Luận văn Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu thiết lập quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein từ phế liệu tôm

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ THANH

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC
GIÀU CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU TÔM

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHẾ BIẾN LƢƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

HUẾ - 2018


ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ THANH

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC
GIÀU CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU TÔM

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHẾ BIẾN LƢƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
Mã số: 8540101

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. ĐỖ THỊ BÍCH THỦY

HUẾ - 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan:
Đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của
PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thủy. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực, một phần đã đƣợc cơng bố trên tạp chí khoa học chun ngành với sự đồng ý
và cho phép của các đồng tác giả. Phần cịn lại chƣa đƣợc ai cơng bố trong bất kỳ
cơng trình nào khác.

Tác giả luận văn

Lê Thị Thanh


ii

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn ngoài sự nỗ
lực và đam mê của bản thân, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ, động viên của q
thầy cơ, gia đình và bạn bè.
Lời đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thủy
đã định hƣớng nghiên cứu và tận tình hƣớng dẫn tơi trong q trình học tập và thực
hiện luận văn.
Tơi xin cảm ơn Phòng Đào tạo, Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Huế
đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tơi hồn thành mọi thủ tục cần thiết trong q
trình làm nghiên cứu.

Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Chủ nhiệm Khoa, các thầy cô giáo
trong khoa Cơ khí - Cơng nghệ, trƣờng Đại học Nông Lâm Huế đã luôn quan tâm,
giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi học ở trƣờng và thực hiện đề
tài luận văn.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn những ngƣời thân trong gia đình và bạn bè đã ln ở
bên để động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học
tập và nghiên cứu vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận văn

Lê Thị Thanh


iii

TĨM TẮT
Nghiên cứu một số thơng số cơng nghệ thích hợp để thủy phân và lên men phế
liệu tôm bởi chủng B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 và đề xuất quy trình sản xuất
chế phẩm probiotic giàu carotenprotein từ PLT. Kết quả của đề tài làm tiền đề cho
nghiên cứu xử lý PLT kết hợp hai chế phẩm vi sinh nhằm tạo ra chế phẩm probitic
giàu carotenoprotein có khả năng ứng dụng trong chăn nuôi. Các phƣơng pháp đƣợc
sử dụng để phân tích các chỉ tiêu trong q trình nghiên cứu và thực hiện nội dung đề
tài: phƣơng pháp tăng sinh và nuôi cấy để thu nhận sinh khối tế bào, xác định số tế bào
sống bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch, xác định hoạt độ protease bằng
phƣơng pháp Ason cải tiến, xác định hàm lƣợng protein tổng số bằng phƣơng pháp
Kjeldahl, xác định hàm lƣợng nitơ formol bằng phƣơng pháp sorensen, xác định hoạt
tính kháng oxy hóa bằng phƣơng pháp DPPH, xác định hàm lƣợng astaxanthin trong
phế liệu tôm và xác định độ ẩm bằng phƣơng pháp sấy đến khối lƣợng không đổi.
Các thông số cơng nghệ thích hợp để xử lý PLT trong quy trình sản xuất chế

phẩm probiotic giàu carotenprotein: tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10
gieo cấy ban đầu vào PLT là 1:2. Nhiệt độ lên men 35oC và thời gian lên men 24 giờ.
Sau khi xác định đƣợc các thông số để xử lý PLT, chúng tôi tiếp tục khảo sát tỷ lệ phối
trộn dịch carotenoprotein thu đƣợc từ quá trình lên men vào chất mang bã sắn khô,
thực hiện sấy chế phẩm ở nhiệt độ 35oC trong 5 giờ và đã xác định đƣợc tỷ lệ phối trộn
thích hợp là 1:4 thơng qua các chỉ tiêu mật độ tế bào sống (9,45 lg CFU/g), hoạt độ
protease (28,74 UI/ml), hàm lƣợng astaxanthin (4,2 µg/g) và độ ẩm (6,9%) đạt yêu cầu
của chế phẩm. Xây dựng đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu
carotenoprotein từ phế liệu tôm.


iv

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii
TÓM TẮT...................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ......................................................................................................................iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ......................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ..............................................................................................ix
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài .............................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .....................................................................................2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC ..............................................................................3
1.1.1. Khái niệm probiotic ............................................................................................... 3
1.1.2. Tác dụng của probiotic .......................................................................................... 3
1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC ................................................................ 5

1.2.1. Khái niệm vi khuẩn lactic ......................................................................................5
1.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic ................................................................................6
1.2.3. Lactobacillus fermentum .......................................................................................8
1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN BACILLUS ............................................................ 9
1.3.1. Giới thiệu về Bacillus ............................................................................................ 9
1.3.2. Đặc điểm chung ...................................................................................................10
1.3.3. Bacillus subtilis ...................................................................................................10
1.4. PHẾ LIỆU TÔM .....................................................................................................13
1.5. PHỨC HỢP CAROTENOPROTEIN VÀ ASTAXANTHIN ................................ 13
1.5.1. Nguồn gốc và bản chất của chế phẩm caroten-protein ........................................13
1.5.2. Astaxanthin và các ứng dụng ..............................................................................14


v
1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI....................................16
1.6.1. Trên thế giới ........................................................................................................16
1.6.2. Ở Việt Nam..........................................................................................................20
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 24
2.1. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .......................................................24
2.1.1. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................. 24
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................................... 24
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................24
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................25
2.3.1. Phƣơng pháp vi sinh ............................................................................................ 25
2.3.2. Phƣơng pháp hóa sinh ......................................................................................... 26
2.3.3. Phƣơng pháp vật lý .............................................................................................. 28
2.3.4. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm để thực hiện nội dung nghiên cứu .....................29
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ...................................................................................34
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................36
3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA PHẾ LIỆU TÔM .............................................36

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ GIỮA B. subtilis C10
VÀ L. fermentum TC10 GIEO CẤY BAN ĐẦU VÀO PHẾ LIỆU TÔM ĐẾN CHẤT
LƢỢNG CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN ...................37
3.2.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu
vào PLT đến hoạt độ enzyme protease ..........................................................................37
3.2.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu
vào PLT đến mật độ tế bào sống ...................................................................................39
3.2.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu
vào PLT đến hoạt tính kháng oxy hóa ...........................................................................40
3.2.4. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu
vào PLT đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với ban đầu...........................................41
3.2.5. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu
vào PLT đến hàm lƣợng nitơ formol .............................................................................42
3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ LÊN MEN ĐẾN
CHẤT LƢỢNG CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN .......43


vi
3.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ protease ......................................43
3.3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến mật độ tế bào sống ..................................44
3.3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hoạt tính kháng oxy hóa .......................... 45
3.3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với
ban đầu ............................................................................................................. 46
3.3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hàm lƣợng nitơ formol ............................ 47
3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN LÊN MEN ĐẾN
CHẤT LƢỢNG CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN .....48
3.4.1. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hoạt độ protease .....................................49
3.4.2. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến mật độ tế bào sống .................................50
3.4.3. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hoạt tính kháng oxy hóa ......................... 51
3.4.4. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với ban

đầu .................................................................................................................................52
3.4.5. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hàm lƣợng nitơ formol ........................... 54
3.5. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ PHỐI TRỘN DỊCH
CAROTENOPROTEIN VÀO CHẤT MANG ĐẾN CHẤT LƢỢNG CỦA CHẾ
PHẨM PROBIOTIC ......................................................................................................55
3.5.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein vào chất mang đến mật độ tế
bào sống ......................................................................................................................... 55
3.5.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein vào chất mang đến hoạt độ
protease, hàm lƣợng astaxanthin và độ ẩm chế phẩm ...................................................56
3.6. THIẾT LẬP QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIÀU
CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU TÔM ............................................................. 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................60
KẾT LUẬN ...................................................................................................................60
ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 61
PHỤ LỤC


vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA

Analysis of Variance

AA

Activity of Amylase

BOD

Biochemical Oxygen Demand

CFU

Colony-forming Unit

COD

Chemical Oxygen Demand

ĐC

Đối chứng

DDA

Deacety hóa

DH

Degree of Hydrolysis

DO

Dissolved Oxygen

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

FBC

Fat Binding Capacity

LAB

Lactic acid bacteria

OD

Optical Density

PA

Protease Activity

PFCP

Peptide from Carotenoprotein

PLT

Phế liệu tôm

SF

Submerged Fermentation

SSF

Solid - State Fermentation

UI

International Unit

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

WBC

Water Binding Capacity


viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1. Thành phần hoá học cơ bản của phế liệu tơm ...............................................36
Bảng 3.2. Thơng số thích hợp cho quá trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu
carotenoprotein từ PLT bởi B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 ............................. 54
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein vào chất mang đến hoạt
độ protease, hàm lƣợng astaxanthin và độ ẩm chế phẩm ..............................................56

ix

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Vi khuẩn Lactobacillus fermentum .................................................................8
Hình 1.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên mơi trƣờng thạch ........................................11
Hình 1.2. Tế bào Bacillus subtilis sau khi nhuộm gram................................................11
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo astaxanthin .......................................................................14
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10
và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến chất lƣợng của chế phẩm
probiotic giàu carotenoprotein......................................................................................... 29
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến chất
lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein .....................................................31
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian lên men đến
chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein ...............................................33
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch
carotenprotein với chất mang đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu
carotenoprotein ...............................................................................................................35
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban
đầu vào PLT đến hoạt độ protease ................................................................................38
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban
đầu vào PLT đến mật độ tế bào sống ............................................................................39
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban
đầu vào PLT đến hoạt tính kháng oxy hóa ....................................................................40
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban
đầu vào PLT đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với ban đầu ....................................41
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban
đầu vào PLT đến hàm lƣợng nitơ formol ......................................................................42
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ protease .................................44
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến mật độ tế bào sống ............................. 45

Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hoạt tính kháng oxy hóa .....................46
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với ban
đầu .................................................................................................................................47
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến hàm lƣợng nitơ formol .....................48


x
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hoạt độ protease .............................. 49
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của thời gian đến mật độ tế bào sống ........................................51
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hoạt tính kháng oxy hóa ..................52
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với
ban đầu ........................................................................................................................... 53
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hàm lƣợng nitơ formol .....................54
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein vào chất mang đến mật
độ tế bào sống ................................................................................................................55
Hình 3.18. Bột sắn khơ ..................................................................................................57
Hình 3.17. Dịch carotenoprotein ...................................................................................57
Hình 3.19. Chế phẩm trƣớc và sau khi sấy....................................................................57
Hình 3.20. Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein .....................58


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp có ngành chăn ni phát triển và có đóng
góp to lớn vào sự phát triển kinh tế của đất nƣớc. Vì vậy, vấn đề nâng cao năng suất,
chất lƣợng sản phẩm và cải thiện môi trƣờng chăn nuôi rất đƣợc quan tâm ở nƣớc ta
hiện nay. Việc lạm dụng kháng sinh của ngƣời chăn nuôi đang trở thành vấn đề nan
giải. Hệ quả là lƣợng tồn dƣ kháng sinh có trong thực phẩm khơng chỉ ảnh hƣởng đến

vật ni mà còn nguy hại đến sức khỏe con ngƣời khi tiêu thụ thực phẩm.
Để hạn chế và tiến tới loại bỏ kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi, sử dụng
probiotic là một trong những giải pháp thay thế kháng sinh quan trọng. Probiotic là
những vi khuẩn có ích hoặc nấm men khi đƣa vào cơ thể một liều lƣợng vừa đủ sẽ sản
sinh ra các enzyme tiêu hóa, các vitamin và các chất có hoạt tính kháng khuẩn, tạo ra
những tác động tích cực đối với q trình tiêu hóa, giúp hấp thu dƣỡng chất tốt hơn
(FAO/WHO, 2001) [66].
Các loài Bacillus và Lactobacillus đƣợc xem là những đối tƣợng giàu tiềm năng
để sản xuất probiotic. Do Bacillus khơng chỉ có khả năng sinh bào tử để chống chịu
với điều kiện môi trƣờng bất lợi (Sanders và cs, 2003, Hong và cs, 2005) [73], [109],
mà cịn có thể sinh chất kháng sinh, chất kháng khuẩn kìm hãm VSV (vi sinh vật) gây
bệnh (Sanders và cs, 2003) [109]. B. subtilis sinh ra rất nhiều loại enzyme, đặc biệt là
 amylase và protease kiềm có giá trị cao. Ngồi ra, B. subtilis có khả năng sinh ra
riboflavin (tiền vitamin B2) (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2001) [4]. Lactobacillus đƣợc
biết đến là nhóm VK (vi khuẩn) có chức năng probiotic có nhiều tác động có lợi cho
sức khỏe con ngƣời cũng nhƣ động vật. Khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của VK
lactic làm cho chúng ức chế các VK gây bệnh đƣờng ruột (Đỗ Thị Bích Thủy, 2014)
[25]. L. fermentum là VK có khả năng chống chịu trong dịch dạ dày, dịch ruột non,
kháng các VSV gây bệnh, tăng cƣờng hệ miễn dịch, tăng khả năng kháng oxy hóa
(Gotteland và cs, 2006; Garcia và cs, 2009; Garcia và cs, 2012) [67],[68],[69].
Trong công nghệ chế biến thuỷ sản xuất khẩu của Việt Nam, công nghệ chế
biến tôm tạo ra một lƣợng lớn PLT (phế liệu tôm) bao gồm đầu tôm và vỏ tôm. Lƣợng
này thƣờng chiếm 50-70% nguyên liệu ban đầu. PLT là nguồn cung cấp protein, chitin
và carotenoids (Holanda và Netto, 2006) [72]. Trong đó, carotenoid đƣợc biết là một
chất màu tự nhiên an tồn cho các ngành cơng nghệ thực phẩm, dƣợc phẩm và mỹ
phẩm. Gần đây, nhiều phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng để tách chiết và thu nhận các chế
phẩm đạm giàu carotenoid. Chúng có thành phần chính là protein và carotenoid ở dạng
phức hợp caroten-protein và có nhiều trong phế liệu giáp xác (tơm hùm, tơm sú, tơm
chì, tơm thẻ chân trắng) và một số phế liệu hải sản khác. Theo Lê Minh Hoàng và cs

2
(2015) thành phần của carotenoprotein tách chiết từ vỏ đầu tơm có màu đỏ gạch và
mùi thơm gồm 7,1% hàm lƣợng chất khô, 68,5% hàm lƣợng protein, 7,3% hàm lƣợng
lipid, 390 ppm hàm lƣợng astaxanthin, 22,7% hàm lƣợng khoáng [6]. Việc tách chiết
chúng không chỉ thu nhận đƣợc các sản phẩm có giá trị gia tăng mà cịn giảm thiểu ô
nhiễm môi trƣờng (Chakrabarti, 2002; Phạm Thị Đan Phƣợng và Trần Thị Luyến,
2013) [16],[58]. Vì vậy, nghiên cứu thủy phân và lên men PLT bằng phƣơng pháp vi
sinh vừa thu hồi đƣợc hàm lƣợng caroten-protein vừa tách đƣợc lƣợng chitin đáng kể
(Phạm Thị Đan Phƣợng và cs, 2015) [19].
Với mong muốn tận dụng và nâng cao giá trị của PLT bằng tạo ra sản phẩm
probiotic bổ sung vào thức ăn chăn ni, góp phần giảm thiểu vấn nạn sử dụng kháng
sinh tràn lan, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thiết lập quy trình sản xuất chế phẩm
probiotic giàu carotenoprotein từ phế liệu tôm”.
2. Mục tiêu đề tài
Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
từ PLT có khả năng ứng dụng trong chăn ni ở quy mơ phịng thí nghiệm làm tiền đề
cho các nghiên cứu ở quy mô tiền pilot và sản xuất.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1) Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm những thông tin tài
liệu liên quan đến sản xuất chế phẩm probiotic nói riêng và các lĩnh vực trong cơng
nghệ thực phẩm nói chung.
2) Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu về chế phẩm probiotic sẽ tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ
sở sản xuất chế phẩm ở quy mô công nghiệp nhằm nâng cao giá trị sử dụng của phế
liệu tơm và góp phần hạn chế việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi.


3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC
1.1.1. Khái niệm probiotic
Từ “probiotic” đƣợc bắt nguồn từ Hy Lạp, theo tiếng Anh là “for life” nghĩa là
“dành cho cuộc sống”, chỉ những vi sinh vật sống trong cơ thể động vật và mang lại
những tác động có lợi cho cơ thể vật chủ. Có rất nhiều định nghĩa về probiotic đã đƣợc
đề nghị, Fuller (1989) (theo FAO/WHO, 2001), đã chỉ rõ bản chất VSV của probiotic
qua định nghĩa: “một sự bổ sung vi sinh vật sống qua đƣờng tiêu hóa mà tạo ra những
tác động có lợi lên vật chủ thông qua việc gia tăng sự cân bằng trong đƣờng tiêu hóa”.
Năm 1998 Guarner và Schaafsma (theo FAO/WHO, 2001) định nghĩa probiotic “là
những vi sinh vật sống, khi đƣợc đƣa vào một lƣợng thích hợp, mang lại những lợi ích
sức khỏe cho vật chủ”. Định nghĩa của FAO/WHO (2001) đã khái quát đƣợc những
đặc điểm chính của probiotic, theo đó probiotic là “VSV sống khi đƣợc đƣa vào với số
lƣợng hợp lý đem lại lợi ích cho sức khỏe trên vật chủ” [66]. Nhƣ vậy, những điểm
chính về probiotic là:
- Những sản phẩm gồm có các VSV sống khi có mặt trong cơ thể sẽ gây ra tác
động có lợi cho vật chủ.
- Cần đƣợc đƣa vào với một lƣợng phù hợp để mang lại tác động mong muốn.
Các VSV có tính chất nhƣ một probiotic có mặt trong đời sống, trong thực
phẩm hàng ngày, và có thể đƣợc đƣa bổ sung vào cơ thể thơng qua đƣờng ăn uống các
sản phẩm ăn sống có chứa chúng nhƣ sữa chua, nem, tôm chua, dƣa cải…
1.1.2. Tác dụng của probiotic
Probiotic hiện nay khơng chỉ có lợi cho con ngƣời mà cịn đƣợc ứng dụng trong
ni trồng thủy sản, sử dụng trong chăn nuôi gia súc, trong việc xử lý môi trƣờng.
1.1.2.1. Giảm nguy cơ tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa
Trên thế giới mỗi năm thƣờng có vài triệu ngƣời chết vì tiêu chảy, thƣờng tập
trung chủ yếu ở trẻ em của những nƣớc đang phát triển. Có khoảng 30% dân số ở
những nƣớc phát triển bị tiêu chảy do thực phẩm (FAO/WHO, 2001) [66]. Probiotic có

thể làm giảm đƣợc nguy cơ tiêu chảy do có khả năng ức chế các VK gây bệnh đƣờng
ruột, cạnh tranh chỗ trú đóng với VK gây bệnh bằng cách cản chúng bám dính vào
thành ruột, tiết ra các enzyme hỗ trợ q trình tiêu hóa nên có thể làm giảm nguy cơ
các triệu chứng rối loạn về tiêu hóa, tiêu chảy (FAO/WHO, 2001; Parvez1 và cs, 2006;
Lee và Salminen, 2009) [66],[81],[103].


4
1.1.2.2. Giảm nguy cơ nhiểm Helicobacter pylori
Helicobacter pylori là một loại VK gram âm gây viêm dạ dày, có thể dẫn đến
loét và ung thƣ dạ dày. Các thí nghiệm in vitro và thử nghiệm trên động vật đã xác
minh rằng VK lactic có thể ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh và làm giảm hoạt
tính của enzyme urease, một enzyme cần cho Helicobacter pylori để thích nghi với
điều kiện axit của dạ dày (FAO/WHO, 2001) [66]. Kabir và cs (1997) đã chứng minh
đƣợc L. salivarius có khả năng ức chế Helicobacter pylori [76]. Michetti và cs (1999)
cũng phát hiện chủng L. johnsonii La1 cũng có khả năng ức chế Helicobacter pylori ở
ngƣời [93].
1.1.2.3. Ngăn ngừa ung thư
Probiotic có thể làm giảm các nguy cơ về ung thƣ (FAO/WHO, 2001; Saikali và
cs, 2004; Parvez1 và cs, 2006; Lee và Salminen, 2009) [66],[103],[81],[108]. Một số
vi khuẩn đƣờng ruột có thể tạo ra các chất gây ung thƣ (carcinogen) nhƣ các
nitrosamine, sự có mặt của probiotic sẽ gây ức chế sự tăng trƣởng của các VK này và
do đó làm giảm đƣợc khả năng ung thƣ (FAO/WHO, 2001) [66]. Nhóm của Saikali và
cs (2004) và nhóm của Mongkol và cs (2009) đã phát hiện sữa lên men sống có chứa
probiotic có thể giảm nguy cơ ung thƣ ruột kết (colon cancer) [94],[108]. Theo nghiên
cứu của Yu và Li (2016) một ứng dụng lâm sàng của chế phẩm sinh học đã cho thấy
các chủng probiotic có thể làm giảm tỷ lệ viêm sau phẫu thuật ở bệnh nhân ung thƣ và
nghiên cứu đã kết luận các sản phẩm probiotic đƣợc sử dụng an toàn và giúp cải thiện
sức khỏe của vật chủ, một số chủng probiotic cịn có thể đƣợc sử dụng để hỗ trợ ngăn
ngừa và điều trị ung thƣ [124]. Các nghiên cứu trên dòng tế bào cũng nhƣ trên mơ hình

động vật và cơ thể ngƣời của Motevaseli và cs (2017) cho thấy probiotic có tác dụng
làm giảm xâm lấn và di căn của tế bào ung thƣ [95].
1.1.2.4. Ổn định hệ vi sinh vật trong đường niệu - sinh dục
Chi Lactobacillus có vai trị rất quan trọng trong việc chống lại mất cân bằng và
nhiễm trùng đƣờng sinh dục và niệu đạo. Do có khả năng sinh axit lactic làm giảm pH
âm đạo và sinh một số chất kháng khuẩn khác nên chúng có thể ức chế một số VSV
gây nhiễm trùng đƣờng âm đạo (FAO/WHO, 2001) [66].
1.1.2.5. Kích thích hệ miễn dịch tự nhiên
Bên cạnh chức năng ức chế các VK gây bệnh đƣờng ruột và ổn định hệ VSV
đƣờng ruột, VK probiotic cịn có khả năng kích thích miễn dịch. Hệ thống miễn dịch tự
nhiên của cơ thể có các tế bào đại thực bào (Macrophage), tế bào trung tính (neutrophil),
tế bào giết tự nhiên (natural killer-NK, gồm có tế bào T gamma và T delta). Chúng là
hàng rào đầu tiên bảo vệ cơ thể bằng cách tiêu diệt tế bào lạ xâm nhập và trình diện
kháng nguyên. Sự xâm nhập của VK lactic không gây bệnh cho cơ thể nhƣng lại kích


5
thích hoạt động của các tế bào này, từ đó tăng cƣờng đƣợc hoạt động miễn dịch. Sự
có mặt của VK lactic cịn có thể kích thích sản xuất kháng thể IgA (FAO/WHO,
2001) [66].
1.1.2.6. Chức năng dinh dưỡng và hỗ trợ tiêu hóa
VK lactic trong đƣờng ruột tạo ra một số vitamin nhƣ thiamine, nicotin, folic
acid, pyridoxin, Vitamin B12, …; tạo ra enzyme có lợi nhƣ lactase; giải phóng các
amino axit tự do, các axit béo mạch ngắn (Lee và Salminen, 2009) [81]. Ngồi ra, sự
có mặt của VK lactic trong các sản phẩm lên men cũng làm tăng giá trị dinh dƣỡng
của chúng. Các sản phẩm nhƣ sữa chua, thịt lên men chua (nem, xúc xích…) dễ tiêu
hơn và kích thích đƣợc vị giác, tạo cảm giác ngon miệng.
Đối với những ngƣời thƣờng bị chứng không dung nạp lactose (lactose
intolerant) thì enzyme lactase của VK lactic sẽ giúp họ tiêu hóa đƣờng này dễ dàng hơn.
1.1.2.7. Giảm hấp thu cholesterol và lượng cholesterol huyết thanh

Hàm lƣợng cholesterol trong huyết thanh ảnh hƣởng rất lớn đến các bệnh về tim
mạch. Nếu hàm lƣợng này cao hơn so với mức bình thƣờng thì ngƣời bệnh có nhiều
nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch và béo phì. Việc sử dụng các sản phẩm probiotic
có khả năng làm giảm hàm lƣợng cholesterol trong máu (Liong và Shah, 2005;
Parvez1 và cs, 2006; Lee và Salminen, 2009) [81],[84],[103]. Liong và Shah (2005)
trong thử nghiệm in vitro đã nhận thấy có sự liên kết giữa cholesterol và tế bào một số
chủng Lactobacillus, do đó gây ra sự loại bỏ cholesterol [84].
1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC
1.2.1. Khái niệm vi khuẩn lactic
VK lactic là những VK tạo ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic trong quá trình lên
men carbonhydrate (Dũng Nguyễn Lân, 1983; Prescott và cs, 2002) [3],[104]. Là
những VK gram dƣơng, bất động, khơng sinh bào tử, catalase và oxydase âm tính. Khả
năng sinh tổng hợp những hợp chất cần cho sự sống là rất yếu, nên chúng là những
VSV đa khuyết dƣỡng đối với nhiều amino acid, nhiều loại vitamin…, khơng có khả
năng tổng hợp nhân hem của porphyrine, chúng khơng có cytochrome. Nhiều lồi
trong chúng là những VK kỵ khí tùy nghi, vi hiếu khí và có khả năng tồn tại cả hiếu
khí cũng nhƣ kỵ khí.
Chi Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm VK lactic, gồm khoảng 80 lồi với
mức độ khác nhau rất nhiều về hình thái, đặc điểm sinh hóa và sinh lý. Sự khơng đồng
nhất thể hiện ở khoảng tỉ lệ mol G+C rất rộng, từ 32-55% (Prescott và cs, 2002) [104].
Tuy nhiên, chúng vẫn đƣợc chấp nhận trong một chi thống nhất theo định nghĩa của
chi, về cơ bản là những VK lactic hình que.


6
Theo Abbaszadeh và cs (2015), các VK lactic nhƣ L. acidophilus, L.
rhamnosus, L. casei, L. paracasei và Bifidobacterium bifidum có khả năng ức chế sự
phát triển của một số loại nấm gây hại thông thƣờng nhƣ A. niger, A. flavus, A.
parasiticus và P. chrysogenum [39].
Arasu và cs (2016) đã nghiên cứu tiềm năng probiotic của VK lactic và trong

đó L. plantarum đã thu hút đƣợc nhiều nhà nghiên cứu vì ứng dụng rộng rãi trong
lĩnh vực y tế nhƣ khả năng chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ và chống
béo phì [45].
Nghiên cứu của Veron và cs (2017) cho thấy 17 chủng VK lactic đƣợc phân lập
từ các loại trái cây O. ficus-indica mọc ở các vùng khô cằn từ Argentina có tiềm năng
probiotic. Các đặc tính probiotic đƣợc kiểm tra có khả năng chống chịu trong đƣờng
tiêu hóa, tính chất bề mặt tế bào và hoạt tính kháng khuẩn [122]. Bên cạnh đó chúng
cũng ảnh hƣởng đến tính chất của nƣớc ép lên men. Theo nghiên cứu của Sandes
(2017), bê mới sinh ra dễ bị một số VSV gây bệnh niêm mạc. Vì thế sử dụng VK lactic
có tính chất probiotic làm thực phẩm bổ sung trong chăn nuôi giúp cải thiện sức khỏe,
tăng hiệu suất sinh sản vật nuôi và giảm nguy cơ nhiễm trùng niêm mạc [110].
Nghiên cứu của Abushelaibi và cs (2017) đã xác định tính chất probiotic và lên
men của các chủng VK lactic phân lập từ sữa lạc đà. Cơng trình này đã nghiên cứu các
tính chất của LAB về sinh lý, khả năng tự kết dính, đồng kết dính, tính kỵ nƣớc, chịu
acid và muối mật, loại bỏ cholesterol, sinh tổng hợp exopolysaccharide và khả năng
sinh kháng sinh. Sự biến đổi của các yếu tố trong quá trình lên men nhƣ sự phát triển
tế bào, sự biến đổi pH, sự thủy phân protein cũng đƣợc nghiên cứu trong cơng trình
này [40].
1.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic
VK lactic có khả năng lên men đƣờng tạo axit lactic trong mơi trƣờng kỵ khí làm
cho pH giảm xuống dƣới 5, ức chế đƣợc các VSV khác. Vì vậy, chúng đƣợc ứng dụng
trong bảo quản thực phẩm, trong chế biến thức ăn gia súc, chế biến sữa, các sản phẩm
thực phẩm len men lactic và lên men thu nhận axit lactic ở quy mô công nghiệp.
1.2.2.1. Sản xuất axit lactic
Trong công nghiệp nhẹ, axit lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn,
vecni, nhuộm và thuộc da. Nguyên liệu chính dùng để sản xuất axit lactic là rỉ mật,
đƣờng, tinh bột đã đƣợc đƣờng hố. Nồng độ đƣờng sử dụng cho q trình lên men
lactic từ 8% đến 20%. Ngồi ra cịn sử dụng một số thức ăn bổ sung chứa đạm hữu cơ
và các loại chất sinh trƣởng (nhƣ mầm đại mạch, cám, cao ngô…). Khả năng sinh axit
lactic rất khác nhau tùy theo chủng. Trong sản xuất cơng nghiệp axit lactic thì chỉ có

những lồi lên men đồng hình là có giá trị. Hƣớng nghiên cứu hiện nay trong việc sản


7
xuất axit lactic thông qua lên men lactic là tuyển chọn dòng sinh axit lactic cao
(Kaloyan và cs, 2008; Cock và Stouvenel, 2006) [63], [77] tối ƣu hóa khả năng lên
men lactic, lên men lactic với nguồn nguyên liệu rẻ tiền (Ohkouchi và Inoue, 2006)
[99] và gây biến đổi di truyền để thu đƣợc các chủng sản xuất cao.
1.2.2.2. Bảo quản và chế biến thực phẩm
Nhờ khả năng sinh axit lactic làm hạ pH môi trƣờng và sinh một số chất kháng
khuẩn khác nhƣ H2O2, bacteriocin nên VK lactic có thể ức chế các VK làm hỏng thực
phẩm (Cho và Hyung Ki Do, 2006; Ljubisa, 2006) [60],[87]. Mặt khác quá trình lên
men lactic làm tăng hƣơng vị và giá trị dinh dƣỡng của thực phẩm. Các loại thực phẩm
lên men lactic thƣờng gặp nhƣ sữa chua, các loại thịt, hải sản lên men, rau quả và nƣớc
ép quả muối chua. Thông thƣờng để ức chế sự phát triển của VK gây thối ngay từ đầu
và tạo điều kiện cho VK lactic phát triển, ngƣời ta thƣờng bổ sung và nguyên liệu một
lƣợng NaCl khoảng 3-5%. Ở Việt Nam có khá nhiều sản phẩm loại này nhƣ tôm chua,
nem chua, rau quả muối chua …
Đặc biệt, trong ngành công nghiệp sữa, VK lactic có vai trị rất quan trọng.
Chúng là tác nhân chính trong q trình sản xuất các sản phẩm sữa lên men có giá trị
dinh dƣỡng cao, dễ bảo quản. Hai chủng S. thermophilus và L. delbrueckii subsp.
bulgaricus đƣợc dùng để sản xuất sữa chua và một số loại phomat. Lactococcus lastic
cũng đƣợc dùng trong sản xuất phomat. Một số chủng Leuconostoc có liên quan đến
q trình chín và quá trình lên men ban đầu của sữa chua và phomat (Prescott và cs,
2002; Axelsson, 2004) [49],[104]. Ngồi ra cịn có một số nghiên cứu tuyển chọn các
chủng VK lactic mới để sản xuất sữa chua thông thƣờng và sữa chua từ đậu nành (Park
và Oh, 2007) [102].
1.2.2.3. Ủ chua thức ăn gia súc
Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến trong các trang trại chăn nuôi. Thức
ăn khi ủ không những giảm đƣợc sự tổn thất giá trị dinh dƣỡng mà còn bổ sung nhiều

loại vitamin do VSV tổng hợp. Phƣơng pháp này dựa vào sự chuyển hóa đƣờng có sẵn
trong nguyên liệu của VK lactic.
Nguyên liệu đƣợc ủ thành đống, hoặc chất vào các hố sâu trong đất. Các VSV
có sẵn trong nguyên liệu sẽ phát triển dần lên. Đầu tiên là nhóm VK hiếu khí phát triển
mạnh sử dụng hết lƣợng oxy có trong đống nguyên liệu, làm tiêu thụ phần thức ăn dễ
tiêu và phân giải protein của nguyên liệu. Kết quả là tạo điều kiện cho VK lactic phát
triển, làm tích lũy dần axit lactic.
Bên cạnh đó, VK lactic cịn ứng dụng trong tách chiết carotenoids. Theo nghiên
cứu của (Armenta & cộng sự, 2002) lên men lactic để chiết xuất carotenoids tự nhiên


8
từ các lớp vỏ cứng là một phƣơng pháp đơn giản và thân thiện với môi trƣờng để đạt
đƣợc hiệu quả cao [47].
1.2.3. Lactobacillus fermentum
L. fermentum thuộc nhóm VK lactic, tế bào có dạng hình que, kỵ khí tùy ý,
Gram dƣơng (Hình 1.1). Thƣờng đƣợc phân lập tự nội tại đƣờng ruột hoặc các sản
phẩm lên men từ sữa, bột bánh mì, nguyên liệu thực vật lên men. VK phát triển tốt
trong môi trƣờng acid pH 5,5-6,2, chúng tồn tại đƣợc ở cả pH dƣới 5 nên ức chế sự
hoạt động của VK gây thối.

Hình 1.1. Vi khuẩn Lactobacillus fermentum [130]
Nhiệt độ phát triển tối ƣu từ 30 - 40oC, phù hợp với thân nhiệt cơ thể ngƣời.
Lƣợng axit lactic sinh ra vừa có tác dụng hồn thiện hƣơng vị đồng thời có tác dụng
bảo quản cho sản phẩm. Bên cạnh đó, VK lactic có tiềm năng probiotic lớn, có chức
năng probiotic có nhiều tác động có lợi cho sức khỏe con ngƣời cũng nhƣ động vật.
Hơn nữa, VK lactic trong đƣờng ruột tạo ra một số vitamin nhƣ thiamine, nicotin, folic
acid, pyridoxin, vitamin B12 … tạo ra enzyme có lợi nhƣ lactase, giải phóng các
amino acid tự do, các axit béo mạch ngắn (Lee và Salminen, 2009; Parvez1 và cs,
2006) [81],[103].

Ngồi ra L. fermentum cịn có khả năng chống chịu trong dịch dạ dày, dịch ruột
non, kháng các VSV gây bệnh, tăng cƣờng hệ miễn dịch, tăng khả năng kháng oxy hóa
(Gotteland và cs, 2006; Garcia và cs, 2009; Garcia và cs, 2012) [67],[68],[69].


9
Strompfova và cs (2005) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của L. fermentum AD1 lên
hệ VSV đƣờng ruột của chim. Kết quả đã chứng minh rằng sau 4 ngày thử nghiệm thì
chủng này làm tăng đáng kể số lƣợng axit lactic và làm giảm đáng kể số lƣợng E. coli
trong phân. Tỷ lệ tăng cân hàng ngày đã tăng 14%. Mặc dù pH ở ruột của cả 2 nhóm
chim tƣơng tự nhau, nhƣng nồng độ axit lactic ở nhóm thí nghiệm tăng đáng kể. Nồng
độ của các axit hữu cơ khác (acetic, acetoacetic, formic, succinic, valeric, propionic,
butyric) cũng nhƣ glutathione peroxidase trong máu không bị ảnh hƣởng. Chỉ số hoạt
động thực bào của bạch cầu cũng đƣợc cải thiện đáng kể [117].
Từ những nghiên cứu của Lin và cs (2009), một số chủng L. fermentum phân lập
từ gia cầm đƣợc tìm thấy có tính chất probiotic rất cần thiết để sử dụng bổ sung vào thức
ăn chăn nuôi. Nghiên cứu này cho thấy đƣờng tiêu hóa của gia cầm có tiềm năng
probiotic cho việc phân lập VK lactic. Chẳng hạn nhƣ Escherichia coli, Salmonella spp.,
S. sonnei và một số S. aureus enterotoxigenic [83].
Nghiên cứu của Zoumpopoulou và cs (2008) đã thành cơng khi áp dụng mơ
hình chuột viêm đại tràng và nhiễm trùng salmonella để làm thử nghiệm với L.
fermentum ACA-DC 179. Kết luận là chủng L. fermentum ACA-DC 179 đƣợc đánh
giá là có tiềm năng probiotic cao đối với chức năng hoạt tính kháng khuẩn và khả năng
miễn dịch [127].
Theo nghiên cứu của Huỳnh Ngọc Tâm và cs (2016), dƣa lê non muối chua
bằng phƣơng pháp lên men tự nhiên đã phân lập đƣợc 19 dòng VK thể hiện các
đặc điểm sinh hóa của VK lactic. Ngồi khả năng sinh bacteriocin kháng lại VK,
L. fermentum cịn có đặc tính probiotic và có thể sử dụng trong các chế phẩm sinh
học [20].
VK lactic nói chung và L. fermentum nói riêng có khả năng sinh tổng hợp axit

lactic tiết ra môi trƣờng. Lƣợng axit lactic sinh ra là giảm pH của môi trƣờng cùng với
khả năng sinh bacteriocin của chúng làm ức chế, thậm chí là tiêu diệt VSV gây bệnh
cũng nhƣ gây thối. Vì vậy, các lồi VK này đƣợc sử dụng rộng rãi trong bảo quản, chế
biến thực phẩm cũng nhƣ xử lý phế phụ phẩm. Bên cạnh đó, với tiềm năng probiotic,
sự có mặt của chúng trong các sản phẩm thực phẩm cũng nhƣ trong các chế phẩm thu
đƣợc sau khi xử lý phế phụ phẩm góp phần quan trọng lớn trong việc cải thiện sức
khỏe cho ngƣời cũng nhƣ động vật.
1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN BACILLUS
1.3.1. Giới thiệu về Bacillus
Bacillus là một trong những VSV đầu tiên đƣợc phát hiện và mô tả trong giai
đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành VSV học ở cuối thế kỷ 19. Đây là một chi
lớn với gần 200 loài VK hiếu khí, hình que, có khả năng sinh nội bào tử để chống


10
chịu các điều kiện bất thƣờng của môi trƣờng sống. Bacillus phân bố rộng rãi trong
các hệ sinh thái tự nhiên: từ trên cạn đến dƣới nƣớc, từ nƣớc ngọt đến nƣớc mặn và từ
vùng ven bờ đến đáy các Đại Dƣơng (Vos và cs, 2009) [123]. Bên cạnh các loài VK
gây bệnh cho con ngƣời nhƣ B. anthracis và B. cereus, nhiều lồi VK Bacillus, đặc
biệt là nhóm B. subtilis, có tiềm năng sản xuất các sản phẩm thƣơng mại ứng dụng
trong y học, trong nông nghiệp và trong công nghiệp thực phẩm.
1.3.2. Đặc điểm chung
Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nƣớc, khơng khí do chúng
có khả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí tùy tiện. Phần lớn các chủng thuộc các
lồi của giống này đều có khả năng sinh ra nhiều -amylase và protease kiềm, có một
số chủng sinh ra xenlulase, giống này không sinh ra lipase [29].
Bacillus là VK Gram dƣơng, hình que có kích thƣớc khác nhau (0,5-2,5) x (1,210) m. Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động. Là VK dị dƣỡng
hóa năng, hoại sinh thu năng lƣợng nhờ oxy hóa các hợp chất hữu cơ [29].
Bacillus có khả năng sinh bào tử. Thơng thƣờng bào tử đƣợc tạo ra khi tế bào đã
trải qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dƣỡng. Đa số

Bacillus sinh trƣởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9-10 nhƣ B. alcalophillus,
hay có loại phù hợp với pH = 2-6 nhƣ B. acidocaldrius. Về nhiệt độ có nhiều chủng ƣa
nhiệt độ cao (45oC-75oC), hay ƣa lạnh (5oC-25oC), nhƣng thƣờng gặp Bacillus sống ở
nhiệt độ 34oC-37oC. Hầu hết Bacillus không gây độc cho ngƣời và động vật. Một số
loại gây độc cho cơn trùng. Chúng có khả năng sinh enzyme ngoại bào do đó đƣợc ứng
dụng nhiều trong cơng nghiệp, bảo vệ môi trƣờng, nông nghiệp....[29].
1.3.3. Bacillus subtilis
B. subtilis đƣợc nhà khoa học cùng thời với Rober Knoch tên là Ferdinand
Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872. B. subtilis phân bố nhiều trong đất đặc biệt là cỏ
khô nên cịn đƣợc gọi là trực khuẩn cỏ khơ. Có dạng hình que, ngắn và nhỏ, kích thƣớc
0,6 x (3-5) m. B. subtilis là VK gram dƣơng, đôi khi các tế bào nối lại với nhau tạo
thành chuỗi dài, ngắn khác nhau hoặc các tế bào đứng riêng rẽ (Hình 1.2). Là khuẩn
lạc khô, không màu hoặc màu xám trắng, hoặc tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt
thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào mơi trƣờng thạch
(Hình 1.3) (Nguyễn Lân Dũng, 1983; Lƣơng Đức Phẩm, 2007) [3],[15].


11

Hình 1.2. Tế bào Bacillus subtilis sau
khi nhuộm gram [131]

Hình 1.3. Khuẩn lạc Bacillus
subtilis trên môi trường thạch [129]

B. subtilis có lớp màng nhày, đƣợc cấu tạo chủ yếu từ polypeptit chủ yếu là axit
polyglutamic. Việc hình thành màng nhày giúp VK có khả năng chịu đƣợc điều kiện
khắc nghiệt nhờ màng nhày có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ VK tránh bị tổn
thƣơng khi khô hạn. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng của B. subtilis là 36oC –
50oC, tối đa khoảng 60oC, là loại ƣa nhiệt cao. Bào tử của B. subtilis cũng chịu đƣợc

nhiệt khá cao. Bào tử có hình bầu dục, kích thƣớc 0,6 – 0,9 m. Phân bố không theo
nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhƣng khơng chính tâm. B. subtilis sinh ra
rất nhiều loại enzyme, đặc biệt là  amylase và protease kiềm có giá trị cao, ngồi ra
B. subtilis có khả năng sinh ra riboflavin (tiền vitamin B2). Vì vậy chúng đƣợc ứng
dụng nhiều trong cơng nghiệp cũng nhƣ một số ngành khác (Nguyễn Thành Đạt 1990;
Nguyễn Lân Dũng, 1983) [2],[3].
Chủng B. subtilis đƣợc chứng minh là có khả năng tạo ra enzyme ngoại bào
protease trong lên men trạng thái rắn (SSF) khi sử dụng bánh đậu nành làm môi trƣờng
nuôi cấy (Soares và cs, 2005). Khi so sánh ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy và pH ban
đầu trong sản xuất protease giữa SSF và lên men chìm (SF), kết quả cho thấy trong
SSF có phạm vi pH rộng hơn (5-10), nhƣng cùng nhiệt độ tối ƣu (37oC). Hoạt độ
enzyme protease và năng suất tối đa là 960 U g-1 và 15,4 U g-1 h-1 đối với SSF và 12 U
mL-1 và 1,3 U mL-1 h-1 đối với SF. Những kết quả này chỉ ra rằng VK này có tiềm
năng cơng nghệ sinh học cao trong sản xuất enzyme protease khi lên men trạng thái
rắn [115].
Theo một nghiên cứu của Zhao và cs (2012), thí nghiệm đƣợc tiến hành để xác
định ảnh hƣởng tiềm năng probiotic của B. subtilis T13 (phân lập từ ruột của chuột
biển khỏe mạnh) về sự tăng trƣởng, khả năng miễn dịch và khả năng kháng bệnh.


12
Nghiên cứu này đã chứng minh đƣợc tác dụng có lợi của B. subtilis T13 nhƣ là
probiotic trong chế độ ăn ở trẻ vị thành niên [126].
Theo nghiên cứu của Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền (2016) khảo sát đặc
tính probiotic của 21 chủng VK B. subtilis phân lập từ đất và phân trại gà tại các tỉnh
Đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả cho thấy, 100% các chủng nhạy với 5 loại kháng
sinh trong 9 loại thử nghiệm, tỷ lệ nhạy với kháng sinh Colistin là thấp nhất (5%). 10
chủng trong tổng số 21 chủng B. subtilis có khả năng sinh cả 3 loại enzyme ngoại bào
amylase, protease và lipase. Khi khảo sát tính đối kháng với VK gây bệnh đƣờng ruột,
các chủng AG27, AG60, VL05, VL28 có khả năng ức chế sự phát triển của E.coli,

Salmonella spp., Staphylococcus spp., và Streptococcus spp. Kết quả bƣớc đầu cho
thấy, 4 chủng VK B. subtilis AG27, AG60, VL05, VL28 có tiềm năng ứng dụng làm
probiotic trong chăn ni gia cầm [38]. Nghiên cứu gần đây của Liu và cs (2009) về
việc sử dụng chủng B. subtilis E20 có khả năng sinh protease mạnh bổ sung vào thức
ăn của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). Kết quả cho thấy tôm có bổ sung
B. subtilis E20 có khả năng tiêu hóa tốt hơn hơn so với tôm không đƣợc bổ sung nên
tăng trƣởng nhanh hơn [85].
Blanco và cs (2016) đã nghiên cứu sản xuất enzyme amylase và protease bởi B.
subtilis UO-01 trong chất thải của nhà máy bia bằng cách kết hợp phƣơng pháp phản
ứng bề mặt và nghiên cứu quá trình động học. Các điều kiện tối ƣu (T = 36oC và pH =
6,8) cho sinh khối cao (0,92 g/l) tƣơng tự với các điều kiện (T = 36,8oC và pH 6,6) cho
AA cao (9,26 IU/ml). Tuy nhiên, mức độ tối đa PA (9,77 IU/ml) thu đƣợc ở pH 7.1 và
37,8 oC. Trong những điều kiện này, mức giảm đáng kể (khoảng 69,9 và 77,8%) nhu
cầu oxy hóa ban đầu của chất thải đã đạt đƣợc. Điều kiện tối ƣu để sản xuất mỗi
enzyme, AA và PA thu đƣợc sau 15 giờ ủ, lần lƣợt là 9,35 và 9,87 IU/ml [51].
Manha và cs (2016) đã nghiên cứu và đánh giá các thuộc tính probiotic của B.
subtilis AMS6 đƣợc phân lập từ đậu tƣơng lên men (Churpi). Phân lập này thể hiện khả
năng chịu đựng pH thấp (pH 2.0) và muối mật (0,3%). B. subtilis AMS6 cũng cho thấy
hoạt tính kháng khuẩn cao nhất chống lại chủng gây bệnh Salmonella enterica
typhimurium (MTCC 1252). Kết quả nghiên cứu cho thấy B. subtilis AMS6 có tiềm
năng probiotic và đƣợc ứng dụng nhƣ là một phụ gia trong thức ăn chăn nuôi giúp tăng
cƣờng tiêu hóa chất xơ và sức khỏe đƣờng ruột của động vật [89].
B. subtilis khơng những có khả năng sinh tổng hợp nhiều enzyme ngoại bào mà
còn ức chế hoặc tiêu diệt các VK gây bệnh đƣờng ruột nhƣ E. coli, Samonella…. Hơn
nữa, lồi VK này cịn có khả năng sinh bào tử và có chức năng probiotic. Chính vì vậy,
việc nghiên cứu sử dụng B. subtilis để xử lý, thủy phân, tách chiết protein từ PLT sẽ có
tiềm năng lớn về khả năng thủy phân để tách chiết. Đồng thời sự có mặt của lồi VK
này trong chế phẩm thu đƣợc sẽ ảnh hƣởng có lợi cho sức khỏe của vật nuôi.

13
1.4. PHẾ LIỆU TÔM
Nguồn PLT rất quan trọng trong chế biến tơm cơng nghiệp hiện nay, nó chiếm
khoảng 35-45% trọng lƣợng tôm. PLT rất giàu nguồn chitin, protein và astxanthin. Vì
vậy việc tận dụng nguồn phế liệu này đang đƣợc quan tâm trong những năm gần đây.
Trần Thị Luyến (2004) cho biết trong vỏ tôm tƣơi chitosan chiếm khoảng 5% khối
lƣợng, trong vỏ tôm khô khoảng 20-40% khối lƣợng. PLT là những thành phần phế
thải từ các cơ sở chế biến tơm bao gồm đầu, vỏ và đi tơm. Ngồi ra, cịn có tơm gãy
thân, tơm lột vỏ sai quy cách hoặc tôm bị biến màu [12]. Holanda và Netto (2006) cho
rằng PLT có thể chiếm 50 - 70% so với nguyên liệu. Phần lớn tôm đƣợc đƣa vào chế
biến dƣới dạng bóc vỏ, bỏ đầu. Phần đầu thƣờng chiếm khối lƣợng 34-45%, phần vỏ,
đuôi và chân chiếm 10-15% trọng lƣợng của tôm nguyên liệu [72]. Theo nghiên cứu
của (Trang Sĩ Trung và cs, 2015) sự biến đổi chất lƣợng đầu tôm diễn ra rất nhanh,
protein và astaxanthin trong đầu tôm tổn thất đáng kể chỉ sau 4 giờ bảo quản ở nhiệt độ
thƣờng hoặc sau một ngày bảo quản lạnh [37]. PLT dễ hỏng một phần vì chứa enzyme
phân giải protein, một phần do quá trình phân hủy vi sinh. Các loại phế liệu này nếu
không đƣợc bảo quản mà thải trực tiếp ra môi trƣờng sẽ gây ô nhiễm môi trƣờng
trầm trọng và nếu đem xử lý chất thải thì chi phí sẽ rất lớn. Hiện nay ở nƣớc ta đa
số sử dụng PLT đông lạnh để sản xuất thức ăn chăn ni. Ngày nay đã có rất nhiều
hƣớng nghiên cứu sử dụng PLT để sản xuất các chế phẩm có giá trị trong đó việc
sản xuất chitin chitosan từ vỏ giáp xác là phổ biến nhất. Một số cơng trình khác đi
theo hƣớng tách chiết protein và carotenoid từ phế phụ phẩm này. Các cơng trình
nghiên cứu này sẽ đƣợc giới thiệu ở phần 1.6.
1.5. PHỨC HỢP CAROTENOPROTEIN VÀ ASTAXANTHIN
1.5.1. Nguồn gốc và bản chất của chế phẩm caroten-protein
Trong các loài sinh vật biển, carotenoid và protein thƣờng liên kết với nhau tạo
thành phức carotenoprotein. Ngoài ra, phức carotenoprotein còn liên kết với các chất
khác nhƣ axit béo, chitin, khoáng chất. Đặc biệt, phức carotenoprotein thƣờng gặp ở
các loài động vật giáp xác thủy sản, tồn tại nhiều ở lớp ngoại bì, trong vỏ, ở các cơ
quan nội tạng (trứng, dạ dày hay bạch huyết). Carotenoprotein đƣợc chia thành 2 nhóm

chính: (1) carotenoid liên kết với lipo (glyco) protein, (2) carotenoid liên kết với một
protein hoặc glycoprotein (Zagal sky, 1976) [125]. Phản ứng giữa các nhóm 4- và 4’keto trong các vòng đầu mạch của astaxanthin với các nhóm chức amin trong protein
là điều kiện tiên quyết để hình thành phức carotenoprotein giữa astaxanthin và protein
(Chakrabarti, 2002) [58].
Phức hợp carotenoprotein tan trong nƣớc và có tính bền vững. Trong một vài
trƣờng hợp, màu sắc của nó bền đến vài năm trong khơng khí ở điều kiện nhiệt độ
phịng. Các carotenoid có liên kết với protein ít bị oxy hóa hơn so với khi chúng ở