở ra một hướng đi mới đầy triển vọng
cho Lâm Đồng trong việc sản xuất dược liệu quý trên diện rộng. Đây là người
đầu tiên trong nước đưa ra được qui trình hồn chỉnh về sản xuất đơng trùng
hạ thảo trên con tằm dâu, một loại côn trùng được người dân ni từ rất lâu
đời và với qui trình này có thể sản xuất đại trà loại dược liệu quý này ngay
trên đất Lâm Đồng. Cho đến nay tiến sỹ Tuấn đã hồn thiện 2 qui trình ni
cấy đơng trùng hạ thảo ở 2 sản phẩm là nhộng trùng thảo (Cordyceps

militaris) trên nhộng tằm dâu và đông trùng hạ thảo tằm dâu (Cordyceps
takaomontana hay Isaria tenuipes (còn gọi là Paecilomyces tenuipes)) trên
con tằm dâu.
Theo Tiến sỹ Nguyễn Xuân Thám [30], Phó Giám đốc Sở Khoa học
Cơng nghệ Lâm Đồng, việc hồn tất qui trình sản xuất đơng trùng hạ thảo trên
tằm dâu có ý nghĩa đặc biệt cho những người làm nghiên cứu sinh học trên đất
Lâm Đồng, mở ra một hướng đi mới cho việc nghiên cứu sản xuất các loại
dược liệu ở địa phương phục vụ phát triển kinh tế xã hội.
Nhận xét:
Từ phần tổng quan tài liệu những nghiên cứu về Đông trùng hạ thảo
cho thấy: nấm Đông trùng hạ thảo là một lồi nấm có giá trị dược liệu quý,
chữa trị được nhiều loài bệnh nan y như ung thư, kháng khuẩn, chống oxy hóa
và các bệnh về yếu sinh lý.


10

Nghiên cứu về thành phần loài, giá trị dược liệu và nuôi trồng thể quả
được tiến hành nghiên cứu với trình độ cao ở nhiều nước trên thế giới và đạt
được kết quả tốt.
Tại Việt Nam, những nghiên cứu về thành phần lồi nấm Đơng trùng hạ
thảo được cơng bố vào năm 1996 và 2001 có 3 lồi nấm thuộc chi Cordyceps.
Về thành phần hóa học và giá trị dược liệu chưa được nghiên cứu nhiều, từ
các nguồn tài liệu khác nhau, các nhà khoa học đã khẳng định nấm Đông
trùng hạ thảo là một dược liệu quý và hiếm.
Từ những cơ sở lý luận trên, việc nghiên cứu hệ thống về nấm Đông
trùng hạ thảo ở Việt Nam là rất cần thiết. Việc phân lập thuần khiết các chủng
nấm ở Việt Nam để lưu trữ nguồn gen và tiến hành xác định hàm lượng để
tuyển chọn chủng có tiềm năng dược liệu cao. Đây là cơ sở ban đầu để tiếp
tục nghiên cứu quy trình ni trồng nấm trong điều kiện ở Việt Nam.

11

Chương 2
MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu.
-

Tìm hiểu một số đặc điểm của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết của

các chủng nấm đã thu thập được.
-

Đánh giá hoạt tính sinh học của chủng nấm thơng qua hoạt tính kháng

khuẩn, kháng nấm bệnh của chúng.
-

Đánh giákhả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo.

2.2. Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm Isaria tenuipes sưu tầm ở Vườn quốc gia Ba Vì.
2.3. Nội dung nghiên cứu.
2.3.1. Phân lập các chủng nấm Isaria tenuipes ở Việt Nam
- Phân lâp ̣ vànghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi nấm trong nuôi cấy
thuần khiết.
-

Nghiên cứu đặc điểm hiǹ h thái nấm Isaria tenuipes.

2.3.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết
Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của
hệ sợi.
sợi.

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ khơng khí đến sự sinh trưởng của hệ

-

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi.

2.3.3. Nghiên cứu hoạt tính của các chủng nấm
-

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng Isaria tenuipes.

-

Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các chủng Isaria tenuipes.

2.3.4. Nghiên cứu khả năng hình thành thể quả trên giá thể nhân tạo
-

Thí nghiệm ni trồng các chủng Isaria tenuipes trên giá thể lỏng

-

Thí nghiệm ni trồng các chủng Isaria tenuipes trên nhộng tằm.

12

2.4. Phương pháp nghiên cứu.
2.4.1. Phương pháp phân lập
2.4.1.1. Phương pháp phân lâpp̣ và nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi
trong nuôi cấy thuần khiết
Phân lâpp̣ nấm: Môi trường phân lập nấm Đông trùng hạ thảo là môi
trường PDA (Potato Dextrose Agar). Môi trường sau khi pha xong được hấp
khử trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút sau đó được đổ vào các hộp lồng vơ
trùng. Chọn thểquảnấm tươi mới, non không bị sâu bệnh. Tách lấy bôṭ bào tử
nấm cấy vào môi trường dinh dưỡng. Sau đócất giữ mẫu trong tủ định ơn ở
nhiệt độ 25oC. Khi sơị nấm bắt đầu xuất hiêṇ chọn sợi nấm không bị tạp
nhiễm mọc ra từ mô nấm cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới. Sau khi
tách sợi nấm khoảng 2 - 3 lần, sợi nấm không bị nhiễm khuẩn, nấm tạp và sợi
nấm mọc đồng nhất thì được sợi nấm thuần khiết.
Đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi nấm trong nuôi cấy thuần khiết:
Các chủng nấm được cấy trên môi trường chuẩn PDA và được nuôi trong tủ
định ôn có nhiệt độ 250C. Định kỳ theo thời gian 05 ngày quan sát mô tả cách
thức mọc, màu sắc, và đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi và khả năng sinh bào
tử vơ tính (bào tử chồi) của nấm. Sử dụng phương pháp quan sát, mô tả, đo
đếm và chụp ảnh dưới sự hỗ trợ của kính hiển vi quang học và kính soi nổi.
2.4.1.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm Isaria tenuipes
Nhận biết đặc điểm hình thái qua quan sát, mơ tả, chụp ảnh (hình dạng,
kích thước, màu sắc…) bằng mắt thường, kính hiển vi soi nổi Olympus SZ-PT
vàkính hiển vi quang học Olympus BX50, xem đặc điểm của nấm như thể
quả, bào tử, (hình dạng, kích thước, màu sắc, cách thức sắp xếp…).
2.4.2. Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết
2.4.2.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến

sinh trưởng và phát triển của hệ sợi.


13

Nấm đươc ̣ nuôi cấy trên 07 môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần
như sau:
TT
1

2

3

4

5
6

7
Môi trường được pha chế theo đúng tỷ lệ, hấp khử trùng ở 121 oC và
được đổ vào các lọ thuỷ tinh sạch, để nguội và cấy nấm. Mỗi lồi nấm được
cấy trên 10 bình thuỷ tinh, thí nghiệm lặp lại 03 lần. Sinh trưởng của hệ sợi
đánh giá thông qua trong ̣ lương ̣ tươi, trong ̣ lương ̣ khô hê ̣ sơị. Xử lý số liệu
bằng Excel và SPSS.
2.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ khơng khí đến sinh
trưởng và phát triển của hệ sợi


Sau khi cấy nấm vào hộp lồng chứa môi trường thích hợp đặt vào các

thang nhiệt độ khơng khí khác nhau: 100C, 150C, 200C, 250C, 300C và 350C.