Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Đánh giá mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới vô sinh đến khám và điều trị tại Bệnh viện A

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
..................  ....................

DƯƠNG THỊ NHÀN

ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN HỆ GIỮA
MỨC ĐỘ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG
VÀ CÁC CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ Ở NAM GIỚI VÔ SINH
ĐẾN KHÁM VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN A THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN, 2020


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
..................  ....................

DƯƠNG THỊ NHÀN

ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN HỆ GIỮA
MỨC ĐỘ PHÂN MẢNH DNA TINH TRÙNG
VÀ CÁC CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ Ở NAM GIỚI VÔ SINH
ĐẾN KHÁM VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN A THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phú Hùng

THÁI NGUYÊN, 2020


i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực và chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào. Mọi kết quả thu được
không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn trong
luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả


ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn này, em xin trân trọng được gửi lời cảm ơn
sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Phú Hùng đã định hướng khoa học, tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình em tiến hành
nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Công nghệ
Sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ,
chỉ bảo và truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu khoa học.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Bộ phận Sau đại
học – Phòng Đào tạo & QHQT, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái
Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thủ tục, văn bản trong suốt quá trình
học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Bệnh viện A Thái Nguyên, đặc
biệt các anh chị, các bạn, các em trong Khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A
Thái Nguyên nơi tôi đang công tác, đã chia sẻ và giúp đỡ tôi trong thời gian tôi

tiến hành làm luận văn.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn bố mẹ, anh chị em trong gia đình
ln động viên và cho tơi thêm động lực hồn thành tốt q trình học tập và
nghiên cứu khoa học.
Thái Nguyên,09 tháng 07 năm 2020
Tác giả

Dương Thị Nhàn


iii
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................... 3
3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
1.1. Sơ lược sinh lý sinh sản nam.......................................................................... 4
1.1.1. Cấu tạo hệ sinh dục nam ......................................................................... 4
1.1.2. Cấu tạo tinh trùng người ......................................................................... 4
1.1.2. Cấu tạo nhiễm sắc chất tinh trùng người ................................................ 7
1.2. Tình hình vơ sinh ở nam giới ......................................................................... 8
1.2.1. Sơ lược vô sinh nam ................................................................................ 8
1.2.2. Nguyên nhân vô sinh ở nam giới ............................................................ 9
1.2.3. Sơ lược tinh dịch đồ ................................................................................ 9
1.3. Sự phân mảnh DNA tinh trùng người .......................................................... 10
1.3.1. Khái niệm về sự phân mảnh DNA tinh trùng ....................................... 11
1.3.2. Một số nguyên nhân chính gây tổn thương DNA của tinh trùng.......... 11

1.3.3. Ảnh hưởng của sự phân mảnh DNA tinh trùng tới khả năng sinh sản
của nam giới .................................................................................................... 13
1.3.4. Các phương pháp xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng .................. 15
1.3.5. Phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng .................... 16
1.4. Tình hình khám và điều trị vô sinh tại khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A
Thái Nguyên ........................................................................................................ 18
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................ 21
NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 21
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................... 21
2.2. Hóa chất và thiết bị....................................................................................... 22
2.2.1. Hóa chất................................................................................................. 22


iv
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 22
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 23
2.3.1. Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm ................................................ 23
2.3.2. Phương pháp phân tích tinh dịch đồ ..................................................... 23
2.3.3. Quy trình phân tích sự phân mảnh DNA tinh trùng bằng phương pháp
khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất (SCSA) ....................................................... 24
2.3.4. Phân tích số liệu .................................................................................... 25
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu ............................................................................ 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 26
3.1. Đặc điểm lâm sàng và đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu .... 26
3.1.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu ...................................... 26
3.1.2. Đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu ................................. 28
3.2. Kết quả phân tích mức độ phân mảnh DNA của tinh trùng......................... 29
3.3. Kết quả mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với đặc điểm
lâm sàng và chỉ số tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu ................................. 31
3.3.1. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với các đặc điểm

lâm sàng........................................................................................................... 32
3.3.2. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và chỉ số tinh dịch
đồ của đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 49
1. Kết luận ........................................................................................................... 49
2. Kiến nghị ......................................................................................................... 50


v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

AO

Acridine orange

AOT

Acridine orangetest

Phương pháp nhuộm
acridine orange

ART

Assited reproductive
techniques

Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản
Bệnh nhân

BN
DFI

DNA fragmentation index

Chỉ số phân mảnh DNA

dsDNA

Double – stranded DNA

DNA mạch đơi

FCM

Flow cytometer

Máy phân tích dịng chảy
tế bào

FSH

Follice stimulating hormone

Hormon kích thích nang
nỗn
Hỗ trợ sinh sản

HTSS
LH

Luteinizing hormone

Hormon kích thích hồng
thể

ICSI

Intra cytoplasmic sperm
ịnjection

Kỹ thuật tiêm tinh trùng
vào bào tương trứng

IUI

Intra ulterine insemination

Kỹ thuật bơm tinh trùng
vào buồng tử cung

IVF

Invitro fertilization

Thụ tinh trong ống nghiệm
Nhiễm sắc thể

NST
ROS

Reactive oxygen species

Các tác nhân oxy hóa

GTMTT

Giãn tĩnh mạch thừng tinh

TTTON

Thụ tinh trong ống nghiệm


vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Giá trị bình thường của tinh dịch đồ [54], [81] .................................. 10
Bảng 1.2. Một số phương pháp xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng .......... 15
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng cho nghiên cứu ..................................... 22
Bảng 2.2. Danh mục dụng cụ sử dụng cho nghiên cứu ...................................... 22
Bảng 2.3. Danh mục thiết bị sử dụng cho nghiên cứu........................................ 23
Bảng 3.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu ................................... 26
Bảng 3.2. Đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu .............................. 28
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá mức độ phân mảnh DNA tinh trùng ...................... 30

Bảng 3.4. Mối liên hệ giữa việc sử dụng rượu bia với mức độ phân mảnh DNA
tinh trùng ............................................................................................................. 32
Bảng 3.5. Mối liên hệ giữa việc sử dụng thuốc lá với mức độ phân mảnh DNA
tinh trùng ............................................................................................................. 34
Bảng 3.6. Mối liên hệ giữa tiền sử bị quai bị với mức độ phân mảnh DNA tinh
trùng..................................................................................................................... 36
Bảng 3.7. Mối liên hệ giữa độ tuổi với mức độ phân mảnh DNA tinh trùng .... 38
Bảng 3.8. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thời gian
kiêng xuất tinh ..................................................................................................... 40
Bảng 3.9. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với độ pH của
tinh dịch ............................................................................................................... 41
Bảng 3.10. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng với thể tích
xuất tinh ............................................................................................................... 42
Bảng 3.11. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với mật độ tinh trùng ... 43
Bảng 3.12. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với độ di động của tinh
trùng..................................................................................................................... 44
Bảng 3.13. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với tỷ lệ sống của tinh
trùng..................................................................................................................... 45
Bảng 3.14. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với hình dạng của tinh
trùng..................................................................................................................... 47


vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc tinh trùng trưởng thành ......................................................... 5
Hình 1.2. Sự sinh tinh .......................................................................................... 6
Hình 1.3. Cấu trúc chromatin của tinh trùng ....................................................... 8
Hình 1.4. Các cơ chế chính gây tổn thương DNA trong tinh trùng trong quá
trình sản xuất hoặc vận chuyển các tế bào tinh trùng ........................................ 11
Hình 3.1. Cường độ tín hiệu của tinh trùng sau khi nhuộm AO ....................... 29

Hình 3.2. Tần suất mức độ phân mảnh DNA tinh trùng trong tổng số 151 bệnh
nhân được nghiên cứu ......................................................................................... 31
Hình 3.3. Mối liên hệ giữa tiền sử quai bị với mức độ phân mảnh DNA tinh
trùng..................................................................................................................... 37
Hình 3.4. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và pH tinh dịch41
Hình 3.5. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với mật độ tinh trùng ..... 43
Hình 3.6. Mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA với độ di động của tinh
trùng..................................................................................................................... 45
Hình 3.7. Mối tương quan giữa mức độ phân mảnh DNA với tỷ lệ sống của tinh
trùng..................................................................................................................... 46


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Lý do chọn đề tài
Vô sinh là tình trạng khơng có thai sau một thời gian 1 năm chung sống
vợ chồng và không sử dụng một biện pháp tránh thai nào [110]. Vô sinh đã trở
nên phổ biến trên toàn thế giới và ảnh hưởng đến hơn 70 triệu cặp vợ chồng
trong độ tuổi sinh sản [23]. Theo ghi nhận của y văn thế giới, tỷ lệ vô sinh nam
chiếm từ 30 – 40% và cách đây hơn 10 năm, tỷ lệ nam giới điều trị hiếm muộn
có liên quan đến bất thường tinh dịch chiếm 77,3% [7]. Có ý kiến cho rằng khả
năng sinh sản của nam giới đã giảm trong nhiều thập kỷ qua [51] và tỷ lệ khuyết
tật hạt nhân tinh trùng là nguyên nhân gây vơ sinh được ước tính đại diện cho
khoảng 3% các cặp vợ chồng vô sinh được hỗ trợ bằng phương pháp thụ tinh
trong ống nghiệm (IVF - In Vitro Fertilization) [62].
Trong hai thập kỷ qua, hình thái tinh trùng được công nhận là một yếu tố
dự báo quan trọng về kết quả trong thụ tinh nhân tạo, thông thường là IVF và
ICSI (Intra cytoplasmic sperm injection) [74]. Trong khi mối quan hệ giữa mật
độ tinh trùng và sự phân mảnh DNA tinh trùng (SDF- Sperm DNA
fragmentation) ở nam giới hiếm muộn có vẻ khác nhau, mối tương quan giữa

SDF và khả năng sống của tinh trùng cũng đã được đánh giá [24]. Nhiều nghiên
cứu cho thấy mức độ đứt gãy DNA tinh trùng ở những người nam vô sinh cao
hơn ở người bình thường [21], [100] và có mối liên quan giữa mức độ dị dạng
của tinh trùng với sự phân mảnh DNA tinh trùng [27], [77], nhưng yếu tố để dự
đoán mức độ phân mảnh DNA tinh trùng khơng phải là hình dạng tinh trùng
[27] và những tinh trùng bình thường vẫn có thể mang DNA bị phân mảnh [16].
Tinh trùng có tỷ lệ DNA phân mảnh cao sẽ làm ảnh hưởng tới chất lượng
tinh trùng và kết quả có thai của các trường hợp bệnh nhân được điều trị bằng
các phương pháp hỗ trợ sinh sản. DNA bị phân mảnh sẽ ảnh hưởng tới độ di
động của tinh trùng [95], làm giảm tỷ lệ thụ tinh đối với các trường hợp làm
ICSI [79], tăng nguy cơ sảy thai [108], giảm chất lượng phôi, giảm tỷ lệ tiền làm
tổ [48]. Theo Aziz N (2008), thất bại của IUI (Intra ulterine insemination) đòi


2
hỏi phải đánh giá thêm các đặc tính sinh học của tinh trùng, chẳng hạn như dấu
hiệu apoptotic và phân mảnh DNA tinh trùng [17].
Các phương pháp phổ biến được sử dụng để đánh giá sự phân mảnh DNA
tinh trùng gồm có phương pháp khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất tinh trùng
(SCD – Sperm chromatin dispersion assay), phương pháp khảo sát cấu trúc
nhiễm sắc chất tinh trùng (SCSA – Sperm chromatin structure assay), phương
pháp dịch mã đứt gãy tại chỗ,... Một trong những phương pháp phổ biến được sử
dụng để đánh giá sự phân mảnh DNA tinh trùng là phương pháp SCSA. Phương
pháp này sẽ định lượng sự phân mảnh DNA trực tiếp dựa vào sự kết hợp DNA
bị biến tính với chất nhuộm DNA huỳnh quang acridine orange. Giá trị ngưỡng
của SCSA đã được xác định và đưa vào trong chẩn đoán lâm sàng. SCSA là một
phương pháp có nhiều tiềm năng hỗ trợ cho chẩn đốn và điều trị của các cặp vợ
chồng hiếm muộn.
Tại Bệnh viện A Thái Nguyên, lượng bệnh nhân vô sinh đến khám và
điều trị ngày càng tăng và với nhiều nguyên nhân khác nhau. Để đưa ra được

hướng điều trị nhằm đạt kết quả tốt nhất cho từng trường hợp, các cặp vợ chồng
cần phải làm đầy đủ các xét nghiệm lâm sàng, đối với nữ: xét nghiệm nội tiết,
siêu âm đánh giá tử cung – buồng trứng, xét nghiệm máu cơ bản (viêm gan B,
viêm gan C, HIV,…); đối với nam: xét nghiệm nội tiết, xét nghiệm tinh dịch đồ,
xét nghiệm máu cơ bản, và gần đây là xét nghiệm phân mảnh DNA tinh trùng.
Ở Việt Nam hiện nay, có nhiều trung tâm đã nghiên cứu và triển khai
đánh giá mức độ phân mảnh DNA tinh trùng bằng nhiều phương pháp khác
nhau. Tuy nhiên, để đánh giá mối tương quan giữa các chỉ số tinh dịch đồ với
mức độ phân mảnh của các trường hợp vô sinh nam đến khám và điều trị tại
khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A Thái Ngun chưa được xây dựng. Chính
vì vậy, tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá mối liên hệ giữa mức độ
phân mảnh DNA tinh trùng và các chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới vô sinh
đến khám và điều trị tại Bệnh viện A Thái Nguyên” để góp phần vào việc đưa


3
thêm yếu tố tiên lượng cho việc hỗ trợ điều trị hiếm muộn được cải thiện và
nâng cao hơn.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân tích sự phân mảnh DNA của tinh trùng và mối liên hệ giữa mức độ
phân mảnh với các chỉ số tinh dịch đồ phục vụ cho công tác chẩn đốn và điều
trị vơ sinh nam tại Bệnh viện A Thái Nguyên.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu các chỉ số tinh dịch đồ và đặc điểm lâm sàng của đối tượng
nghiên cứu.
- Phân tích mức độ phân mảnh DNA tinh trùng của đối tượng nghiên cứu.
- Phân tích mối liên hệ giữa mức độ phân mảnh DNA tinh trùng và các
chỉ số tinh dịch đồ.

4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược sinh lý sinh sản nam
1.1.1. Cấu tạo hệ sinh dục nam
Hệ sinh dục nam bao gồm:
- Tinh hoàn: là nơi sinh ra tinh trùng và tổng hợp nội tiết tố nam
testosterone.
- Đường dẫn tinh trùng: từ tinh hoàn đi đến đổ vào niệu đạo và ra ngoài.
- Các tuyến sinh dục phụ: chế tiết các dịch tiết, đóng vai trị quan trọng
trong việc hình thành tinh dịch.
Sự điều hịa hoạt động sinh tinh chế tiết nội tiết tố của tinh hồn thơng
qua trục hạ đồi – tuyến yên – tinh hoàn và một số cơ chế điều hịa nội tại ở tinh
hồn. Hiện tượng cương dương vật và phóng tinh ở nam có sự tham gia của hệ
thần kinh tự động và hệ thần kinh cảm thể [3], [7].
Trong những năm gần đây, vô sinh nam đang thu hút sự quan tâm ngày
càng tăng vì bằng chứng về chất lượng tinh dịch giảm ở những người đàn ông
trẻ và khỏe mạnh trên toàn thế giới [12], [83], [106]. Giảm số lượng hay chất
lượng tinh trùng hay bất thường ở bất kỳ giai đoạn nào trong quá trình sinh tinh
trùng, vận chuyển tinh trùng, phóng tinh… đều có thể dẫn đến vơ sinh nam [21],
[100].
1.1.2. Cấu tạo tinh trùng người
Tinh trùng người là các tế bào đơn bội, mang 23 nhiễm sắc thể (NST) là
đặc điểm di truyền của người cha. Tinh trùng có cấu tạo phù hợp giúp tinh trùng
có thể di chuyển, nhận biết và thụ tinh với noãn trong đường sinh dục nữ. Tế bào
tinh trùng có kích thước nhỏ nhất trong cơ thể và có mức độ biệt hóa cao. Một
tinh trùng trưởng thành có chiều dài khoảng 50µm, bao gồm phần đầu và phần
đi. Phần đầu có chiều dài khoảng 5µm, ngang 2,5µm và dày 1,5µm bao gồm


5

thể cực đầu (acrosome) chứa các enzyme cần thiết cho quá trình thụ tinh và nhân
chứa vật chất di truyền [1]. Phần đi tinh trùng dài khoảng 45µm, gồm phần
cổ, đoạn giữa, đoạn chính và chóp đi. Đi tinh trùng là bộ phận chịu trách
nhiệm chính cho khả năng di động của tinh trùng (Hình 1.1)
Hình 1.1. Cấu trúc tinh trùng trưởng thành [14]
(Head: đầu; Plasma membrane: màng plasma; Acrosome: thể cực đầu; Nucleus:
nhân; Centriole: trung thể; Mitochondria: ty thể; Mid-pieace: đoạn giữa; Tail: đi;
End piece: chóp đi; Flagellium: roi; Axialflament: trục chính)

Theo Mortimer (1994), sau khi q trình sinh tinh được diễn ra, để hình
thành nên tinh trùng trưởng thành từ tinh nguyên bào sẽ mất khoảng 70 ± 4 ngày
và gồm 2 giai đoạn chính [84]:
- Giai đoạn hình thành tinh tử.
- Giai đoạn tinh tử biệt hóa thành tinh trùng.
Các tinh nguyên bào tinh trùng gồm có tinh nguyên bào loại A1, A2, A3,
A4, tinh nguyên bào trung gian và tinh nguyên bào loại B nằm ở phần biểu mô
gần màng đáy ống sinh tinh. Mỗi loại, theo thứ tự là kết quả của việc phân chia
nguyên nhiễm từ loại tinh nguyên bào trước đó. Tinh nguyên bào loại B là loại
cuối cùng còn nguyên phân để tạo nên tinh bào sơ cấp. Các tinh bào sơ cấp trải
qua giảm phân I tạo thành tinh bào thứ cấp. Tinh bào thứ cấp giảm phân II tạo ra
tinh tử đơn bội.

Theo Dym (1971), các tinh nguyên bào sẽ liên kết với nhau qua cầu sinh
chất trong suốt quá trình phân bào và tế bào chất phân chia khơng hồn tồn.
Suốt q trình phát triển, các tế bào dần dần di chuyển từ màng đáy để tiến về
lòng ống sinh tinh. Khi tinh tử đến thành ngoài cùng của lịng ống, chúng tách
bỏ phần tế bào chất dính với nhau (thể thừa) và biệt hóa thành các tinh trùng tự
do [41], [88].

6
Để tạo nên tinh trùng trưởng thành, tinh tử sẽ thay đổi về cấu tạo, hình
thái sau khi trải qua 3 bước gồm: sự cơ đặc nhân, sự hình thành thể cực đầu
(acrosome) và q trình hình thành đi. Sự cơ đặc nhân là q trình nén chặt để
NST (Nhiễm sắc thể) có cấu trúc nhỏ gọn nhất. Cấu trúc này giúp ổn định và
bảo vệ DNA người cha trong suốt quá trình di chuyển của tinh trùng. Acrosome
được hình thành từ bộ máy Golgi, che phủ khoảng 30 – 50% bề mặt nhân tế bào
tinh trùng [37]. Acrosome có chứa nhiều enzyme thủy phân, bao gồm
hyaluronidase và proacrosine, cần thiết cho q trình xâm nhập vào nỗn và thụ
tinh của tinh trùng. Những enzyme này có vai trị quan trọng trong việc hỗ trợ
tinh trùng xâm nhập vào màng trong suốt (màng zona pellucida – zp) của noãn.
Như vậy, nhân tinh trùng và acrosome là cấu tạo chính phần đầu của tinh trùng.
Phần cổ và đuôi tinh trùng được hình thành từ trung tử. Đi có cấu trúc sợi
trục, gồm hai sợi trong trung tâm và chín cặp ngoại vi. Các ti thể bao bọc quanh
sợi trục ở phần giữa, cung cấp năng lượng cho hoạt động di chuyển của đi
tinh trùng.
Hình 1.2. Sự sinh tinh [41]
Như vậy, sự biệt hóa thành tinh tử được đặc trưng bởi việc bất hoạt bộ
gen, nhiễm sắc thể được nén chặt tạo thuận lợi cho quá trình di chuyển của tinh
trùng và sự hình thành các cấu trúc chức năng quan trọng cho q trình di
chuyển và thụ tinh như phần đi tinh trùng, thể cực đầu. Sự phát sinh tinh trùng
là một q trình được kiểm sốt liên tục và chính xác, bao gồm những thay đổi
cực kỳ rõ rệt về tế bào, di truyền và nhiễm sắc thể dẫn đến việc tạo ra các tế bào
tinh trùng chuyên biệt cao.
Sau khi tinh trùng được giải phóng ra mào tinh, tinh trùng mất đi các túi
bào tương thừa ở cổ, ổn định cấu trúc cực đầu. Cấu trúc glycoprotein màng
ngoài tinh trùng thay đổi tạo thuận lợi cho quá trình nhận diện và phản ứng với
nỗn. Bên cạnh đó, mức độ chuyển hóa trong tinh trùng tăng dần và khả năng di
động của tinh trùng tăng dần trong thời gian tinh trùng di chuyển dọc theo mào

7
tinh. Như vậy, sự trưởng thành của tinh trùng trong mào tinh giúp tinh trùng tăng
khả năng di chuyển, nhận diện và kết hợp với noãn trong đường sinh dục nữ.
1.1.2. Cấu tạo nhiễm sắc chất tinh trùng người
Nhiễm sắc chất (Chromatin) là vật chất di truyền của tế bào gồm các
chuỗi DNA kết hợp với protein cấu trúc. Phần lớn chất nhiễm sắc của tinh trùng
được ngưng tụ bởi các protamine ở dạng cấu trúc hình xuyến rất nhỏ gọn, mỗi
cấu trúc chứa khoảng 50 Kb DNA [18], [62], mặc dù khoảng 8% DNA vẫn được
tổ chức bởi histones [55], [56], [61]. Các protein cấu trúc này có vai trị tổ chức
hình thái và điều hịa hoạt động của DNA. Ở tế bào sinh dưỡng, protein cấu trúc
chủ yếu là các protein histone. Chromatin trong tế bào tinh trùng có sự khác biệt
với chromatin của tế bào sinh dưỡng. Trước quá trình giảm phân, chromatin của
tinh nguyên bào cũng mang các protein histone, khi các tế bào giảm phân,
protein histone này được thay thế bởi biến thể histone đặc trưng cho tinh hoàn
[30]. Trước khi tiến hành thay thế histone, chromatin dãn rộng và có nhiều vùng
co cụm. Các biến thể histone thay thế vào giúp chromatin trở nên gọn gàng và
đồng đều hơn [86]. Tiếp theo, trong các tinh tử hình cầu, protein histone được
thay thế dần bởi protein chuyển tiếp. Đến giai đoạn tinh tử kéo dài, protein
chuyển tiếp bị loại khỏi chromatin và thay bằng protamine. Ở người khi kết thúc
quá trình sinh tinh, khoảng 85% histone được thay thế bởi protamine [39]. Quá
trình thay thế histone thành protamine rất quan trọng trong sự hình thành
tinh trùng cũng như chức năng sinh lý của tinh trùng khi gặp nỗn [115].
Protamine có kích thước khoảng một nửa histone. Chúng là các protein rất
kiềm, giàu 2 amino axit là arginine và cysteine [39], [71]. Hàm lượng arginine
cao (lên đến 70% trong tổng số các amino axit) hình thành một mạng lưới điện
tích dương, giúp protamine có thể liên kết chặt chẽ với DNA mang điện tích âm
[26]. Cysteine góp phần trong việc hình thành cầu nối disulfide nội phân tử của
protamine và liên kết giữa các protamine với nhau [34]. Protamine giúp nén chặt
các sợi DNA và hình thành các đơn vị đóng gói cơ bản của chromatin tinh trùng

được gọi là toroid, một phần nhỏ liên kết với histone tạo cấu trúc lỏng lẻo hơn


8
và phần còn lại liên kết với chất nền nhân tinh trùng (Matrix Attachment
Regions - MAR) có kích thước khoảng 50kb (Hình 1.3). Các liên kết chéo
disulfide nội phân tử và liên phân tử giữa các cysteine trong protamine giúp các
toroid càng nén chặt hơn nữa [70]. Với cấu trúc có sự tham gia của protamine,
DNA tinh trùng người được nén chặt bằng 1/6 so với DNA của tế bào sinh
dưỡng bình thường.
Hình 1.3. Cấu trúc chromatin của tinh trùng [111]
Thành phần protein quan trọng khác trong cấu trúc DNA tinh trùng là
histone. Theo Hammoud và cộng sự (2009), có khoảng 4% lượng DNA liên kết
với histone tại các vùng gen khởi động phiên mã (gene promoter site) [61]. Toàn
bộ các vùng gen đặc trưng cho quá trình sinh tinh và thụ tinh được xác định là
liên kết với histone trong nhiễm sắc thể của tinh trùng. Tuy nhiên, những vùng
gen này lại dễ bị bất hoạt bởi hoạt động của các enzyme nuclease. Histone trong
DNA tinh trùng không được thay thế bởi histone của nỗn sau q trình thụ tinh
nên bất cứ tổn thương nào ở vùng này cũng sẽ truyền trực tiếp cho phơi [10]. Do
đó, nếu khơng được phát hiện và sửa chữa sẽ ảnh hưởng lớn đến sự phát triển
của phơi và thai nhi.
1.2. Tình hình vô sinh ở nam giới
1.2.1. Sơ lược vô sinh nam
Vô sinh nam được định nghĩa là tình trạng nam giới khơng có khả năng
thụ thai cho nữ giới sau khi kết hôn 12 tháng mà không sử dụng biện pháp tránh
thai nào [40]. Người ta ước tính rằng 20 - 30% các trường hợp vô sinh chỉ do
yếu tố nam giới và 20% khác liên quan đến các vấn đề từ cả hai vợ chồng [64]
và sự suy giảm số lượng tinh trùng được báo cáo trong các báo cáo khoa học
ngày càng tăng [78]. Song song với số lượng tinh trùng, suy giảm là một xu
hướng đáng lo ngại không kém và kéo dài trong các bất thường của hệ thống

sinh sản nam giới, chẳng hạn như hiện tượng tinh hoàn ẩn, khối u tế bào mầm và
đến tuổi dậy thì [104]. Nếu xu hướng tiêu cực về số lượng tinh trùng và các vấn
đề về hệ thống sinh sản nam có giá trị, thì điều đó có nghĩa gì đối với khả năng


9
sinh sản của nam giới nói chung và có những vấn đề khác liên quan đến sức
khỏe sinh sản của nam giới [105].
1.2.2. Nguyên nhân vô sinh ở nam giới
Các nguyên nhân dẫn tới vô sinh nam bao gồm [3]:
- Nhóm nguyên nhân bất thường về tinh trùng:
+ Thiểu năng tinh trùng: Tinh trùng ít, yếu, dị dạng.
+ Khơng tinh trùng.
- Nhóm nguyên nhân khác:
+ Giãn tĩnh mạch thừng tinh (GTMTT).
+ Rối loạn chức năng giao hợp, rối loạn phóng tinh.
+ Rối loạn nội tiết.
+ Miễn dịch.
+ Bệnh lý toàn thân.
+ Tổn thương tinh hoàn mắc phải.
+ Nhiễm trùng tuyến sinh dục phụ.
+ Bệnh lý di truyền.
1.2.3. Sơ lược tinh dịch đồ
Người ta ước tính các bất thường của tinh trùng về sản xuất hay hoạt động
chức năng, chiếm từ 35% đến 50% các trường hợp vô sinh. Tinh dịch đồ là một
xét nghiệm nhằm đánh giá chất lượng của tinh trùng, thông qua các chỉ số như
số lượng, khả năng di động, hình dạng bình thường… mặc dù khơng cung cấp
các thông tin về hoạt động chức năng của tinh trùng, dựa vào kết quả của một
tinh dịch đồ, người ta có thể đánh giá một cách khái quát về khả năng sinh sản
của nam giới [20], [113].

Đa số các trung tâm trên thế giới và khu vực đều đánh giá tinh dịch đồ
dựa theo cẩm nang của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Phiên bản đầu tiên được
phát hành vào 1980 và từ 2010 đến nay, hầu hết các trung tâm đều thực hiện
theo hướng dẫn của phiên bản thứ năm (WHO, 2010) [113]. Đây là phiên bản
hồn chỉnh nhất hiện nay, thay đổi quy trình và cách diễn giải kết quả, cũng như


10
cách đánh giá theo tiêu chuẩn mới chính xác hơn, nghiêm ngặt hơn để hạn chế
sai số tối thiểu và mang lại kết quả tối ưu nhất cho các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản
(Bảng 1.1).
Tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới, ngoài các chỉ số
về tinh trùng cịn có các trị số về pH tinh dịch. Dịch túi tinh mang tính kiềm,
trong khi đó dịch tiền liệt tuyến mang tính axít, sự pha trộn của hai dịch này làm
cho độ pH của tinh dịch có tính kiềm (pH = 7,2 - 8). Nếu túi tinh khơng có, teo
hay vơ chức năng, hay bế tắc cả hai ống phóng tinh, thể tích tinh dịch sẽ thấp (<
1mL) và pH axit (< 7,0) vì tinh dịch chỉ có dịch tuyến tiền liệt là chính [66],
[113].
Trong điều kiện được kiểm soát, chất lượng tinh dịch phụ thuộc các yếu
tố thường không thể thay đổi như khả năng sản xuất tinh trùng từ tinh hoàn, dịch
tiết từ các tuyến phụ và tình trạng sức khỏe gần thời điểm lấy mẫu (đặc biệt là
bệnh sốt cao), cũng như thời gian kiêng xuất tinh. Các điều này cần được ghi
nhận khi phân tích kết quả.
Bảng 1.1. Giá trị bình thường của tinh dịch đồ [54], [81]
Các chỉ số bình thường của WHO,

Các chỉ số bình thường của WHO,

2010

1999

- Thể tích tinh dịch: ≥ 1,5ml.

- Thể tích tinh dịch ≥ 2 ml.

- pH ≥ 7,2.

- pH: 7,2 - 8,0.

- Mật độ tinh trùng: ≥ 15.106/ml.

- Mật độ: ≥ 20.106 TT/ml.

- Tổng số tinh trùng: ≥ 39.106/lần xuất
tinh.
-

Độ di động của tinh trùng:

PR ≥ 32%, hoặc PR + NP ≥ 40%.
- Hình dạng bình thường: ≥ 4%.
- Tỉ lệ sống: ≥ 58%.

- Độ di động của tinh trùng: A ≥
25%, hoặc A+B ≥ 50%.
- Hình dạng bình thường: ≥ 15%.
- Tỉ lệ sống ≥ 75%.

1.3. Sự phân mảnh DNA tinh trùng người

11
1.3.1. Khái niệm về sự phân mảnh DNA tinh trùng
Sự phân mảnh DNA tinh trùng là hiện tượng bất ổn trong bộ nhiễm sắc thể
của tinh trùng. Các phân tử DNA bị đứt gãy, làm thay đổi tính tồn vẹn của bộ gen.
Sự bất thường về bộ gen này gây ra mất khả năng kết hợp giữa tinh trùng và trứng,
mất khả năng phân chia tế bào hoặc phôi ngừng phân chia, thối hố và chết. Điều
này giải thích cho sự giảm khả năng thụ tinh hoặc sảy thai liên tiếp, hoặc sinh con
bất thường. Đây là nguyên nhân đặc biệt quan trọng dẫn tới vô sinh nam. Nguyên
nhân dẫn tới phân mảnh DNA của tinh trùng có thể bao gồm:
- Khiếm khuyết trong thay thế histone bằng protamine trong q trình biệt hóa.
- Hiện tượng chết theo chu trình (Apoptosis).
- Hậu quả của việc tiếp xúc với các tác nhân oxy hóa (Reactive
oxygen species - ROS) trong q trình di chuyển trong lịng ống sinh tinh và
mào tinh hồn.
Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Denny Sakkas và cộng sự (2010) cũng
chỉ ra một số nguyên nhân gây ra sự phân mảnh DNA tinh trùng (Hình 1.4)
Hình 1.4. Các cơ chế chính gây tổn thương DNA trong tinh trùng trong quá
trình sản xuất hoặc vận chuyển các tế bào tinh trùng [38]
((i) Apoptosis trong quá trình sản sinh tinh trùng; (ii) Sự phá vỡ chuỗi DNA
trong quá trình sản sinh tinh trùng; (iii) DNA phân mảnh do ROS ở sau tinh hoàn; (iv)
DNA phân mảnh do yếu tố nội sinh và ngoại sinh; (v) DNA phân mảnh do xạ trị và
hóa trị; (vi) DNA phân mảnh do ơ nhiễm mơi trường)

1.3.2. Một số ngun nhân chính gây tổn thương DNA của tinh trùng
* Khiếm khuyết trong thay thế histon bằng protamine trong q trình biệt hóa
Trong q trình biệt hóa, tinh tử được thay thế protein histon bằng
protamine dẫn đến hư hỏng DNA. Trong quá trình này, các chromatin phải biến
đổi để nén toàn bộ vật chất di truyền vào đầu tinh trùng. Khi thay đổi các protein

cấu trúc và tiến hành cuộn nén, DNA phải chịu một áp lực xoắn rất lớn. Enzyme
DNA topoisomerase II giúp DNA tháo xoắn và giảm áp lực này bằng cách cắt
mạch DNA tạo các nick tạm thời [76].


12
* Hiện tượng chết theo chu trình (apoptosis)
Quá trình apoptosis ở tế bào mầm sinh dục xảy ra theo con đường truyền
tín hiệu đến thụ thể nhận diện sự chết nằm trên bề mặt tế bào (cell surface death
receptor). Quá trình này được điều khiển bởi tế bào Sertoli khi tế bào mầm bước
vào giai đoạn giảm phân I, thông qua sự hoạt động của các thụ thể chết (Fas).
Các tế bào Sertoli có chức năng ni dưỡng, giúp các tế bào mầm phát triển và
biệt hóa tinh tử thành tinh trùng. Tuy nhiên, tế bào Sertoli chỉ có thể hỗ trợ một
số lượng tế bào mầm có giới hạn. Vì vậy, quá trình chết theo chương trình
(apoptosis) thường xảy ra để ngăn chặn sự sản xuất quá mức các tế bào mầm và
loại bỏ có chọn lọc các tế bào mầm bị tổn thương [52]. Protamine hoạt động như
một trạm kiểm sốt (checkpoint) của q trình sinh tinh, những tế bào biểu hiện
protamine bất thường, có nguy cơ tổn thương DNA sẽ kích hoạt q trình
apoptosis [42]. Trong q trình sinh tinh, có khoảng 50% – 60% tế bào mầm
sinh dục sẽ bị sàng lọc và cảm ứng quá trình apoptosis.
* Tiếp xúc với các tác nhân oxy hóa tự do nội bào hay ngoại bào
Khi tinh trùng tách ra khỏi các tế bào Sertoli thì khả năng sửa chữa sai
hỏng DNA cũng bị hạn chế. Tinh tử trước khi phát triển thành tinh trùng sẽ loại
bỏ các túi bào tương thừa để trưởng thành về hình thái. Những túi bào tương
thừa này chứa rất nhiều enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH).
G6PDH tồn tại ở nồng độ cao đã kích thích sự sản sinh ra NADPH, một nguồn
cung cấp electron cho các phản ứng tạo ra ROS [94]. Gần đây, một số nghiên
cứu đã chứng minh rằng ở những người đàn ông vô sinh, ty thể của tinh trùng
tạo ra sự dư thừa của ROS có liên quan đến giảm khả năng vận động và tổn
thương DNA [102]. Người ta đã phát hiện ra rằng, sự khiếm khuyết tinh trùng

người được đặc trưng bởi hàm lượng axit béo khơng bão hịa cao bất thường
thúc đẩy sự tạo ra ROS bởi ty thể của tinh trùng, tạo ra trạng thái căng thẳng oxy
hóa và mất khả năng chức năng đồng thời [69], [89]. Việc sản xuất ROS của tinh
trùng được liên kết với hệ thống NADPH oxyase được định vị trong màng
plasma của tinh trùng và với hệ thống oxy hóa NADH có trong chuỗi hơ hấp của


13
ty thể. Các enzyme này, trong điều kiện đặc biệt, tạo ra H2O2, được coi là chất
nền có khả năng phản ứng cao trong các phản ứng hóa học với kim loại (ví dụ
Fe² +), mang lại sự hình thành OH hydroxyl triệt để. -OH được coi là gốc phản
ứng nguy hiểm và nguy hiểm nhất có thể phản ứng với lipit màng, protein và
DNA/RNA khi nồng độ của nó vượt quá nồng độ của chất nền [67]. Hai yếu tố
bảo vệ DNA tinh trùng khỏi các tác động của gốc tự do: đóng gói DNA bằng
protein histone và các hợp chất chống oxy hóa [59], [60].
Stress oxy hóa xảy ra khi có sự sản sinh các tác nhân oxy hóa (Reactive
Oxygen Species – ROS) vượt mức. Một ví dụ oxy hóa điển hình là peroxide hóa
lipid trong màng tế bào. Màng tế bào tinh trùng chứa nhiều axit béo khơng bão
hịa. Khi bị oxy hóa, chúng tạo thành gốc peroxyl (ROO-) và alkoxyl (RO-),
đồng thời giải phóng H+ hoặc OH-. Gốc OH- có thể gây hư hỏng DNA bằng
việc tấn công các phân tử đường pentose, purin và pyrimidine [5], [93].Tinh
trùng có thể tiếp xúc ROS do những nguyên nhân sau: (1) tiếp xúc với các tinh
trùng chưa trưởng thành khi cùng di chuyển trong lòng ống sinh tinh và mào
tinh hồn; (2) do các tác động từ mơi trường. ROS được tạo ra có thể cảm ứng
làm phân mảnh DNA tinh trùng trưởng thành do các tế bào tinh trùng trưởng
thành di chuyển cùng và ở rất gần với các tế bào tinh trùng chưa trưởng thành từ
ống sinh tinh đến đuôi mào tinh [117].
Tuy nhiên, các tổn thương xảy ra sau tinh hồn, trong q trình vận
chuyển tinh trùng trong mào tinh cũng là một trong những nguyên nhân gây
phân mảnh DNA tinh trùng.

1.3.3. Ảnh hưởng của sự phân mảnh DNA tinh trùng tới khả năng sinh sản
của nam giới
Tinh trùng khơng có khả năng sửa chữa DNA bị tổn thương xảy ra trong
mào tinh hoặc trong quá trình xuất tinh [8]. Hoạt động sửa chữa DNA của tinh
trùng phụ thuộc vào hệ thống tự sửa chữa của tế bào noãn sau khi thụ tinh được
diễn ra [108]. Trên thực tế, các bản sao và protein của mẹ hỗ trợ sự phát triển
của hợp tử cho đến khi bộ gen của phơi thai được kích hoạt. Khả năng của noãn


14
bào để sửa chữa tổn thương DNA trong thụ tinh tinh trùng sẽ không chỉ phụ
thuộc vào mức độ và loại tổn thương nhiễm sắc thể tinh trùng, mà còn về chất
lượng của máy móc sửa chữa tế bào mầm nữ [108]. Vì vậy, sự phân mảnh DNA
tinh trùng là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra tình trạng vơ sinh
ở nam giới.
Tính tồn vẹn DNA của tinh trùng là yếu tố quan trọng để có thể truyền
đạt ổn định đặc điểm di truyền của người cha [43]. Nghiên cứu của Brahem và
cộng sự (2012) đã chứng minh có mối liên quan giữa sự phân mảnh DNA và khả
năng tồn tại của tinh trùng, mức độ phân mảnh DNA cao thì tỷ lệ tinh trùng chết
cũng cao [19]. Nhiều nghiên cứu cũng đã cho thấy mức độ tổn thương DNA tinh
trùng cao có ảnh hưởng đến khả năng sinh sản. Chỉ số phân mảnh DNA tinh
trùng (DFI) thấp (0 –15%), trung bình (16 – 29%) và cao (≥ 30%) lần lượt tương
ứng với tiềm năng sinh sản cao, trung bình và rất thấp [43]. Cũng theo nghiên
cứu của Evenson và cộng sự (2008), sự phân mảnh DNA có liên quan đến việc
giảm khả năng thụ thai tự nhiên, suy giảm chất lượng phôi và tỷ lệ sẩy thai cao
hơn bình thường [19]. Đồng thời, theo nghiên cứu của Zini và cộng sự (2005), tỷ
lệ phân mảnh DNA cao cũng gia tăng nguy cơ sẩy thai khi thực hiện các kỹ
thuật hỗ trợ sinh sản như thụ tinh trong ống nghiệm (Invitro Fertilization – IVF)
hay tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn (Intra Cytoplasmic Sperm Injection –
ICSI) [117]. Ngồi ra, tổn thương DNA tinh trùng có thể gây ảnh hưởng đến tỷ

lệ thành cơng của các q trình hỗ trợ sinh sản như làm giảm tỷ lệ thụ tinh, giảm
khả năng làm tổ, giảm chất lượng phôi, giảm tỷ lệ thai tiến triển và tỷ lệ trẻ sinh
sống [13]. Trẻ sinh ra từ bố có tinh trùng bị phân mảnh DNA có nguy cơ bị dị tật
bẩm sinh, mắc các bệnh ung thư, giảm khả năng sinh sản và có thể ảnh hưởng
đến nhiều chức năng khác trong cơ thể sau khi trưởng thành [9]. Theo Bungum
và cộng sự (2007), nếu những người chồng có chỉ số DFI của tinh trùng trên
25% thì cặp vợ chồng đó nên được điều trị bằng ICSI để đạt được tỷ lệ thành
công cao nhất. Bungum cũng cho rằng cơ hội mang thai bị giảm đáng kể khi một
cặp

vợ

chồng

tiến

hành

bơm

tinh

trùng

vào

buồng

tử

cung


15
(IntraUterineInsemination – IUI) với chỉ số DFI của người chồng càng gần 30%
và cơ hội gần như bằng không nếu chỉ số DFI vượt quá 30% [25].
1.3.4. Các phương pháp xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng
Năm 2016, một hội đồng bao gồm năm bác sĩ tiết niệu và bác sĩ nội khoa
cùng với chuyên gia về vô sinh nam đã đưa ra khuyến nghị dựa trên bằng chứng
và đưa ra các phương pháp đánh giá sự phân mảnh DNA tinh trùng [6]. Các
phương pháp sử dụng phổ biến hiện nay được trình bày trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Một số phương pháp xác định sự phân mảnh DNA tinh trùng
Tên phương pháp

Nguyên tắc phát hiện

Phương thức đọc kết quả

Acridine Orange
Staining - Nhuộm
acridine orange

Phát hiện sự tổn thương DNA dựa
trên sự bắt màu thuốc nhuộm khác Kính hiển vi huỳnh
nhau giữa DNA mạch đôi và
quang
DNA mạch đơn

TUNEL assay
- Sàng lọc Tunel

Phát hiện sự phân mảnh DNA
nguyên nhân do dứt gãy DNA
mạch đơn và mạch đơi

Alkaline single

Đánh giá mức độ tồn vẹn DNA

cell gel
electrophoresis

tinh trùng dựa vào phát hiện tỷ lệ
DNA đứt gãy mạch đôi hoặc
mạch đơn

(Comet assay) Sàng lọc Comet
Sperm Chromatin
Structure Assay
(SCSA) - Khảo sát
cấu trúc nhiễm sắc
chất tinh trùng
Sperm Chromatin
Dispersion Test
(SCD test)- Test sự
phân tán nhiễm sắc
chất

Kính hiển vi huỳnh quang
hoặc máy phân tích dịng

chảy tế bào (Flow Cytometry
– FCM)

Kính hiển vi huỳnh quang

Biến tính DNA trong mơi trường
axit, nhuộm với Acridine Orange
để đánh giá mức độ tổn thương
DNA

Máy phân tích dịng chảy tế
bào (FCM)

Dựa vào kích thước quầng sáng
DNA tập trung xung quanh phần
đầu tinh trùng để đánh giá tính
tồn vẹn của DNA

Kính hiển vi huỳnh quang
hoặc kính hiển vi quang học


16
Các phương pháp đã được xây dựng thành công trong những năm gần đây
bao gồm: phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng (SCSA),
phương pháp điện di trên cá thể tế bào đơn (COMET), phương pháp nhuộm
acridine orange (AOT), phương pháp đánh dấu đứt gãy DNA bằng các dUTP
được xúc tác bởi enzyme terninal deoxunucleotidyl transferase (TUNEL),
phương pháp dịch mã đứt gãy tại chỗ (ISNT), phương pháp khảo sát sự phân tán
nhiễm sắc chất của tinh trùng (SCD)…[46], [52], [53] (Bảng 1.2). Các phương

pháp thường được sử dụng là phương pháp TUNEL, SCD, và SCSA [80]. Hiện
nay, khảo nghiệm SCSA chỉ có một quy trình được quốc tế chấp nhận, trong khi
các phương pháp khác (TUNEL, COMET, SCD) đều có các quy trình biến thể
riêng phù hợp với khả năng của các phịng thí nghiệm [49]. Trong nghiên cứu
này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh
trùng và phương pháp này được trình bày cụ thể ở phần tiếp theo.
1.3.5. Phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng
1.3.5.1. Nguyên tắc phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh
trùng
Evenson bắt đầu nghiên cứu về cấu trúc nhiễm sắc chất (chromatin) của
động vật có vú vào những năm cuối của thập niên 70. Evenson đã sử dụng kính
hiển vi điện tử truyền qua cho thấy, tinh trùng của người có một lượng lớn
chromatin khơng đồng nhất [43]. Khi so sánh kết quả nhuộm acridine orange
(AO) trên chromatin của người và chuột thơng qua máy phân tích dịng chảy tế
bào đã chứng minh sự không đồng nhất này [44]. Kết quả nghiên cứu cho thấy
sự không đồng nhất này được cho là do các đứt gãy trên sợi DNA, hay còn gọi
là “phân mảnh DNA tinh trùng”. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp khảo sát
cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng (SCSA) chủ yếu dựa vào sự phát màu khác
nhau của AO khi bám lên mạch đôi DNA (dsDNA) hay mạch đơn DNA
(ssDNA). Các phân tử AO kích thước nhỏ, có thể dễ dàng thấm sâu vào
chromatin của tinh trùng. Xử lý mẫu tinh dịch bằng axit làm màng tinh trùng tạo
ra các lỗ nhỏ giúp các phân tử AO đi qua, đồng thời môi trường axit giúp các