Tổng hợp và chuyển cấu trúc microrna nhân tạo vào cây đậu nành (Glycine max L.)

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019

Kỷ yếu khoa học

TỔNG HỢP VÀ CHUYỂN CẤU TRÚC microRNA NHÂN TẠO VÀO CÂY ĐẬU NÀNH
(Glycine max L.)
Hà Thị Trúc Mai, Đặng Lê Trâm, Nguyễn Thế Phương,
Nguyễn Thị Ngọc Loan, Nguyễn Vũ Phong*
Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
*Tác giả liên hệ:
TĨM TẮT
Effector là các protein cụ thể được tuyến trùng tiết vào trong tế bào thực vật, tạo thuận lợi cho
quá trình ký sinh cây chủ. Bất hoạt các effector này làm giảm khả năng ký sinh của tuyến trùng
và giúp hạn chế tác hại do tuyến trùng gây ra. Gene Minc14137 mã hóa cho một effector chưa
rõ chức năng được tạo dòng từ tuyến trùng Meloidogyne incognita. Mục tiêu của nghiên cứu
là tổng hợp microRNA nhân tạo có khả năng bất hoạt gene Minc14137. Cấu trúc microRNA
này được chèn vào vector biểu hiện và chuyển vào cây đậu nành bằng vi k���
A. tumefaciens
nhằm tìm hiểu chức năng của effector MINC14137 trong tiến trình ký sinh thực vật của tuyến
trùng sưng rễ thông qua con đường làm câm lặng gene bởi cây chủ (HIGS).
Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, htpII, nốt lá mầm, microRNA, PCR overlapping.
CONSTRUCTION AND TRANSFORMATION AN ARTIFICIAL microRNA
STRUCTURE TO SOYBEAN (Glycine max L.)
Ha Thi Truc Mai, Dang Le Tram, Nguyen The Phuong,
Nguyen Thi Ngoc Loan, Nguyen Vu Phong*
Nong Lam University Ho Chi Minh City
*Corresponding Author:
ABSTRACT
Effectors are specific proteins secreted by nematodes into plant cells that facilitate their
parasitism to host plants. Inactivation of these effectors reducing the parasitic ability of
nematodes on plants to help reduce the damage caused by nematodes. Gene Minc14137

encodes an effector unknown function that is cloned from the Meloidogyne incognita. The
objective of the study was to synthesize artificial microRNAs capable of inactivating gene
Minc14137. This microRNA structure was inserted into an expression vector in soybean by A.
tumefaciens to investigate the function of effector MINC14137 in the parasitic process of rootknot nematode via gene silencing by host plant (HIGS).
Keywords: Agrobacterium tumefaciens, htpII, cotyledonary node, microRNA, PCR
overlapping.
TỔNG QUAN
Đậu nành (Glycine max (L.)) là một trong
những cây trồng mang lại giá trị kinh tế cao.
Những năm gần đây, sản lượng đậu nành ngày
càng giảm mạnh do tuyến trùng gây hại. Việc sử
dụng hóa chất kiểm sốt tuyến trùng mặc dù có
hiệu quả nhưng lại ảnh hưởng lớn đến môi
trường và sức khỏe con người. Vì vậy, bên cạnh
các phương pháp sinh học truyền thống, việc tìm
kiếm một phương pháp mới, thân thiện với môi
trường đang được quan tâm nghiên cứu
(Nguyễn Vũ Phong, 2018). Tuyến trùng tiết ra
các effector tạo thuận lợi cho quá trình ký sinh
cây chủ. Bất hoạt các effector này làm giảm
khả năng ký sinh của tuyến trùng, từ đó hạn

90

chế được nhiều tổn thất do tuyến trùng gây ra.
Trong nghiên cứu này, gene Minc14137 mã
hóa cho một effector chưa rõ chức năng, tạo
dòng từ tuyến trùng M. incognita, được sử
dụng làm dữ liệu để tổng hợp microRNA nhân
tạo có khả năng bất hoạt gene này. Cấu trúc

microRNA sau đó được chèn vào vector biểu
hiện và chuyển vào cây đậu nành DT22 bằng
vi khuẩn A. tumefaciens.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
Thiết kế và tổng hợp miRNA nhân tạo
Trình tự gene Minc14137 của dòng tuyến
trùng Mi-PN03, độ tương đồng đến 95% với


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019

Kỷ yếu khoa học

(đồng nuôi cấy mẫu và vi khuẩn trong 4 hoặc
6 ngày) ở 25oC, trong điều kiện ánh sáng mờ.
Để loại bỏ vi khuẩn trên mẫu đã lây nhiễm,
rửa mẫu bằng 50 ml môi trường tạo chồi có bổ
sung kháng sinh cefotaxime 100 mg/l,
vancomycin 50 mg/l, timentin 50 mg/l. Thời
gian rửa mẫu 2 - 3 phút. Mẫu sau rửa được cấy
nghiêng một góc 45o trên mơi trường thanh lọc
có chứa cefotaxime 100 mg/l, timentin 50
mg/l.
Chọn lọc và kiểm tra chồi giả định chuyển
gene
Sau 14 ngày trên môi trường thanh lọc, mẫu
được chuyển sang môi trường tạo chồi có bổ
sung tác nhân chọn lọc hygromycin với nồng
độ 5 mg/l. Sau 28 ngày, tiếp tục chuyển mẫu

sang mơi trường chọn lọc có nồng độ 10 mg/l
hygromycin để xác định chồi chuyển gene.
Chồi giả định chuyển gene được tách chiết
DNA bằng hóa chất theo phương pháp của
Doyle và Doyle (1990), đo OD để xác định
nồng độ và độ tinh sạch trước khi thực hiện
phản ứng PCR, sử dụng cặp primer HptII-F
(5’-CAGCGAGAGCCTGACCTATTGC-3’)
và
primer
HptII-R
(5’GCCATCGGTCCAGACGGCCCGCGC-3’)
khuếch đại gene hptII kháng hygromycin có
trên cấu trúc plasmid.

cDNA của tuyến trùng M. incognita trên
GenBank (ID: AW441106.1), được sử dụng
để thiết kế các miRNA nhân tạo nhờ phần
mềm WMD3 (Cấu trúc amiRNA mục tiêu
được chọn dựa theo các tiêu chí đề xuất bởi
Schwab và ctv 2006). Cơng cụ Oligo của phần
mềmWMD3 được sử dụng để thiết kế các
primer thay thế đoạn 21 nu của precursor athmi319a bởi đoạn miRNA 21 nu mới nhờ kỹ
thuật PCR overlapping. Cấu trúc amiRNA sau
đó được nhân dịng bởi vector pJET1.2/blunt
(Thermo Scentific) và giải trình tự nhằm đảm
bảo tính chính xác trước khi gắn vào vector
biểu hiện.
Gắn cấu trúc amiRNA vào vector biểu hiện
Đoạn miR319a trong vector pSM103 (Melito

và ctv, 2010) được thay thế bằng đoạn trình tự
amiRNA tổng hợp được. Vector pSM103 và
đoạn amiRNA được xử lý bằng enzyme cắt
BamHI và PstI (Thermo Scientific) và nối với
nhau nhờ enzyme T4 DNA ligase (Thermo
Scientific) để tạo vector tái tổ hợp. Vector tái
tổ hợp pSM103-amiRNA được tạo dòng trong
tế bào E. coli TOP10 khả biến bằng phương
pháp sốc nhiệt, sau đó biến nạp vào vi khuẩn
A. tumefaciens LBA4404 để chuyển cấu trúc
amiRNA vào cây chủ.
Chuẩn bị lá mầm đậu nành DT22
Hạt được khử trùng theo quy trình khử mẫu
của Trần Thị Cúc Hịa (2008). Chuẩn bị mẫu
lá mầm đậu nành theo quy trình của Phan Lê
Tư và ctv (2018): đậu nành (5 - 7 ngày) được
giữ lại phần trụ hạ diệp cách nốt lá mầm
khoảng 3 - 5 mm, đồng thời dùng dao tạo 3 4 vết thương tại mặt trong vị trí trụ hạ diệp tiếp
giáp lá mầm.
Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens
LBA4404
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404
mang vector pSM103-amiRNA được nuôi
trên môi trường YEB rắn (An và ctv, 1988) bổ
sung 50 mg/l kanamycin ở 28oC trong 48 giờ.
Khuẩn lạc đơn phát triển tốt được tăng sinh
trong môi trường YEP lỏng chứa 50 mg/l
kanamycin ở 28oC đến khi OD600 đạt 1,0 - 1,2.
Tiến hành thu sinh khối vi khuẩn và pha loãng
trong môi trường IM lỏng thành dạng huyền

phù.
Đồng nuôi cấy và tái sinh chồi đậu nành
Mẫu nốt lá mầm được ngâm với dịch huyền
phù vi khuẩn trong 30 phút. Mẫu sau nhiễm
được thấm khô và đặt úp lên môi trường CCM

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Thiết kế và tổng hợp miRNA nhân tạo
Từ danh sách các amiRNA gợi ý, amiRNA ứng
viên được chọn theo các tiêu chí: 1) bất hoạt
gene mục tiêu ở tuyến trùng mà không bất hoạt
các gene khác của đậu nành; 2) vị trí gắn của
miRNA nhân tạo với mRNA mục tiêu nằm ở
vùng 3’; 3) năng lượng liên kết giữa amiRNA
với mRNA mục tiêu từ -35 đến -40 kcal/mol,
không quá -30 kcal/mol; 4) không bắt cặp sai
từ vị trí 2 - 12 của amiRNA đối với đoạn mục
tiêu. Trong nghiên cứu này, microRNA nhân
tạo được chọn ký hiệu là amiR14137, có trình
tự 5’-UAACUAUAAUCUAGGGCACGU-’3
được tổng hợp theo quy trình miêu tả bởi
Schwab và ctv (2006), precursor mang cấu trúc
amiRNA được tổng hợp có kích thước khoảng
428 bp. Cấu trúc precursor mang amiR14137
được tạo dòng nhờ vector pJET1.2/blunt trong
tế bào E. coli TOP10 và sàng lọc bằng PCR
khuẩn lạc. Plasmid tái tổ hợp của 3 dòng vi
khuẩn ngẫu nhiên được tách chiết và giải trình
tự với primer pJET1.2-F. Kết quả sau hiệu đính

91


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019

Kỷ yếu khoa học

bp và một đoạn 2974 bp. Trên thực tế, kết quả
điện di sản phẩm cắt vector pSM103 cho một
băng có kích thước lớn hơn 10 kb và một băng
tương đương 400 bp, plasmid pJET1.2/bluntamiR14137 cho một băng có kích thước gần 3
kb và một băng hơn 400 bp (Hình 1).

cho thấy cấu trúc amiR14137 có chiều dài và
trình tự đúng với dự tính.
Tạo vector biểu hiện cấu trúc amiRNA
Theo lí thuyết, pSM103 sau khi cắt tạo sản
phẩm gồm hai đoạn có kích thước lần lượt là
412 bp và khoảng 12 kb; trong khi
pJET1.2/blunt-amiR14137 cho một đoạn 428

Hình 1. Kết quả cắt vector (a) pSM103 và (b) pJET1.2-amiR14137.
(M): DNA marker 1 kb; (1): plasmid; (2): cắt bằng BamHI và PstI
Vector pSM103 mở vòng và đoạn amiR14137 sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc (Hình 2). Kết
được thu hồi từ gel agarose bằng GeneJET Gel quả đã tạo dịng thành cơng amiRNA trong vi
Extraction Kit (Thermo Scientific) và tái tổ khuẩn E. coli. Cấu trúc này được thu nhận,
hợp bằng enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens
nối sau đó được biến nạp vào tế bào khả nạp LBA4404 kanamycin và áp dụng tạo cây đậu
E. coli TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt. nành chuyển gene.
Các dòng vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp được

Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR sàng lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp
(M): DNA marker 100 bp; (1-10): các k�����
bào thực vật. Mẫu trên môi trường đồng nuôi
Đồng nuôi cấy và tái sinh chồi
Trong q trình chuyển gene thơng qua vi cấy đã cảm ứng (phình to, mép lá cong lên
khuẩn A. tumefaciens, đồng nuôi cấy là giai khỏi mặt tiếp xúc với môi trường). Trên môi
đoạn vi khuẩn thực hiện cơ chế chuyển đoạn trường thanh lọc và tái sinh chồi từ vị trí vết
T-DNA vào tế bào. Q trình này ảnh hưởng thương đã tạo mẫu tái sinh từ 1 - 2 chồi mỗi
rất lớn đến khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn chồi có chiều cao từ 1 - 2 cm, chồi có màu
xanh nhạt.
và kết quả của quá trình chuyển gene vào tế

92


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019

Kỷ yếu khoa học

Hình 3. Hình thái mẫu đậu nành và chồi tái sinh trên các môi trường
a) đồng nuôi cấy ; b) tái sinh chồi; c) 5mg/L hygromyci; d) 10mg/L hygromycin
mg/l hygromycin và tiếp tục theo dõi. Trên
Kết quả chọn lọc chồi chuyển gene
Trong nghiên cứu này, chồi giả định chuyển môi trường bổ sung 10 mg/l hygromycin
gene được chọn lọc trên môi trường bổ sung nhận thấy hầu hết chồi nhanh bị ức chế sinh
10 mg/l hygromycin tương đồng với nghiên trưởng, vàng lá và chết. Bảng 1 cho thấy kết
cứu của (Phan Lê Tư và ctv, 2018). Kết quả quả thu nhận được trong thời gian 4 ngày đồng
Hình 3 cho thấy, các chồi giả định chuyển nuôi cấy: 3 mẫu chồi ở đợt 1 (2,5%), 2 mẫu
gene khi chuyển lên môi trường chọn lọc chồi ở đợt 2 (1,67%); trong thời gian 6 ngày

chứa 5 mg/l hygromycin vẫn phát triển với tỷ đồng nuôi cấy: 6 mẫu chồi ở đợt 1 (5,0%).
lệ mẫu sống trên 90% tuy nhiên một phần lá Mẫu chồi đậu nành cịn sống trên mơi trường
mầm có dấu hiệu vàng, xuất hiện các đốm 10 mg/l hygromycin sẽ được kiểm tra bằng
đen trên lá mầm và chồi phát sinh, trụ mầm phương pháp PCR và chuyển sang môi trường
bị hoá nâu. Sau 28 ngày, mẫu chồi được vươn chồi.
chuyển lên môi trường chọn lọc chứa 10
Bảng 1. Kết quả chọn lọc chồi giả định chuyển gene đậu nành DT22
Tỷ lệ mẫu sống (%)
Đồng nuôi
Đợt
+5 mg/l hygromycin,
+10 mg/l hygromycin,
cấy
28 ngày
28 ngày
4 ngày
6 ngày

1

96,0 (24/25)

12,0 (3/25)

2

92,3 (24/26)

7,69 (2/26)

1

93,6 (44/47)

12,8 (6/47)

Kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 4) cho
thấy ở 1 dịng giả định chuyển gene có sự xuất
hiện của một băng DNA có kích thước khoảng
500 bp khi so sánh với thang chuẩn (phù hợp
với kích thước của gene hptII được khuếch đại
là 507 bp), phù hợp với kích thước của gene
hptII trên plasmid và kích thước của gene

hptII trên chồi đậu nành đã được chuyển gene
thành công ở nghiên cứu trước. Trong khi đó
mẫu đối chứng âm (-) (cây khơng chuyển
gene) cho kết quả âm tính. Do đó, có thể
khẳng định sự hiện diện của gene hptII trên
mẫu thí nghiệm.

93


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019

Kỷ yếu khoa học

Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự hiện diện của gene hptII trên mẫu chồi giả
định chuyển gene

(L) Hyper Ladder 100bp, Bioline;(P) plasmid; (+) đối chứng dương; (-) đối chứng
âm; (1 - 11) tương ứng với các dòng cây giả định chuyển gene của giống DT22
Hiệu quả chuyển nạp cao là tiền đề nhằm nghiên KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
cứu chức năng của gene và chọn giống theo Dựa vào trình tự gene Minc14137, cấu trúc
phương pháp phân tử. Chuyển gene gián tiếp amiRNA có khả năng bất hoạt sự biểu hiện
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens là phương của gene này đã được tổng hợp và biến nạp
pháp thường dùng để cải tiến giống cây trồng, thành công vào vi khuẩn A. tumefaciens
trong đó bốn yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu LBA4404 để tạo cây đậu nành biến đổi gene.
quả xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium Thời gian đồng nuôi cấy 6 ngày giúp tăng số
bao gồm mật độ vi khuẩn, giống đậu nành, môi mẫu tạo chồi sau lây nhiễm và hiệu quả
trường huyền phù và thời gian đồng nuôi cấy. chuyển nạp gene so với thời gian đồng nuôi
Thời gian đồng nuôi cấy 6 ngày trên giống đậu cấy 4 ngày. Cần tiếp tục cải tiến quy trình
nành DT22 đã giúp tăng tỷ lệ mẫu cảm ứng, từ chuyển gene và tạo cây đậu nành, sau đó thực
đó tăng số chồi tái sinh và hiệu quả chuyển nạp hiện khảo sát thực tế với tuyến trùng M.
incognita.
gene.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
MELITO S., HEUBERGER A.L., COOK D., DIERS B.W., MACGUIDWIN A.E., BENT A.F.
2010. A nematode demographics assay in transgenic roots reveals no significant impacts
of the Rhg1 locus LRR-Kinase on soybean cyst nematode resistance. BMC Plant Biol. 10:
104.
NGUYỄN VŨ PHONG. 2018. Tạo vector biểu hiện chứa cấu trúc microRNA nhân tạo nhằm
bất hoạt gene tuyến trùng Meloidogyne incognita. Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp.2:
48-49.
PHAN LÊ TƯ, TƠN BẢO LINH, NGUYỄN VŨ PHONG (2018). Đánh giá khả năng tái sinh
và chuyển gene nhờ vi kh��=
Agrobacterium tumefaciens ở một số giống đậu nành . Tạp
chí KHKT Nơng Lâm nghiệp.1: 8-15.
SCHWAB R, OSSOWSKI S, RIESTER M, WARTHMANN N, WEIGEL D, 2006. Highly
specific gene silencing by artificial miRNAs in Arabidopsis. Plant Cell 18: 1121- 1133.

TRẦN THỊ CÚC HỊA (2008). Tối ưu hóa quy trình chuyển nạp gene đậu tương bằng cải tiến
phương pháp lây nhiễm với Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Nơng nghiệp và Phát
triển Nông thôn 9: 8-11.

94