Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên của giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh care

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LƯƠNG QUỐC HƯNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC,
SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ TÍNH KHÁNG NGUN CỦA
GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VƠ HOẠT PHỊNG
BỆNH CARE

Ngành:

Thú y

Mã số:

60.64.01.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Lan

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám
ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng

Tác giả luận văn

Lương Quốc Hưng

i

năm 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, tơi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết
ơn sâu sắc PGS. TS. Nguyễn Thị Lan đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời
gian và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tơi
trong q trình học tập, thực hiện đề tài và hồn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phịng thí nghiệm trọng
điểm cơng nghệ sinh học thú y và phịng thí nghiệm bộ môn bệnh lý đã giúp đỡ và tạo điều
kiện cho tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tơi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hoàn thành luận văn./.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

Tác giả luận văn

Lương Quốc Hưng

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ................................................................................................................. i
Lời cảm ơn ....................................................................................................................ii
Mục lục .......................................................................................................................iii
Danh mục chữ viết tắt .................................................................................................. vi
Danh mục bảng ........................................................................................................... vii
Danh mục hình ........................................................................................................... viii
Trích yếu luận văn........................................................................................................ ix
Thesis Abstract ............................................................................................................ xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1
1.1.

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI.................................................................. 1

1.2.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .......................................................................... 2

1.3.

PHẠM VI NGHIÊN CỨU ............................................................................. 2

1.4.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ....... 3

1.4.1.

Những đóng góp mới ..................................................................................... 3

1.4.2.

Ý nghĩa khoa học........................................................................................... 3

1.4.3.

Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................... 3

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 4
2.1.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGỒI NƯỚC .... 4

2.1.1.

Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước .................................................. 4

2.1.2.

Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngồi nước .................................................. 5

2.2.

MỘT SỐ THƠNG TIN VỀ VIRUS CARE .................................................... 6

2.2.1.

Phân loại virus gây bệnh Care........................................................................ 6

2.2.2.

Hình thái của virus Care ................................................................................ 7

2.2.3.

Cấu trúc của virus Care ................................................................................. 7

2.2.4.

Sức đề kháng của virus Care .......................................................................... 8

2.2.5.

Cơ chế sinh bệnh ........................................................................................... 8

2.2.6.

Đặc tính sinh học của virus Care.................................................................... 8

2.2.7.

Đặc tính sinh học phân tử của virus Care ....................................................... 9

2.3.

MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ BỆNH CARE ................................................... 14

2.3.1.

Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care................................................................... 14

iii


2.3.2.

Triệu chứng bệnh tích .................................................................................. 16

2.3.3.

Chẩn đốn bệnh Care................................................................................... 17

2.3.4.

Điều trị ........................................................................................................ 21

2.4.

MỘT SỐ THƠNG TIN VỀ VACXIN PHỊNG BỆNH CARE ..................... 21

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................... 24
3.1.

ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ......................................................................... 24

3.2.

THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ....................................................................... 24

3.3.

ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU................................................... 24

3.4.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 25

3.4.1.

Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của những chủng giống gốc sản xuất
vacxin vơ hoạt phịng bệnh Care .................................................................. 25

3.4.2.

Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của những chủng giống gốc
sản xuất vacxin vô hoạt phịng bệnh Care .................................................... 26

3.4.3.

Nghiên cứu tính kháng ngun của những chủng giống gốc sản xuất
vacxin vơ hoạt phịng bệnh Care .................................................................. 26

3.5.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 26

3.5.1.

Phương pháp nuôi cấy tế bào ....................................................................... 26

3.5.2.

Phương pháp phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST ............ 27

3.5.3.

Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) ....................................... 28

3.5.4.

Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus...................... 28

3.5.5.

Phương pháp RT-PCR ................................................................................. 28

3.5.6.

Phương pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene ............... 30

3.5.7.

Phương pháp vô hoạt kháng nguyên virus .................................................... 32

3.5.8.

Phương pháp ELISA ................................................................................... 33

3.5.9.

Xử lý số liệu ................................................................................................ 34

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 35
4.1.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA
NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VƠ HOẠT
PHỊNG BỆNH CARE ................................................................................ 35

4.1.1.

Khả năng gây bệnh tích tế bào của những chủng giống gốc sản xuất
vacxin vơ hoạt phịng bệnh Care .................................................................. 35

4.1.2.

Hiệu giá của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vơ hoạt phịng bệnh
Care............................................................................................................. 38

iv

4.1.3.

Kết quả xác định quy luật nhân lên của những chủng giống gốc sản xuất
vacxin vơ hoạt phịng bệnh Care .................................................................. 39

4.2.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ
CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VƠ HOẠT
PHỊNG BỆNH CARE ................................................................................ 42

4.2.1.

Kết quả giải trình tự gene của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô
hoạt phịng bệnh Care .................................................................................. 42

4.2.2.

Kết quả so sánh trình tự nucleotide của những chủng giống gốc sản xuất
vacxin vô hoạt phịng bệnh Care .................................................................. 44

4.2.3.

Kết quả so sánh trình tự amino acid của những chủng giống gốc sản xuất
vacxin vô hoạt phòng bệnh Care .................................................................. 52

4.2.4.

Kết quả so sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid
giữa những chủng giống gốc sản xuất vacxin vơ hoạt phịng bệnh Care ....... 57

4.2.5.

Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử........................................................ 60

4.3.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA NHỮNG
CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VƠ HOẠT PHỊNG
BỆNH CARE .............................................................................................. 64

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 67
5.1.

KẾT LUẬN ................................................................................................. 67

5.2.

KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 69
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 78

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

CDV

Canine distemper virus (Virus gây bệnh Care ở chó)

CPE

Cytophathogenic Effect (Khả năng gây bệnh tích tế bào)

DW

De-ionized water (Nước khử ion)

DNA

Deoxyribonucleic acid (Axít deoxyribonucleic)

EDTA

Ethylene diamine tetra acetic acid (Axít etylen diamin tetraaxetic)

ELISA

Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (Phương pháp miễn dịch
gắn enzyme)

FBS

Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò)

FCS

Fetal Calf Serum (Huyết thanh thai bê)

MOI

Multiplicity Of Infection (Bội số gây nhiễm)

PBS

Phosphate Buffered Saline (Dung dịch muối đệm phosphat)

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase)

RNA

Ribonucleic acid (Axít ribonucleic)

RT-PCR

Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng
hợp chuỗi phiên mã ngược)

SLS

Sample loading solution (Dung dịch pha mẫu)

TBE

Tris/Borate/EDTA (Dung dịch đệm có axít boric)

TCID50

Tissue Culture Infective fifty percent Dose (Liều gây nhiễm 50%
trên môi trường nuôi cấy mô)

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các virus thuộc giống Morbillivirus và bệnh do chúng gây ra .....................6
Bảng 2.2. Danh sách các loại vacxin phòng bệnh Care được lưu hành ở
Việt Nam .................................................................................................. 23
Bảng 3.1. Thông tin của hai chủng giống gốc nghiên cứu.......................................... 24
Bảng 3.2. Mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR và giải trình tự gene P và H .............. 25
Bảng 3.3. Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCR .......................................... 29
Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT-PCR .........................................................30
Bảng 3.5. Thành phần và thể tích cho phản ứng PCR sequence ................................. 31
Bảng 3.6. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR sequence................................................. 31
Bảng 3.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.............................................................................. 33
Bảng 4.1. Hiệu giá của những chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu................ 38
Bảng 4.2. Các vị trí sai khác nucleotide của gene P giữa hai chủng giống gốc
nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu
AF378705)................................................................................................ 50
Bảng 4.3. Các vị trí sai khác nucleotide của gene H giữa hai chủng giống gốc
nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu
AF378705)................................................................................................ 50
Bảng 4.4. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene H giữa hai chủng giống

gốc nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu
AF378705)................................................................................................ 56
Bảng 4.5. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene P giữa hai chủng giống
gốc nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu
AF378705)................................................................................................ 56
Bảng 4.6. Sự tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid của gene H giữa
hai chủng giống gốc nghiên cứu với một số chủng virus Care tham
chiếu (%) .................................................................................................. 58
Bảng 4.7. Sự tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid của gene P giữa
hai chủng giống gốc nghiên cứu với một số chủng virus Care tham
chiếu (%) .................................................................................................. 59

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc hạt virus Morbillivirus ................................................................... 7
Hình 2.2. Cấu trúc của virus Care................................................................................ 7
Hình 2.3. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene H của virus Care .................... 13
Hình 4.1. Kết quả theo dõi khả năng gây bệnh tích tế bào của hai chủng giống gốc
nghiên cứu và chủng virus vacxin Onderstepoort ....................................... 35
Hình 4.2. CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X) ..................... 37
Hình 4.3. CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X) ..................... 37
Hình 4.4. CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X) ..................... 37
Hình 4.5. CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X) ..................... 37
Hình 4.6. CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 60 giờ gây nhiễm (10X) ..................... 38
Hình 4.7. CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 60 giờ gây nhiễm (10X) ..................... 38
Hình 4.8. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus VNUA-CDV-03 và chủng
virus vacxin Onderstepoort ........................................................................ 41
Hình 4.9. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus VNUA-CDV-04 và chủng

virus vacxin Onderstepoort ........................................................................ 41
Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR với gene H ........................... 42
Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR với gene P ............................ 42
Hình 4.12. Giản đồ giải trình tự gene tự động đoạn gene Phosphor của chủng virus
VNUA-CDV-04 ........................................................................................ 44
Hình 4.13. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene H của hai chủng giống gốc và
chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705)....................... 45- 47
Hình 4.14. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene P của hai chủng giống gốc và
và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) ........................ 48
Hình 4.15. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene H của hai chủng giống
gốc và và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) ............. 54
Hình 4.16. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene P của hai chủng giống
gốc và và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) ............. 55
Hình 4.17. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene H của hai chủng
giống gốc nghiên cứu và một số chủng virus Care tham chiếu ................... 62
Hình 4.18. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene P của hai chủng
giống gốc nghiên cứu và một số chủng virus Care tham chiếu ................... 63
Hình 4.19. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus Care bằng phương pháp
ELISA trên lơ chó thí nghiệm và đối chứng ............................................... 64

viii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Lương Quốc Hưng
Tên Luận văn: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng
nguyên của giống gốc sản xuất vacxin vơ hoạt phịng bệnh Care
Ngành: Thú y

Mã số: 60.64.01.01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định và đánh giá được một số đặc tính sinh
học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin
vơ hoạt phịng bệnh Care.
Phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của những chủng
giống gốc sản xuất vacxin vơ hoạt phịng bệnh Care. Nghiên cứu một số đặc tính sinh
học phân tử của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vơ hoạt phịng bệnh Care.
Nghiên cứu tính kháng nguyên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vơ hoạt
phịng bệnh Care.
Đối tượng nghiên cứu là hai chủng giống gốc sản xuất vacxin vơ hoạt phịng bệnh
Care được phân lập từ các chó mắc bệnh Care.
Trang thiết bị phục vụ nghiên cứu: Micropippet, tủ ấm nuôi cấy tế bào (5% CO 2),
kính hiển vi soi nổi, máy ly tâm, máy gia nhiệt PCR, máy giải trình tự gene tự động
Beckman Coulter CEQ 8000.
Hóa chất dùng trong nghiên cứu: Dòng tế bào Vero-DST; DMEM, FBS, dung
dịch đệm EDTA, penicillin, streptomycine, fungizone; kit tách chiết RNA tổng số, cặp
mồi gene H và P, kit phản ứng RT-PCR và PCR sequence, đệm TBE, agarose, hóa chất
tinh sạch sản phẩm PCR sequence và kit chạy giải trình tự gene.
Nghiên cứu sử dụng các phương pháp nghiên cứu như: phương pháp nuôi cấy tế
bào Vero-DST, phương pháp phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST,
phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml), phương pháp xác định đường biểu
diễn sự nhân lên của virus; phương pháp RT-PCR, phương pháp giải trình tự gene và xử
lý dữ liệu giải trình tự gene; phương pháp vô hoạt kháng nguyên virus, phương pháp
ELISA. Những số liệu kết quả thu được trong nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm
thống kê sinh học GraphPad Prism version 6.

ix

Kết quả chính và kết luận
Một số đặc tính sinh học của hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUACDV-04 đã được xác định trên mơi trường ni cấy dịng tế bào Vero-DST. Bệnh tích
tế bào xuất hiện sau 12 giờ gây nhiễm, đạt 50-55% sau 36 giờ gây nhiễm và phá hủy
hoàn toàn tế bào sau 60-72 giờ gây nhiễm. Hiệu giá virus lần lượt là: 3,16 x 104
TCID50/25µl và 1,47 x 104 TCID50/25µl. Hàm lượng virus bên trong và giải phóng
tự do ngồi tế bào đạt cực đại sau 48 giờ gây nhiễm. Hàm lượng virus tập trung trong
tế bào ln cao hơn hàm lượng virus ở ngồi tế bào tại các thời điểm thu hoạch virus
khác nhau.
Đặc tính sinh học phân tử của hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUACDV-04 được xác định dựa vào kết quả giải trình tự và phân tích gene H và P. Kết quả
giải trình tự gene H và P có độ dài lần lượt là 1824 bp và 402 bp. Mức độ tương đồng
về trình tự nucleotide ở gene H và P giữa 2 chủng virus nghiên cứu là 89,20% và
95,10%. Mức độ tương đồng về trình tự amino acid mã hóa từ gene H và P giữa 2
chủng virus nghiên cứu là 88,83% và 93,08%. Hai chủng giống gốc thuộc 2 nhánh phát
sinh khác nhau lần lượt là genotype Asia 1 và Classic.
Hỗn dịch kháng nguyên virus vô hoạt được chế từ hai chủng giống gốc VNUACDV-03 và VNUA-CDV-04 có tính kháng ngun cao trên chó thí nghiệm. Hiệu giá
kháng thể đạt trên ngưỡng giá trị tới hạn sau 21 ngày tiêm. Hiệu giá kháng thể đạt cực
đại sau 42 ngày tiêm của hai chủng giống gốc lần lượt là 1,643 ± 0,410 và 1,347 ±
0,246. Chủng VNUA-CDV-03 có giá trị hiệu giá kháng thể tại các thời điểm theo dõi
sau khi tiêm cao hơn so với chủng VNUA-CDV-04.

x


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Luong Quoc Hung
Thesis title: Research some biological, molecular and antigenic characteristics of
master seed produced inactivated Canine distemper virus vaccine
Major: Veterinary Medicine

Code: 60.64.01.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
This study was performed to indentify and estimate some biological, molecular
and antigenic characteristics of master seed that produced inactivated Canine distemper
virus vaccine.
Materials and Methods
Research contents: This study was conducted to determine some biological
characteristics of master seed that produced inactivated Canine distemper virus vaccine.
Some molecular characteristics of master seed was investigated. Antigenicity of master
seed was studied.
Research subject of this study was master seeds that was isolated from infected
dogs in the field was used for producing inactivated Canine distemper virus vaccine.
This study was used some following materials as: adjustable-volume pipettes,
cell culture incubator with 5% CO2, inverted microscopes, centrifuge, PCR machine,
Genetic Analysis System – Beckman Coulter CEQ 8000.
This study used chemicals as: Vero-DST cell line, DMEM, FBS, EDTA buffer,
penicillin, streptomycine, fungizone, total RNA extraction kit, H and P primers, RTPCR and PCR-sequence kit, TBE buffer, agarose, chemical purification of PCRsequence and kit for sequencing.
This study was studied by some methods as: cell culture Vero-DST cells, virus
isolation, titration using 50% tissue culture infectious dose, growth kinetics; reverse
transcriptase-PCR, sequence and sequence analysis method; inactivated method and
ELISA test. The database of this research was processed by GraphPad Prism
biostatistics software version 6.
Main findings and conclusions
Some biological characteristics of VNUA-CDV-03 and VNUA-CDV-04
virus strain was studied in cell culture Vero-DST cells. The cytopathogenic effect

xi

(CPE) could be observed 12hpi, CPE was 50-55% at 36hpi and cell layer was
affected 100% at 60-72 hpi. The viral titer was 3,16 x 104 TCID50/25µl and 1,47 x
104 TCID50/25µl, respectively. Maximum titer of cell-associated viruses and
released viruses was 48hpi. The titer of cell-associated viruses was always higher
than released viruses at different hpi.
The molecular characteristics of VNUA-CDV-03 and VNUA-CDV-04 virus
strain was determined by sequencing H and P gene of virus. Nucleotide sequence
analyses of the H gene and P gene were 1824bp and 402bp in length, respectively. The
nucleotide identities between two master seed strains was 89.20% (H gene) and 95.10%
(P gene). The predicted amino acid homolgies between two master seed strains was
88.83% (H gene) and 93.08% (P gene). Two master seed strains belonged two different
cluster as Asia 1 and Classic genotype.
Inactivated VNUA-CDV-03 and VNUA-CDV-04 was able to stimulate dogs to
produce specific antibodies against PRRSV. The immune respone was detected 21 day
post immunization (dpi), peaked at 42 dpi with OD mean was 1,643 ± 0,410 and 1,347
± 0,246, respectively. The OD means of VNUA-CDV-03 was higher than VNUACDV-04 at different dpi.

xii


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Ngày nay, chó được ni nhằm phục vụ nhiều mục đích khác nhau như giữ
nhà, làm bạn trong nhà, làm cảnh, đi săn, chăn cừu, phục vụ an ninh quốc
phòng,… Do các lợi ích mang lại từ việc ni chó nên ngành chăn nuôi thú cảnh
hiện nay đang dần phát triển nhanh chóng về số lượng và chất lượng. Tuy nhiên,
cùng với sự phát triển thì tình hình dịch bệnh trên đàn chó ni ở các hộ gia đình
và trang trại chăn nuôi đang diễn biến ngày càng phức tạp. Trong đó, bệnh Care

hay bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm thường xảy
ra ở chó con, lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao. Bệnh Care xảy ra rộng rãi trên
toàn thế giới, xảy ra ở một số nước như Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi
và nhiều nước ở châu Âu, gần đây nhất là ở các nước châu Á như Nhật Bản (Lan
et al., 2006a), Thái Lan (Keawcharoen et al., 2005), Hàn Quốc (An et al., 2008)
và Ấn Độ (Latha et al., 2007).
Nguyên nhân gây bệnh Care là do virus Care (Canine distemper virus CDV). CDV là thành viên của giống Morbillivirus, họ Paramixoviridae. Virus
Care có cấu tạo gồm một sợi RNA đơn không phân đoạn với khoảng 15.690
nucleotide. Bộ gene virus Care cấu trúc gồm 6 gene mã hóa cho các protein như
protein tạo lớp vỏ bọc (M), hai glycoprotein (yếu tố kết dính (H), yếu tố kết hợp
virus với thụ thể trên màng tế bào (F), hai protein có liên quan tới sự sao chép
RNA (phosphoprotein – P và large protein – L) và nucleocapsid N đóng gói
RNA của virus (Sidhu et al., 1993). Dựa trên trình tự của protein Haemagglutinin
(H), Harder and Osterhaus (1997) và Martella et al. (2006) đã phân loại virus
Care thành 7 nhóm chính theo ví trí địa lý gồm: Arctic – like, America 1,
America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife.
Virus Care có tính gây nhiễm hướng lympho, niêm mạc và mô thần kinh.
Virus Care đã được tiến hành phân lập trên một số dòng tế bào như dịng tế bào
biểu mơ và ngun bào sợi, tế bào lympho của chó (Appel et al., 1992), đại thực
bào phế nang của chó (Appel, 1978), đại thực bào màng bụng chồn sương (Poste,
1971), xơ phôi gà (Ezeibe, 2005). Tuy nhiên việc phân lập và xác định hiệu giá
virus Care là rất khó khăn do khơng có dịng tế bào nào thích hợp để virus sinh
trưởng và gây bệnh tích tế bào. Nghiên cứu của Seki et al. (2003) và Lan et al.

1


(2005a) đã chỉ ra Vero-DST là dịng tế bào thích hợp, có thể sử dụng để phân lập
và xác định hiệu giá virus.
Năm 1920, bệnh Care đã được phát hiện ở nước ta. Chó phát bệnh thường

chết với tỷ lệ chết 50-80%, có thể lên đến 100% nếu khơng được điều trị kịp thời
(Hồ Đình Chúc, 1993). Hiện nay, bệnh Care xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây
thiệt hại lớn cho đàn chó ni trong nước do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê
Thị Tài, 2006). Tuy nhiên, vấn đề hiện nay vẫn đang tồn tại trên thực tế chăn
ni chó đó là chó đã được tiêm phòng vacxin nhưng vẫn mắc bệnh Care (EkKommonen et al., 1997; Lan et al., 2006a) và những báo cáo cụ thể về hiệu quả
bảo hộ của các vacxin nhập khẩu từ nước ngồi cịn q ít. Chính vì vậy, việc
nghiên cứu sản xuất vacxin có hiệu quả cao trong phòng bệnh Care đang là yêu
cầu đối với các nhà nghiên cứu trong nước. Để có thể tạo được vacxin có hiệu
quả bảo hộ cao và an tồn với đàn chó ni trong nước thì việc lựa chọn và sàng
lọc được chủng giống gốc từ chính các chủng đang gây bệnh ngồi thực địa là vơ
cùng quan trọng và quyết định tới khả năng thành công của vacxin khi ứng dụng
trên thực địa. Do đó, nghiên cứu này sẽ tiến hành đánh giá các đặc tính sinh học,
sinh học phân tử và tính kháng nguyên của các chủng giống gốc được lựa chọn
sản xuất vacxin vơ hoạt phịng bệnh Care. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần cung
cấp các thơng tin chi tiết về các đặc tính của chủng giống gốc phục vụ cho các
nghiên cứu sản xuất vacxin vô hoạt phịng bệnh, từ đó góp phần khống chế dịch
bệnh xảy ra, giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh Care gây ra trên đàn chó.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định và đánh giá được một số đặc
tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên của những chủng giống gốc
sản xuất vacxin vơ hoạt phịng bệnh Care.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Đối tượng nghiên cứu là những chủng giống gốc sản xuất vacxin vơ hoạt
phịng bệnh Care được phân lập từ các chó mắc bệnh Care.
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2016 tới tháng 5/2017
- Địa điểm nghiên cứu:
+ Khu ni động vật thí nghiệm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp
Việt Nam.

2

+ Bộ môn bệnh lý thú y, Khoa Thú y, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam.
+ Phịng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, Khoa Thú y, Học
viện Nơng nghiệp Việt Nam.
1.4. NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
1.4.1. Những đóng góp mới
Nghiên cứu đã cung cấp bức tranh khái quát và hoàn chỉnh về các đặc tính
cơ bản của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vơ hoạt phịng bệnh Care
trong nước.
1.4.2. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo phục vụ công tác giảng dạy và
nghiên cứu về bệnh Care và vacxin phòng bệnh Care trong các trường, viện
nghiên cứu trong lĩnh vực thú y. Thông tin chi tiết của các chủng giống gốc có ý
nghĩa trong việc xây dựng ngân hàng dữ liệu hồ sơ chủng giống gốc, phục vụ cho
các bước nghiên cứu tiếp theo trong q trình nghiên cứu và sản xuất vacxin
phịng bệnh. Kết quả nghiên cứu này sẽ giúp cho bước đăng ký chủng giống với
ngân hàng bảo tồn nguồn gene quốc gia được thuận lợi và dễ dàng hơn.
1.4.3. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu giúp đánh giá các đặc điểm sinh học, sinh học phân tử và tính
kháng nguyên của những chủng giống gốc cường độc phục vụ sản xuất vacxin
vô hoạt phịng bệnh. Đây có thể coi là một khâu quan trọng trong quá trình lựa
chọn và sàng lọc chủng giống gốc phục vụ cho bước sản xuất vacxin. Đồng
thời, kết quả nghiên cứu giúp tạo ra được nguồn chủng giống gốc với đầy đủ
thông số kĩ thuật và nguồn gốc rõ ràng, có thể chuyển giao cho các cơ sở
nghiên cứu, công ty sản xuất vacxin trong nước để nghiên cứu, sản xuất và
thương mại hóa các sản phẩm sử dụng trong phòng và điều trị bệnh như vacxin
hay các chế phẩm sinh học.

3

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGỒI NƯỚC
2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước
Ở Việt Nam, bệnh Care được phát hiện từ năm 1920. Nghiên cứu của Hồ
Đình Chúc (1993) đã chỉ ra thời kỳ ủ bệnh Care là 3 - 6 ngày (có thể kéo dài 17 21 ngày) và có thể kéo dài trong khoảng thời gian trên dưới 1 tháng. Tất cả các
lồi chó đều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm là lồi chó lai, chó cảnh, chó nội ít
mẫn cảm hơn (Tơ Du và Xn Giao, 2006).
Nghiên cứu của Lan et al. (2008) đã phân lập được chủng virus Care gây
bệnh trên chó tại Việt Nam. Virus Care được phân lập trên dòng tế bào VeroDST, sau đó được kiểm tra bằng phản ứng RT-PCR. Chủng virus CDV-HN1 có
hiệu giá virus là 3,16 x 105 TCID50/25 l. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy đàn
chó ở địa bàn Hà Nội mắc bệnh Care.
Trong nghiên cứu của Lan et al. (2009a), hai chủng virus Care Vn86 và
Vn99 đã được phân lập từ chó 4 tháng tuổi có các biểu hiện như viêm não không
mưng mủ, viêm phổi, suy giảm tế bào lympho và viêm dạ dày ruột. Kết quả phân
tích sinh học phân tử đã chỉ ra 2 chủng virus phân lập được thuộc nhóm cổ điển
(Classic type), khác với nhóm Asia 1 và Asia 2.
Nguyễn Thị Lan và Khao Keonam (2012) đã chỉ ra được đặc điểm bệnh lý
của chó Phú Quốc mắc bệnh Care và ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
để chẩn đoán bệnh. Các dấu hiệu lâm sàng đầu tiên khi mắc bệnh Care là sốt cao,
biếng ăn hoặc không ăn, nôn mửa đối với chó con, ho ở chó trưởng thành, có nốt
sài tại vùng da mỏng ở vùng bụng, tiêu chảy và có triệu chứng thần kinh như đi
vịng trịn. Bệnh tích đại thể tập trung chủ yếu ở phổi và ruột. Mặt cắt phổi có
nhiều dịch chảy ra; ruột có hiện tượng sung huyết, xuất huyết; đại não bị sung
huyết. Các dấu hiệu bệnh tích khác là: lách sưng, mặt cắt lồi, hạch lympho sưng,
gan thối hóa, túi mật sưng to. Các bệnh tích vi thể gồm có xuất hiện nhiều hồng
cầu trong lòng phế nang, vách phế nang đứt nát, thối hóa tế bào nhu mơ, lơng
nhung ruột bị đứt nát, thâm nhiễm tế bào viêm ở não.
Nguyễn Thị Lan và cs. (2015) đã nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của

chó được gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus Care (CDV-768). Kết quả gây

4


nhiễm chủng virus Care (CDV-768) cho 3 chó lai Becgie 2 tháng tuổi với liều
106 TCID50/25l qua đường mắt, khí dung và miệng cho thấy chó có triệu chứng
ủ rũ, mệt mỏi, bỏ ăn, sốt, nôn mửa, tiêu chảy, ỉa ra máu, có nốt sài trên da, sừng
hóa gan bàn chân. Các bệnh tích đại thể chủ yếu ở phổi (mặt cắt phổi có dịch,
phổi nhục hóa), ruột có hiện tượng sung huyết, xuất huyết, đại não bị sung huyết,
hạch lympho sưng, gan thối hóa, túi mật sưng to. Các bệnh tích vi thể như xuất
hiện nhiều hồng cầu trong lịng phế nang, vách phế nang đứt nát, thối hóa tế bào
nhu mô, lông nhung ruột bị đứt nát, thâm nhiễm tế bào viêm ở não. Virus tập
trung chủ yếu ở các cơ quan như phổi, hạch lympho, ruột. Kết quả nghiên cứu đã
chỉ ra chủng virus Care (CDV-768) có độc lực và có khả năng gây bệnh cho chó.
Nghiên cứu của Trần Văn Nên và cs., (2016), vacxin vô hoạt Care được
chế từ chủng CDV-VNUA-768 đã được đánh giá khả năng bảo hộ trên 6 chó
bằng cơng cường độc với chủng CDV-HUA-04H. 6 chó becgie cái 6 tuần tuổi
được tiêm vacxin vô hoạt Care chế từ chủng CDV-VNUA-768, sau đó 3 tuần
được cơng cường độc bằng chủng virus CDV-HUA-04H. Đáp ứng miễn dịch của
các chó thí nghiệm sau khi tiêm vacxin vô hoạt Care được khảo sát bằng phản
ứng ELISA. Hiệu giá kháng thể đạt ngưỡng trên giá trị tới hạn sau 21 ngày tiêm
vacxin, sau đó đạt cực đại sau 35-42 ngày tiêm (với hiệu giá trung bình đạt 1,54).
Ở ngày 42 tới 49 sau khi tiêm, hiệu giá kháng thể giảm dần nhưng vẫn đạt trên
ngưỡng giá trị tới hạn ở 49 ngày với giá trị hiệu giá trung bình đạt 1,35. Sau 21
ngày tiêm vacxin lần hai, các chó thí nghiệm và đối chứng được cơng cường độc
với chủng CDV-HUA-04H. Kết quả theo dõi hiệu giá kháng thể ở lô tiêm vacxin
đã tạo ra kháng thể đặc hiệu với virus Care với giá trị hiệu giá trung bình đạt 0,69
lớn hơn giá trị tới hạn. Kết quả nghiên cứu cho thấy chó được bảo hộ 100% khi
tiêm vacxin vơ hoạt Care chế từ chủng CDV-HUA-768.

2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngồi nước
Bệnh Care được báo cáo đầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel and
Gillespie, 1972). Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã được mô tả
từ năm 1809 bởi EdwardJenner (Shell, 1990). Năm 1905, bác sĩ thú y người Pháp
Henri Carré đã phân lập được mầm bệnh từ nước mũi của chó bệnh.
Năm 1923, Putoni lần đầu tiên sản xuất được vacxin nhược độc, tuy nhiên
chủng virus vacxin vẫn còn độc lực. Từ năm 1948 tới nay, với sự phát triển mạnh
mẽ của các nghiên cứu về virus Care nhiều vacxin phòng bệnh hiệu quả đã ra đời.

5


Hiện nay bệnh được phát hiện ở khắp nơi trên thế giới, khơng những xảy ra
trên đàn chó ni mà cịn xuất hiện trên nhiều lồi động vật hoang dã. Chó mắc
bệnh Care thể cận lâm sàng trở thành mối đe dọa nghiêm trọng trong việc bảo
tồn nhiều loài thú ăn thịt và thú có túi. Qua thống kê một số nghiên cứu đã cho
thấy bệnh Care là một trong các bệnh quan trọng làm tuyệt chủng chồn chân đen,
hổ Tasmania và gây chết chó hoang dã châu Phi (Assessment, 2005). Năm 1991,
bệnh Care gây chết 20% tổng đàn sư tử Serengeti ở Tanzania (Woma and Van
Vuuren, 2009). Đặc biệt virus Care có khả năng gây bệnh trên một số động vật
biển (Kennedy et al., 1989). Ở loài cáo tai to, bệnh Care đã xuất hiện lần đầu tiên
cùng với các ca mắc cầu trùng (Woo et al., 2010).
2.2. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS CARE
2.2.1. Phân loại virus gây bệnh Care
Morbillivirus là một virus tương đối lớn (đường kính 150 – 250nm) với cấu
trúc xoắn ốc, chúng có một lớp vỏ lipoprotein (Kennedy et al., 1989).
Bảng 2.1. Các virus thuộc giống Morbillivirus và bệnh do chúng gây ra
Virus

Bệnh

Vật chủ tự nhiên

Measles virus (MV)
Rinderpest virus (RPV)

Bệnh sởi
Dịch tả trâu bò

Người
Ngựa, dê, cừu, lợn

Peste des petits ruminants virus (PPRV)

Bệnh trên động
vật nhai lại nhỏ

Dolphin morbillivirus (DMV)
Porpoise morbillivirus (PMV)

Cá heo mỏ
Cá heo

Canine distemper virus (CDV)
Phocine distemper virus (PDV)

Bệnh Care

Chó
Chó biển

Ghi chú: DMV và PMV gần đây được xếp vào nhóm virus Morbillivirus trên động vật biển có vú
(cetacean morbillivirus – CMV).

Nguồn: Greene and Appel (1998)

Mặc dù có sự khác biệt nhỏ về kháng nguyên giữa các chủng virus Care
nhưng chỉ có một serotype duy nhất. Tuy nhiên, có sự khác biệt về khả năng gây
bệnh của các chủng virus phân lập được và các type ở các khu vực địa lý khác
nhau. Các type của virus Care gồm: Asia 1 (Nhật Bản, Trung Quốc), Asia 2 (chỉ
có ở Nhật Bản), Bắc Cực, động vật hoang dã châu Âu, USA 1 và 2, cổ điển
(Onderstepoort, Convac, Rockborne và Snyder Hill) (Haas et al., 1997, 1999).

6


2.2.2. Hình thái của virus Care
Hình thái virus được quan sát dưới kính hiển vi điện tử có hình vịng trịn,
hình bán nguyệt do các sợi cuộn cuộn trịn tạo thành. Dạng trịn này có đường
kính nằm trong khoảng 115nm đến 230nm. Màng cuộn kép có độ dày 75 đến
85A0 với bề mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy et al., 1989).

Hình 2.1. Cấu trúc hạt virus Morbillivirus
Nguồn: Greene and Appel (2006)

2.2.3. Cấu trúc của virus Care
Virus Care khơng phân đoạn, sợi âm tính, sợi đơn, với bộ gene RNA
khoảng 15,7 Kb và đường kính vỏ bọc có kích thước từ 150 tới 300 nm (Murphy
et al., 1999). Virus Care gồm 1 protein phi cấu trúc (C) và 6 protein cấu trúc
gồm: large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P), nucleocapsid

protein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M) (Diallo, 1990).

Hình 2.2. Cấu trúc của virus Care
Nguồn: Greene and Appel (2006)

7


2.2.4. Sức đề kháng của virus Care
Virus Care không ổn định và nhạy cảm với nhiệt độ, tia UV, các dung mơi
hịa tan lipid, các chất tẩy rửa và chất ơxy hóa (Grưne et al., 1998) mặc dù nó có
vỏ bọc protein chống lại tác động của các tác nhân bên ngồi.
Thời gian tồn tại và duy trì độc lực của virus dài trong điều kiện nhiệt độ
lạnh. Ở nhiệt độ dưới 00C, virus có thể tồn tại trong mơi trường vài ngày nếu
được bảo vệ bởi các vật liệu hữu cơ. Virus tồn tại ở nhiệt độ -650C ít nhất là 7
năm. Việc bảo quản virus ở dạng đông khơ có ý nghĩa rất lớn trong việc bảo quản
giống virus, sản xuất vacxin và nghiên cứu trong phịng thí nghiệm (Greene and
Appel, 2006).
Độ pH: virus ổn định trong khoảng pH = 4,5 – 9. Virus bị ảnh hưởng khi
pH>10,4 hoặc pH<4,4 (Greene and Appel, 2006).
Vỏ bọc của virus rất mẫn cảm với ete, clorofor, fomalin loãng (<0.5%),
phenol (75%), dung dịch amoni. Do đó nên sử dụng các hóa chất trên để tiêu độc
chuồng và bệnh viện (Greene and Appel, 2006).
2.2.5. Cơ chế sinh bệnh
Các nghiên cứu của Appel (1969, 1978, 1987); Appel and Summers (1995)
đã chỉ ra cơ chế sinh bệnh của virus Care đó là virus gây nhiễm hướng mô
lympho, niêm mạc và mô thần kinh. Đầu tiên, virus nhân lên ở mô lympho của
hệ hô hấp. Sau đó virus vào các dịch bạch huyết rồi vào máu gây bại huyết. Virus
tác động đến nội mạc mạch máu và gây sốt, sốt kéo dài từ 1 - 2 ngày. Virus theo
máu vào hệ hơ hấp, hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống thần kinh trung ương

cũng như dây thần kinh thị giác. Do sự suy yếu của hệ bạch huyết, dẫn tới suy
giảm hệ miễn dịch và tạo điều kiện cho các vi khuẩn như: Staphylococcus,
Bronchisepticum, Salmonella,... kế phát gây bệnh. Ít ngày sau, cơn sốt thứ 2 xuất
hiện, biểu hiện trầm trọng hơn do nhiễm trùng nặng ở cơ quan phủ tạng.
2.2.6. Đặc tính sinh học của virus Care
Lan et al. (2005a, 2005b) đã nghiên cứu đặc tính sinh trưởng của một số
chủng virus Care trên dòng tế bào Vero.
Nghiên cứu của Lan et al. (2006b) đã phân lập được 3 chủng virus 007Lm,
S124C, Ac96I và chủng virus vacxin Onderstepoort trên môi trường tế bào VeroDST nhằm xác định sự ổn định về đặc tính sinh học của các chủng virus nghiên
cứu. Nghiên cứu đã tiến hành so sánh về trình tự gene và đặc tính ni cấy giữa

8


chủng virus gốc ban đầu và chủng virus sau khi cấy truyền 20 đời. Cả 4 chủng
virus ở đời 20 sinh trưởng tốt hơn so với chủng giống gốc ban đầu. Các chủng
virus ở đời 20 có khả năng gây bệnh tích tế bào chậm hơn so với chủng gốc ban
đầu. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra dòng tế bào Vero có biểu hiện SLAM phù hợp
trong việc phân lập và cấy truyền nhiều đời virus Care nhưng không làm thay đổi
về đặc điểm di truyền của virus.
Nghiên cứu của Lan et al. (2009b) đã tiến hành phân loại phát sinh loài của
10 chủng virus Care phân lập được trước đó dựa vào quy luật nhân lên và khả
năng gây bệnh tích tế bào trên mơi trường ni cấy dòng tế bào Vero-DST. Các
chủng virus P94S, Ac96I, S124C, MD231, MS232, MSA5 và 095Cr thuộc
genotype Asia 1 ít khi gây bệnh tích tế bào trên dịng tế bào Vero-DST. Kết quả
nghiên cứu đã chỉ ra các chủng virus Care phân lập được tại Nhật Bản thuộc
genotype Asia 2, có khả năng gây bệnh tích tế bào trên dịng tế bào Vero do sự
sai khác về đặc tính sinh học phân tử.
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và cs. (2012) đã làm rõ thêm một số đặc
tính sinh học của virus Care phân lập trên dòng tế bào Vero-DST. Các mẫu bệnh

phẩm của chó mắc bệnh Care như phổi, hạch lympho, ruột cho khả năng phân lập
virus rất cao. Tế bào Vero-DST là tế bào thích hợp để phân lập virus CDV. Virus
nhân lên nhanh trong tế bào Vero-DST và gây bệnh tích tế bào điển hình thể
Syncytium - thể hợp bào. Bệnh tích tế bào xuất hiện sau 12h gây nhiễm, đạt cao
nhất sau 60 giờ gây nhiễm và phá hủy muộn nhất là 96 giờ sau gây nhiễm. Để
tìm hiểu sâu hơn về đặc tính sinh học của virus phân lập được, chúng tôi không
chỉ tiến hành nghiên cứu với những virus phân lập được mà còn đồng thời tiến
hành đối với cả chủng virus vacxin Onderstepoort. Virus CDV4-H phân lập được
có khả năng phá hủy tế bào mạnh hơn virus vacxin chủng Onderstepoort. Virus
CDV4-H có hiệu giá virus cao nhất sau 36 giờ gây nhiễm với CPE đạt 90%. Hai
chủng virus này đều tồn tại trong tế bào và ngoài tế bào, hiệu giá virus trong tế
bào cao hơn hiệu giá virus giải phóng ra ngồi tế bào. Kết quả này có ý nghĩa cho
người làm nghiên cứu virus có thể xác định được thời điểm thu hoạch virus dựa
vào việc quan sát bệnh tích tế bào (CPE).
2.2.7. Đặc tính sinh học phân tử của virus Care
Các nghiên cứu về sinh học phân tử đã chỉ ra cấu trúc của virus Care, gồm:
protein phi cấu trúc (C) được tạo ra bởi một khung đọc mở nằm ở gene P của
virus. Nhiều báo cáo về sự đột biết xảy ra ở các protein cấu trúc như H, F và N.
Trong đó, protein H và F được coi là kháng ngun chính của virus, có khả năng

9


kích thích đáp ứng miễn dịch trên vật chủ, đây cũng là vị trí sai khác nhau về
gene/ kháng nguyên của virus Care (Mochizuki et al., 1999).
Protein phi cấu trúc (C) được mã hóa từ một khung đọc mở ở gene P. Chức
năng của protein C chưa được xác định rõ ràng.
N: Nucleocapsid, khối lượng phân tử 58 kDa bao quanh và bảo vệ cho hệ
gene của virus, nhạy cảm với những chất có khả năng phân giải protein.
P: Phosphoprotein, khối lượng phân tử 54,9 - 66 kDa, nhạy cảm với những

yếu tố có khả năng phân giải protein, đóng vai trò quan trọng trong sự sao chép
của RNA (Sidhu et al., 1993).
M: Matrix, khối lượng phân tử 34 - 39 kDa, đóng vai trị quan trọng trong
sự trưởng thành của virus và nối nucleocapsid với những protein vỏ bọc.
F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử 59 –
62 kDa, đóng vai trị trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn đến kết
hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (hợp bào).
H: Protein gây ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là
glycoprotein thứ hai của vỏ bọc, khối lượng phân tử 76 – 80 kDa, đóng vai trị
gắn virus vào tế bào đích. Ở virus Care, protein này khơng hấp phụ hồng cầu và
gây ngưng kết hồng cầu. Protein H quyết định chính tới ái lực và khả năng gây
bệnh trên tế bào (Von Messling et al., 2001). Protein này tạo ra kháng thể trung
hịa và có tính chất bảo vệ protein của virus. Do vai trò của protein này trong đáp
ứng miễn dịch ở vật chủ nên được sử dụng rộng rãi cho việc phân tích cây phát
sinh loài (Haas et al., 1997; Mochizuki et al., 1999). Phân loại theo địa lý của
virus Care dựa trên trình tự protein H được chia thành 7 nhóm chính gồm:
Arctic-like, America 1, America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife
(Harder and Osterhaus, 1997).
L: Large protein có khối lượng phân tử lớn 180 - 200 kDa, có kích thước
lớn, thể hiện phần lớn các hoạt động của RNA polymerase (Diallo, 1990).
Carpenter et al. (1998) đã tiến hành nghiên cứu bệnh Care trên đàn sư tử tại
Serengeti, châu Phi. Một số loài động vật khác ở Serengeti cũng mắc bệnh Care.
Nghiên cứu đã tiến hành giải trình tự gene H và P của các chủng virus phân lập
được từ sư tử (Panthera leo), linh cẩu (Crocuta crocuta), cáo (Otocyon
megalotis) và chó nhà (Canis familiaris) ở Serengeti. Kết quả phân tích trình tự
gene đã chứng minh các chủng virus Care được phân lập từ nhiều lồi động vật ở
Serengeti có mối quan hệ di truyền gần gũi và khác so với các chủng virus Care

10

được phân lập trên các loài động vật khác ở khu vực khác. Kết quả nghiên cứu
này đã chỉ ra: (1) một chủng virus Care độc lực cao đã xuất hiện trên loài động
vật ăn thịt ở Serengeti trong nhiều năm qua; (2) các chủng virus phân lập được
khác nhau về mặt di truyền ở gene H và P khi so sánh với các chủng virus Care ở
các nơi khác trên thế giới; và (3) các chủng virus Care thường lây truyền qua các
vật chủ là các loài động vật ăn thịt ở Serengeti.
Iwatsuki et al. (1997) đã phân lập 3 chủng virus Care Ueno, Hamamatsu và
Yanaka từ chó ở Nhật Bản và phân tích đặc điểm di truyền ở đoạn gene H. Phân
tích trình tự gene H đã chỉ ra 9 vị trí glycosyl hóa liên kết với Asparagine trên
trình tự amino acid mã hóa từ gene H của các chủng virus mới phân lập được,
trong khi đó chủng virus Onderstepoort chỉ có 4 vị trí. Do đó, sự sai khác về số
lượng vị trí glycosyl hóa ở trình tự amino acid mã hóa từ gene H có thể dẫn đến
sự sai khác về tính kháng nguyên của các chủng virus. Trình tự gene H của các
chủng virus mới được phân lập ở Nhật Bản có mức độ tương đồng là 99% giữa
các chủng và 95% so với chủng Châu Âu và Hoa Kỳ (phân lập từ chó biển, chó
Đức và chồn sương và thú thuộc họ mèo) và 90% so với chủng vacxin. Dựa trên
cây sinh học phân tử, các chủng virus mới phân lập tại Nhật Bản thuộc một
nhánh phát sinh khác với các chủng phân lập được tại Châu Âu và Hoa Kỳ và
khác với nhánh phát sinh của chủng vacxin.
Hirama et al. (2004) đã phân tích trình tự gene Hemagglutinin (H) của hai
chủng virus Care (Haku93 và Haku00) được phân lập từ loài cầy hương hoang dã
(Paguma larvata). Trình tự amino acid mã hóa từ gene H của hai chủng virus
phân lập được có độ dài là 607 amin acid. Trình tự nucleotide và amino acid mã
hóa từ đoạn gene H của chủng virus Haku93 và Haku00 có mức độ tương đồng
cao với các chủng virus được phân lập từ thực địa như Yanaka và Tanu96, nhưng
lại tương đồng thấp với chủng virus vacxin phân lập trước đó. Vị trí glycosyl hóa
liên kết với N (Asparagine) của cả 2 chủng Haku93 và Haku00 giống với các
chủng virus Care phân lập trước đó. Phân tích cây sinh học phân tử đã chỉ ra các
chủng virus Care phân lập được từ cầy hương hoang dã nằm trong cùng nhánh

phát sinh với các chủng virus Care được phân lập gần đây tại Nhật Bản.
Vongpunsawad et al. (2004) đã xác định vị trí liên kết trên protein mã hóa
từ gene H là cần thiết giúp cho việc phá vỡ tế bào qua các receptor. Nghiên cứu
đã phân tích trình tự protein mã hóa từ gene H của morbillivirus bằng cách gây
đột biến theo chu kỳ ở các sản phẩm protein theo phương pháp dựa vào chức
năng cơ bản của từng receptor tương ứng, và sử dụng mơ hình 3 chiều gene H

11


của morbillivirus. Mơ hình sử dụng cấu trúc protein hemagglutininneuraminidase của virus Newcastle làm khuôn mẫu. Kết quả đã xác định được 7
amino acid quan trọng cho SLAM và 9 amino acid quan trọng cho CD46
(receptor của tế bào Vero) tham gia vào việc phá vỡ tế bào. Kết quả nghiên cứu
góp phần vào việc nghiên cứu cơ chế sinh bệnh của morbillivirus và ứng dụng
trong việc sản xuất vacxin và điều trị bệnh.
Lan et al. (2005c) đã phân tích dữ liệu cây sinh học phân tử của đoạn gene
H và P nhằm chỉ ra trình tự nucleotide và amino acid của chủng virus 007Lm sau
khi phân lập trên môi trường tế bào Vero-DST là giống với trình tự của chủng
virus ban đầu phân lập được từ mẫu bệnh phẩm. Chủng 007Lm thuộc genotype
Asia 2 và khác với các nhánh phát sinh khác.
Nghiên cứu của Lan et al. (2007) đã so sánh về đặc điểm di truyền và đặc
tính ni cấy của 2 chủng virus Care mới phân lập được thuộc genotype Asia 1
và Asia 2. Các chủng virus nghiên cứu đã được phân lập từ chó có biểu hiện lâm
sàng mắc bệnh. Dữ liệu kết quả giải trình tự gene H và P của các virus nghiên
cứu được so sánh với đặc tính ni cấy. Trình tự amino acid mã hóa từ gene H
gồm 12 Cysteine ở genotype Asia 1 và Asia 2. Vùng kị nước ở trình tự amino
acid mã hóa từ gene H của genotype Asia 2 dài hơn so với genotype Asia 1 là 1
amino acid. Trình tự amino acid được mã hóa từ đoạn gene H của các virus thuộc
genotype Asia 1 có 9 vị trí glycosyl hóa liên kết với Asparagine, trong khi
genotype Asia 2 có 8 vị trí glycosyl hóa liên kết với Asparagine. Ở các chủng

virus thuộc genotype Asia 1, có hàm lượng virus trong tế bào cao hơn so với hàm
lượng virus giải phóng ngồi mơi trường tế bào và các chủng virus thuộc
genotype Asia 2 thì ngược lại. Đặc điểm di truyền và đặc tính ni cấy của 2
genotype Asia 1 và Asia 2 rất khác nhau nhưng không thấy có sự khác biệt về
triệu chứng lâm sàng và bệnh tích trên các chó mắc bệnh.
Nghiên cứu của Guo et al. (2013) đã phân tích cây sinh học phân tử dựa
trên trình tự gene H và chỉ ra các chủng virus Care phân lập được từ gấu trúc và
chó hoang có nguồn gốc khác so với chủng vacxin và các chủng virus Care tự
nhiên khác. Các chủng virus Care phân lập được thuộc genotype Asia 1 và có
mức độ tương đồng cao 91,5-99,8% (trình tự nucleotide) và 94,4-99,8% (trình tự
amino acid). Kết quả nghiên cứu này giúp nâng cao hiểu biết về đặc điểm bộ
gene của các chủng virus Care phân lập được và góp phần vào việc phát triển các
phương pháp giám sát và kiểm soát dịch bệnh Care trực tiếp hoặc gián tiếp ở
Trung Quốc.

12