Phân tích đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của gen OsHKT2 4 ở lúa (oryza sativa)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Nguyễn Tiến Đạt

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN
VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN OsHKT2;4
Ở LÚA (Oryza sativa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------*

*------------

Nguyễn Tiến Đạt

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN
VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN OsHKT2;4
Ở LÚA (Oryza sativa)

Chuyên ngành :

Di truyền học

Mã số:

60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Đỗ Thị Phúc

H Nội


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Đỗ
Thị Phúc, người đã hướng dẫn, quan tâm và tận tình chỉ bảo, giúp
đỡ tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài. Cảm ơn cô,
người đã luôn truyền cảm hứng và niềm tin cho tơi trong từng thí
nghiệm, từng cơng việc.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô công tác tại
Bộ môn Di truyền học đã quan tâm và tạo mọi điều kiện
thuận lợi giúp tôi hồn thành luận văn. Các thầy cơ đã chỉ bảo cho tơi
sự cẩn thận, kiên trì và nghiêm túc trong nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới CN. Trần Xuân An, CN.
Phạm Quỳnh Hoa, CN. Ngô Thị Hạnh đã ln giúp đỡ tơi
trong các thí nghiệm. Các em đã luôn quan tâm và truyền đạt cho tôi
những kinh nghiệm quý báu trong thực nghiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn Phịng Thí nghiệm Trọng
điểm Cơng nghệ Protein và Enzyme; Học viện Nông
nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong q trình thực

hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người
thân, những người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt
nhất để tôi học tập. Cảm ơn mọi người đã ln động viên, khuyến
khích tơi trong q trình học tập và thí nghiệm.
Hà Nội, tháng 11 năm 2016

Nguyễn Tiến Đạt


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1
CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................3

1.1.

Giới thiệu về cây Lúa (Oryza sativa) .............................................. 3

1.2.

Giới thiệu về họ protein vận chuyển ion xuyên màng HKT ở

thực vật và ở lúa...................................................................................... 4
1.2.1.

Họ protein HKT ở thực vật ....................................................... 5

1.2.2.

Họ protein HKT ở cây lúa ......................................................... 8

1.2.3.

Gen OsHKT2;4 .......................................................................... 9

1.2.4.

Tình hình nghiên cứu gen OsHKT2;4 ..................................... 10

1.3.

Một số phƣơng pháp nghiên cứu đa hình nucleotide .................... 11

1.3.1.

Phƣơng pháp RFLP-PCR ........................................................ 11

1.3.2.

Phƣơng pháp giải trình tự ........................................................ 14

1.4.

Phƣơng pháp phân tích mức độ biểu hiện của gen ....................... 16

1.4.1.

Lai Northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ ......................... 16

1.4.2.

RT-PCR và Real-time PCR ..................................................... 17

1.4.3.

Các phƣơng pháp sử dụng chip ............................................... 19

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................20
2.1.

Đối tƣợng nghiên cứu, hóa chất và thiết bị ................................... 20

2.1.1.

Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................. 20

2.1.2.

Vật liệu, hóa chất và thiết bị.................................................... 21

2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................. 22

2.2.1.

Các phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình gen

OsHKT2;4 ............................................................................................. 22
2.2.2.

Các phƣơng pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen ....... 25


CHƢƠNG 3.
3.1.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................29

Phân tích đa hình gen Oshkt2;4 ở lúa ........................................... 29

3.1.1.

Tách chiết DNA tổng số .......................................................... 29

3.1.2.

Khuếch đại gen OsHKT2;4 bằng PCR .................................... 30

3.1.3.

Giải trình tự gen OsHKT2;4 .................................................... 31

3.1.4.

Phân tích đa hình gen OsHKT2;4............................................ 32

3.2.

Phân tích biểu hiện gen ................................................................. 42

3.2.1.

Kết quả trồng lúa thủy canh và xử lý mặn .............................. 42

3.2.2.

Kết quả tách chiết RNA và tổng hợp cDNA ........................... 42

3.2.3.

Phản ứng Real-time PCR và phân tích mức độ biểu hiện

gen OsHKT2;4 ...................................................................................... 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................49
KẾT LUẬN .............................................................................................. 49
KIẾN NGHỊ .............................................................................................. 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................50
Phụ lục 1
Phụ lục 2
Phụ lục 3
Phụ lục 4


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các protein họ HKT đã đƣợc biết ........................................................ 6
Bảng 1.2. Họ gen HKT ở lúa (Oryza sativa) ........................................................ 9
Bảng 2.1. Các giống lúa trong nghiên cứu ......................................................... 20

Bảng 2.2. Các cặp mồi đặc hiệu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ...................... 21
Bảng 3.1. Hai nhóm giống lúa phân chia theo các đa hình nucleotide .............. 32
Bảng 3.2. Vị trí các đa hình nucleotide ở nhóm 2 .............................................. 34
Bảng 3.3. Các đa hình amino acid tƣơng ứng với đa hình nucleotide ............... 35
Bảng 3.7. Giá trị Fold change mẫu tách chiết từ lá giống Nipponbare và
Pokkali tại các thời điểm ............................................................................... 46


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây lúa (Oryza sativa) và các bộ phận của cây lúa ...............................3
Hình 1.2. Một số cơ chế vận chuyển Na+ trong hệ thống đáp ứng stress
mặn ở thực vật ..................................................................................................5
Hình 1.3. Gen OsHKT2;4 trên cơ sở dữ liệu Phytozome ....................................10
Hình 1.4. Phƣơng pháp RFLP-PCR sử dụng trong nghiên cứu di truyền
phân tử ............................................................................................................13
Hình 1.5. Kỹ thuật giải trình tự bằng phƣơng pháp Sanger cải biến ...................14
Hình 1.6. Các bƣớc cơ bản trong phƣơng pháp Northern blot ............................17
Hình 1.7. Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ máy Real-time PCR............18
Hình 1.8. Sử dụng chip Microarray trong phân tích biểu hiện ............................19
Hình 2.1. Các bƣớc thí nghiệm nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4 ..................22
Hình 2.2. Các bƣớc thực hiện thí nghiệm phân tích biểu hiện gen
OsHKT2;4 ......................................................................................................25
Hình 2.3. Trồng lúa thủy canh và xử lý mặn .......................................................26
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá của 14 giống
lúa ...................................................................................................................30
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen OsHKT2;4 .......30
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự đƣợc phân tích bằng phần mềm Bioedit ............31
Hình 3.4. Một phần kết quả so sánh các trình tự bằng cơng cụ MultAlin...........33
Hình 3.5. Mơ hình dự đốn cấu trúc bậc ba protein OsHKT2;4 ........................36
Hình 3.6. Phân bố góc quay của các amino acid trong mơ hình cấu trúc

3D qua phân tích Ramachandran Plot ............................................................37
Hình 3.7. Cấu trúc phân tử của các amino acid đa hình vị trí 53 và 253 ............38
Hình 3.8. Cấu trúc phân tử của các amino acid đa hình vị trí 342 ......................39
Hình 3.9. Mơ hình dự đốn cấu trúc xuyên màng ...............................................40
Hình 3.10. Filter pore của protein OsHKT2;4 ở hai nhóm giống lúa .................41
Hình 3.11. Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số ..............................................43
Hình 3.12. Biểu đồ Association curve thể hiện nhiệt độ gắn mồi .......................44
Hình 3.13. Biểu đồ Amplification curve các mẫu gen OsHKT2;4......................45


Hình 3.14. Đồ thị biểu hiện mức độ thay đổi nồng độ mRNA của các mẫu
xử lý mặn so với mẫu đối chứng ở giống Nipponbare (A) và giống
Pokkali (B). ....................................................................................................47


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

HKT

High-affinity Potassium Transporter

DNA

Deoxyribonucleic Acid

RNA

Ribonucleic acid

cDNA

Complementary Deoxyribonucleic Acid

bp

Basepair

PCR

Polymerase Chain Reaction

RFLP-PCR

Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction

RT-PCR

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

dNTP

Deoxy Nucleoside Triphosphate (Deoxynucleotide)

ddNTP

Dideoxynucleotide

Fw

Forward

Rv

Reverse


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt

MỞ ĐẦU
Tình hình biến đổi khí hậu trên thế giới đang diễn ra ngày càng phức tạp.
Việt Nam là một trong những nƣớc chịu các tác động tiêu cực nặng nề của biến đổi
khí hậu. Với đƣờng bờ biển dài hơn 3.260 km, cùng với hệ thống sơng ngịi chằng
chịt đổ ra biển qua rất nhiều cửa sơng, tình hình xâm nhập mặn, một trong những hệ
quả của biến đổi khí hậu đang ảnh hƣởng mạnh đến tình hình sản xuất nơng nghiệp
của nƣớc ta. Ở đồng bằng sơng Cửu Long tình hình xâm nhập mặn lấn sâu vào đất
liền qua các con sông đến 70 km, và dự báo đến tiếp tục tăng. Hạn hán và đất nhiễm
mặn đã và đang ảnh hƣởng đến trên 30 tỉnh thành của nƣớc ta.
Đất nhiễm mặn gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sự sinh trƣởng và phát triển
của cây trồng, gây mất cân bằng ion do tích lũy Na+ và Cl-, tăng cƣờng peroxide
lipid, tăng sản phẩm của các dạng phản ứng oxy nhƣ các gốc superoxide và
hydroxyl.
Để cải thiện năng suất trong điều kiện stress mặn ở thực vật nói chung và ở
lúa nói riêng, việc hiểu đƣợc các cơ chế phân tử của các đáp ứng stress mặn là hết
sức quan trọng. Khả năng chịu mặn là tính trạng đƣợc kiểm sốt bởi nhiều gen.
Việc tìm hiểu mối liên hệ giữa gen quan tâm và khả năng đáp ứng với stress mặn có
vai trị rất quan trọng trong lai tạo giống chịu mặn.
Có rất nhiều kênh vận chuyển trên màng tế bào thực vật giữ vai trị chính
trong các cơ chế chống chịu mặn. Trong số các kênh vận chuyển Na+ và K+ liên
quan đến tính trạng chống chịu mặn, họ protein HKT (High-affinity potassium

transporter) có vai trị quan trọng trong đáp ứng với stress mặn. OsHKT2;4 thuộc
nhóm 2 họ protein HKT, OsHKT2;4 đƣợc biết đến với vai trò đồng vận chuyển Na+
và K+. Tuy nhiên, các nghiên cứu phân tử về gen mã hóa cho protein OsHKT2;4
trên các giống lúa Việt Nam vẫn cịn rất hạn chế. Vì vậy, chúng tơi thực hiện đề tài:
“Phân tích đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của gen OsHKT2;4 ở lúa

QH.2014.T.CH - 60420121
1


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
(Oryza sativa)” với mục tiêu: Phân tích đa hình gen OsHKT2;4 và nghiên cứu mức
độ biểu hiện của gen OsHKT2;4 ở một số giống lúa có khả năng chịu mặn khác
nhau.

QH.2014.T.CH - 60420121
2


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt

CHƢƠNG .

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY LÚA (Oryza sativa)
Lúa (Oryza sativa) là một trong năm loại cây lƣơng thực chính của thế giới,
cùng với ngơ (Zea mays L.), lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot esculenta Crantz)

và khoai tây (Solanum tuberosum L.)[39]. Lúa thuộc bộ Poales, họ Poaceae, chi
Oryza; ngƣời ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một loài cây hoang dại trên
siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các
châu lục trong q trình trơi dạt lục địa, hiện nay có khoảng 21 lồi cây hoang dại
thuộc chi này và 2 lồi lúa đã đƣợc thuần hóa là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa
châu Phi (Oryza glaberrima) [70,73].

Hình 1.1. Cây lúa (Oryza sativa) và các bộ phận của cây lúa [73]

QH.2014.T.CH - 60420121
3


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
Lúa (Oryza sativa) có nguồn gốc tại khu vực xung quanh vùng Đơng Nam
Á; sau đó đƣợc nhân rộng và phân hóa thành hai nhóm sinh thái là Indica và
Japonica. Japonica đƣợc trồng ở nơi khô ráo, mát mẻ của vùng cận nhiệt đới và ơn
đới trong khi Indica đƣợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới Châu Á. Hai nhóm sinh thái
này đƣợc phân biệt bởi các đặc điểm về hình thái (Hình 1.1.), sinh lý và đặc điểm
sinh thái; Indica có lá bản rộng và sáng hơn, cây cao và đẻ nhánh tốt, hạt dài mảnh,
cịn Japonica có lá hẹp và xanh đậm hơn, chiều cao cây thấp hơn và đẻ nhánh trung
bình, hạt trịn ngắn.
Lúa (Oryza sativa) có rất nhiều giống thích nghi với nhiều điều kiện mơi
trƣờng và đƣợc gieo trồng làm cây lƣơng thực trên khắp thế giới [70]. Với tầm quan
trọng trong cung cấp lƣơng thực toàn cầu, việc nghiên cứu tăng năng suất của cây
lúa đang ngày càng đƣợc chú trọng; nghiên cứu đáp ứng mặn ở cây lúa là một trong
những hƣớng nghiên cứu đầy tiềm năng.

1.2. GIỚI THIỆU VỀ HỌ PROTEIN VẬN CHUYỂN ION

XUYÊN MÀNG HKT Ở THỰC VẬT VÀ Ở LÚA
Đất nhiễm mặn là một trong những vấn đề thách thức nền nông nghiệp các
quốc gia trên thế giới. Cây trồng bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi đất nhiễm mặn ở
nồng độ muối cao [9]. Stress mặn ở thực vật có thể phân ra các giai đoạn gồm mất
cân bằng thẩm thấu xảy ra ở giai đoạn sớm, gây độc do tích tụ ion Na+ và Cl-.
Có rất nhiều kênh vận chuyển trên màng tế bào thực vật giữ vai trị chính
trong các cơ chế chống chịu với các stress do các nhân tố sinh học và phi sinh học
gây ra (Hình 1.2.). Trong số các kênh vận chuyển Na+ và K+ liên quan đến tính
trạng chống chịu

mặn [40;49], họ protein HKT có vai trò quan trọng trong sự

chống chịu mặn ở thực vật [17;18;51].

QH.2014.T.CH - 60420121
4


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt

Hình 1.2. Một số cơ chế vận chuyển Na+ trong hệ thống đáp
ứng stress mặn ở thực vật [75]
1.2.1. Họ protein HKT ở thực vật
Schachtman và Schroeder là hai ngƣời đầu tiên đã phát hiện ra các protein
HKT (High-affinity Potassium Transporters) chỉ có ở thực vật nhƣng có trình tự và
chức năng tƣơng tự với lớp protein vận chuyển cation TrkH / TrkB ở vi khuẩn và
nấm [56].
HKTs thuộc lớp các protein màng quan trọng (IMP), tham gia vào quá trình
vận chuyển cation qua màng tế bào, đóng vai trị quan trọng trong việc tham gia vào

khả năng chống chịu mặn ở thực vật [63]. HKT là nhân tố chính trong sự chống
chịu mặn ở thực vật bằng cách loại bỏ Na+ khỏi xylem, giảm sự thẩm thấu của các
ion theo gradien nồng độ [15;26;30].

QH.2014.T.CH - 60420121
5


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
Các nghiên cứu về chức năng đã chỉ ra rằng protein vận chuyển HKT có
chức năng vận chuyển các cation hóa trị 1, với sự chọn lọc cation khác nhau giữa
các thành viên cụ thể trong họ gen HKT [51;57]. Một số protein HKT có tính chọn
lọc cao với Na+, trong khi một vài protein HKT có khả năng vận chuyển cả Na+ và
K+; thậm chí, một số protein HKT có thể thay đổi tính chọn lọc của nó tùy thuộc
vào các ion trong môi trƣờng [57].

Bảng 1.1. Các protein họ HKT đã đƣợc nghiên cứu [57]
Protein

Loài

Mã số

AtHKT1;1

Arabidopsis thaliana

Q84TI7.1

BdHKT1

Brachypodium distachyon

XP_003560515.1

BdHKT4

Brachypodium distachyon

XP_003581628.1

BdHKT6

Brachypodium distachyon

XP_003570995.1

BdHKT8

Brachypodium distachyon

XP_003564102.1

BdHKT9

Brachypodium distachyon

XP_003563514.1

CaHKT1

Cochlearia anglica

AFH37929.1

DfHKT

Diplachne fusca

AEM55592.1

EcHKT1;1

Eucalyptus camaldulensis

AF176035_1

EcHKT1;2

Eucalyptus camaldulensis

AF176036_1

EsHKT1

Eutrema salsugineum

AFJ23835.1

GmHKT1

Glycine max

XP_003540998.1

HbHKT

Hordeum brevisubulatum

AER42622.1

HvHKT1;5

Hordeum vulgare

ABK58096.1

HvHKT4

Hordeum vulgare

AEM44690.1

HvHKT2;1

Hordeum vulgare

AEM55590.1

McHKT1;1

Mesembryanthemum crystallinum

AF367366_1

McHKT1;2

Mesembryanthemum crystallinum

AAO73474.1

MtHKT1;5

Medicago truncatula

AES77170.1

OgHKT1

Oryza glumipatula

ABD15858.1

QH.2014.T.CH - 60420121
6


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt

OrHKT1

Oryza rufipogon

AAY33540.1

OsHKT1;1

Oryza sativa

Q7XPF8.2

OsHKT1;3

Oryza sativa

Q6H501.1

OsHKT1;5

Oryza sativa

A2WNZ9.2

OsHKT2;1

Oryza sativa

A2YGP9.2

OsHKT2;2

Oryza sativa

Q93XI5.1

OsHKT2;3

Oryza sativa

Q8L481.1

OsHKT2;4

Oryza sativa

Q8L4K5.1

PaHKT1

Phragmites australis

BAE44384.1

PtHKT1

Populus trichocarpa

EEF03794.1

PutHKT2;1

Puccinellia tenuiflora

ACT21087.1

SbiHKT1;5

Sorghum bicolor

EES02856.1

SbiHKT1;3

Sorghum bicolor

EES04614.1

SbiHKT2;3

Sorghum bicolor

EER90327.1

SbHKT1

Salicornia bigelovii

ADG45565.1

SmHKT1

Selaginella moellendorffii

EFJ18587.1

SsHKT1

Suaeda salsa

AAS20529.2

TaHKT1;5-D

Triticum aestivum

ABG33949.1

TaHKT2;1

Triticum aestivum

AAA52749

TaHKT1;5-B1

Triticum aestivum

ABG33947.1

TaHKT1;5-B2

Triticum aestivum

ABG33948.1

TmHKT1;5-A

Triticum monococcum

ABG33946.1

ThHKT1

Thellungiella halophila

BAJ34563.1

VvHKT1

Vitis vinifera

XP_002270986.1

VvHKT1;3

Vitis vinifera

XP_002267717.1

ZmHKT1

Zea mays

AEK27028.1

ScTRK1

Saccharomyces cerevisiae

AAA34728

ScTRK2

Saccharomyces cerevisiae

AAA35172

VpTrkH

Vibrio parahaemolyticus

Q87TN7.1

QH.2014.T.CH - 60420121
7


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt

Dựa vào khả năng vận chuyển đặc hiệu ion, họ protein HKT đƣợc chia thành
hai nhóm: nhóm vận chuyển chọn lọc với Na+ (nhóm I) và nhóm đồng vận chuyển
Na+ và K+ (nhóm II) [16;18;57].
1.2.2. Họ protein HKT ở cây lúa
Ở lúa (Oryza sativa), họ protein HKT cũng đƣợc chia ra hai nhóm và đƣợc
mã hóa bởi 7 – 9 gen tùy theo các giống. Trong đó, họ protein HKT nhóm I đƣợc
mã hóa bởi các gen OsHKT1;1, OsHKT1;2, OsHKT1;3, OsHKT1;4, OsHKT1;5 và
nhóm II đƣợc mã hóa bởi các gen OsHKT2;1, OsHKT2;2, OsHKT 2;3, OsHKT2;4
[57].
OsHKT1;5 đƣợc xác định nằm trên locus định lƣợng SKC1 mã hóa cho một
protein tham gia vào vận chuyển Na+, có chức năng quan trọng trong mơ xylem,
nhằm giúp thu hồi Na+ từ mạch gỗ, do đó làm giảm tích lũy Na+ trong thân bẹ của
cây. OsHKT1;1 có thể đƣợc biểu hiện ở chồi và rễ. OsHKT1;3 chủ yếu biểu hiện ở
thân lá, ít biểu hiện ở rễ [8;24;45;57]. OsHKT2;1 có mặt ở vỏ rễ, và có khả năng thu
thập Na+ trong điều kiện thiếu K+, cung cấp ion nội mô [25;35;43;57]. Dƣới điều
kiện mặn sự biểu hiện của gen này sẽ đƣợc điều hòa giảm hoạt động [35;61].
Protein OsHKT2;1 vận chuyển Na+ vào trong rễ, nhƣng hoạt động của nó bị giảm
xuống ở những cây xử lý mặn 30mM NaCl, do đó làm giảm tích lũy Na+ gây độc
cho cây [31]. Ngoài ra, OsHKT2;1 cũng đƣợc biểu hiện trong lá [23;35;44].
OsHKT2;2 có thể hoạt động đồng vận chuyển Na+ và K+ [64]. Cây lúa xử lý mặn ở
150 mM NaCl làm tăng cƣờng biểu hiện của gen này ở lá, đặc biệt là ở các tế bào
diệp lục. Các gen OsHKT2;3 và OsHKT2;4 biểu hiện mạnh trong mô thân bẹ, ít
biểu hiện ở rễ [25;29;33].

QH.2014.T.CH - 60420121
8


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt

Bảng 1.2. Họ gen HKT ở lúa (Oryza sativa) [8;57]
Gen

Mã số Nucleotide

Nhóm

Mã số protein

OsHKT1;1

AJ491816

Nhóm I

CAD37183

OsHKT1;2

AJ506745

Nhóm I

-

OsHKT1;3

AJ491818

Nhóm I

CAD37185

OsHKT1;4

AJ491853

Nhóm I

CAD37197

OsHKT1;5

AK108663

Nhóm I

BAB93392

OsHKT2;1

AB061311

Nhóm II

BAB61789

OsHKT2;2

AB061313

Nhóm II

BAB61791

OsHKT2;3

AJ491820

Nhóm II

CAD37187

OsHKT2;4

AJ491855

Nhóm II

CAD37199

1.2.3. Gen OsHKT2;4
Gen OsHKT2;4 nằm trên nhiễm sắc thế số 6, dài 1749 bp, trình tự mã hóa
CDS dài 1530 bp mã hóa cho chuỗi 509 amino acid [1;2;74]. Gen OsHKT2;4 ít biểu
hiện ở rễ và bông con, chủ yếu đƣợc biểu hiện ở các mô lá, bẹ lá, các chồi phân
sinh. Gen OsHKT2;4 thuộc nhóm II họ gen HKT, quy định các protein đồng vận
chuyển Na+ và K+ hoặc vận chuyển chọn lọc Na+ khi ion này ở nồng độ cao [31;32].

QH.2014.T.CH - 60420121
9

Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt

Hình 1.3. Gen OsHKT2;4 trên cơ sở dữ liệu Phytozome [74]
1.2.4. Tình hình nghiên cứu họ gen OsHKT
Hiện nay, một số thành viên trong họ gen OsHKT đã đƣợc nghiên cứu ở các
giống lúa Việt Nam: Đa hình của gen OsHKT1 (OsHKT2;1) trong công bố năm
2016 của Hoa và cộng sự (Pham Quynh Hoa, Rice Science 23:334-338); đa hình
của gen OsHKT1;2 cơng bố năm 2016 của Phúc và cộng sự (Đỗ Thị Phúc, VNU
Journal of Science: Natural Sciences and Technology 32: 189-193); đa hình của gen
OsHKT1;4 cơng bố năm 2015 của Hoa (Đặng Ngọc Hoa, Tạp chí Khoa học,
ĐHQGHN, số 31, 129-135); nghiên cứu mức độ biểu hiện của OsHKT2;1 công bố
năm 2016 của Phúc và cộng sự (Đỗ Thị Phúc, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, số 2, 54-58) [66-69].
Trên thế giới có một số nghiên cứu về gen OsHKT2;4 nhằm đánh giá về mối
liên hệ của gen này và các quá trình đáp ứng stress mặn ở lúa. Nổi bật là các nghiên
cứu của T. Horie và các cộng sự tại Đại học Shinshu, Nhật Bản. Trong nghiên cứu
công bố năm 2011[32], tác giả đã phân tích khả năng vận chuyển chọn lọc cation
của OsHKT2;4, OsHKT2;4 thể hiện cách thức chọn lọc và vận chuyển ion K+ và
Na+ tƣơng đối khác biệt so với các protein vận chuyển HKT khác.

QH.2014.T.CH - 60420121
10


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
Tác giả đã mơ tả sự chọn lọc ion của nhóm II họ gen HKT thông qua protein

vận chuyển của lúa OsHKT2;4 biểu hiện trên nấm men và trên trứng ếch châu Phi
(Xenopus laevis). Ở nấm men đột biến làm giảm khả năng hấp thụ K+, OsHKT2;4
đã khắc phục đƣợc khiếm khuyết trong phát triển của nấm men. Ở tế bào trứng ếch,
OsHKT2;4 biểu hiện khiến các tế bào trứng có khả năng thẩm thấu K+ mạnh mẽ.
Tuy nhiên các tế bào trứng biểu hiện OsHKT2;4 thẩm thấu K+ khơng u cầu sự
kích thích ngoại bào bởi Na+, điều này khơng giống với các protein vận chuyển
HKT lớp II khác. Hơn nữa, OsHKT2;4 thể hiện khả năng thẩm thấu cả Mg2+ và
Ca2+ khi khơng có sự cạnh tranh của ion K+, nhƣng khả năng thẩm thấu các cation
hóa trị 2 là khơng đáng kể khi có mặt K+. Điều này chứng tỏ OsHKT2;4 giống với
một kênh vận chuyển K+ chuyên biệt, không phụ thuộc vào ion Na+, khác với các
kênh vận chuyển HKT nhóm II khác, vốn là kênh đồng vận chuyển ion K+/Na+ [32].
Hiện nay chƣa có nghiên cứu về gen OsHKT2;4 thực hiện trên các giống lúa
Việt Nam. Do đó những thơng tin về đa hình hay mức độ biểu hiện của gen
OsHKT2;4 để phục vụ cho nghiên cứu chọn giống lúa ở Việt Nam còn rất hạn chế.

MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH

1.3.

NUCLEOTIDE
1.3.1. Phƣơng pháp RFLP-PCR
Phƣơng pháp RFLP-PCR (Restriction Fragment Length PolymorphismPolymerase Chain Reaction) sử dụng kỹ thuật phát triển trên cơ sở phản ứng PCR
(Polymerase Chain Reaction) nhằm khuếch đại có chọn lọc một đoạn trình tự DNA.
1.3.1.1.

Phản ứng PCR

PCR là phƣơng pháp đƣợc xây dựng bởi Kary Mullis vào những năm 1980.
Phản ứng đƣợc thực hiện dựa trên khả năng tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với
trình tự khn DNA ban đầu của DNA polymerase. Enzyme này chỉ có khả năng

kéo dài mạch nhờ gắn thêm một nucleotide vào nhóm chức 3’- OH tự do của

QH.2014.T.CH - 60420121
11


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
nucleotide trƣớc đó, do đó nó cần có trình tự mồi chứa đầu 3’- OH tự do để thực
hiện kéo dài chuỗi. Điều này dẫn đến sự đặc hiệu của phản ứng PCR trong việc
khuếch đại một vùng DNA mong muốn bằng cách thiết kế mồi đặc hiệu.
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện bằng máy gia nhiệt, giúp tăng giảm chính xác
nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng một cách nhanh chóng tại các khoảng thời gian xác
định ở mỗi chu kỳ. Đầu tiên, hai sợi của phân tử DNA kép phải đƣợc tách ra để cho
phép các cặp mồi bám vào khuôn, đƣợc gọi là giai đoạn biến tính DNA (94OC –
98OC). Sau khi tách sợi, nhiệt độ đƣợc làm giảm đến nhiệt độ gắn mồi, cho phép
mồi xuôi và mồi ngƣợc liên kết với các sợi DNA đơn. Tùy vào mục đích nghiên
cứu, cặp mồi có thể đƣợc thiết kế gắn ngẫu nhiên hay gắn đặc hiệu dựa trên trình tự
của vùng DNA quan tâm. Tiếp theo enzyme DNA polymerase sẽ xúc tác tổng hợp
đoạn DNA mới từ mỗi sợi đơn theo chiều 5’ - 3’ ở nhiệt độ kéo dài chuỗi (72OC).
Quá trình này đƣợc lặp lại sau khoảng 25 - 40 chu kỳ. Phản ứng có thể tổng hợp
đƣợc rất nhiều bản sao của trình tự gen mong muốn chỉ trong thời gian vài giờ [72].
Ở nhiệt độ biến tính DNA (khoảng 95OC), các polymerase của đa số sinh vật
đều bị phân giải và mất hoạt tính; vì vậy enzyme sử dụng cho phản ứng PCR cần là
enzyme chịu nhiệt. Ngƣời ta đã phân lập đƣợc một số vi khuẩn phát triển trong điều
kiện nhiệt độ cao, có thể lên tới 100OC, nhƣ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus
aqaticus và tách đƣợc polymerase của vi khuẩn này (Taq polymerase). Việc tìm ra
enzyme chịu nhiệt đã mở ra bƣớc tiến quan trọng cho phản ứng PCR và các kỹ thuật
ứng dụng phản ứng PCR trong xét nghiệm chẩn đoán và nghiên cứu phân tử.

QH.2014.T.CH - 60420121
12


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
1.3.1.2.

RFLP-PCR

RPLP-PCR là phƣơng pháp phát triển trên cơ sở phản ứng PCR thƣờng đƣợc
sử dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền. Phƣơng pháp sử dụng phản ứng PCR
nhằm khuếch đại có chọn lọc một đoạn trình tự DNA, sau đó tiến hành phân cắt
đoạn DNA bằng enzyme cắt giới hạn. Đa hình di truyền của các mẫu DNA đƣợc
phân tích dựa trên sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di sản phẩm
cắt bằng enzyme cắt giới hạn [72]. Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy
điện di sẽ cho biết sự đa hình đoạn DNA phân tích.

Hình 1.4. Phƣơng pháp RFLP-PCR sử dụng trong nghiên cứu
di truyền phân tử [79]
Ƣu điểm của phƣơng pháp này là ít tốn kém, thao tác đơn giản, dễ thực hiện,
có thể ứng dụng trong phân tích đa hình đơn nucleotide. Tuy nhiên, nhƣợc điểm là
khơng xác định đƣợc chính xác trình tự gen, trình tự và vị trí đa hình. Mỗi enzyme

QH.2014.T.CH - 60420121
13


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt

giới hạn thƣờng chỉ nhận biết và cắt tại một trình tự đặc hiệu nên sẽ khó có thể phân
tích đƣợc các gen có tính đa hình cao, do đó phƣơng pháp khơng thích hợp cho
phân tích các gen có mức độ đa hình cao, địi hỏi sử dụng nhiều enzyme cắt.
1.3.2. Phƣơng pháp giải trình tự
Kỹ thuật giải trình tự là một trong những công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu
di truyền phân tử. Từ phƣơng pháp giải trình tự đầu tiên của Sanger, đến nay các
phƣơng pháp giải trình tự ngày càng đƣợc phát triển để đáp ứng với yêu cầu về độ
chính xác, nhanh nhạy, hiệu suất cao [73].
Phƣơng pháp giải trình tự DNA đầu tiên đƣợc mơ tả bởi Sanger và Coulson
đƣợc gọi là phƣơng pháp “cộng và trừ” [54]. Phƣơng pháp này sử dụng DNA
polymerase từ vi khuẩn Escherichia coli và bacteriophage T4 với các nucleoside
triphosphate khác nhau [19;20]. Sản phẩm tạo ra bởi các polymerase đƣợc điện di
trên gel acrylamide. Do sự không hiệu quả của phƣơng pháp này, nên 2 năm sau đó
ơng và cộng sự đã mơ tả một phƣơng pháp mới mang tính đột phá, giải trình tự các

Hình 1.5. Kỹ thuật giải trình tự bằng phƣơng pháp Sanger cải biến[76]
QH.2014.T.CH - 60420121
14


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
oligonucleotide thông qua chuỗi trùng hợp bằng enzyme [55].
Phƣơng pháp này đã mở ra cuộc cách mạng trong lĩnh vực gen và đƣợc biết
đến nhƣ phƣơng pháp Sanger hay phƣơng pháp dideoxynucleotide. Bao gồm một
enzyme xúc tác phản ứng trùng hợp các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) bổ
sung với các mẫu DNA quan tâm. Phản ứng sẽ đƣợc kéo dài cho đến khi các
enzyme kết hợp một dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) đƣợc đánh dấu vào
chuỗi đang tổng hợp. Do các ddNTP khơng chứa nhóm 3’ - OH nên enzym sẽ
không thể xúc tác gắn thêm nucleotide tiếp theo, dẫn đến phản ứng kéo dài bị kết

thúc. Phản ứng đƣợc thực hiện trong 4 ống khác nhau, mỗi ống ngồi thành phần
của phản ứng PCR thơng thƣờng sẽ chứa một loại ddNTP đƣợc đánh dấu.
Sau quá trình tổng hợp, sản phẩm gồm hỗn hợp các DNA kích thƣớc khác
nhau đƣợc điện di trên gel polyacrylamide biến tính theo 4 đƣờng chạy song song
và đƣợc đọc bằng phóng xạ tự ghi. Các phƣơng pháp giải trình tự bằng enzyme
khác cũng đƣợc sử dụng để xác định trình tự các đoạn nucleotide trong nghiên cứu
di truyền [27].
Vào năm 1977, hai nhà khoa học ngƣời Mỹ Allan Maxam và Walter Gilbert
đã phát minh ra một phƣơng pháp hóa học có thể xác định đƣợc trình tự các
nucleotide trong chuỗi DNA. Theo phƣơng pháp này, trƣớc hết phân tử DNA đƣợc
đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5’, tạo ra những đoạn có thể đƣợc phát
hiện bằng hình ảnh phóng xạ. Sau đó các nucleotide trong phân tử DNA đƣợc đánh
dấu sẽ đƣợc xử lý với các hóa chất khác nhau làm biến đổi và cắt phân tử DNA tại
những vị trí nucleotide khác nhau. Bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C,
và C. Kết quả sẽ tạo thành những đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau 1
base [41]. Các đoạn này đƣợc điện di trên gel polyacrylamide và hiển thị bằng máy
phóng xạ tự ghi, huỳnh quang hay các phản ứng màu nhờ enzyme [4;53].
Tổng hợp các kết quả, ta thu đƣợc trình tự các nucleotide trên mạch đơn
DNA, từ đó ta biết đƣợc trình tự sắp xếp các nucleotide của gen.

QH.2014.T.CH - 60420121
15


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
Ngày nay, việc giải trình tự đƣợc thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ của
máy giải trình tự tự động. Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của
phƣơng pháp Sanger có cải biến. Trong đó các ddNTP khơng đƣợc đánh dấu phóng
xạ mà đƣợc đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại

ddNTP. Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính nhƣ: hệ mao quản,
hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu. Các vạch điện di trong mao quản sẽ
đƣợc phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Hệ thống nhận diện tín hiệu màu
sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G [73].

1.4. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA
GEN
1.4.1. Lai Northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ
Phƣơng pháp lai Northern blot đƣợc ra đời vào năm 1977, là một kĩ thuật
đƣợc sử dụng để phát hiện và định lƣợng các phân tử RNA cụ thể trong một hỗn
hợp các RNA. Northern blot đƣợc ứng dụng để phân tích các mẫu RNA từ một mơ
hay tế bào cụ thể để định lƣợng mức độ biểu hiện của những gen quan tâm.
Phƣơng pháp Northern blot sử dụng mẫu RNA đã đƣợc biến tính thành các
sợi đơn. Các phân tử RNA này sau đó đƣợc phân tách theo kích thƣớc nhờ điện di.
Sau khi điện di, RNA trên các băng đƣợc chuyển lên màng thấm. Các màng thấm
này sẽ đƣợc lai với các mẫu đầu dò đƣợc thiết kế sẵn, có trình tự bổ sung với chuỗi
RNA quan tâm trong mẫu. Các đầu dò đƣợc phát hiện và định lƣợng nhờ đƣợc gắn
các nhãn phóng xạ nhờ đó xác định đƣợc kích thƣớc và nồng độ của phân tử RNA
quan tâm [34].
Cùng với sự phát triển của khoa học, các cải tiến trong lai Northern blot cũng
đƣợc ra đời. Tiêu biểu là việc sử dụng huỳnh quang thay thế cho các nhãn phóng xạ.
Ƣu điểm của huỳnh quang là an tồn, ít địi hỏi các thiết bị máy móc phức tạp nhƣ
sử dụng nhãn phóng xạ [78].

QH.2014.T.CH - 60420121
16