Nghiên cứu tạo dòng, biểu hiện và thu nhận hIGF 1 (human insulin like growth factor 1) từ escherichia coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


DƢƠNG LONG DUY

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ
THU NHẬN hIGF-1 (HUMAN INSULIN LIKE
GROWTH FACTOR 1) TÁI TỔ HỢP TỪ E. coli


Chuyên ngành: DI TRUYỀN
Mã số: 60 42 70


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC



NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐẶNG THỊ PHƢƠNG THẢO


Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2012
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến GS.TS. Trần
Linh Thước, người thầy đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em học tập và hoàn
thành luận văn này.
Em chân thành cảm ơn TS. Đặng Thị Phương Thảo, cô là người đã luôn
động viên, quan tâm giúp đỡ và định hướng cho em trong suốt quá trình nghiên cứu
cũng như trong cuộc sống.
Chân thành cảm ơn chị Phương Hiếu và anh Văn Đức đã dìu dắt em trong

những ngày đầu bước chân vào lab A.
Xin cảm ơn chị Kim Hằng và chị Mỹ Trinh đã chỉ bảo và giúp đỡ em rất
nhiều trong thời gian vừa qua.
Cảm ơn tất cả các anh chị và các bạn ở BM CNSH Phân tử & Môi trường,
PTN CNSH Phân Tử A đã luôn bên mình, cùng chia sẻ những niềm vui, nỗi buồn
trong những ngày tháng làm việc tại Lab A.
Và trên hết, con xin cảm ơn mẹ và anh chị đã luôn quan tâm, chăm sóc và
tạo mọi điều kiện cho việc học của con. Gia đình sẽ mãi là niềm tự hào, là động lực
để con vươn tới thành công.
Một lần nữa, xin cảm ơn tất cả mọi người!


Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9/2012
Dương Long Duy


Luận văn Thạc sĩ Sinh học Mục lục

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ii
LỜI MỞ ĐẦU 1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Nhân tố tăng trƣởng hIGF-1 4
1.1.1. Giới thiệu 4
1.1.2. Đặc điểm gene mã hóa và cấu trúc phân tử protein hIGF-1 4
1.1.3. Đặc điểm hoạt động của hIGF-1 5
1.1.4. Chức năng của hIGF-1 trong cơ thể sống 7
1.1.5. Các hướng ứng dụng hIGF-1 8
1.1.5.1. Điều trị bệnh IGFD 8

1.1.5.2. Điều trị một số bệnh khác 9
1.1.5.3. Ứng dụng khác của hIGF-1 10
1.1.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất hIGF-1 trên thế giới và ở Việt Nam 11
1.2. Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp trên Escherichia coli 13
1.3. Tái gấp cuộn in vitro protein thu nhận từ thể vùi biểu hiện trong tế bào E.
coli 14
1.4. Tinh chế thu nhận protein tái tổ hợp 17
1.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học hIGF-1 in vitro 18
PHẦN II: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 21
2.1. Vật liệu 22
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị 22
2.1.2. Hóa chất và môi trường 23
2.1.3. Nguyên vật liệu 28
2.2. Phƣơng pháp 30
2.2.1. Thu nhận gene higf-1 từ phIGF1 bằng phản ứng PCR 32
2.2.2. Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b 34
2.2.3. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1 37
2.2.4. Tạo dòng tế bào E. coli Origami(DE3) mang vector pET22b-higf1 40
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Mục lục

2.2.5. Cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1 ở E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 .40
2.2.6. Tinh chế thu nhận hIGF-1 44
2.2.7. Kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1 thu nhận được 45
PHẦN III: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 43
3.1. Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b 48
3.1.1. Thu nhận gene higf-1 và chuẩn bị vector pET-22b 49
3.1.2. Tạo dòng E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1 50
3.2. Tạo dòng tế bào E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 55
3.3. Cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1 57
3.3.1. Phân tích sự biểu hiện protein hIGF-1 trong tế bào chất

E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 bằng Tricine SDS-PAGE 57
3.3.2. Khẳng định sự biểu hiện hIGF-1 bằng Western blot. 58
3.4. Tinh chế thu nhận và kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1. 59
PHẦN IV: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 64
1. Kết luận 65
2. Đề nghị 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
PHỤ LỤC 70
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Danh mục các chữ viết tắt
-i-
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ALS Acid Labile Subunit
Amp Ampicillin
Amp
r
Ampicillin resistance
bp base pair
DNA Deoxyribose Nucleic Acid
dH
2
O distilled water (nước cất)
dNTP deoxyNucleotide TriPhosphate
DTT DiThioThreitol
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylene Diamine TetraAcetic acid
EMEA European Medicines Agency
FDA Food and Drug Administration
FPLC Fast Performance Liquid Chromatography
GH Growth Hormone
HRP HorseRadish Peroxidase

IPTG IsoPropyl-β-D-Thio-Galactoside
hIGF-1 human Insulin-like Growth Factor
IGF1R IGF-1 Receptor
IGFBP Insulin-Like Growth Factor Binding Protein
kDa kilo Dalton
LB Môi trường Luria-Bertani
MCS Multiple Cloning Site
PBST Phosphate Buffered Saline Tween
PCR Polymerase Chain Reaction
RNA Ribose Nucleic Acid
RNase Enzyme thuỷ giải RNA
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel
Electrophoresis
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Danh mục các bảng và hình
-ii-

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ plasmid pET-22b 50
Bảng 3.2. Lượng hIGF-1 trong các phân đoạn tinh chế 62
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của hIGF-1 5
Hình 1.2. Các con đường truyền tín hiệu trong tế bào được kích hoạt bởi hIGF-1 6
Hình 1.3. Một số sản phẩm rhIGF-1 trên thị trường 12
Hình 1.4. Các phương pháp sắc ký được sử dụng để tinh chế protein 17
Hình 1.5. Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro 18
Hình 2.1. Cấu trúc plasmid pET-22b 28
Hình 2.2. Thang chuẩn protein và DNA 29
Hình 2.3. Chương trình PCR 33

Hình 3.1. Quy trình tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b 48
Hình 3.2. Thu nhận gene higf-1 49
Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α 51
Hình 3.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 52
Hình 3.5. Sơ đồ vị trí chèn gene higf-1 và vị trí bắt cặp của các mồi trên vector
pET22b-higf1 53
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra plasmid pET22b-higf1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi
T7 pro/T7 ter và cặp mồi 5’-NdeI-higf1 /T7 ter 54
Hình 3.7. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 vào tế bào E. coli
Origami(DE3) 56
Hình 3.8. Kết quả PCR khuẩn lạc E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 với cặp mồi
T7 pro/T7 ter 56
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện protein hIGF-1 bằng điện di Tricine-SDS-
PAGE 58
Hình 3.10. Chứng minh sự biểu hiện protein hIGF-1 bằng lai Western 59
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Danh mục các bảng và hình
-iii-
Hình 3.11. Sắc ký đồ tinh chế thu nhận hIGF-1 bằng sắc ký trao đổi cation 60
Hình 3.12. Kết quả phân tích Tricine SDS-PAGE các phân đoạn protein thu nhận
từ quá trình tinh chế sắc ký trao đổi cation 61
Hình 3.13. Kết quả phân tích độ tinh sạch của mẫu trước và sau tinh chế bằng
phần mềm Quantity One (Biorad, Hoa Kỳ) 62
Hình 3.14. Ảnh hưởng của hIGF-1 sau tinh chế lên khả năng tăng sinh của dòng tế
bào MCF-7 63


Luận văn Thạc sĩ Sinh học Lời mở đầu
Trang 1
LỜI MỞ ĐẦU
hIGF-1 hay còn gọi là somatomedin C là một protein hormone được tạo ra chủ

yếu ở gan nhờ sự kích thích của hormone tăng trưởng GH (Growth Hormone).
hIGF-1 có vai trò kích thích sự tăng trưởng và phát triển của hầu hết các loại tế bào
trong cơ thể đặc biệt là các tế bào cơ - xương, tế bào gan, tế bào thần kinh, tế bào
da, tế bào tạo máu … Bên cạnh đó hIGF-1 còn giúp cân bằng các chu trình chuyển
hoá protein, lipid, carbohydrate cùng nhiều loại hormone và các hợp chất sinh học
khác. Sự thiếu hụt hIGF-1 ở trẻ gây ra bệnh IGFD (Insulin-like growth factor 1
deficiency). Trẻ bị mắc bệnh IGFD bị lùn hơn so với trẻ bình thường và phát triển
không cân đối trong khi lượng GH bình thường. Nguyên nhân có thể là do đột biến
gene mã hóa cho hIGF-1 hoặc thụ thể của GH không đáp ứng được với GH…Do đó
để đảm bảo cho trẻ thiếu hụt hIGF-1 có khả năng phát triển bình thường thì việc
phục hồi lượng hIGF-1 trong máu về mức bình thường là hết sức cần thiết. Hiện
nay không có phương thuốc chữa trị hiệu quả cho những bệnh nhân mắc bệnh IGFD
ở giai đoạn muộn, cách tốt nhất để chữa trị IGFD là phát hiện sớm bệnh nhân mắc
bệnh và tiêm bổ sung đủ lượng hIGF-1 cần thiết bằng cách sử dụng rhIGF-1. Vào
năm 2005 các sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp gồm Increlex (Tercia) và Iplex (Insmed)
đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực
phẩm, Hoa Kỳ) chấp nhận sử dụng là thuốc để điều trị trẻ bị lùn do thiếu hụt hIGF-
1. Trong những năm qua các cơ quan có chức năng đã cho phép trẻ em có tầm vóc
nhỏ, lùn được điều trị với rhIGF-1 ngày càng tăng lên.
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy hIGF-1 có tác dụng tích cực trong việc
điều trị một số bệnh thần kinh, suy tim, tổn thương do bỏng, bệnh xơ cứng cột bên
teo cơ, đái tháo đường loại 1, 2 và làm giảm lượng mỡ trong cơ thể. hIGF-1 còn
được sử dụng trong công nghệ mỹ phẩm làm đẹp da và sử dụng cho các vận động
viên thể dục thể thao để tăng lượng cơ bắp cũng như tăng cường các quá trình đồng
hóa giúp tăng cường thể lực. Ngoài ra, đang có rất nhiều nghiên cứu đang được tiến
hành để làm rõ hơn vai trò và khả năng ứng dụng của hIGF-1.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Lời mở đầu
Trang 2
Tại Việt Nam các sản phẩm hIGF-1 chủ yếu được nhập về từ nước ngoài với

giá thành cao. Việc nghiên cứu tìm ra một quy trình sản xuất protein với hiệu suất
cao, đơn giản và rẻ tiền nhằm sản xuất sản lượng lớn hIGF-1 giá rẻ phục vụ cho
việc điều trị bệnh cũng như phục vụ các nghiên cứu ứng dụng trong nước là hết sức
cần thiết. Do đó, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử và Môi trường, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành
nghiên cứu sản xuất protein hIGF-1 bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. Trong khuôn
khổ chương trình nghiên cứu, luận văn này được thực hiện nhằm: “Nghiên cứu tạo
dòng, biểu hiện và thu nhận hIGF-1 (human insulin-like growth factor 1) từ
Escherichia coli”. Luận văn bao gồm các nội dung chính như sau:
1. Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b.
2. Tạo chủng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1.
3. Tạo chủng tế bào E. coli Origami(DE3) mang vector tái tổ hợp pET22b-
higf1.
4. Cảm ứng biểu hiện và thu nhận thể vùi có chứa hIGF-1 từ chủng E. coli
Origami(DE3)/pET22b-higf1.
5. Hòa tan thể vùi và tái gấp cuộn hIGF-1.
6. Tinh chế thu nhận hIGF-1 sau khi tái gấp cuộn.
7. Kiểm tra hoạt tính hIGF-1 thu nhận được.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 3







PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 4
1.1. Nhân tố tăng trƣởng hIGF-1 (human Insulin-like growth factor 1)
1.1.1. Giới thiệu
Trong quá trình tăng trưởng và phát triển của cơ thể từ giai đoạn thai nhi đến
lúc trưởng thành luôn chịu sự chi phối của nhiều loại hormone khác nhau. Trong đó
đóng vai trò quan trọng nhất là nhóm các hormone điều hòa tăng trưởng bao gồm
GHRH, GH, IGF-1,…Các hormone điều hòa tăng trưởng có vai trò quan trọng và
quyết định đối với giai đoạn phát triển từ trẻ nhỏ sang giai đoạn trưởng thành thông
qua việc kích thích thúc đẩy quá trình trao đổi chất, tăng cường các quá trình tổng
hợp đặc biệt là tổng hợp hệ cơ-xương; đồng thời kiểm soát quá trình tăng trưởng ở
một giới hạn nhất định để tạo ra một cơ thể phát triển cân đối hài hòa. Một trong
những nhóm hormone điều hòa tăng trưởng quan trọng đó là nhóm hormone tăng
trưởng insulin-like growth factors (IGFs).
IGFs là họ protein hormone có trình tự amino acid tương đồng với proinsulin
khoảng 50% bao gồm IGF-1 và IGF-2 (hay còn gọi là somatomedin C và
somatomedin A) [9]. Trình tự amino acid của IGF-1 và IGF-2 có độ tương đồng
khoảng 70% và có độ bảo tồn cao giữa các loài [16]. IGFs có vai trò kích thích tăng
sinh hầu hết các loại tế bào, tham gia vào các quá trình trao đổi chất quan trọng của
cơ thể [2, 16-17]. IGF-2 có vai trò kích thích tăng sinh và phát triển cơ thể chủ yếu
ở giai đoạn thai nhi trong khi đó IGF-1 lại có vai trò kích thích thúc đẩy sự tăng
trưởng ở trẻ mới lớn và tham gia vào các quá trình biến dưỡng ở người trưởng thành
[16]. Vì IGF-2 có vai trò chủ yếu trong giai đoạn thai nhi và ít có vai trò quan trọng
trong giai đoạn trưởng thành nên nhiều nghiên cứu chỉ tập trung chủ yếu vào IGF-1.
Cho đến nay, vai trò và chức năng IGF-1 ngày càng được làm sáng tỏ, nhiều nghiên
cứu ứng dụng IGF-1 đã và đang mang lại hiệu quả trong trị liệu và nhiều ứng dụng
quan trọng khác [1, 15].
1.1.2. Đặc điểm gene mã hóa và cấu trúc phân tử protein hIGF-1
Protein hIGF-1 được mã hóa bởi gene dài 90kb, gồm 6 đoạn exon nằm trên
cánh dài của NST số 12 [13]. Gene này được biểu hiện ở nhiều mô trưởng thành,

nhưng chủ yếu ở gan. Sự biểu hiện hIGF-1 được điều hòa bởi hormone tăng trưởng
GH, insulin và điều kiện dinh dưỡng [2, 7].
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 5
Phân tử hIGF-1 chỉ có một chuỗi polypeptide dài 70 amino acid với 3 cầu nối
disulfide nội phân tử ở các vị trí Cys6-Cys48, Cys18-Cys61 và Cys47-Cys52.
Trọng lượng phân tử 7649 Da, với bốn vùng chức năng A, B, C và D. Trong đó
vùng A, B và C tương đồng với vùng A, B và C trên phân tử proinsulin [9]. Không
giống như phân tử insulin, vùng C của hIGF-1 không được loại bỏ mà còn tham gia
một phần vào vùng cấu trúc hoạt động [9].
Cấu trúc hIGF-1 có 3 xoắn alpha, trong đó xoắn alpha Gly8-Cys18 thuộc vùng
chức năng B, xoắn alpha Ile43-Cys47 và Leu54-Glu58 đều thuộc trong vùng chức
năng A. Hai vùng chức năng A và B liên kết với nhau bởi ba cầu nối disulfide, có
vai trò nhận diện thụ thể IGF1R (insulin-like growth factor 1 receptor) [9].

Hình 1.1. (A): Cấu trúc phân tử hIGF-1. (B): Cấu trúc không gian ba chiều
của hIGF1, các vùng chức năng được phân biệt bằng màu sắc; Đỏ: vùng B; xanh:
vùng C; cam: vùng A; vàng: vùng D [2, 9].
1.1.3. Đặc điểm hoạt động của hIGF-1
Trong quá trình phát triển bình thường của cơ thể, tuyến yên được kích thích
sản xuất GH, GH tác động lên các tế bào gan tổng hợp hIGF-1 và đi vào máu đến
các mô đích để thực hiện chức năng [2]. hIGF-1 được sản xuất mạnh ở giai đoạn trẻ
mới lớn và dậy thì, giảm dần khi về già. Trong máu, hIGF-1 chủ yếu tồn tại dưới
dạng liên kết với 6 loại protein chuyên biệt IGFBPs (insulin-like growth factor
binding protein) (IGFBP1-6), trong đó IGFBP-3 chiếm tỉ lệ cao nhất. Có đến trên
90% hIGF1 tạo thành phức hợp với IGFBP-3 và tiểu đơn vị ALS (acid labile
subunit), một peptide với trọng lượng phân tử 85 kDa, được sản xuất ở gan [16]. Sự
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 6
liên kết của 3 thành phần trên tạo thành một cấu trúc ổn định giúp kéo dài thời gian

tồn tại hIGF-1 trong cơ thể đồng thời bất hoạt chức năng của hIGF-1 nhằm ngăn
chặn tác dụng hạ đường huyết không mong muốn [16]. hIGF-1 chỉ hoạt động khi
tồn tại dưới dạng tự do, khi đến cơ quan đích, dưới tác động của một số nhân tố, quá
trình ly giải phức hợp IGFBP-ALS-hIGF-1 xảy ra và phóng thích hIGF-1 để liên
kết với thụ thể IGF1R trên bề mặt tế bào đích và thực hiện chức năng [7, 10]. Giống
như hIGF-1, IGFBPs cũng được tổng hợp phần lớn ở gan và ở một số mô, cơ quan
khác. Trong một số trường hợp nhất định, các IGFBPs còn có khả năng tác động hỗ
trợ hIGF-1 gắn lên thụ thể IGF1R [9].

Hình 1.2. Các con đường truyền tín hiệu trong tế bào được kích hoạt bởi hIGF-1.
IGF1R là thụ thể của hIGF-1 thuộc họ Tyrosine kinase, có cấu trúc tương
đồng với thụ thể insulin. IGF1R gồm 2 tiểu đơn vị α nằm ngoài tế bào và 2 tiểu đơn
vị β xuyên màng tế bào. IGF1R hoạt động ở dạng dimer hóa tạo thành phức hợp
α2β2 [9, 16]. Khi hIGF-1 gắn vào tiểu phần α sẽ kích hoạt quá trình phosphoryl hóa
gốc tyrosine nằm trên tiểu đơn vị β ở bên trong tế bào. Sự phosphoryl hóa tyrosine
dẫn đến kích hoạt một loạt các con đường truyền tín hiệu tiếp theo bao gồm sự tăng
cường biểu hiện các gene liên quan đến chu trình tế bào như cyclin D1 và D2 làm
cho tế bào bước sang giai đoạn phân bào và tăng sinh; đồng thời kích hoạt các con
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 7
đường tín hiệu AKT/protein kinase B, MAPK làm ngăn chặn quá trình apoptosis
của tế bào; ngoài ra còn hoạt hóa một loạt các quá trình khác nhau tùy thuộc vào
loại tế bào đích tác động như tăng tăng cường biểu hiện các protein liên quan đến
quá trình tạo cơ ở tế bào cơ, kích thích quá trình tạo xương ở các tế bào xương, điều
hòa quá trình tạo cytokine ở các tế bào thuộc hệ miễn dịch,…[17].
Cho đến nay, vai trò của hIGF-1 vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ và nhiều
nghiên cứu đang được tiến hành để làm sáng tỏ thêm. Dựa trên sự hiểu biết và vai
trò của hIGF-1 đối với từng loại tế bào từ đó có thể đưa ra những ứng dụng có ý
nghĩa to lớn trong việc điều trị một số bệnh quan trọng.
1.1.4. Chức năng hIGF-1 trong cơ thể sống

hIGF-1 có vai trò kích thích tăng sinh hầu hết các loại tế bào thông qua việc
thúc đẩy sự phát triển tế bào từ phase G
2
đến phase M đưa tế bào đến giai đoạn
phân bào trong chu trình tế bào. Bên cạnh đó, hIGF-1 còn kích thích tổng hợp
DNA, ức chế quá trình apoptosis, tham gia vào các quá trình trao đổi chất của cơ
thể, làm tăng hấp thu amino acid, giảm phân hủy protein, kích thích hấp thu glucose
và tổng hợp glycogen góp phần giúp hạ đường huyết. Ngoài ra hIGF-1 còn thúc đẩy
quá trình phân giải acid béo thành năng lượng cần thiết cho cơ thể, làm giảm acid
béo dư thừa, chất béo trung tính, và lượng cholesterol trong máu [17, 22].
Trong giai đoạn phát triển bình thường của trẻ, khi bước sang giai đoạn dậy
thì, hàng loạt các biến đổi xảy ra trong đó có quá trình phát triển của hệ cơ xương
thúc đẩy sự gia tăng kích thước và tầm vóc của cơ thể [7]. Tuy nhiên để kích thích
hệ cơ xương phát triển cần phải có sự tham gia của các hormone quan trọng trong
đó có hIGF-1. Nếu cơ thể không sản xuất đủ lượng hIGF-1 trong giai đoạn này thì
trẻ phát triển không bình thường và bị lùn. Hội chứng này được gọi là IGFD
(insulin-like growth factor 1 deficiency) [4]. Những nghiên cứu trên chuột đột biến
trên gene mã hóa cho IGF-1 cho thấy trọng lượng nặng hơn 30% so với bình
thường. Đối với các động vật thiếu gene mã hóa cho IGF-1, trọng lượng cũng giảm
rõ rệt, một số trường hợp đã chết ngay sau khi sinh. Những trường hợp sống sót vẫn
tiếp tục thể hiện sự tăng trưởng chậm, ốm yếu [19].
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 8
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi tác nhân lạ
xâm nhập có liên quan đến tương tác của các tế bào hệ miễn dịch với hIGF-1. hIGF-
1 làm tăng cường sản xuất nhanh các đại thực bào, nội độc tố để bảo vệ vật chủ
chống lại tác nhân lạ một cách nhanh nhất, hiệu quả nhất. Năm 1992, Timsit đã
chứng minh hIGF-1 có tác dụng kích thích tổng hợp DNA và tăng sinh các tế bào
biểu mô tuyến ức, cơ quan quan trọng của hệ miễn dịch [28]. hIGF-1 giúp hồi phục
và phát triển chức năng tuyến ức, đồng thời tạo nhiều tế bào T, đẩy nhanh quá trình

tạo kháng thể trong cơ thể [12, 28]. Bên cạnh đó hIGF-1 còn có vai trò cân bằng
hormone cho cơ thể, sự hiện diện hIGF-1 kiểm soát quá trình sản xuất GH. Tùy vào
nồng độ mà hIGF-1 sẽ cho tín hiệu ức chế hay kích thích tiết GH từ tuyến yên [2].
1.1.5. Các hƣớng ứng dụng hIGF-1
1.1.5.1. Điều trị bệnh IGFD
Bệnh IGFD (insulin-like growth factor 1 deficiency) là tình trạng cơ thể sản
xuất không đủ lượng protein hIGF-1 để đáp ứng nhu cầu cần thiết cho quá trình
tăng trưởng và phát triển của cơ thể. Nếu kết quả kiểm tra nồng độ hIGF-1 < 15μg/l
hoặc nồng độ IGFBP-3 < 400μg/l thì cơ thể đang thiếu protein hIGF-1 và cần phải
được xem xét để điều trị kịp thời [4]. Nguyên nhân thiếu hụt hIGF-1 có thể là do
[7]:
- Những yếu tố có liên quan tới sự suy giảm tín hiệu của thụ thể hormone GH,
từ đó làm giảm sự tổng hợp hIGF-1.
- Thiếu hụt GH nghiêm trọng do suy tuyến yên, hoặc các bệnh liên quan đến
vùng dưới đồi.
- Do đột biến của các nhân tố trong con đường truyền tín hiệu của GH.
- Do gene mã hóa cho GH bị phá hủy hoặc kháng thể trung hòa GH.
- Hoạt động bất thường của thụ thể GH.
- Sự phá hủy hay đột biến trong cấu trúc gene mã hóa hIGF-1 cũng làm thiếu
hụt hIGF-1.
- Tình trạng tuổi tác, dinh dưỡng, các bệnh về gan cũng góp phần ảnh hưởng
đến lượng hIGF-1 trong cơ thể.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 9
Triệu chứng của bệnh IGFD cho thấy cơ thể có biểu hiện tích tụ chất béo dư
thừa, giảm độ vững chắc của xương, giảm quá trình tổng hợp amino acid, mất cân
bằng nội tiết, tăng nguy cơ rối loạn chuyển hóa chất dinh dưỡng, thiếu chất dinh
dưỡng dẫn đến tình trạng chậm tuổi dậy thì, cơ thể lùn bất thường, phát triển không
cân đối. Ngoài ra thiếu hụt hIGF-1 có thể trở nên bị điếc, kém trí tuệ và chậm hiểu
biết [4].

Trước đây người ta cho rằng sự thiếu hụt hIGF-1 là do thiếu hụt hormone GH.
Do đó, trẻ em mắc bệnh IGFD đã được điều trị với hormone rhGH. Tuy nhiên, một
số thử nghiệm khác đo lường sự hiện diện của hormone hGH và hIGF-1 của trẻ mắc
bệnh chỉ cho thấy mức độ thấp bất thường của hIGF-1. Như vậy đối với trẻ thiếu
hụt hIGF-1 do thiếu hụt GH thì có thể sử dụng GH tái tổ hợp để điều trị cho kết quả
tốt. Nhưng trong một số trường hợp khi cung cấp hormone tăng trưởng cho cơ thể
nhưng vẫn không chữa được bệnh và nồng độ hIGF-1 vẫn không được phục hồi. Để
điều trị những trường hợp này chỉ có thể bổ sung vào cơ thể một lượng hIGF-1 đã
thiếu để bù đắp cho lượng hIGF-1 thiếu hụt. Hiện tại không có phương thuốc hữu
hiệu nào để chữa trị các bệnh nhân bị IGFD ở giai đoạn muộn. Do đó, phương thức
hiệu quả nhất đó là chẩn đoán sớm bệnh IGFD và tiêm bổ sung cho đủ lượng hIGF-
1. Lượng hIGF-1 sử dụng cho điều trị chủ yếu là hIGF-1 tái tổ hợp [1].
1.1.5.2. Điều trị một số bệnh khác
Ngoài việc sử dụng hIGF-1 để điều trị bệnh IGFD thì hiện nay người ta còn
hướng đến việc dùng hIGF-1 để chữa bệnh tiểu đường, bệnh tim, bệnh Alzheimer
(AD), bệnh xơ cứng cột bên teo cơ (ALS - Amyotrophic Lateral Sclerosis), lão
hóa…[6, 15].
Các tác dụng kích thích đáng kể của hIGF-1 trên sự hấp thụ glucose của tế bào
có vai trò quan trọng trong chữa bệnh tiểu đường ở người. hIGF-1 liên kết với thụ
thể insulin nhỏ hơn rất nhiều so với insulin nhưng trên thực tế nó vẫn có tác dụng hạ
đường huyết. Với những hiểu biết về hIGF-1, các nhà khoa học đã tiến hành thử
nghiệm sử dụng hIGF-1 trên bệnh nhân tiểu đường trong một thời gian xác định và
đã đưa ra kết luận rằng hIGF-1 có thể kiểm soát làm giảm lượng glucose trong máu
mà không có các tác dụng phụ. Như vậy hIGF-1 cho chúng ta thêm một loại thuốc
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 10
có thể điều trị bệnh tiểu đường [6]. Tuy nhiên, hIGF-1 có tác dụng làm tăng sinh tế
bào nếu sử dụng liều cao quá có thể dẫn đến nguy cơ gây ung thư.
hIGF-1 còn được sử dụng trong điều trị bệnh mất trí nhớ. Khi cơ thể mắc bệnh
AD thì lượng protein hIGF-1 và thụ thể IGFR giảm rõ rệt. Thử nghiệm trên chuột

có gene mã hóa cho IGF-1 bị phá hủy cho thấy sự sớm tích lũy protein amyloid beta
(Aβ) trong não. Amyloid beta là một chuỗi liên kết peptide của 36-43 amino acid,
tạo thành màng bao phủ trong mạch máu não làm tổn thương mạch máu não và tế
bào thần kinh. Điều đó nói lên rằng hIGF-1 có thể giảm mức độ tích tụ của protein
amyloid beta trong não và hIGF-1 có nhiều tiềm năng trong chữa bệnh AD [6].
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy hIGF-1 có thể sử dụng trong điều trị bệnh
suy tim. Suy tim là tình trạng cơ tim ngày càng yếu đi và không thể bơm đủ máu để
đi nuôi các cơ quan trong cơ thể, không đưa được máu thiếu oxi về tim nên máu bị
ứ lại gây tình trạng phù nề, mệt mỏi, khó thở. hGF-1 có thể kích thích tăng trưởng
cơ tim bằng cách tăng sự hấp thu amino acid, tổng hợp protein, ngăn ngừa quá trình
apoptosis của tế bào cơ tim. Điều khiển tăng lượng canxi trong tế bào để tăng hoạt
động co bóp cơ tim. Mở rộng mạch máu, tăng lượng oxi và các chất dinh dưỡng đến
từng phần của cơ thể bằng cách kích hoạt làm tăng oxide nitric (NO) [8].
hIGF-1 còn góp phần quan trọng trong quá trình tổng hợp, kích thích tăng sinh
tế bào xương, tế bào cơ, nguyên bào sợi ở da, giúp tăng mật độ tế bào xương làm
xương vững chắc, tăng khả năng phục hồi, mau chóng chữa lành vết thương ở các
vùng da và tăng khối lượng cơ. Vì vậy hIGF-1 được đề xuất cho liệu pháp chữa
bệnh loãng xương, bệnh teo cơ, điều trị các tổn thương ngoài da [6]. Một số nghiên
cứu đã chỉ ra rằng hIGF-1 có vai trò làm chậm quá trình thoái hóa cơ ở bệnh xơ
cứng cột bên theo cơ (ALS) và vai trò của hIGF-1 đối với bệnh này vẫn đang được
tiếp tục nghiên cứu [23].
1.1.5.3. Ứng dụng khác của hIGF-1
Trong thể dục thể thao, các vận động viên trên thế giới thường hay sử dụng
các sản phẩm rhIGF-1 để tăng khối lượng cơ, cải thiện hiệu quả luyện tập. hIGF-1
thúc đẩy sự tăng trưởng cơ bắp, kích thích sự giảm mỡ, giúp thân hình trở nên săn
chắc, thể lực cường tráng, thúc đẩy chữa lành các vết thương. Trong quá trình luyện
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 11
tập đòi hỏi cơ thể phải sử dụng năng lượng, sự hiện diện hIGF-1 làm tăng quá trình
oxy hóa chất béo, glycogen để cung cấp nguồn năng lượng cần thiết cho cơ thể

đồng thời tăng hiệu quả hấp thu glucose. hIGF-1 còn kích thích cơ tim hoạt động
điều hòa lưu thông máu mang oxi đến các tế bào, giúp các vận động viên khỏe
mạnh hơn, tăng hiệu quả tập luyện.
hIGF-1 còn được sử dụng trong công nghệ thẫm mỹ và làm đẹp. Với sự tăng
thêm của tuổi tác, lượng collagen giảm thiểu, khiến cho làn da xuất hiện nhiều vết
nhăn và trở nên thô ráp. hIGF-1 làm tăng nhanh tốc độ tổng hợp các nguyên bào
sợi, tổng hợp collagen giúp làn da hồng hào, mịn màng và mất dần vết nhăn. hIGF-
1 thúc đẩy quá trình phân giải chất béo không cần thiết cho cơ thể. Tác dụng này
làm giảm đi phần lớn lượng mỡ thừa ở phần bụng, hông và bắp tay… hIGF-1
thường được bổ sung vào kem dưỡng da.
1.1.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất hIGF-1 trên thế giới và ở Việt Nam.
hIGF-1 đã được sản xuất từ lâu trên thế giới chủ yếu bằng công nghệ sản xuất
protein tái tổ hợp trên hệ thống tế bào chủ E. coli [3] và nấm men [29] là chủ yếu.
Đáng chú ý là vào tháng 08 năm 2005, FDA đã chấp nhận cho các sản phẩm rhIGF-
1 thương mại là Increlex của hãng dược phẩm Tercia (Hoa Kỳ) sử dụng để điều trị
IGFD trên người. Đến tháng 12 năm 2005, FDA cũng chấp thuận cho sản phẩm
Iplex (phối trộn giữa rhIGF-1 và IGFBP-3) của hãng Insmed (Hoa Kỳ) sử dụng để
điều trị IGFD [1]. Một hướng triển vọng mới đang mở ra cho thị trường hIGF-1 tái
tổ hợp. Vào năm 2007, cơ quan kiểm tra sản phẩm y tế (EMEA) của châu âu cũng
đã đồng ý cho phép sử dụng hIGF-1 tái tổ hợp để điều trị IGFD [32]. Đến năm
2009, FDA đã chấp nhận cho việc sử dụng IPLEX để nghiên cứu điều trị bệnh xơ
cứng cột bên teo cơ [33]. Trong những năm qua các cơ quan có chức năng đã cho
phép trẻ em có tầm vóc nhỏ, lùn được điều trị với rhIGF1 ngày càng tăng lên. Một
số sản phẩm rhIGF-1 chủ yếu trên thế giới gồm:
- Increlex (mecasermin) là sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp được sản xuất trên hệ
thống tế bào E. coli bởi công ty Tercia (Hoa kỳ). Increlex là dạng thuốc tiêm được
bán ở dạng lọ tiêm nhiều lần gồm 10mg và 40mg rhIGF-1. Giá bán Increlex lọ
40mg trên thị trường Hoa Kỳ là 562,5 USD [34].
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 12

- Iplex (mecasermin rinfabate) là sản phẩm gồm hIGF-1 tái tổ hợp và IGFBP-
3 tái tổ hợp với tỉ lệ phối trộn 1:1 được sản xuất trên hệ thống E. coli bởi công ty
Insmed (Hoa Kỳ). Sản phẩm kết hợp này giúp tăng thời gian tồn tại hIGF-1 trong
máu sau khi tiêm đồng thời làm giảm tác dụng phụ của hIGF-1. IPLEX được bán
dưới dạng liều tiêm một lần 36mg/0,6ml. Giá bán Iplex trên thị trường Hoa Kỳ là
90 USD/liều [31].
- Hiện nay trên thị trường còn có loại sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp đã được
biến đổi cấu trúc với tên gọi là IGF-1 Long R3. Trình tự hIGF-1 đã được thay thế
glutamine ở vị trí thứ 3 thành arginine đồng thời dung hợp thêm chuỗi 13 amino
acid ở đầu N. Kết quả của sự biến đổi này là phân tử hIGF-1 không thể gắn được
vào các IGFBPs và do đó hoạt tính của hIGF-1 không bị kìm hãm và tăng lên một
cách đáng kể. Sản phẩm này chủ yếu sử dụng cho nghiên cứu mà không được sự
chấp thuận cho việc sử dụng điều trị vì lý do không kiểm soát được tác dụng của
hIGF-1. IGF-1 Long R3 được bán trên thị trường thế giới với giá dao động từ 300-
500 USD/ 1mg [36].
- Ngoài ra còn một loạt các sản phẩm hIGF-1 không sử dụng cho điều trị
nhưng được sử dụng cho nghiên cứu của các hãng hóa chất và công nghệ sinh học
như Sigma, R&D system,… với giá thành khá cao.

Hình 1.3. Một số sản phẩm rhIGF-1 trên thị trường
Tại Việt Nam, hIGF-1 vẫn chưa được biết đến nhiều và tiềm năng ứng dụng
của hIGF-1 là rất lớn. Hiện nay trên thị trường Việt Nam cũng đã xuất hiện một số
sản phẩm rhIGF-1 dưới dạng thực phẩm chức năng. Sản phẩm kết hợp IGF-1 và
Vigorex dạng dịch phun 30ml/lọ được sản xuất bởi công ty Megalife (Hoa Kỳ) có
giá bán 4.600.000VNĐ tại Việt Nam [35]. Giá thành như vậy còn khá cao so với
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 13
mặt bằng chung thu nhập của người dân Việt Nam. Do đó việc nghiên cứu quy trình
sản xuất lượng lớn hIGF-1 với giá rẻ nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị và nghiên cứu
trong nước là việc hết sức cần thiết.

1.2. Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống E. coli
Với nhu cầu ngày càng tăng cao đối với các protein sử dụng trong trị liệu và
nghiên cứu, đặc biệt là các protein có nguồn gốc từ động vật hữu nhũ thì lượng tách
chiết thu nhận từ cơ thể sinh vật rất thấp với giá thành rất cao. Do đó yêu cầu đặt ra
làm thế nào để thu nhận một lượng lớn protein mục tiêu với giá thành rẻ. Để giải
quyết vấn đề này, công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp ra đời và cho đến nay đã
đem lại những thành tựu hết sức to lớn. Hàng loạt các sản phẩm protein tái tổ hợp
đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp và đem lại doanh thu lên đến hàng tỉ
USD/năm. Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp là sự vận dụng thành công kỹ
thuật di truyền, thao tác gene và các hiểu biết về sinh học tế bào. Một trong những
hệ thống tế bào chủ biểu hiện thành công protein tái tổ hợp và cho đến nay vẫn
được sử dụng phổ biến đó là hệ thống tế bào chủ E. coli. Hệ thống tế bào chủ E. coli
được sử dụng phổ biến tại vì nó có những ưu điểm sau [18]:
- E. coli có hệ thống di truyền đơn giản và đã được biết rõ, thuận lợi cho việc
biến đổi gen nhằm tạo ra các chủng tế bào đột biến phục vụ sản xuất protein tái tổ
hợp được dễ dàng.
- E. coli là hệ thống tế bào chủ an toàn khi sử dụng. Chúng được tìm thấy
trong tự nhiên ở cả người và động vật.
- E. coli có tốc độ tăng trưởng rất nhanh nếu so với các hệ thống tế bào chủ
khác, với thời gian một thế hệ khoảng 20 phút. Tốc độ tăng trưởng nhanh cũng
đồng nghĩa với tốc độ sản xuất tốt hơn khi đưa vào lên men.
- Hệ thống E. coli có khả năng dung nạp gene ngoại lai thông qua plasmid tái
tổ hợp, tồn tại khá ổn định. Việc nuôi cấy E. coli khá dễ dàng với môi trường đơn
giản và rẻ tiền. Sản lượng protein tái tổ hợp tạo ra cao, có thể lên đến 50% lượng
protein của tế bào.
Các chủng E. coli thường sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp là BL21 và
K12 cùng các dẫn xuất của chúng. Ưu điểm hơn so với chủng K12, các chủng BL21
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 14
khiếm khuyết hai protease ompt và lon, nhờ vậy làm giảm sự phân hủy các protein

mục tiêu. Ngoài ra các dẫn xuất BL21 được thiết kế di truyền để có được những đặc
tính mong muốn như chủng đột biến recA giúp tăng cường tính ổn định của plasmid
mục tiêu, chủng đột biến trxB/gor giúp tăng cường khả năng hình thành cầu nối
disulfide (Novagen Origami và AD949), chủng đột biến lacY tạo khả năng biểu
hiện protein ở các mức biểu hiện khác nhau (Novagen Tuner) [26]…. Tùy thuộc
vào hệ thống vector được sử dụng mà từ các chủng chủ này có thể được biến đổi di
truyền để tạo thành nhiều dẫn xuất khác nhau phù hợp với vector được sử dụng.
Chẳng hạn như chủng tế bào E. coli BL21(DE3) là chủng BL21 có mang gene mã
hóa cho T7 RNA polymerase là enzyme phiên mã của T7 promoter. Chủng này
được sử dụng cho các hệ thống vetor biểu hiện gene dưới sự kiểm soát của T7
promoter [5]. Dựa vào đặc điểm gene và cấu trúc protein ngoại lai muốn biểu hiện
và hệ thống vector biểu hiện được sử dụng mà lựa chọn chủng chủ E. coli cho thích
hợp.
Tuy nhiên việc biểu hiện protein tái tổ hợp bằng E. coli cũng gây ra nhiều khó
khăn đối với các protein có nguồn gốc từ eukaryote vì tế bào chủ E. coli không có
quá trình biến đổi sau dịch mã. Protein tái tổ hợp được biểu hiện vượt mức tạo thể
vùi không có hoạt tính. Điều này gây khó khăn cho việc thu hồi, tốn chi phí tái gấp
cuộn sản phẩm và hiệu suất thu hồi thấp [18].
1.3. Tái gấp cuộn in vitro protein thu nhận từ thể vùi biểu hiện trong tế bào E.
coli [20-21]
Đã có nhiều chiến lược được sử dụng để làm tăng khả năng tan và có hoạt tính
của protein mục tiêu biểu hiện trong E. coli như biểu hiện ở nhiệt độ thấp, điều kiện
stress, sử dụng hệ thống promoter cho phép biểu hiện ở mức độ vừa phải, đồng biểu
hiện các chaperone phân tử như scPDI, DsbA, GroES/EL… nhằm hỗ trợ quá trình
gấp cuộn đúng của protein mục tiêu. Tuy nhiên các phương pháp này vẫn còn một
số giới hạn như lượng protein có hoạt tính thu được ít, ảnh hưởng đến sức sống của
tế bào chủ, protein tan trong tế bào chất gây khó khăn cho quá trình tinh chế thu
nhận. Do đó, hướng thu nhận protein từ thể vùi vẫn được ưa chuộng do sản lượng
protein mục tiêu thu được cao có thể lên đến 50% lượng protein tổng số của tế bào,
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu

Trang 15
thể vùi không tan và không bị tác động của các protease nội bào, độ tinh sạch
protein thu được từ thể vùi lên đến trên 70%. Do thể vùi không tan và đa số các
protein của tế bào chủ ở dạng tan nên có thể loại bỏ lượng lớn protein tạp chỉ qua
một bước ly tâm. Mặt khác một số protein biểu hiện ở dạng tan lại gây độc cho tế
bào chủ. Sau khi thu nhận được thể vùi thì vấn đề đặt ra là làm sao thu nhận được
protein mục tiêu có hoạt tính sinh học. Để giải quyết vấn đề này, phương pháp tái
gấp cuộn (refolding) ra đời để đưa protein mục tiêu trở về cấu hình đúng và có hoạt
tính. Kể từ khi sự tạo thành thể vùi được phát hiện, một số lượng lớn quy trình tái
gấp cuộn cho những loại protein khác nhau đã ra đời và được phát triển.
Sau quá trình nuôi cấy, tế bào chủ E. coli được thu nhận để tiến hành phá tế
bào và thu nhận thể vùi. Có thể phá tế bào bằng nhiều phương pháp khác nhau
nhưng chủ yếu là bằng sóng siêu âm hoặc bằng áp suất. Thể vùi được thu nhận từ
dịch phá tế bào bằng phương pháp ly tâm. Thể vùi được xử lý với Dnase để loại bỏ
DNA nhiễm sắc thể, xử lý với các chất tẩy như Triton-X100 ở nồng độ khoảng 2%
để hoà tan lipid và các protein màng (đặc biệt là các protease gắn màng), sự hiện
diện của muối ở nồng độ cao như NaCl 0.5-1.5M giúp hoà tan các protein tạp trong
thể vùi.
Trước khi tái gấp cuộn, thể vùi cần dược hoà tan để tạo ra những chuỗi
polypeptide riêng lẻ bằng các chất biến tính mạnh như guanidine hydrochloride
(GdnHCl), urea. Một số phương pháp hòa tan thể vùi sử dụng chất biến tính ở nồng
độ thấp kết hợp với pH thấp hoặc pH cao cũng cho kết quả khả quan hoặc có thể sử
dụng áp suất để đánh tan thể vùi. Sau quá trình hòa tan thể vùi, protein mục tiêu
được chuyển sang quá trình tái gấp cuộn bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Do thể vùi được hòa tan trong dung dịch có nồng độ chất biến tính cao nên cần
phải giảm nồng độ chất biến tính đến mức tối thiểu để có thể vừa hạn chế tối đa sự
kết tụ protein mà vẫn cho phép các protein tái gấp cuộn được. Phương pháp phổ
biến nhất là pha loãng protein mục tiêu trong một thể tích lớn dung dịch tái gấp
cuộn. Cần phải khuấy trộn tốt trong quá trình pha loãng nhằm hạn chế tương tác
liên phân tử và sự kết tụ protein mục tiêu. Quá trình tái gấp cuộn protein mục tiêu

diễn ra trong dung dịch tái gấp cuộn. Cần phải kiểm soát những yếu tố ảnh hưởng
đến quá trình tái gấp cuộn như:
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 16
- Nồng độ protein mục tiêu tối ưu cho quá trình tái gấp cuộn. Đây là yếu tố
quan trọng cần được xác định dựa vào thực nghiệm đối với từng loại protein. Vì quá
trình tái gấp cuộn thường xảy ra ở nồng độ protein mục tiêu thấp nên cần phải có
thêm những bước cô mẫu để tăng nồng độ protein mục tiêu để phục vụ cho các
bước tinh chế thu nhận tiếp theo.
- Nhiệt độ tối ưu cho quá trình tái gấp cuộn. Nhìn chung đối với nhiều loại
protein thì nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả tái gấp cuộn và làm giảm sự kết tụ
protein mục tiêu bởi vì nhiệt độ thấp làm giảm tốc độ tái gấp cuộn cũng như làm
giảm tương tác kị nước trong đó khi nhiệt độ cao làm tăng tốc độ kết tụ.
- Đối với tái gấp cuộn các protein có cầu nối disulfide, sự hiện diện của hệ
thống oxy hóa-khử là hết sức cần thiết cho việc tạo thành cầu nối disulfide giữa hai
gốc cysteine. Việc lựa chọn cặp oxy hóa-khử cũng đóng vai trò quyết định. Một
trong những cặp oxy hóa-khử thường được sử dụng phổ biến là GSSG/GSH. Tuy
nhiên trong một số trường hợp, các cặp oxy hóa-khử nhỏ hơn như cystein/cystine
lại cho hiệu quả tốt hơn như trong trường hợp tái gấp cuộn proinsulin.
- Sự kết cụm protein trong quá trình tái gấp cuộn cũng là một vấn đề đáng lưu
ý. Để ngăn chặn sự kết cụm, người ta thường sử dụng các hợp chất hóa học có trọng
lượng phân tử nhỏ. Chất thường được sử dụng phổ biến đó là L-arginine, có giả
thuyết cho rằng L-arginine làm mất ổn định các cấu trúc trung gian của protein mục
tiêu và không ảnh hưởng đến cấu trúc gấp cuộn đúng. Ngoài ra còn có các chất biến
tính như urea, GdnHCl; các chất tẩy như SDS, Triton X-100…; các chất hoạt động
bề mặt như Tween 20 cũng được bổ sung vào dung dịch tái gấp cuộn để hạn chế sự
kết cụm protein.
- pH tối ưu cho quá trình tái gấp cuộn của từng loại protein. Đối với trường
hợp protein có cầu nối disulfide thì pH kiềm là cần thiết cho quá trình hình thành và
tái sắp xếp cầu nối disulfide. pH dao động cũng làm ảnh hưởng đến hiệu quả tái gấp

cuộn. Do đó để duy trì pH tối ưu người ta thưởng bổ sung vào dung dịch tái gấp
cuộn các hệ đệm pH như Tris-HCl cho pH kiềm hoặc hệ đệm acetate cho pH acid.
Tóm lại, để tái gấp cuộn thành công cần phải hiểu rõ cấu trúc phân tử protein
mục tiêu do mỗi protein đều có cấu trúc và đặc điểm riêng biệt. Từ đó tiến hành
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 17
khảo sát và tối ưu hóa các thông số của quá trình tái gấp cuộn để đem lại hiệu suất
tái gấp cuộn cao nhất.
1.4. Tinh chế thu nhận protein tái tổ hợp [11]
Sau khi tái gấp cuộn thành công protein tái tổ hợp in vitro vấn đề tiếp theo cần
được giải quyết đó là làm thế nào để thu nhận được protein mục tiêu với độ tinh
sạch cao nhất có thể mà vẫn giữ được hoạt tính sinh học. Đây là bước hết sức quan
trọng vì nó giữ vai trò quyết định đối với sản phẩm protein tái tổ hợp, đặc biệt là các
protein được ứng dụng trong y dược phải thỏa các yêu cầu nghiêm ngặt về độ tinh
sạch cũng như hoạt tính sinh học vì được sử dụng trực tiếp trên người.
Khi bước vào nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp tùy vào các tiêu chí như
hiệu suất quá trình sản xuất, độ tinh sạch, mục đích sử dụng và giá thành mà người
ta phải tính đến các chiến lược tạo dòng, biểu hiện, lựa chọn chủng chủ cũng như
các công đoạn tinh chế thu nhận tương ứng sau này sao cho phù hợp. Phương thức
tinh chế thu nhận còn tùy thuộc vào đặc điểm từng loại protein như trọng lượng
phân tử, điện tích bề mặt, giá trị điểm đẳng điện (pI), tính kị nước, sự phân bố của
các amino acid trên bề mặt phân tử, cấu trúc không gian,…Ngoài ra còn phụ thuộc
vào đặc điểm biểu hiện protein mục tiêu ở tế bào chủ .

Hình 1.4. Một số phương pháp sắc ký được sử dụng để tinh chế protein
Thông thường thì để thu nhận được một loại protein tái tổ hợp có độ tinh
sạch cao thì thường phải trải qua ít nhất là hai bước tinh chế với mỗi bước là một
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu
Trang 18
phương pháp tinh chế khác nhau. Các phương pháp tinh chế được sử dụng chủ yếu

hiện nay là sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography-IEC), sắc kí lọc gel
(size exclusion chromatography), sắc kí ái lực (affinity chromatography), sắc kí kị
nước (hydrophobic interaction chromatography), sắc kí đảo pha (reverse phase
chromatography) .
1.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học hIGF-1 in vitro
Trong việc nghiên cứu các phân tử có hoạt tính sinh học người ta sử dụng
phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro để đánh giá hoạt tính của chúng. Đây là
phương pháp hiệu quả để đo đạc mức độ đáp ứng của dòng tế bào chuyên biệt đối
với phân tử cần thử nghiệm. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên việc sử
dụng dòng tế bào có các receptor đáp ứng hiệu quả với phân tử cần thử nghiệm, từ
đó gây ra chuỗi truyền tín hiệu nội bào, kết quả là một số gene quan trọng được hoạt
hóa dẫn đến các đáp ứng có thể đo đạc được [27].

Hình 1.5. Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro [27]
Dựa trên cách thức tác động của phân tử cần thử nghiệm đối với tế bào đích,
thử nghiệm sinh học in vitro được chia thành 4 nhóm bao gồm: thử nghiệm sinh học
đo mức độ tăng sinh hoặc ức chế tăng trưởng của tế bào, thử nghiệm sinh học đánh
giá mức gây độc đối với tế bào, thử nghiệm sinh học đánh giá một chức năng đặc
biệt nào đó của tế bào chẳng hạn kiểm tra tính xâm lấn của tế bào (invasive), và thử
nghiệm sinh học định lượng các sản phẩm được tạo ra bởi tế bào đích dưới tác động
của phân tử được thử nghiệm [27].
Trong phương pháp thử nghiệm sinh học tăng sinh tế bào, lượng phân tử thử
nghiệm hoạt tính được xác định dựa trên khả năng kích thích tăng sinh dòng tế bào
Tế bào Hoạt hóa
receptor
Tín hiệu
nội bào
Gen
biểu hiện Đáp ứng
Tế bào Hoạt hóa

receptor
Tín hiệu
nội bào
Gen
biểu hiện Đáp ứng