Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene kháng nguyên độc tố không bền nhiệt LTa của e coli trong tế bào vi khuẩn e coli BL21 (DE3) và tối ưu các điều kiện biểu hiện

i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi và nhóm nghiên cứu, các
số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai cơng bố
trong một cơng trình nào khác.
Tác giả luận văn

Hoàng Thị Thùy Nhung

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


ii

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.
TS. Đinh Thị Bích Lân, Ngun Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học, đã định
hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện hóa chất,
thiết bị, cũng như kinh phí để giúp tơi thực hiện và hồn thành luận văn này.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể Bộ môn Miễn dịch học và Vắc
xin - Viện Công nghệ sinh học và đặc biệt là Th.S Đặng Thanh Long, Th.S Lê Quốc
Việt, đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tơi trong quá trình thực nghiệm cũng như chia sẽ
những kinh nghiệm chuyên môn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc chuyên ngành Thú Y –
Khoa Chăn ni Thú y, các thầy cơ giáo của Phịng đào tạo sau đại học, Trường Đại
học Nông Lâm Huế cùng với Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học – Đại học Huế đã chỉ
bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi học tập cũng như hồn thành đề tài nghiên cứu.
Cơng trình này được hồn thành với kinh phí từ đề tài cấp Đại học Huế do
BSTY. Lê Công Thịnh – Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin - Viện Công nghệ Sinh
học – Đại học Huế làm chủ nhiệm: “Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen độc tố

không chịu nhiệt và độc tố chịu nhiệt, tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng
bệnh do E. coli ở lợn”. Mã số: DHH2016-15-05.
Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, người thân và bạn bè
đã giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Huế, ngày 20 tháng 05 năm 2016
Tác giả luận văn

Hoàng Thị Thùy Nhung

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


iii

TÓM TẮT
Tiêu chảy là một bệnh gây thiệt hại kinh tế không nhỏ cho ngành chăn nuôi, đặc
biệt là trong chăn nuôi lợn. Trong các nguyên nhân gây nên tiêu chảy ở lợn, vi khuẩn E.
coli với các yếu tố độc lực của nó đóng vai trị vơ cùng lớn. Độc tố LTa là một độc tố
đường ruột do E. coli tiết ra, có tác dụng kích thích lớp niêm mạc bên dưới biểu mô
ruột tiết ion Cl vượt quá mức bình thường và ngăn cản sự hấp thu NaCl, kéo theo sự di
chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy. Nghiên cứu phân lập
gen eltA , tạo dòng, biểu hiện và khảo sát điều kiện thích hợp để sản xuất số lượng lớn
kháng nguyên tái tổ hợp LTa, là cơ sở cho việc sản xuất và ứng dụng trong việc phòng
trừ bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra ở lợn con sau cai sữa. Trong nghiên cứu này, đoạn
gen eltA mã hóa cho kháng ngun LTa được tạo dịng vào plasmid pGEM®-T easy và
biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli TOP10. Thể biến nạp được sàng lọc trên thạch đĩa
LB+Ampicilin+IPTG+Xgal. Những khuẩn lạc có màu trắng chứng tỏ phản ứng gắn tạo
dịng đã thành cơng, đoạn gene mong muốn đã được chèn vào vector tạo dòng, những
khuẩn lạc màu xanh là âm tính. Tách chiết plasmid từ các dịng khuẩn lạc dương tính,

chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu của gene eltA và cặp mồi M13 (được thiết kế sẵn trên
vector pGEM®-T easy). Tiến hành giải trình tự nucleotid và trình tự amino acid, so
sánh với trình tự đã cơng bố trên ngân hàng Gene. Tinh sạch ADN từ gel agarose 1%
(từ sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu gene eltA). ADN tinh sạch được gắn vào vector
biểu hiện pET200/D-TOPO và biến nạp vào vi khuẩn E. coli BL21(DE3). Tìm điều
kiện tối ưu về mơi trường ni cấy, mật độ tế bào ban đầu, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ
IPTG, thời gian biểu hiện trong biểu hiện etlA. Sản phẩm của biểu hiện này được kiểm
chứng bằng điện di biến tính trên gel polyacrylamid (SDS - PAGE). Kết quả: đã tạo
dịng thành cơng gene eltA trong vi khuẩn E. coli TOP10, chứng minh được sự biểu
hiện gen eltA bằng phương pháp SDS - PAGE; Tìm được các điều kiện tối ưu trong
biểu hiện eltA: môi trường nuôi cấy YJ; mật độ tế bào ban đầu OD600 0,8; nhiệt độ nuôi
cấy 250C; nồng độ IPTG là 0,8 mM; thời gian nuôi cấy 6 giờ.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


iv

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii
TÓM TẮT...................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ......................................................................................................................iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................................ix
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................... x
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................1
2. Mục đích của đề tài ......................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ....................................................................................2

1) Ý nghĩa khoa học: .......................................................................................................2
2) Ý nghĩa thực tiễn: ........................................................................................................2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................3
1.1. VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI ..........................................................................3
1.1.1. Hình thái ................................................................................................................3
1.1.2. Đặc tính ni cấy ...................................................................................................3
1.1.3. Đặc tính sinh hóa ...................................................................................................4
1.1.4. Phân loại ................................................................................................................4
1.1.5. Sức đề kháng .........................................................................................................4
1.1.6. Các yếu tố độc lực cơ bản của E. coli ...................................................................5
1.1.7. Vai trò của vi khuẩn E. coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn ............................. 17
1.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ GENE ĐỘC TỐ LT CỦA VI KHUẨN E. COLI ...17
1.2.1. Những nghiên cứu ở trong nước..........................................................................17
1.2.2. Những nghiên cứu trên thế giới ...........................................................................18
1.3. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E. COLI ..19
1.3.1. Chủng E. coli TOP10 .......................................................................................... 22
1.3.2. Chủng E. coli BL21 (DE3) ..................................................................................22

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


v

1.3.3. Hệ thống vector tạo dịng pGEM®-T easy........................................................... 23
1.3.4. Hệ thống vector biểu hiện pET ............................................................................25
1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA GENE TÁI
TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VẬT CHỦ ........................................................................27
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 29
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ......................................................29
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 29

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................. 29
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................29
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................29
2.3.1. Thu thập mẫu phân lợn tiêu chảy ........................................................................29
2.3.2. Tách chiết ADN tổng số ......................................................................................30
2.3.3. Phân lập gene eltA bằng phản ứng PCR .............................................................. 30
2.3.4. Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gene ..................................................32
2.3.5. Biểu hiện gen trong vector pET200/D-TOPO .....................................................34
2.3.6 Điện di SDS- PAGE ............................................................................................. 35
2.3.7. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp ...36
2.3.8. Nghiên cứu Ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh trưởng của chủng
E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp ....................................................................................... 36
2.3.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng biểu hiện của kháng
nguyên LTa ....................................................................................................................38
2.3.10. Phương pháp sắc ký lọc gel bằng cột Ni-NTA..................................................39
2.3.11. Xử lí thống kê ....................................................................................................39
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................40
3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ VI KHUẨN E. COLI ................40
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GENE eltA BẰNG PHẢN ỨNG PCR ............................ 40
3.3. KẾT QUẢ TẠO DỊNG GENE eltA VÀO VECTOR PGEM®-T EASY VÀ BIẾN
NẠP VÀO TẾ BÀO VẬT CHỦ E. COLI TOP10 ........................................................ 41
3.4. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GENE eltA .............................................................. 43

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


vi

3.5. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GENE eltA MÃ HÓA TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ
HỢP LTa TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E. COLI BL21 (DE3) .................................45

3.6. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG E. COLI
BL21 (DE3) TÁI TỔ HỢP ............................................................................................ 47
3.7. KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG SINH
TRƯỞNG CỦA CHỦNG E. COLI BL21 (DE3) TÁI TỔ HỢP ...................................48
3.7.1. Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau .......................................................... 48
3.7.2. Ảnh hưởng của các tỷ lệ tiếp giống khác nhau ...................................................49
3.7.3. Ảnh hưởng của các tốc độ lắc khác nhau ............................................................ 49
3.8. KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG BIỂU
HIỆN CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LTa TRONG CHỦNG E. COLI
BL21(DE3) ....................................................................................................................51
3.8.1. Kết quả thăm dò thời gian cảm ứng tối ưu .......................................................... 51
3.8.2. Kết quả thăm dò nồng độ chất cảm ứng IPTG tối ưu ..........................................51
3.8.3. Kết quả thăm dị thành phần các mơi trường tối ưu ............................................52
3.8.4. Kết quả thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu ....................................53
3.8.5. Kết quả thăm dò nhiệt độ cảm ứng tối ưu ........................................................... 54
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 57

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

µl

Microliter

6xHis

Homooligohistidine

APS

Ammonium persulphate

Bp

Cặp bazơ (Base pair)

BSA

Bovine serum albumin

Cs

Cộng sự

DAEC

E. coli bám dính phân tán (Diffusely adherent Escherichia coli)

AND

Deoxyribonucleic acid

Dntp

Deoxyribonucleotid

EAEC

E. coli đường ruột (Enteroaggregative Escherichia coli)

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetace Acid

EHEC

E. coli gây xuất huyết ruột (Enterohaemorrhagic Escherichia coli)

EIEC

E. coli xâm nhập ruột (Enteroinvasive Escherichia coli)

EPEC

E. coli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic Escherichia coli)

ETEC

E. coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic Escherichia coli)

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria-Broth

LT

Độc tố không chịu nhiệt (Labile toxin)

MAEC

E. coli gây viêm màng não (Meningitidis-associated Escherichia coli)

Ml

Milliliter

mM

Millimol

nm

Nanometer

OD

Mật độ quang (Optical density)

PCR

Chuỗi phản ứng trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SOB

Super Optimal Broth

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


viii

SOC

Super Optimal broth

ST

Độc tố chịu nhiệt (Stabile toxin)

TAE

Tris-acetate-EDTA

Taq

Thermus aquaticus

TB

Terrific Broth

TE

Tris EDTA

TEMED

Tetramethylethylenediamine

TNE

Tris HCL-NaCl-EDTA

UPEC

E. coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu (Uropathogenic Escherichia coli)

VT

Độc tố gây độc tế bào Vero (Verocytocin)

YJ

Yang Jijian

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma

ix

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. So sánh hệ thống tế bào vật chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp ...............20
Bảng 1.2. Thành phần chính của plasmid pGEM®-T easy...........................................25
Bảng 2.1. Trình tự nucleotid của cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA ................................ 31
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR phân lập gene eltA của E. coli .......................... 31
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn .............................................................................33
Bảng 2.4. Công thức gel polyacrylamide 15% .............................................................. 35
Bảng 3.1. Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng
nguyên LTa ở các môi trường khác nhau ......................................................................48
Bảng 3.2. Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng
nguyên LTa ở các tỷ lệ tiếp giống khác nhau ................................................................ 49
Bảng 3.3. Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng
nguyên LTa ở các tốc độ lắc khác nhau ........................................................................50

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


x

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. E. coli ..............................................................................................................3
Hình 1.2. Cấu trúc của độc tố LT ....................................................................................6
Hình 1.3. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố LT ................................................................ 7
Hình 1.4. Cấu trúc bậc 1 của độc tố ST ...........................................................................8
Hình 1.5. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố STa .............................................................. 9

Hình 1.6. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố STb ............................................................ 10
Hình 1.7. Cấu trúc bậc 1 của độc tố EAST1 .................................................................11
Hình 1.8. Cơ chế tác động của độc tố VT .....................................................................13
Hình 1.9. Cấu trúc kháng nguyên O .............................................................................14
Hình 1.10. Cơ chế biểu hiện của hệ thông pET trong tế bào E. coli BL21 (DE3) .......22
Hình 1.11. Trình tự và cấu trúc vector pGEM®-T easy.................................................24
Hình 1.12. Cấu trúc Vector pET200/D-TOPO .............................................................. 26
Hình 1.13. Tương tác giữa protein dung hợp chứa 6xHis và giá thể gắn Nikel ...........26
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ................................................................ 31
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm về khả năng sinh trưởng của E. coli tái tổ hợp .................37
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tối ưu sự biểu hiện của các kháng nguyên LTa ................38
Hình 2.4. Sơ đồ Tinh chế protein dung hợp với thể 6xHis trên hệ thống cột sắc ký ái
lực Ni-NTA....................................................................................................................39
Hình 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số từ vi khuẩn E. coli .....................................40
Hình 3.2. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA trên
gel agarose 1%. ..............................................................................................................40
Hình 3.3. Kết quả biến nạp trên mơi trường chọn lọc ...................................................41
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm plasmid từ các dịng dương tính và kết quả PCR với
cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA từ khuôn mẫu ADN plasmid tái tổ hợp thu được trên
gel agarose 1%. ..............................................................................................................42
Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên gel agarose 1%.
.......................................................................................................................................43
Hình 3.6. Mức độ tương đồng giữa gene eltA do nhóm đề tài phân lập với gene eltA đã
được công bố (K01995.1 ) ............................................................................................. 44

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


xi

Hình 3.7. Mức độ tương đồng của trình tự amino acid của kháng nguyên LTa do nhóm
đề tài phân lập và kháng nguyên LTa đã được công bố (AEE59980.1) ....................... 45
Hình 3.8. Kết quả biến nạp trên mơi trường chọn lọc LB đặc + kanamycin 100 µg/ml.
.......................................................................................................................................46
Hình 3.9. Ảnh điện di thăm dò khả năng biểu hiện của kháng nguyên tái tổ hợp LTa và
khả năng liên kết giữa đuôi 6xHis với phối tử Ni2+ trên gel SDS – PAGE 15%. ........47
Hình 3.10. Đường cong sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa
kháng ngun LTa .........................................................................................................47
Hình 3.11. Ảnh điện di thăm dò thời gian cảm ứng biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp
LTa trên gel 15%. ..........................................................................................................51
Hình 3.12. Ảnh điện di thăm dị nồng độ chất cảm ứng IPTG lên biểu hiện kháng
nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15%. .............................................................................52
Hình 3.13. Ảnh điện di thăm dị thành phần các mơi trường tối ưu lên biểu hiện kháng
nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15%.. ..............................................................................53
Hình 3.14. Ảnh điện di thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu lên biểu hiện
kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel SDS 15% ........................................................... 54
Hình 3.15. Ảnh điện di thăm dò nhiệt độ cảm ứng tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên
tái tổ hợp LTa trên gel SDS 15%. .................................................................................55

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Tiêu chảy ở lợn con luôn là mối lo đối với người chăn nuôi, không những làm
giảm tăng trọng, giảm tỉ lệ ni sống, mà cịn dễ dàng làm xuất hiện các bệnh kế phát
và làm giảm hiệu quả kinh tế. Bệnh do nhiều nguyên nhân gây ra, trong đó vai trị của
E. coli là quan trọng nhất, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn đường ruột gây

tiêu chảy (Đào Trọng Đạt và cs, 1996).
Vi khuẩn E. coli gây bệnh thông qua các yếu tố độc lực mà bản thân chúng có.
Phần lớn các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột (ETEC) được phân lập từ
lợn tiêu chảy có khả năng sản sinh một hoặc nhiều yếu tố bám dính bám vào thụ thể
trên bề mặt biểu mô ruột như F4, F5, F6, F18 và F41; và một hay nhiều độc tố ruột
(enterotoxin), bao gồm độc tố chịu nhiệt (STa, STb, EAST1) và độc tố không chịu
nhiệt (LT) (Gyles and Faibrother, 2010).
Độc tố không chịu nhiệt ( Labile toxin) là một protein có tính kháng ngun
cao, quyết định tới khả năng gây tiêu chảy của ETEC. LT do một plasmid mã hóa, có
liên quan đến độc tố tả (CT) (Guidry và cs, 1997).
LT bao gồm một tiểu đơn vị A có khối lượng 25 kDa và 5 tiểu đơn vị B, mỗi
đơn vị có khối lượng 11,5 kDa. Sau khi phần B giúp độc tố bám vào tế bào biểu mô
ruột thì phần A được đẩy vào bên trong tế bào, làm hoạt hóa enzyme adenylate
cyclase. Khi enzyme adenylate cyclase hoạt hóa thì AMPc vịng nội bào tăng lên dẫn
đến ức chế hấp thu Na+ ở tế bào niêm mạc ruột, tăng bài tiết Cl- vào lòng ruột, làm
cho áp lực thẩm thấu trong lòng ruột tăng nhanh. Hậu quả là một lượng lớn nước từ
trong tế bào được kéo ra ngồi lịng ruột để cân bằng áp lực thẩm thấu giữa trong và
ngoài tế bào, gây tiêu chảy. (Giannella và cs, 1974).
Trong thực tế hiện nay, việc phòng trị tiêu chảy do E. coli chủ yếu dựa vào
thuốc kháng sinh, liệu pháp này đang bộc lộ những hạn chế như hiện tượng đề kháng
kháng sinh và có thể ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu tìm kiếm một
chế phẩm sinh học trong chẩn đốn và phịng trị tiêu chảy trên lợn do E. coli là hết sức
cần thiết.
Xuất phát từ tình hình đó, tơi tiến hành đê tài: "Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện
gene kháng nguyên độc tố không bền nhiệt LTa của E. coli trong tế bào vi khuẩn E.
coli BL21 (DE3) và tối ưu các điều kiện biểu hiện".
Đây là bước quan trọng cho nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích sản xuất kháng
thể đặc hiệu để phục vụ trong cơng tác phịng tránh dịch bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra
ở lợn.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


2

2. Mục đích của đề tài
Nghiên cứu phân lập gene eltA , tạo dòng, biểu hiện và khảo sát điều kiện thích
hợp để sản xuất số lượng lớn kháng nguyên tái tổ hợp LTa, làm cơ sở cho việc sản xuất
và ứng dụng kháng thể đặc hiệu trong việc phòng trừ bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra ở
lợn con sau cai sữa.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1) Ý nghĩa khoa học:
Trong những năm gần đây, kháng nguyên tái tổ hợp đang được nhiều nhà khoa
học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng ở một số nước trên thế giới, nhưng ở Việt Nam
hầu như có rất ít nghiên cứu được thực hiện. Kết quả nghiên cứu sẽ giúp chúng ta có thể
chủ động sản xuất một lượng lớn protein kháng nguyên tái tổ hợp LTa theo mong muốn
tạo nguồn nguyên liệu cho nhiều hướng ứng dụng khác nhau.
2) Ý nghĩa thực tiễn:
- Nội dung nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta tiếp cận và ứng dụng được các kỹ
thuật hiện đại của Công nghệ sinh học.
- Các kết quả này sẽ là cơ sở cho phép nghiên cứu tạo các vaccine tái tổ hợp hoặc
sản xuất kit chẩn đốn để phục vụ trong cơng tác phòng tránh dịch bệnh tiêu chảy do E.
coli gây ra ở lợn.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI
Vi khuẩn E. coli được phát hiện
lần đầu tiên vào năm 1885 do nhà khoa
học người Đức Theodore Escherich
phân lập được từ phân của một bệnh
nhân nhi (Neil và cs, 1994).
1.1.1. Hình thái
Là trực khuẩn ngắn, kích thước
2 - 3 × 0,6 μm, hiếu khí và yếm khí tùy
tiện. Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể
bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu. Một
số chủng E. coli có khả năng di động
do có lơng ở xung quanh thân (Nguyễn
Như Thanh và cs, 1997).
1.1.2. Đặc tính ni cấy

Hình 1.1. E. coli (Nguồn: Internet)

E. coli phát triển tốt trên các loại môi trường thông thường với phổ nhiệt khá
rộng ( 5-400C) và hình thành nên những khuẩn lạc điển hình có thể phân biệt được với
các vi khuẩn khác (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997). Ở 370C, E. coli phát triển nhanh,
khoảng cách thế hệ khoảng 20-30 phút.
- Môi trường thạch thường: hình thành những khuẩn lạc dạng S trịn, ướt, bóng
láng khơng trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 - 3mm. Ni lâu,
khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc
dạng R và M.
- Môi trường thạch máu: khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền khơng gọn, màu xám nhạt,
một số chủng có khả năng gây dung huyết.
- Môi trường nước thịt: phát triển rất nhanh, tốt, mơi trường đục đều có lắng cặn
màu tro nhạt dưới đáy, đơi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối.

- Mơi trường MacConkey: khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, trịn nhỏ, hơi lồi,
rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
- Môi trường CT-SMAC: khuẩn lạc trịn nhỏ, hơi lồi, rìa gọn, màu hồng cánh
sen (lên men đường Sorbitol) hoặc màu trắng đục (không lên men đường Sorbitol).
- Môi trường Simmon citrate: khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục.
- Môi trường Endo, SS: khuẩn lạc màu đỏ.
- Môi trường EMB: khuẩn lạc màu tím đen.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


4

1.1.3. Đặc tính sinh hóa
- Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi các loại đường Lactose, Fructose, Glucose,
Levulose, Galactose, Xylose, Manitol; lên men không chắc chắn các loại đường
Duncitol, Saccarose và Salixin.
Hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli đều lên men đường Lactose nhanh và sinh
hơi, đây là đặc điểm quan trọng để dựa vào đó phân biệt vi khuẩn E. coli và
Samonella.
- Phản ứng Indol, Catalase và MR dương tính; phản ứng H2S, VP, Urea,
Oxidase, Citrat âm tính.
- Đặc tính khác: Vi khuẩn làm đơng vón sữa sau 24 - 72 giờ nuôi cấy ở 370C;
không làm tan chảy gelatin (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2012).
1.1.4. Phân loại
+ Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E. coli được chia thành các type huyết thanh.
Với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh
khác nhau (Lior, 1996).
+ Dựa vào vị trí gây bệnh các E. coli có khả năng gây bệnh ở người được chia
thành 2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E.

coli) hay E. coli gây tiên chảy (DEC-Dierrheagenic E. coli), thứ hai là nhóm gây bệnh
ngồi đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E. coli) (Kaper và cs, 2004).
- Các loại E. coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:
 EPEC (Enteropathogenic Escherichia coli): E. coli gây bệnh đường ruột
 ETEC (Enterotoxigenic Escherichia coli): E. coli sinh độc tố ruột
 EIEC (Enteroinvasive Escherichia coli): E. coli xâm nhập ruột
 EAEC (Enteroaggregative Escherichia coli): E. coli bám dính kết tập ruột
 DAEC (Diffusely adherent Escherichia coli): E. coli bám dính phân tán
 EHEC (Enterohaemorrhagic Escherichia coli): E. coli gây xuất huyết ruột
- Hai loại E. coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:
 MAEC (Meningitidis-associated Escherichia coli): E. coli gây viêm màng não
 UPEC (Uropathogenic Escherichia coli): E. coli gây nhiễm khuẩn đường tiết
niệu
1.1.5. Sức đề kháng
Vi khuẩn E. coli bị bất hoạt khi đun 50°C trong 1giờ, 60°C trong 30 phút và
chết ngay ở 100°C.
Dễ bị tiêu diệt với các thuốc sát trùng thơng thường (formol 0,2%, axít phenic,
biclorua thủy ngân, hydroperoxit 1‰ diệt vi khuẩn sau 5 phút) (Nguyễn Như Thanh và
cs, 1997).

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


5

1.1.6. Các yếu tố độc lực cơ bản của E. coli
1.1.6.1. Giáp mơ
Bản chất hóa học là polysaccharide mang tính acid, chúng tạo ra trên bề mặt vi
khuẩn điện tích âm gây nên một lực hút với lớp màng trong tế bào biểu mơ ruột mang
điện tích dương. Hiện tượng trên giúp cho vi khuẩn bám dính, xâm nhập tế bào vật chủ

một cách thuận lợi.
Giáp mơ cịn được coi là một yếu tố bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại hiện tượng
thực bào bằng cách ngăn trở quá trình hoạt hóa bổ thể, đặc biệt là thành phần bổ thể C3b.
1.1.6.2. Thành tế bào
Lipopolysaccharide (LPS) và protein màng ngoài của E. coli là các yếu tố làm
tăng độc lực của vi khuẩn. Lipid A (một thành phần của LPS) kích thích tế bào đại
thực bào và một số tế bào khác sản sinh các hoạt chất sinh học thuộc nhóm cytokine
gây nên những biến đổi đáng kể ở cơ thể vật chủ. Protein màng ngoài tế bào vi khuẩn
E. coli liên quan đến khả năng đề kháng với hoạt động diệt khuẩn của huyết thanh.
1.1.6.3. Yếu tố kháng khuẩn
Nhiều chủng vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn, có tác
dụng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, gọi là ColicinV. Vì vậy, yếu tố này
cũng được coi là một trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli gây bệnh
(Smith.H.W và Halls.S, 1967).
1.1.6.4. Độc tố đường ruột (Enterotoxin)
Các chủng ETEC có khả năng sản sinh hai loại độc tố đường ruột: Độc tố không
bền nhiệt (heat labile enterotoxin - LT) và độc tố bền nhiệt (heat stable enterotoxin - ST).
 Độc tố không bền nhiệt (LT)
Độc tố LT có trọng lượng phân tử cao, tác động kích thích lên niêm mạc ruột,
ảnh hưởng đến quá trình trao đổi nước và chất điện giải. Kết quả là làm xung huyết
niêm mạc ruột, tăng tính thấm thành mạch, hút nước từ mạch quản vào lòng ruột gây
ra tiêu chảy.
* Cấu trúc của độc tố LT:
Độc tố LT gồm 1 tiểu đơn vị A (A-subunit) với 240 axít amin và 5 tiểu đơn vị B
(B-subunit) với 103 axít amin (hình 1.2). Tiểu đơn vị A mang hoạt tính enzyme của
độc tố và gồm 2 chuỗi peptide A1, peptide A2. Hai chuỗi peptide này liên kết nhau bởi
cầu nối disulfide giữa A1- axit amin Cystein (Cys) 187 và A2-Cys199. Chuỗi A2 tạo
thành cái móc liên kết khơng đồng hóa trị giữa tiểu đơn vị A và lỗ hổng giữa của vòng
5 tiểu đơn vị B. Năm tiểu phân tử B trong cấu trúc của LT sắp xếp thành vòng nhẫn 5
cạnh bền vững. Mỗi tiểu phân tử B có một vị trí gắn với thụ thể tiếp nhận độc tố của tế

bào vật chủ (O’Bien và Holmes, 1996).

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


6

Quá trình sinh tổng hợp các tiểu phân tử của độc tố LT được thực hiện trong tế
bào chất, sau đó được vận chuyển qua lớp màng trong (inner membrane) đến chu chất
và q trình hồn thiện độc tố được thực hiện tại đây. Gene mã hóa cho tiểu đơn vị A
và B của LT là eltA và eltB nằm trên plasmid và được phiên mã thành một mRNA đơn
(O’Bien và Holmes, 1996). Sau khi quá trình sinh tổng hợp kết thúc, LT có thể được
giải phóng ra mơi trường bên ngồi hoặc chỉ giải phóng lên trên bề mặt tế bào vi
khuẩn (Tauschek và cs, 1995).

Hình 1.2. Cấu trúc của độc tố LT (Robert và cs, 2002)
* Cơ chế tác động của độc tố LT:
Sau khi bám lên các thụ thể tiếp nhận của tế bào biểu mô ruột, độc tố LT được
chuyển qua màng và đi vào nội bào. Bên trong tế bào, độc tố di chuyển nhờ hệ thống
vận chuyển của Golgi. Sau khi tiểu phân tử A và B phân cắt ở Golgi, tiểu phân tử A
được chuyển đến màng lưới nội chất, tiểu phân tử B được tái sử dụng từ Golgi cho đến
cuối endosome và lysosome. Theo Lencer, tiểu phân tử B cũng có thể là đơn vị vận
chuyển cho tiểu phân tử A và sự phân cắt A-B chỉ xẩy ra khi gặp màng lưới nội chất.
Tiểu phân tử B được gắn với lớp màng liên kết, di chuyển đến lớp màng basolateral và
được chuyển ra khỏi tế bào (Lencer và cs, 1995).
Đích của độc tố LT trong tế bào là enzyme Adenylate cyclase ở lớp màng ngồi
của tế bào biểu mơ ruột (Nataro và Kaper, 1998). Do đó, sau khi chuyển đến bào
tương, chuỗi peptide A1 bám lên phức hợp protein Gsαβγ. Chuỗi peptide A1 có hoạt
tính như enzyme ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến
protein của liên kết GTP (GTP-binding protein) là Gsα. Quá trình bám của GTP lên

Gsα làm cho Gsα tách khỏi phức hợp protein Gsβγ và gây hoạt hóa enzyme Adenylate
cyclase, làm gia tăng cAMP (cyclic adenosine monophosphate) trong tế bào. Vì vậy,

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


7

cAMP sẽ hoạt hóa enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) dẫn đến sự
phosphoryl hóa kênh ion chloride (Cl-) ở màng tế bào biểu mơ vượt q mức bình
thường. Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl- và ngăn cản sự hấp
thụ NaCl bởi những tế bào lơng nhung. Hàm lượng ion Cl- trong lịng ruột gia tăng kéo
theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lịng ruột, gây tiêu chảy (hình 1.3)
(Nataro và Kaper, 1998).

Hình 1.3. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố LT (Bloch, 2006)
Mặc dù sự kích thích của Cl- do sự gia tăng lượng cAMP trong tế bào là cách
giải thích cổ điển về cơ chế gây tiêu chảy của độc tố LT. Tuy nhiên, ngày càng có
nhiều bằng chứng cho thấy rằng đáp ứng tăng tiết đối với những độc tố này có cơ chế
phức tạp hơn. Một cơ chế tác động khác của độc tố có liên quan đến prostaglandin E
(PGE1 và PGE2) và yếu tố hoạt hóa tiểu cầu. Sự tổng hợp và phóng thích những chất
chuyển hóa của axít arachidonic như prostaglandin và leukotriene có thể kích thích sự
vận chuyển các chất điện giải và kích thích nhu động ruột. Cơ chế tác động khác thứ
hai có liên quan đến hệ thần kinh ruột (enteric nervous system) điều hòa nhu động và
sự tiết ion ở ruột (Nataro và Kaper, 1998).
 Độc tố bền nhiệt (ST)
ST có trọng lượng phân tử lớn hơn 90.000 dalton, có khả năng chịu được nhiệt
độ 1000C trong 15 phút, bị phá huỷ nhanh khi hấp cao áp và bền vững ở nhiệt độ thấp.
Độc tố chịu nhiệt (độc tố ST) là những đoạn peptide có trọng lượng phân tử
nhỏ, được sản sinh bởi các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC. Độc tố ST được chia

thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động (Sherman và
cs, 1983).

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


8

* Cấu trúc độc tố ST:
Độc tố STa là một peptide với trọng lượng phân tử khoảng 2 kDa với khoảng
18-19 axít amin. Trong đó, có 6 axít amin Cystein tạo thành 3 cầu nối disulfide bên
trong cấu trúc phân tử của STa là Cys6 - Cys11, Cys7 - Cys15 và Cys10 - Cys18 (hình
1.4). Đầu tận cùng carbon (14 axít amin) chính là phần mang hoạt tính của độc tố. Độc
tố STa có 2 biến thể là STp phát hiện trên các chủng ETEC phân lập được trên lợn và
STh phát hiện trên các chủng ETEC phân lập ở người. Sự khác nhau giữa 2 biến thể
chỉ xuất hiện ở đầu tận cùng N- với 4-5 axít amin (Nataro và Kaper, 1998).

Hình 1.4. Cấu trúc bậc 1 của độc tố ST (Sukumar và cs, 1995).
Tương tự độc tố STa, độc tố STb cũng là chuỗi polypeptide được sản sinh chủ
yếu bởi các chủng vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn (Nataro và Kaper, 1998). Độc tố
STb gồm có 48 axít amin, trong đó có 4 axít amin Cystein tạo thành 2 cầu nối disulfide
giữa Cys10 – Cys48 và Cys21 – Cys36.
Gene mã hóa cho độc tố STa, STb lần lượt là estA và estB. Gene estA được tìm
thấy chủ yếu trên plasmid cùng mang nhiều gene mã hóa các yếu tố độc lực khác của
các chủng ETEC như yếu tố xâm nhiễm, kháng kháng sinh, sản sinh colicin (Nataro và
Kaper, 1998). Tương tự, gene estB được tìm thấy trên plasmid cùng mang nhiều yếu tố
độc lực khác như độc tố LT, STa, kháng kháng sinh, yếu tố xâm nhiễm. Độc tố ST
được tổng hợp trong trong tế bào chất như là tiền polypeptide. Đoạn tiền peptide mang
tín hiệu vận chuyển sẽ bị phân cắt khi chuỗi polypeptide vận chuyển từ tế bào chất đến
periplasm thông qua hệ thống vận chuyển SecA. Trong periplasm, các cầu nối

disulfide của độc tố sẽ được hình thành trước khi độc tố được giải phóng khỏi tế bào vi
khuẩn qua hệ thống TolC dưới tác động của protein DsbA (periplasmic oxidoreductase
protein) (Dubreuil và Daniel, 1997).
* Cơ chế tác động của độc tố ST:
- Độc tố STa:
Sau khi được giải phóng ra khỏi tế bào vi khuẩn, độc tố STa bám vào các thụ
thể tiếp nhận trên lớp tế bào lông nhung biểu mô ruột là enzyme Guanylate cyclase C
(GC-C). Sự kết hợp này làm tăng hoạt tính của GC-C, do đó tăng lượng cGMP (cyclic
guanosine monophosphate) nội bào (hình 1.5). Sự gia tăng nồng độ cGMP làm hoạt

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


9

hóa PKGII (cGMP-dependent protein kinase II). PKGII sẽ tác động lên yếu tố điều
khiển quá trình tiết và hấp thụ Cl- là CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator) có mặt trên lớp màng lông nhung tế bào biểu mô ruột. Kết quả sự tương tác
này là kích thích sự phosphoryl hóa kênh Cl- ở màng tế bào biểu mô vượt mức bình
thường làm cho lớp tế bào bên dưới tăng tiết Cl- vào trong lòng ruột và/hoặc ngăn cản
sự hấp thụ NaCl (Forte và cs, 1992). Hơn nữa, cGMP có khả năng ức chế PDE3
(phosphodiesterase 3) - đây là enzyme thủy phân cAMP. Vì thế, cAMP được tích lũy
trong tế bào và gây hoạt hóa enzyme protein kinase A (PKA). Cùng với tác động của
PKGII, PKA cũng có tác kích thích tăng tiết Cl- vào lòng ruột. Bên cạnh đấy, PKA ức
chế q trình tái hấp thụ Cl- thơng qua kênh trao đổi ion NHE3 (Na+/H+ exchanger 3).
Kết quả cuối cùng của q trình này là sự tích lũy nước trong lịng ruột và gây tiêu
chảy. Q trình xâm nhập tế bào biểu mô ruột và gây tiêu chảy của STa xẩy ra rất
nhanh. Độc tố STa kích thích giải phóng cGMP đạt nồng độ sau 5 phút. Tuy nhiên,
quá trình này duy trì trong thời gian ngắn (Hitotsubashi và cs, 1992).

Hình 1.5. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố STa (Michael Field, 2003)
- Độc tố STb:
STb cũng là độc tố tác động nhanh nhưng với cấp độ vừa phải. Tuy nhiên, cơ
chế gây tiêu chảy của STb vẫn chưa được làm sáng tỏ. Bằng phương pháp thắt nút ruột
non chuột, xác định được rằng STb không làm thay đổi nồng độ của cAMP và cGMP
trên lớp tế bào biểu mô ruột (Hitotsubashi và cs, 1992). Năm 1995, Fujii và cs nhận
thấy sự gia tăng nồng độ của PGE2 trong dịch ruột chuột có liên quan đến sự có mặt
của STb. Hơn nữa, nồng độ PGE2 tương quan thuận với sự tích lũy chất lỏng trong
lịng ruột. Nồng độ axít arachidonic và axít phosphatidic cũng được kích thích tăng
dưới tác động của độc tố STb (Fujii và cs, 1995).

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


10

Thử nghiệm của Dreyfus và cs. cho thấy rằng khi độc tố STb bám vào các thụ
thể trên lớp tế bào lơng nhung biểu mơ ruột thì protein liên kết G (G-protein-linked)
được giải phóng (Dreyfus và cs, 1993). Protein này sẽ hoạt hóa kênh vận chuyển Ca2+
trên màng bào tương và Ca2+ được vận chuyển từ bên ngoài vào bên trong tế bào. Sự
gia tăng nồng độ Ca2+ trong tế bào sẽ hoạt hóa enzyme phospholipase, dẫn đến giải
phóng axít arachidonic từ lớp màng lipid. Axít này sẽ kích thích tế bào sản sinh PGE2
và gây tăng tiết một số ion vào lịng ruột (hình 1.6) . Hơn nữa, sự gia tăng nồng độ
Ca2+ trong tế bào cũng có thể kích thích mở kênh Cl-, tăng cường tiết Cl- và HCO-3 vào
lòng ruột (Wu và cs, 2008). Kết quả cuối cùng là sự tích lũy chất lỏng trong lịng ruột
và gây tiêu chảy.

Hình 1.6. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố STb (Dubreuil và cs, 1997)
1.1.6.5. Độc tố EAST1
Độc tố EAST1 là peptide với trọng lượng phân tử khoảng 4,1 kDa, được sản

sinh bởi các chủng vi khuẩn thuộc nhóm EAEC phân lập chủ yếu ở người. Tuy nhiên,
những nghiên cứu gần đây cho thấy các chủng vi khuẩn E. coli thuộc nhóm ETEC
phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy cũng có khả năng sinh độc tố này. EAST1 có đặc
tính sinh học và cơ chế tác động tương đối giống với độc tố STa nhưng không gây
miễn dịch chéo (Savarino và cs, 1991).
* Cấu trúc độc tố EAST1:
Trình tự axít amin của độc tố EAST1 được xây dựng dựa trên trình tự nucleotid
trên gene mã hóa được đặt tên là astA. Độc tố EAST1 có 38 axít amin, điểm đẳng điện
pI là 9,25 và có mức tương đồng 50% về trình tự axít amin ở vị trí 6-18 với độc tố
STa. Có 2 biến thể của EAST1 đã được xác định là EAST1 17-2 và EAST1 0-42. Hai
biến thể này chỉ khác nhau 1 axít amin tại vị trí 21 (hình 1.7) (Savarino và cs, 1993).
Bốn axít amin Cystein tại các vị trí 17, 20, 24 và 27 sẽ hình thành nên hai cầu nối
disulfide. Axít amin Cys17 được xem là có vai trị quan trọng nhất trong q trình thể
hiện hoạt tính của độc tố.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


11

Hình 1.7. Cấu trúc bậc 1 của độc tố EAST1 (Savarino và cs, 1993).
Theo Savarino và cs, gene mã hóa độc tố EAST1 là astA gồm 117 bp, tỷ lệ
G+C là 53% và khơng có sự tương đồng với gene estA (gene mã hóa cho độc tố STa).
Gene astA thường được tìm thấy trên plasmid có khả năng liên kết 60 MDa (60-MDa
plasmid mediating aggregative adherence). Plasmid này không những được tìm thấy
trên các chủng vi khuẩn E. coli thuộc nhóm EAEC mà cịn tìm thấy trên các chủng
thuộc nhóm ETEC (Savarino và cs, 1993).
* Cơ chế tác động của độc tố EAST1:
Cơ chế tác động lên cơ thể vật chủ của độc tố EAST1 vẫn chưa được làm rõ.
Các phân tích thường cho thấy gene mã hóa cho EAST1 chủ yếu được tìm thấy ở các

chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ người và gia súc mắc bệnh tiêu chảy có kèm theo
máu. Theo Nataro và Kaper, độc tố EAST1 có thể bám lên thụ thể của độc tố STa
(GC-C) và kích thích tế bào chủ giải phóng cGMP (Nataro và Kaper, 1998). Một số
nghiên cứu khác cho rằng cAMP và Ca++ có thể tham gia vào quá trình tác động của
EAST1. Độc tố EAST1 chỉ có thể gây tiêu chảy nhẹ ở gia súc nhưng khi kết hợp cùng
độc tố LT thì gia súc sẽ bị tiêu chảy nặng hơn rất nhiều (Ngeleka và cs, 2003).
1.1.6.6. Độc tố gây độc tế bào vero (VT)
Theo Konowalchuk (1977), có hai loại độc tố VT: VT1 và VT2. Độc tố VT1 rất
giống độc tố của Shigella dysenteriae typ 1 về mọi phương diện, kể cả miễn dịch học.
Trong điều kiện in vitro, có thể dùng kháng độc tố Shiga để trung hịa VT1. Vì thế,
VT1 cịn được gọi là độc tố giống độc tố Shiga (SLT). Độc tố VT2 không có liên quan
gì về miễn dịch học với độc tố của Shigella dysenteriae typ 1, nhưng cũng có khả năng
gây độc tế bào như VT1. Konowalchuk nhận thấy rằng một số chủng EPEC có khả
năng tổng hợp độc tố VT1 và/hoặc VT2, vì những chủng này gây độc và làm biến
dạng tế bào Vero đơn lớp. Tuy nhiên, phát hiện này chưa được chú ý đến khi một vụ
dịch do E. coli O157: H7 xảy ra ở Mỹ, và vi khuẩn này có khả năng sản sinh VT.
Trình tự nucleotit của gene chịu trách nhiệm sản sinh VT1 và trình tự axit amin
đã được xác định và so sánh với gene sản sinh độc tố SLT. Mặt khác, VT2 và các biến
thể của nó có những đặc điểm khác biệt với VT1. Mức độ tương đồng của trình tự
nucleotit và axit amin của VT2 và VT1 khoảng 55 - 60%. Các loại VT2 hiện nay đã
xác định được gồm có VT2, VT2vha (VT2va), VT2vhb (VT2vb), VT2vp1 (VT2e) và
VT2vp2.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


12

Cấu trúc chung và cơ chế tác động của các độc tố VT giống với độc tố Shiga.
Mỗi độc tố có cấu trúc gồm tiểu phần A - B, 1 tiểu phần A (khoảng 33 kDa) và 5 tiểu

phần B (khoảng 7,5 kDa). Tiểu phần A có hoạt tính của một enzyme, tác động ức chế
quá trình tổng hợp protein của tế bào, gồm có dung giải protein và phá hủy liên kết
disulfide. Tiểu phần B có mang vị trí tiếp xúc của phân tử độc tố với một receptor
glycolipid trên màng tế bào.
Stein và cs (1992) đã xác định cấu trúc tinh thể của tiểu phần B của VT1 và
nhận thấy nó giống với cấu trúc của tiểu phần B của độc tố LT được sản sinh bởi hầu
hết các chủng E. coli. VT là protein không chịu nhiệt, nhưng khả năng chịu nhiệt của
các loại VT khác nhau là khác nhau. VT2e là kém chịu nhiệt nhất, nó mất hoạt tính
hồn tồn khi ở 650C trong 30 phút. VT2d có khả năng chịu nhiệt cao nhất, khơng mất
hoạt tính khi ở 750C trong 60 phút. VT1 và VT2 là những độc tố có khả năng chịu
nhiệt trung bình.
Receptor của VT1 và VT2 là Globotriosylceramide (Gb3), của VT2e là
Globotetraosylceramide (Gb4). Gb3 là phức hợp trên màng tế bào nội mạc quản cầu
thận. Cấu trúc và số lượng những receptor đặc hiệu ở những lồi và mơ khác nhau tạo
nên sự khác nhau về độ mẫn cảm của tế bào, mô hoặc cơ quan đối với độc tố. Tuy
nhiên, nguyên nhân chính gây phá hủy thận trong bệnh tiêu chảy có liên quan đến
HUS vẫn chưa được làm rõ.
Vì ái lực của VT1 đối với Gb3 lớn hơn so với VT2, người ta cho rằng VT1 gắn
với tế bào biểu mô ruột và gây phá hủy các tế bào này cũng như hệ thống mạch quản ở
ruột, trong khi đó, VT2 có ái lực nhỏ hơn với Gb3 do đó khả năng vào được hệ thống
tuần hoàn lớn hơn, theo máu đến các cơ quan, có thể gây HUS hoặc TTP.
Khi độc tố được gắn với receptor, tiểu phần A sẽ xâm nhập vào trong tế bào theo cơ
chế ẩm bào. Sau đó, nó gây dung giải protein và phá hủy liên kết disulfide, từ đó ức
chế việc tổng hợp yếu tố kéo dài chuỗi gắn với ribosome của phân tử RNA vận
chuyển. Do đó, về cơ bản, sự kéo dài chuỗi peptide bị ngừng lại, ức chế sự tổng hợp
protein, dẫn tới giết chết tế bào đích.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma

13

Hình 1.8. Cơ chế tác động của độc tố VT
1.1.6.7. Độc tố gây xuất huyết ruột (Enterohaemolysin)
Một vài chủng có khả năng gây dung huyết đã được xác định trong các nhóm E.
coli khác nhau. Gây xuất huyết ruột là một đặc điểm điển hình của nhóm EHEC.
Schmidt và cs (1995) cho biết hiện tượng xuất huyết ruột là kết quả của sự có mặt của
một loại protein - đó là protein gây xuất huyết ruột EHEC (EHEC Hly - EHEC
haemolysin protein). EHEC - Hly được mã hóa bởi một plasmid lớn.
Khi vi khuẩn đường ruột phát triển trong tổ chức, cơ quan, hàm lượng sắt đảm
bảo cho sự phát triển của vi khuẩn phụ thuộc vào chất Siderofordo do vi khuẩn sản
sinh ra. Chất này có khả năng phân huỷ sắt liên kết trong tổ chức của vật chủ thông
qua Heamolyzin, chủ yếu là phân huỷ hồng cầu giải phóng ra sắt, để vi khuẩn sử dụng
dưới dạng hợp chất HEM. Vì vậy việc sản sinh ra Heamolyzin cũng được coi là yếu tố
độc lực của vi khuẩn.
Vi khuẩn E. coli có bốn kiểu dung huyết, nhưng quan trọng nhất là kiểu α và β.
Trong đó kiểu β gắn với tế bào và khơng có vai trị độc lực. Kiểu α được sản xuất và
giải phóng vào mơi trường ni cấy ở pha logarit của chu trình phát triển vi khuẩn, đây
là loại protein qua lọc và được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn.
1.1.6.8. Cấu trúc kháng nguyên
Vi khuẩn E. coli được chia làm các serotyp khác nhau dựa trên cấu trúc kháng
nguyên O, K, H và F. Cho đến nay, có ít nhất 173 kháng nguyên O, 89 kháng nguyên
K, 56 kháng nguyên H đã được xác định (Gyles, 2004).

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


14

 Kháng nguyên O (Somatic antigene)

Kháng nguyên O còn gọi là kháng nguyên thân, bản chất là polysaccharide.
Polysaccharide là một thành phần của lipopolysaccharide, đây là thành phần cơ bản
cấu tạo nên màng ngoài của vi khuẩn gram âm. Kháng nguyên O có khả năng chịu
được nhiệt độ, các chất cồn và axit HCN 1N. Cấu trúc phân tử lipopolysaccharide gồm
3 phần: gồm chuỗi lipit A, một vùng lõi và chuỗi polysaccharide (kháng nguyên O).
Khi làm mất dần từng đơn vị đường của các chuỗi polysaccharide hoặc làm thay đổi vị
trí ở các đơn vị này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của vi khuẩn. Thành phần lipit trong
kháng ngun có tác dụng quyết định độc tính của vi khuẩn E. coli.
Kháng nguyên O không phải là một kháng nguyên đơn (single antigen) mà gồm
một số thành phần và thường được gọi là nhóm kháng nguyên O. Các nhóm kháng
nguyên O khác nhau có thể có một vài thành phần kháng nguyên chung, và do đó có
thể gây phản ứng chéo giữa các nhóm.

Hình 1.9. Cấu trúc kháng ngun O (Muhammad and Sangdun, 2014)
Gal, galactose; GalNac, N-acetyl-galactosamine; Glc, glucose; GlcN,
glucosamine; Hep, l-glycero-d-mannoheptose; Kdo, 3-deoxy-d-manno-2-octulonic
acid; Man, mannose; NAG, N-acetyl-glucosamine.
 Kháng nguyên K (Capsular antigen)
Kháng nguyên K còn được gọi là kháng nguyên vỏ bọc, chúng bao quanh tế bào
vi khuẩn và có bản chất hóa học là Polysaccharide. Thơng thường, kháng nguyên K sử
dụng để định typ E. coli không gây ngưng kết với kháng huyết thanh O tương ứng.
Việc xác định kháng nguyên K dựa trên đặc điểm hóa học của kháng nguyên vỏ
lipopolysaccharide. Có 3 nhóm kháng nguyên K đã được sử dụng là L, A và B ; chúng
khác nhau về đặc tính kháng nguyên và khả năng kết hợp với kháng thể khi ở nhiệt độ

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma