Chuyển gen Retrotransposon Tnt1 vào cây đậu nành (Glycine max) bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
oOo


TRẦN LÊ LƯU LY








CHUYỂN GEN RETROTRANSPOSON Tnt1
VÀO CÂY ĐẬU NÀNH (Glycine max) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP Agrobacterium tumefaciens









LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2011


Lời cảm ơn
Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi đã luôn nhận được rất
nhiều sự giúp đỡ từ các thầy, cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
TS . N guyễn Hữu Hổ đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi
hoàn thành luận văn này.
P GS . TS . Bùi Văn Lệ đã giảng dạy, truyền đạt kinh
nghiệm và góp ý cho tôi trong suốt thời gian học tập và
nghiên cứu.
Cô Cung Hoàng P hi P hượng, chò N guyễn Hồng N hã
Trân, bạn N guyễn Thanh N hật Q uang đã ủng hộ, giúp đỡ
về mọi mặt trong thời gian tôi làm luận văn xa nhà.
Thầy Kiều P hương N am, Chò Q uách N gô Diễm P hương,
bạn N guyễn Hữu Hoàng, bạn Bùi Xuân S ơn, em Trần
Minh Tuấn, em Hoàng Thò Thanh Minh, cùng các em sinh
viên đã và đang làm việc tại bộ môn CN S H Thực vật đã
nhiệt tình giúp đỡ tôi trong công việc, học tập cũng như
nghiên cứu.
Chò Bùi Lan A nh, chò N guyễn P han Cẩm Tú đã tận tình
góp ý và sửa chữa trong quá trình hoàn thiện luận văn.

A nh và gia đình đã luôn bên cạnh, ủng hộ và nâng đỡ tôi.
I would like to be grateful to:
Dr Zhanyuan Zhang, the Director of P lant Transformation
Core Facility (P TCF), University of Missouri for thoughtful
recommendations and helpful scientific discussions.
Dr Barapuram S hyam, Dr Heyoung Lee, J ennie and all
staff members of P TCF for kindly showing me the soybean
transformation protocol and friendly helping during my
work.
Dr Henry T. N guyen for providing the scholarship and
financial support to me during this study.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 1 tháng 1 năm 2011
Trần Lê Lưu Ly

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC BẢNG viii
MỞ ĐẦU 1
1 TỒNG QUAN 3
1.1 Cây đậu nành 3
1.1.1 Vị trí phân loại 3
1.1.2 Đặc điểm sinh học 3
1.1.3 Điều kiện nuôi trồng 4

1.1.4 Nguồn gốc, phân bố và sản lượng đậu nành trên thế giới 4
1.1.5 Thành phần dinh dưỡng của hạt đậu nành 5
1.1.6 Nuôi cấy mô, tạo vật liệu cho quá trình chuyển gen ở cây đậu
nành 5
1.1.7 Giá trị thương mại của cây đậu nành 7
1.2 Chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens 8
1.2.1 Phân loại vi khuẩn A. tumefaciens 8
1.2.2 Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh của A. tumefaciens 8
1.2.3 Ti plasmid 8
1.2.4 Quá trình xâm nhiễm của A. tumefaciens 10
1.2.5 Ứng dụng Ti plasmid trong công nghệ gen thực vật 11
1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen bằng A.
tumefaciens… 12
1.3 Một số phương pháp chuyển gen khác 17
1.3.1 Phương pháp bắn gen 18
ii

1.3.2 Phương pháp SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium-
mediated transformation) 18
1.3.3 Phương pháp lọc chân không 19
1.3.4 Phương pháp Floral-dip 19
1.3.5 Phương pháp Agrolistic 19
1.3.6 Vi tiêm DNA 19
1.3.7 Vi sợi "whiskers" 20
1.3.8 Phương pháp PEG (Polyethylene glycol) 20
1.3.9 Phương pháp xung điện 20
1.4 Retrotransposon 20
1.4.1 Giới thiệu… 21
1.4.2 Cơ chế chuyển vị của retrotransposon 21

1.4.3 Phân loại retrotransposon thực vật 22
1.4.4 Phân lập và ứng dụng LTR retrotransposon thực vật 23
1.4.5 Retrotransposon Tnt1 24
1.5 Nghiên cứu chọn tạo giống đậu nành trên thế giới 25
1.5.1 Chọn tạo giống đậu nành bằng phương pháp truyền thống 25
1.5.2 Chọn tạo giống đậu nành bằng phương pháp chuyển gen 26
1.6 Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong phân tích cây chuyển gen 32
1.6.1 Phương pháp thử in vitro và ex vitro khả năng biểu hiện gen chọn
lọc bar của cây chuyển gen 32
1.6.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng
hợp dây chuyền dùng polymerase) 32
1.6.3 Điện di trên gel agarose 34
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35
2.1 Vật liệu 35
2.1.1 Đậu nành… 35
2.1.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và plasmid 36
2.1.3 Vật liệu cho các thí nghiệm sinh học phân tử 36
2.2 Phương pháp 38
iii

2.2.1 Tách chiết plasmid pZY 101 – Tnt1 và kiểm tra sự hiện diện của
Tnt1 bằng phản ứng enzyme cắt giới hạn 38
2.2.2 Khử trùng và gieo in vitro hạt đậu nành 39
2.2.3 Các bước thực hiện quy trình chuyển gen bằng A. tumefaciens
trên mẫu lá mầm cây đậu nành 40
2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi
chưa chuyển gen………. 43
2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của tuổi lá mầm đậu nành lên hiệu quả
chuyển gen 44

2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả chuyển
gen 44
2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả
chuyển gen 45

2.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem
kết hợp với timentin lên sự loại bỏ vi khuẩn A. tumefaciens
AGL1 sau khi đồng nuôi cấy……… 45
2.2.9 Chọn lọc chồi chuyển gen, ra rễ và chuyển cây ra vườn ươm 47
2.2.10 Kiểm tra sự biểu hiện của gen bar ở cây chuyển gen ngoài vườn
ươm bằng phương pháp leaf – painting 48
2.2.11 Tách chiết DNA cây chuyển gen giả định và kiểm tra sự hiện
diện của gen bar trong genome bằng phương pháp PCR 49
2.3 Phương pháp xử lí số liệu 50
2.4 Điều kiện thí nghiệm 50
3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52
3.1 Tách chiết plasmid pZY 101 – Tnt1 và kiểm tra sự hiện diện của Tnt1
bằng phản ứng enzyme cắt giới hạn 52
3.2 Khử trùng và gieo in vitro hạt đậu nành 53
3.3 Khảo sát ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa
chuyển gen 54
3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tuổi lá mầm đậu nành lên hiệu quả chuyển gen 56
iv

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả chuyển gen 60
3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển
gen 62
3.7 Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp
với timentin lên sự loại bỏ vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 sau khi đồng
nuôi cấy…… 64

3.7.1 Ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp
với timentin lên sự phát triển của vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 64
3.7.2 Ảnh hưởng của kháng sinh meropenem và meropenem kết hợp
với timentin lên sự loại bỏ A. tumefaciens ra khỏi mẫu chuyển
gen qua các giai đoạn nuôi cấy……… 66
3.8 Chọn lọc chồi chuyển gen, ra rễ và chuyển cây ra vườn ươm 69
3.9 Kiểm tra sự biểu hiện của gen bar ở cây chuyển gen ngoài vườn ươm
bằng phương pháp leaf – painting 71
3.10 Tách chiết DNA cây chuyển gen giả định và kiểm tra sự hiện diện của
gen bar trong genome bằng phương pháp PCR 73
4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76
4.1 Kết luận 76
4.2 Đề nghị 77
5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79
PHỤ LỤC


v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
AS Acetosyringone
Asp Asparagine
BA 6 – Benzyladenin
Bp Base pair
Cfu Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony forming unit)
DNA Deoxyribonucleic Acid
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamine tetracetic acid
GA

3
Gibberellic acid
Glu Glutamine
GM Môi trường nảy mầm (Germination medium)
IAA Indole – 3 – acetic acid
IBA Indole – 3 – butyric acid
MES 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid
MPN Meropenem
OD Mật độ quang (Optical density)
PCR Polymerase Chain Reaction
RM Môi trường ra rễ (Rooting medium)
Rpm Vòng/phút (Revolutions per minute)
SE Môi trường kéo dài chồi (Shoot elongation
medium)
SI Môi trường cảm ứng tạo chồi (Shoot induction
medium)
TAE Tris - acetate - EDTA
UV Ultra – Violet

vi

DANH MỤC HÌNH
TỔNG QUAN
Hình 1. 1: Cây đậu nành 3
Hình 1. 2: Các quốc gia chính sản xuất đậu nành trên thế giới, thống kê năm
2009 4
Hình 1. 3: Tái sinh in vitro cây đậu nành thông qua việc tạo phôi soma 6
Hình 1. 4: Một số sản phẩm từ đậu nành 7
Hình 1. 5: Trồng và thu hoạch đậu nành tại Mỹ 7
Hình 1. 6: Agrobacterium tumefaciens 8

Hình 1. 7: Cấu tạo của Ti plasmid 9
Hình 1. 8: Mô hình phân tử quá trình xâm nhiễm của A. tumefaciens 10
Hình 1. 9: Sơ đồ cấu trúc các loại retrotransposon. 22
Hình 1. 10: Cơ chế chuyển vị của DNA transposon và retrotransposon 22
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Hình 2. 1: Cấu trúc plasmid pZY 101 và pSH – Tnt1. 36
Hình 2. 2: Bình hút ẩm dùng để khử trùng (A) và hạt đã khử trùng trên môi
trường GM (B) 40
Hình 2. 3: Quy trình tạo vết thương trên vùng nốt lá mầm. 41
Hình 2. 4: Mẫu lá mầm đậu nành sau khi ủ chung với vi khuẩn trên môi trường
đồng nuôi cấy. 42
Hình 2. 5: Khuẩn lạc A. tumefaciens AGL1 mang plasmid pZY 101 – Tnt1 trên
môi trường YEP + 30 mg/l rifampicin + 100 mg/l spectinomycin. 42
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Hình 3. 1: Kết quả điện di plasmid pZY 101 – Tnt1 và plasmid pZY 101 – Tnt1
cắt với enzyme EcoRI 52
Hình 3. 2: Hạt đậu nành giống Maverick đã khử trùng (A) và nảy mầm 5 ngày
trên môi trường GM (B) 53
Hình 3. 3: Biểu đồ ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa
chuyển gen. 55
vii

Hình 3. 4: Ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển
gen sau 2 tuần nuôi cấy 55
Hình 3. 5: Biểu đồ ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen cây đậu
nành. 57
Hình 3. 6: Ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen qua các giai
đoạn nuôi cấy: A – giai đoạn tái sinh, B – giai đoạn chọn lọc, C – giai
đoạn kéo dài lần cấy chuyền thứ 1, D – giai đoạn kéo dài lần cấy chuyền
thứ 2. 58

Hình 3. 7: Chồi trên môi trường SI không glufosinate (A) và có 10 mg/l
glufosinate (B) quan sát dưới kính lúp 59
Hình 3. 8: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả biến nạp gen 61
Hình 3. 9: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển
gen. 62
Hình 3. 10: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen
qua các giai đoạn nuôi cấy. 63
Hình 3. 11: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp timentin lên sự
phát triển của A. tumefaciens AGL1. 65
Hình 3. 12: Biểu đồ ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với
timentin lên hiệu quả chuyển gen qua các giai đoạn nuôi cấy. 67
Hình 3. 13: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên
sự loại bỏ A. tumefaciens ra khỏi mẫu qua các giai đoạn nuôi cấy 68
Hình 3. 14: Chọn lọc chồi và ra rễ in vitro 70
Hình 3. 15: Cây đậu nành chuyển gen trong phòng tăng trưởng 71
Hình 3. 16: Cây đậu nành chuyển gen sau 15 ngày chuyển ra nhà kính. 72
Hình 3. 17: Thử nghiệm leaf – painting ngoài vườm ươm 73
Hình 3. 18: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen bar 74
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Hình 4. 1: Quy trình chuyển gen trên đậu nành bằng phương pháp
Agrobacterium tumefaciens. 77
viii


DANH MỤC BẢNG
TỔNG QUAN
Bảng 1. 1: Một số công trình nghiên cứu về chuyển gen đậu nành công bố trong
và ngoài nước. 29
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Bảng 2. 1: Thành phần các loại môi trường nuôi cấy in vitro cây đậu nành 35

Bảng 2. 2: Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen bar. 50
Bảng 2. 3: Chương trình PCR khuếch đại gen bar. 50
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Bảng 3. 1: Kết quả đo NanoDrop plasmid pZY 101 – Tnt1. 52
Bảng 3. 2: Ảnh hưởng của glufosinate lên sự phát triển của chồi chưa chuyển
gen 54
Bảng 3. 3: Ảnh hưởng của tuổi lá mầm lên hiệu quả chuyển gen cây đậu nành. 57
Bảng 3. 4: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lên hiệu quả chuyển gen 60
Bảng 3. 5: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen 62
Bảng 3. 6: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp với timentin lên
sự phát triển của A. tumefaciens AGL1. 65
Bảng 3. 7: Ảnh hưởng của meropenem và meropenem kết hợp timentin lên sự
loại bỏ vi khuẩn qua các giai đoạn nuôi cấy của quá trình chuyển gen 66








1

MỞ ĐẦU
Thuốc lá chuyển gen ra đời đầu tiên năm 1983 đã mở đầu cho sự phát
triển và tiến bộ của cây chuyển gen. Các loại cây trồng chuyển gen như đậu
nành, bông vải, bắp, lúa và các loại cây cảnh đã được nghiên cứu rộng rãi và
thương mại hóa trên thế giới. Theo thống kê của ISAAA (2010), có 14 triệu
nông dân, ở 25 quốc gia, trồng 134 triệu hecta cây biến đổi gen vào năm 2009,
tăng 7% so với năm 2008.

Đậu nành là một trong những cây thực phẩm có hàm lượng dầu thực vật
và dinh dưỡng cao, dễ trồng và có hiệu quả kinh tế. Sản phẩm từ cây đậu nành
được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu
phụ, ép thành dầu đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu nành…đáp
ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc.
Ngoài ra, dầu và protein của đậu nành còn được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh
vực công nghiệp và dầu sinh học (biodiesel). Năm 2009, sản lượng đậu nành
chiếm 53% hạt có dầu trên toàn thế giới. Mỹ là nước sản xuất đậu nành lớn
nhất thế giới với 31,4 triệu hecta đạt doanh thu 31,9 tỉ đô la, trong đó 34,9 triệu
tấn đậu nành đã được xuất khẩu thu về 21 tỉ đô la. Trung Quốc là khách hàng
tiêu thụ đậu nành lớn nhất của Mỹ với 9,2 tỉ đô la, Mexico xếp thứ 2 với 1,3 tỉ
đô la [63].
Tại Việt Nam, đậu nành là cây thực phẩm quan trọng với nhu cầu tiêu
thụ ngày càng tăng cao, tuy nhiên năng suất cây trồng này còn thấp, bình quân
chỉ khoảng 1,9 tấn/ha. Vì vậy việc áp dụng các phương pháp biến đổi, tạo
giống mới, tạo nhiều biến dị tốt là cần thiết để giúp nâng cao năng suất đậu
nành. Kỹ thuật chuyển gen có thể đưa ra một con đường hiệu quả hơn các
phương pháp truyền thống cho phép đưa các tính trạng đặc biệt vào cây đậu
nành như khả năng kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, tổng hợp acid amin,
tăng hàm lượng acid béo, sản xuất dầu sinh học…
Kể từ khi nghiên cứu chuyển gen trên cây đậu nành đầu tiên được công
bố vào năm 1988 (Hinchee và cộng sự, 1988; McCabe và cộng sự, 1988), đậu
nành biến đổi gen đã được nghiên cứu phát triển và nhân giống rộng rãi bởi các
2

nhà sản xuất của Mỹ, Argentina, Canada, Brazil…77% đậu nành thương mại
hóa trên thị trường là đậu nành đã biến đổi gen. Genome của đậu nành cũng đã
được giải trình tự trong thời gian gần đây bởi các nhà nghiên cứu của viện
Energy – Joint Genome (DOE - JGI) mở ra nhiều cơ hội mới cho công tác nhân
giống và chuyển gen đậu nành. Có khoảng 60.000 gen được phân tích trong đó

5.671 là các nhân tố phiên mã sẽ quyết định kiểu hình bao gồm kháng hạn,
kháng ngập úng, nồng độ protein và dầu cao…[55] Tuy nhiên, khoảng 45 –
50.000 gen của đậu nành đến nay vẫn còn chưa rõ chức năng. Do đó, nhiệm vụ
các nhà nghiên cứu di truyền cây đậu nành là tập trung vào việc tìm hiểu các
gen quy định các tính trạng có lợi cho con người. Việc ứng dụng các nhân tố
chuyển vị trong chuyển gen trên thực vật nhằm tạo ra các quần thể đột biến
không chỉ với mục tiêu làm đa dạng giống loài mà còn là một trong những công
cụ đắc lực cho việc tìm hiểu chức năng của gen thông qua di truyền ngược. Các
nhân tố chuyển vị được ứng dụng cho thực vật bao gồm: retrotransposon Tnt1
(phân lập từ cây thuốc lá), Ac/Ds (phân lập từ cây bắp) và mPing (phân lập trên
lúa)…
Trong thời gian gần đây ở nước ta đã có nhiều nghiên cứu về chuyển
gen vào thực vật gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumafaciens, tuy
nhiên chưa có nhiều nghiên cứu được thực hiện trên cây đậu nành. Do đó, mục
đích nghiên cứu của luận văn “Chuyển gen Retrotransposon Tnt1 vào cây đậu
nành (Glycine max) bằng phương pháp Agrobacterium tumefaciens” là tối ưu hóa
một số thông số của qui trình chuyển gen dùng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens trên cây đậu nành, đồng thời thử nghiệm biến nạp gen mã hóa
retrotransposon Tnt1 nhằm tạo ra các quần thể mang đột biến chèn cho nghiên
cứu kiểu hình và làm vật liệu cho các nghiên cứu di truyền ngược tìm hiểu chức
năng của gen.
Trang 3
Tổng quan
1 TỒNG QUAN
1.1 Cây đậu nành
1.1.1 Vị trí phân loại
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Fabales

Họ: Fabaceae
Họ phụ: Faboideae
Chi: Glycine
Loài: Glycine max
1.1.2 Đặc điểm sinh học
Đậu nành là cây thân cỏ nhất niên cao 0,5 – 1 m. Thân, lá, hoa, trái có
lông đứng, vàng. Lá – phụ xoan nhọn, dài 3 – 12 cm; lá bẹ 3 – 7 mm. Chùm ở
nách lá, dài 1 – 2 cm; hoa dày, tím hay trắng; đài 5 mm, 5 răng, hai trên đính
nhau. Trái dẹp dẹp, to 4 x 0,8 cm; hột 2 – 5, xoan tròn, vàng ít khi đen [4].
Glycine max là loài có tính tự thụ phấn với tỉ lệ lai chéo thấp hơn 1%
(Chiang và Kiang, 1987). Do đó, cây đậu nành có kiểu gen gần như đồng hợp
thuần chủng. Đậu nành được di truyền từ 1 tổ tiên lưỡng bội có n=11, trải qua
quá trình lệch bội hóa (aneuploid) làm n=10 và theo sau đó là quá trình đa bội
hóa (polyploidization) để hình thành nên genome hiện nay với 2n=2x=40
(Lackey, 1980). Bằng chứng về sự nhân đôi bộ gen cho thấy genome đậu nành
tồn tại ổn định ở dạng thể bốn (tetraploid) với genome được nhị bội hóa. Có
khoảng 40-60% genome đậu nành chứa các trình tự lặp lại, được chứng minh
bằng phân tích RFLP (Goldberg, 1978; Gurley và cộng sự, 1979). 90% các mẫu
dò RFLP phát hiện các loci được nhân đôi (Shoemaker và cộng sự, 1996). Ở
đậu nành cũng có sự đa hình thấp trong genome, bằng chứng là Zhu và cộng sự
(2003) đã tính được tần số SNP (single nucleotide polymorphism) chỉ 0,5
SNP/kb trên vùng DNA mã hóa và 4,7 SNP/kb trên vùng DNA không mã hóa

Hình 1. 1: Cây đậu nành [71]
Trang 4
Tổng quan

Hình 1. 2: Các quốc gia sản xuất đậu nành lớn
trên thế giới, thống kê năm 2009 [72]
protein, trong khi con số này cao hơn gấp 10 lần ở bắp (Ching và cộng sự,

2002).
1.1.3 Điều kiện nuôi trồng
Đậu nành sinh trưởng tốt trong mùa hè nóng, nhiệt độ phát triển tối ưu
khoảng 20°C – 30°C, nhiệt độ dưới 20°C hoặc trên 40°C sẽ làm chậm quá trình
phát triển của cây. Chúng có thể phát triển trên một dãi rộng các loại đất, đặc
biệt tốt trên đất phù sa ẩm có hàm lượng chất hữu cơ cao. Đậu nành cũng như
các cây họ đậu khác cũng có quá trình cố định nitrogen thông qua sự cộng sinh
với vi khuẩn Rhizobium japonicum. Các giống đậu nành hiện nay có thể đạt
chiều cao khoảng 1 m, thời gian từ lúc gieo hạt đến thu hoạch khoảng 80 – 120
ngày [74].
1.1.4 Nguồn gốc, phân bố và sản lượng đậu nành trên thế giới
Đậu nành được gieo trồng lần đầu
tiên ở Trung Quốc cách đây khoảng
6000 năm, đây là một trong số những
cây lương thực đầu tiên được thuần hóa.
Cho đến nay, có khoảng 82 quốc gia trên
thế giới trồng và sản xuất các sản phẩm
từ đậu nành theo thống kê của tổ chức
FAO.
Năm 2009, tổng sản lượng đậu
nành được sản xuất trên thế giới là 210,9
triệu tấn. Mỹ là nước dẫn đầu với sản
lượng 80,7 triệu tấn (chiếm 38% so với
toàn thế giới). Brazil xếp thứ 2 với 57
triệu tấn chiếm 27%, Argentina 15% (32
triệu tấn), Trung Quốc 7% (15,5 triệu
tấn)…(hình 1.2) [11], [40], [59], [72].
Trang 5
Tổng quan
1.1.5 Thành phần dinh dưỡng của hạt đậu nành

Dầu và protein chiếm 60% trọng lượng khô của hạt đậu nành, trong đó
protein gồm 18 amino acid thiết yếu chiếm 40% và dầu chiếm 20%. Phần còn
lại gồm có 35% carbonhydrate và 5% chất xơ.
Hầu hết các protein từ đậu nành bền với nhiệt, do đó chúng có thể tồn tại
khi chế biến ở nhiệt độ cao như trong quy trình sản xuất đậu hũ, sữa đậu nành
hay bột đậu nành. Các dạng carbonhydrate chính của đậu nành là sucrose,
raffinose và stachyose.
Dầu đậu nành là một trong số ít các loại dầu thực vật phổ biến có chứa
một lượng lớn acid béo alpha – linolenic và omega – 6. Trong 100 g dầu có
chứa 7 g omega – 3 và 51 g omega – 6.
Đậu nành cũng có chứa các loại isoflavone là genistein và daidzeon với
hàm lượng 3 mg/g trọng lượng khô. Đây là các dạng của phytoestrogen được
các chuyên gia dinh dưỡng và bác sĩ công nhận là có tác dụng ngăn chặn ung
thư và các bệnh rối loạn nội tiết.
Ngoài ra, đậu nành còn chứa một lượng lớn phytic acid – một chất
chống oxy hóa có tác dụng giảm ung thư, tiểu đường và chứng sưng viêm [38],
[42], [67].
1.1.6 Nuôi cấy mô, tạo vật liệu cho quá trình chuyển gen ở cây đậu nành
[50]
Một trong những điều kiện cần thiết và trước tiên nhất cho mọi quy trình
chuyển gen là khả năng nhân giống cây trong điều kiện in vitro. Có hai phương
pháp tái sinh cây đậu nành in vitro chính đã được thiết lập là: tạo chồi bất định
và tạo phôi soma.
1.1.6.1 Tái sinh in vitro cây đậu nành thông qua sự phát sinh chồi bất định
Phát sinh chồi bất định là quá trình chồi hình thành và phát triển từ các
loại mô khác nhau. Chồi sẽ được nuôi cấy và tạo rễ để hình thành cây mới.
Trong quy trình chuyển gen, DNA ngoại lai sẽ được biến nạp vào mô phân sinh
chồi hoặc mô có khả năng phát sinh thành chồi.
Trang 6
Tổng quan

Hình 1. 3: Tái sinh in vitro cây đậu nành thông
qua việc tạo phôi soma [61]
Vùng giao nhau giữa lá mầm và trục hạ diệp (vùng nốt lá mầm –
cotyledonaty node) là nơi cung cấp nguồn mô phân sinh lí tưởng cho việc tạo
chồi. Chồi bất định trên cây đậu nành đã được nghiên cứu và công bố lần đầu
tiên bởi Wright và cộng sự năm 1986 với vật liệu ban đầu là nốt lá mầm. Khi
đặt mẫu trên môi trường có BAP, chồi được hình thành từ các vùng mô dưới
lớp biểu bì. Một trong những ưu điểm chính của phương pháp này là cây con
hoàn chỉnh được hình thành trong khoảng thời gian dưới 3 tháng, trong khi với
phương pháp thông qua phôi soma cần tới 4 tháng hoặc hơn.
1.1.6.2 Tái sinh in vitro cây đậu nành qua việc tạo phôi soma
Phát sinh phôi soma là quá
trình mà qua đó phôi được tạo thành
từ vi bào tử (microspore) hoặc mô
sinh dưỡng. Phôi soma có cả cực chồi
và cực rễ, sẽ hình thành cây con hoàn
chỉnh thông qua giai đoạn nảy mầm.
Finer (1988) đã công bố quy
trình tạo phôi soma trên cây đậu nành,
trong đó phôi được cảm ứng hình
thành từ vật liệu là lá mầm chưa
trưởng thành trên môi trường có nồng
độ 2,4-D cao (40 mg/l). Phôi có thể
được phân chia trên chính môi trường
cảm ứng hoặc nuôi cấy lỏng tạo dịch
huyền phù trên môi trường có nồng độ
2,4-D thấp hơn (Finer và Nagasawa, 1988). Các phân tích về mô học của quá
trình phân chia phôi soma cây đậu nành cho thấy, phôi mới được bắt nguồn tại
ngay hoặc gần vị trí mặt ngoài của phôi cũ (Finer và McMullen, 1991). Với hệ

thống này, phôi được xem là vật liệu thích hợp cho chuyển gen trên đậu nành.

Trang 7
Tổng quan

Hình 1. 5: Trồng và thu hoạch đậu nành tại Mỹ [69], [70], [73]

Hình 1. 4: Một số sản phẩm từ đậu nành [60]
1.1.7 Giá trị thương mại của cây đậu nành
Đậu nành là cây thực phẩm có hàm
lượng dinh dưỡng cao, dễ trồng và có hiệu
quả kinh tế. Sản phẩm từ cây đậu nành được
sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt
thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành
dầu đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo,
sữa đậu nành đáp ứng nhu cầu đạm trong
khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng
như gia súc. Ngoài ra, dầu và protein của
đậu nành còn được ứng dụng rất nhiều trong
lĩnh vực công nghiệp và dầu sinh học
(biodiesel).
Năm 2009, sản lượng đậu nành
chiếm 53% hạt có dầu trên toàn thế giới.
Mỹ là nước sản xuất đậu nành lớn nhất thế giới với 31,4 triệu hecta doanh thu
31,9 tỉ đô la, trong đó 34,9 triệu tấn đậu nành đã được xuất khẩu thu về 21 tỉ đô
la. Trung Quốc là khách hàng tiêu thụ đậu nành lớn nhất của Mỹ với 9,2 tỉ đô
la, Mexico xếp thứ 2 với 1,3 tỉ đô la [63].
Ở Việt Nam và một số quốc gia châu Á khác, đậu nành là một trong
những cây lương thực chủ yếu. Trong một vài năm gần đây, nông dân vùng
đồng bằng sông Cửu Long như ở Lấp Vò, Lai Vung (Đồng Tháp), Chợ Mới

(An Giang), Phước Thới (Ô Môn, Cần Thơ) đã trồng đậu nành thay thế cho vụ
lúa xuân hè do hiệu quả kinh tế cao hơn so với trồng lúa. Giá đậu nành thương
Trang 8
Tổng quan
phẩm tại Việt Nam là 15.000 đồng/kg, thu nhập từ 3,5 – 40 triệu đồng/công, trừ
chi phí mỗi công còn lãi trên 2 triệu đồng [66].
1.2 Chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
1.2.1 Phân loại vi khuẩn A. tumefaciens
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhizobiales
Họ: Rhizobiaceae
Loài: Agrobacterium tumefaciens
1.2.2 Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh của A. tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn Gram âm, hình que, di động,
không sinh bào tử, sống tự do trong đất, tăng trưởng tối ưu ở 32
o
C.
A. tumefaciens có cấu trúc bộ gen đặc biệt gồm 2 nhiễm sắc thể (1
nhiễm sắc thể vòng và 1 nhiễm sắc thể dạng sợi thẳng) và 2 plasmid dạng vòng,
tổng cộng có khoảng 5400 gen. Trong đó có Ti plasmid (Tumor inducing) dài
hơn 200 kb đóng vai trò then chốt trong sự cảm ứng hình thành khối u bệnh ở
thân và rễ của thực vật hai lá mầm, đặc biệt là họ hoa hồng như: đào, lê, táo,
hạnh nhân, mâm xôi….
Khi xâm nhiễm vào cây A. tumefaciens sẽ di chuyển khắp hệ thống rễ
làm giảm khả năng hấp thụ dinh dưỡng của rễ, làm giảm sức sống của cây
nhưng đối với những cây trưởng thành, tác động của bệnh không nhiều [2],
[44], [64].
1.2.3 Ti plasmid

Ti plasmid là DNA vòng riêng biệt của A. tumefaciens có khả năng sao
chép độc lập trong tế bào vi khuẩn. Plasmid gồm hai thành phần chính là T-DNA
và vùng vir (vùng độc tính), ngoài ra còn có vùng sao chép plasmid, vùng phụ
trách chuyển nạp plasmid và vùng dị hóa opine (hình 1.7) [2], [44], [64].

Hình 1. 6: Agrobacterium tumefaciens [62]
Trang 9
Tổng quan

Hình 1. 7: Cấu tạo của Ti plasmid
1.2.3.1 T-DNA
T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 25 kb chứa các gen mã hóa cho
quá trình sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Nhờ khả
năng tổng hợp auxin và cytokinin mà các tế bào khối u của thực vật bị nhiễm
có thể tăng trưởng in vitro mà không cần bổ sung thêm các chất điều hoà tăng
trưởng.
Opine là các amino acid bất thường được vi khuẩn sử dụng như nguồn
dinh dưỡng (nguồn carbon và nitơ) để sinh sản nhanh chóng. Bản chất của
opine tùy thuộc vào kiểu plasmid của vi khuẩn và được quy định bởi Ti
plasmid. Các chủng A. tumefaciens khác nhau sẽ mang các dạng Ti plasmid
khác nhau mã hóa cho việc sản xuất các dạng opine khác nhau. Các opine
thường gặp là: octopine, nopaline và agropine.
Trong Ti plasmid, vị trí T-DNA được giới hạn bằng lề phải (Right
Border-RB) và lề trái (Left Border-LB). Đây là những trình tự lặp lại bao gồm
25 cặp nucleotide, đóng vai trò như tín hiệu nhân tố cis cho bộ máy vận chuyển
T-DNA từ plasmid của vi khuẩn vào DNA tế bào thực vật [2], [44], [64].
1.2.3.2 Vùng gen vir
Quá trình vận chuyển T-DNA là sự phối hợp nhịp nhàng bởi hoạt động
của các protein được mã hóa trong vùng vir
(vùng gen gây bệnh) của Ti plasmid và một

số gen trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn.
Vùng gen vir dài 30-40 kb bao gồm ít
nhất 6 operon quan trọng (virA, virB, virC,
virD, virE, virG ) và 2 operon không quan
trọng (virF, virH). Chỉ có 2 operon biểu hiện
chính là virA, virG, mã hóa cho một cấu trúc
2 thành phần virA-virG kích hoạt sự sao
chép của các gen vir khác. Các vùng virA, virB, virD, virG đóng vai trò thiết
yếu trong sự vận chuyển T-DNA, vùng virC, virE góp phần làm tăng tính hiệu
quả của quá trình xâm nhiễm [2].
Trang 10
Tổng quan
1.2.4 Quá trình xâm nhiễm của A. tumefaciens
Trong tự nhiên, khi cây bị thương sẽ tiết ra một số hợp chất phenol và
đường, các chất này thu hút A. tumefaciens. Tế bào A. tumefaciens sẽ bám vào
vách tế bào chủ ngay tại vị trí mô bị thương nhờ sự giúp đỡ của các “binding
protein” và “attachment protein” - được mã hóa bởi các gen chA, chB, pscA, và
att trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn.

Các hợp chất tiết ra từ mô bị thương, quan trọng nhất là các
monosaccharid và phenol, được nhận diện bởi hệ thống truyền tín hiệu 2 thành
phần VirA-VirG trên màng tế bào A. tumefaciens. VirA trực tiếp tương tác với
các hợp chất đó và trải qua quá trình tự phosphoryl hóa, kéo theo sự
transphosphoryl hóa của VirG - một nhân tố điều hòa phiên mã có chức năng
hoạt hóa các promotor của các gen vir khác trên Ti plasmid. Mạch đơn T-DNA
được tạo ra nhờ sự phối hợp hoạt động của VirD1 và VirD2 (có vai trò như các
endonuclease cắt chuyên biệt tại vùng lề phải và lề trái trên Ti plasmid). Ngay
sau khi cắt và hình thành bản sao T-DNA mạch đơn, VirD2 được gắn vào mạch
T-DNA này bằng nối cộng hóa trị tại đầu 5', hình thành phức hợp T chưa đầy
đủ (gồm mạch đơn T-DNA và VirD2). Chỗ hổng tại vùng T-DNA trên Ti

Hình 1.
8
: Mô hình phân t
ử

quá trình xâm nhi
ễ
m c
ủ
a
A
.
tumefaciens

[51]

Trang 11
Tổng quan
plasmid sẽ được sửa chữa nhờ quá trình tổng hợp DNA và cơ chế hồi phục của
vi khuẩn.
Phức hợp T chưa đầy đủ sẽ được đóng gói bởi các protein VirE2, hình
thành cấu trúc cuộn (để bảo vệ khỏi các nuclease nội bào và thuận tiện cho quá
trình vận chuyển), đây là phức hợp T đầy đủ. VirE2 sau đó sẽ bị tách ra khỏi
phức hợp bởi VirE1, ngăn không cho VirE2 gắn vào T-DNA cho đến khi vào tế
bào chất của tế bào thực vật. Bên cạnh đó, VirD4 kết hợp với 11 protein VirB
tạo thành phức hệ vận chuyển T-DNA vào tế bào chủ. VirD4 có tác dụng như
cầu nối thúc đẩy sự vận chuyển phức hợp T-DNA/VirE2 do VirB thực hiện.
Bên trong tế bào chất của tế bào chủ, VirD2 và VirE2 có mang tín hiệu
định vị nhân (nuclear locational signal - NLS) làm vô hiệu hóa các protein nhận

biết trên màng nhân. Ngoài ra, sự chuyển phức hợp T vào nhân qua lỗ nhân và
sát nhập vào bộ gen tế bào chủ được hỗ trợ bởi các tương tác giữa VirD2 và
VirE2 với các protein của tế bào chủ như: protein AtKAPα, CypA, RocA,
Roc1, PP2C, VIP1, VIP2, và Ran [51], [52].
1.2.5 Ứng dụng Ti plasmid trong công nghệ gen thực vật
Các nghiên cứu về cơ chế phân tử của quá trình chuyển T-DNA vào tế
bào thực vật cho thấy có 3 sự kiện của quá trình có thể ứng dụng trong biến nạp
gen thực vật:
- Thứ nhất: sự hình thành khối u ở các tế bào trải qua quá trình biến nạp
là kết quả của sự vận chuyển, sát nhập và biểu hiện các gen trên vùng T-DNA.
- Thứ hai: các gen trên vùng T-DNA chỉ được phiên mã trong tế bào
thực vật và không đóng vai trò gì trong quá trình vận chuyển.
- Thứ ba: bất kỳ DNA nào nằm giữa hai lề của T-DNA cũng đều được
chuyển vào tế bào thực vật.
Các sự kiện này cho phép các nhà khoa học phát triển các plasmid nhân
tạo, hệ thống các dòng vi khuẩn và biến A. tumefaciens trở thành công cụ đắc
lực trong công nghệ gen thực vật [35].
Vì Ti plasmid có nhiều nhược điểm (cồng kềnh, không có vùng
multicloning site, không tự nhân được trong tế bào E. coli và gây khối u cho
Trang 12
Tổng quan
cây chuyển gen), người ta cải tiến Ti plasmid bằng cách cắt bỏ các gen không
cần thiết, chèn thêm gen chọn lọc, gen chỉ thị, gen mục tiêu và các promotor
thích hợp để DNA có thể tự nhân trong tế bào E. coli, trong A. tumefaciens và
trong tế bào thực vật, thu nhỏ plasmid và có các vị trí thuận lợi cho enzyme cắt
giới hạn.
Các plasmid nhân tạo sử dụng cho A. tumefaciens gồm 2 loại:
- Vector đồng nhập (cointergrated vector): gen ngoại lai được gắn vào Ti
plasmid chung với vùng gen vir (Ruvkin và Ausubel, 1979). Dạng này gen
ngoại lai có thể gắn vào bất kì đâu trên vùng T-DNA (hay các vùng khác trên

Ti plasmid). Tuy nhiên loại vector này lớn và cồng kềnh, gây rất nhiều trở ngại.
- Vector hai nguồn (binary vector): gen ngoại lai được gắn vào trong
vùng T-DNA trên một ORF (open reading frame) riêng, khác với plasmid chứa
vùng gen vir (Hoekema và cộng sự, 1983; de Frammond và cộng sự, 1983).
Theo đó, có hai đơn vị sao chép cùng tồn tại song song trong tế bào A.
tumefaciens, một mang gen vir và một mang vùng T-DNA. Dạng này khắc
phục được sự cồng kềnh của vector đồng nhập nên được sử dụng rất phổ biến
[51].
1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen bằng A.
tumefaciens
Các nhân tố ảnh hưởng lên sự vận chuyển và sát nhập T-DNA vào bộ
gen thực vật bao gồm: kiểu gen của cây, loại mô, dòng vi khuẩn, hóa chất cảm
ứng gen vir, thành phần môi trường nuôi cấy, tình trạng hư hại của mô, sự loại
bỏ A. tumefaciens sau khi đồng nuôi cấy. Để thiết kế các quy trình tối ưu và gia
tăng hiệu quả biến nạp, người ta đi sâu tìm hiểu các nhân tố ảnh hưởng đến
hiệu quả biến nạp.
1.2.6.1 Xử lý mẫu cấy
Việc xử lý mẫu cấy là điều cần thiết trong việc gia tăng tính khả nạp và
thuận tiện trong bước tái sinh sau này.
- Xử lý thẩm thấu: việc bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy 200mM
sucrose và 200mM glucose đã được sử dụng rộng rãi trong các quy trình
Trang 13
Tổng quan
chuyển gen trên cây lúa và bắp (Hiei và cộng sự, 1994; Zhao và cộng sự, 2001;
Frame và cộng sự, 2002). Uze và cộng sự (1997) quan sát thấy xử lý với 65 g/l
sucrose làm tăng hiệu quả biến nạp ở phôi chưa trưởng thành của lúa. Tuy
nhiên, xử lý thẩm thấu không có hiệu quả trên lúa mì (Ye và cộng sự, 2000)
[35].
- Xử lý tiền nuôi cấy: trước khi ủ chung với A. tumefaciens người ta nuôi
cấy mô mục tiêu trên môi trường cảm ứng tạo chồi một thời gian. Phương pháp

này được chứng minh là có hiệu quả rất cao trên cây Arabidopsis thaliana
(Sangwan và cộng sự, 1991) và Saintpaulia ionantha (Satoshi và cộng sự,
2001) [21].
1.2.6.2 Thời gian đồng nuôi cấy và mật độ A. tumefaciens
Thời gian đồng nuôi cấy tối ưu khác nhau trên các loại cây khác nhau,
chẳng hạn: 48 giờ đối với cây canola (Cardoza & Stewart, 2003), 72 giờ đối với
cây bắp cải Trung Quốc (Zhang và cộng sự, 2000)…
Mật độ vi khuẩn trong chuyển gen trên lúa có thể từ 1 x 10
6
đến 1 x 10
10

cfu/l, trong đó tối ưu là 1 x 10
10
cfu/l (Hiei và cộng sự, 1997). Nồng độ này
cũng tối ưu đối với lúa. Ở bắp, nồng độ vi khuẩn càng cao thì cho biểu hiện gus
càng cao nhưng lại làm giảm sự hình thành mô sẹo và hiệu suất biến nạp tối đa
thu được ở nồng độ 0,5 x 10
10
cfu/l (Zhao và cộng sự, 2001). Các thí nghiệm
với các loại mẫu cấy khác nhau của cây khoai mì cho thấy nồng độ vi khuẩn
cao có thể làm gia tăng sự biểu hiện tạm thời gen gus nhưng lại không tương
quan với hiệu suất biến nạp. Nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn nồng độ vi khuẩn
tối ưu thường gây hư hại tế bào thực vật, do đó làm giảm khả năng tái sinh của
mô. Tuy nhiên, đối với các loại cây "cứng đầu" nồng độ vi khuẩn cao là cần
thiết, sau khi ủ xong, người ta rửa lại nhẹ nhàng với môi trường vô trùng hay
thêm vào môi trường các tác nhân sát khuẩn (Zhao và cộng sự, 2001; Zhang và
cộng sự, 2003) [33], [35].
1.2.6.3 Làm khô mẫu cấy
Một nhân tố quan trọng khác ảnh hưởng lên biến nạp là tình trạng khô

của mẫu cấy trước hoặc ngay khi xâm nhiễm A. tumefaciens. Arencibia và cộng
Trang 14
Tổng quan
sự (1998) cho rằng trải dịch huyền phù cây mía thành lớp mỏng và phơi 15 –
60 phút trước khi ủ với A. tumefaciens làm tăng khả năng chuyển T-DNA và
hiệu quả biến nạp. Tương tự, phơi mô sẹo từ dịch huyền phù cây lúa trong 10 –
15 phút làm tăng hiệu quả 10 lần so với đối chứng không phơi (Urushibara và
cộng sự, 2001). Không rõ nhân tố nào bị tác động bởi việc làm khô mẫu, có thể
đó là sự co nguyên sinh và tình trạng tổn thương của mẫu giống như xử lý thẩm
thấu [35].
1.2.6.4 Xử lý với chất chống hoại tử
Sử dụng các chất chống hoại tử như một phương pháp tiền xử lý được
chứng minh là có vai trò quan trọng trong việc làm giảm sự oxy hóa của mẫu.
Trên cây mía, người ta xử lý mô phân sinh với môi trường chứa 15 g/l acid
ascorbic, 40 mg/l cystein, 2 mg/l AgNO
3
làm tăng hiệu quả biến nạp và mô sẹo
mía chuyển gen chỉ thu được khi được xử lý với môi trường này. Một quy trình
tương tự cũng được áp dụng trên lúa (Enrique-Obregon và cộng sự, 1999).
Thêm cystein trong môi trường đồng nuôi cấy sẽ làm tăng sự biểu hiện gus và
hiệu suất biến nạp ổn định ở bắp. Bổ sung các hợp chất thiol: L-cystein,
dithiothreitol và sodium thiosulphat làm tăng 16,4% hiệu quả biến nạp ở đậu
nành (Olhoft và cộng sự, 2003). Thêm AgNO
3
vào môi trường đồng nuôi cấy ở
bắp cũng có hiệu quả tương tự. AgNO
3
ức chế sự phát triển của A. tumefaciens
mà không ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển và sát nhập T-DNA, rất thuận
lợi cho việc tái sinh mẫu sau này [35].

1.2.6.5 Nhiệt độ
Các nghiên cứu về A. tumefaciens cho thấy rằng sự phát triển của khối u
đạt tối ưu trên cây khi nhiệt độ xung quanh vi khuẩn xâm nhiễm khoảng 22
o
C,
và không xuất hiện khi nhiệt độ trên 28
o
C. Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hệ
thống điều hòa 2 thành phần VirA-VirG (phức hợp điều khiển sự vận chuyển
T-DNA). Ở nhiệt độ lớn hơn 32
o
C, gen vir sẽ không biểu hiện vì VirA bị đột
biến thành dạng mất hoạt tính. Nhiệt độ 22
o
C được chứng minh là tối ưu cho sự
chuyển T-DNA vào mô lá cây thuốc lá (Dillen và cộng sự, 1997), tuy nhiên
trong một nghiên cứu khác trên cây thuốc lá, nhiệt độ đồng nuôi cấy 25
o
C lại
cho số cây chuyển gen cao nhất. Điều này cho thấy rằng, nhiệt độ tối ưu cho sự