XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP điêu CHế CAO KHÔ và PHÂN lập PUERARIN từ sán dây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TÉ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ PHƯƠNG DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIÊU CHÉ
CAO KHÔ VÀ PHẦN LẬP PUERARIN

TỪ SÁN DẦY
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TÉ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ PHƯƠNG DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIÊU CHÉ
CAO KHÔ VÀ PHẦN LẬP PUERARIN

TỪ SÁN DẦY
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGHÀNH:

CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM & BÀO CHÉ THUỐC

MÃ SỐ: 60720402

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Văn Hân

HÀ NỘI - 2014


LỜI CẢM ƠN

Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới thầy giáo TS. Nguyễn Văn Hân, là người đã tận tình hướng dẫn và
giúp đỡ tơi nghiên cứu và hồn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Công
nghiệp Dược

đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi về mọi

mặt trong

quá trình

nghiên cứu hồn thành luận văn.
Tơi cũng xin gửi tới Ban giám hiệu, phòng đảo tạo sau đại học, các thầy

cơ giáo trường Đại học Dược Hà Nội lịng biết ơn về sự quan tâm, giúp đỡ
trong thời gian học tập và nghiên cứu tại trường.

Cuôi cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã
động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, tháng Ø7 năm 2014
Học viên

Phạm Thị Phương Dung


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮÁT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIÊU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐƠ THỊ

0002062) ã000005................... 1
Chương 1. TƠNG QUAN ...............................----©22222ES2EE2E12152212112112112212111111121
12.1. cce. 2
Na.

ca

c7...

........

2

1.1.1.

Đặc điểm thực vật và phân bơ của cây sắn dây...............................---- 2

1.1.2.

Thành phần hóa học của rễ củ sắn dây.............................-----cccccccccccceccce 2

“1...1...

mm

°.

nan...

4

1L. .......................

Ố

1.1.5. _ Các nghiên cứu chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây................................. 6
1.2.

Puerarin...............................-c-csecsS5
2529065065 055900 0900598450160866846008008081604601604 12
ANH °.

1.2.2.

1. 15.15. nố e..............

Tính chất lý hóa........................................-----+7c

E221
cre. 12

5-9,

1... k6.

H18.
1.2.5.

1.3.

12

a8

e6...

Tp. 6n

13

l1... ẽe.......

15

Các nghiên cứu tỉnh chế puerarin hiện nay...........................---©--©ccccccce- 79

Cao thuốc.........................................eeeseerrrEHHHHHH
HH HHHHHgirirrrrrsdee 20

'."“AHx(‹(.rL .. ae...
N..

20

s5. ha e.............

20

1.3.3.

Kỹ thuật điều chẾ..........................................Ă 5522222222221 cee 21

1.3.4.

Các chỉ tiêu chất lượng của cao thuỐc............................----c+ccccccccccccccee 22

Chương 2. NGUYÊN
NGHIÊN CỨU. . . . . . . . . . . . -

2.1.

VẬT

LIỆU, TRANG

THIẾT

BỊ VÀ PHƯƠNG

PHÁP

5° SSSESEE*EE1152112111121121111111
11.11 11111101121 11111 1g 23

Nguyên vật liệu, thiết bị ........................s--<-sces
se asSsE2A9EA9 2362350356 39348 e2 23


PIN

HA.... 1T. h5 e...............

23

"4

MwW*:..Š.ẽn

23

PP

KH... 4.8.

2.2.

se...

.a................

23

Nội dung nghiên CỨU............................
c5. G2 << S3 9.9 9.04 9H 0 00406 044606096 24

2.2.1.

Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu khô...............................---------cecce- 24

2.2.2.

Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu tươi..............................---©--©ccccccce- 24

"5U,

Tra

VN

l6. 0)... .àa 1 ....nne..........

2.3.

L

số

na. ............. 25

25

Phương pháp nghiền CứU........................
<< << < <5Ă< 26 4366 584.5304.530 5804 5894.589 0460466 25

2.3.1.

Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin............ 25

2.3.2.

Phương pháp định tính các isoflavonoid bằng sắc ký lớp mỏng.......... 29

2.3.3...

Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô.........................-. 30

2.3.4...

Phương pháp chiết isoflavonoid từ sắn đây tươi............................---- 30

2.3.5...

Phương pháp tinh chế dịch chiết sắn đây tươi ............................--------- 31

2.3.6.

Phương pháp điêu chế cao khô................................----5ccSccccxscsecserreerseee 32

2.3.7.

Phương pháp phân lập puerarim và dqidšiH.............................-ec
2.3.8.

Phương pháp xác định cấu trúc puerarin và daidsin.........................-. 35

2.3.9...

Phương pháp xác định khối lượng cắn trong dịch chiết...................... 35

2.3.10.. Phương pháp xác định mắt khối lượng do làm khô............................- 36
Chương 3. KÉT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................-2-©22+222SEE2EE2+E22EE22E2EEEEEcEErrec 37
3.1.

Định lượng isoflavonoid tồn phần trong nguyên liệu........................... 37

3.1.1.

Đường chuẩn isoflavonoid...............................--S5c SecceEercrrrereea 37

3.1.2.

Định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu...................................... 38

3.2.

Định lượng puerarin trong nguyên lÏỆU...............................
5-5 <5 55<< ssss<

3.3.

Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô ...........................--5
5 e

3.3.1.

Khảo sát các dung mơi chiẾt................................-----©-scs+cssccscsecsererrrerreccee 40

3.3.2.

Tỉnh chế dịch chiết sắn dây khơ................................---©--+ccSccrecrerrrreereereee 44

3.4.

Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tươi.......................s---s-ec5s
3.4.1.

Chiết isoflavonoid từ sắn đây tươi...............................---©-cccccccceccescesrceee 45

3.4.2.

Tỉnh chế dịch chiết sắn dây tươi...............................----©-c+cxccxcscsecsesreerseee 46

3.5.

Điều chế cao khơ từ dịch chiết sắn dây tươi...........................s-ss-s-sscsses 47

4.6.

Phân lập puerarin và đaÏ(|ZÌN. ...........................
25c << 1< 9. 91 591584404 556 49

“ANH...

1516... n..............

40

SA...

T50)... ..n......................... 53

3.6.2.1. Tiến hàànhh..........................-- -+Ss+-S+ES2EE222212211122122122111111122121112212121 1 xe 53

Chương 4. BÀN LUẬN ............................---22-©222222222222222211221122112211211121112111111
211.11. c..e. 57
4.1.

Về nguyên liệu chiết xuất isoflavonoidd .........................«- s-.sc-sccsessesscssecsee "7

4.2.

Về phương pháp bào chế cao khô ......................-e-s-s
4.3...

Về phương pháp phân lập puerarin và đaidzin.........................--.s--s<

-ss- 5

KÉT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤTT..........................---2©-22©EE+EE2+E+EE2212712211 211.2111121... si. 60
cøn

00 ~...............Ơ

60

2004000007557 .-...................Ơ.Ơơ 6l
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AMPK

3'-adenosine monophosphat-activated protein kinase

ATP

Adenosine triphosphat

cv

Coefficient oŸ variation
(Hệ số phân tán)

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DDVN

Dược điển Việt Nam

ESI - MS

ElectroSpray lonization - Mass spectrometry
(Khối phơ - lon hóa băng phương pháp phun mù điện tử)

GOT

Glutamic oxaloacetic transaminase

HDL

High-density lipoprotein

HPLC

High Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HSCCC

High Speed Counter Current Chromatography
(Sắc ký ngược dòng tốc độ cao)

IL

Interleukin

IR

Infrared
(Hồng ngoại)

LDL

Low-density lipoprotein

LPS

Lipopolysaccharid

mTOR

mammalian Target of Rapamycin
(Đích tác dụng trên động vật có vú của RapamycIn)

MAPK

Mitogen-activated-protein-kinase

NMR

Nuclear magnetic resonanc
(Cộng hưởng từ hạt nhân)

'H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

'C-NMR
PG
RSD

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

Pueraria ølycosid
Relative standard deviation


(Độ lệch chuẩn)

TUC

Thịn Layer Chromatography
(Sắc ký bản mỏng)

TNE

Tumor necrosis factors
(Yếu tố hoại tử khối u)

UV

Ultraviolet
(Tử ngoại)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIÊU
Bảng 1.1. Công thức cầu tạo của một số isoflavonoid thường gặp trong sẵn dây......3
Bảng 1.2. So sánh ba phương pháp chiết xuất sắn dây thường dùng............................-- 9
050982091 ï8 i0

0 n

...

.. ...AŒH.HH...

23

Bảng 3.1. Mật độ quang của dãy dung dịch chất đối chiếu tại bước sóng 250 nm. .37
Bảng 3.2. Kết quả định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu.............................--.-- 39
Bảng 3.3. Diện tích pic sắc ký của đãy dung dịch chuân.............................--22 5555- 39
Bảng 3.4. Hàm lượng puerarin trong nguyên liệu thu mua ở Phú Thọ........................ 40
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát các dung mơi ethanol có nồng độ khác nhau................. 41
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát chiết isoflavonoid từ sắn dây khô bằng dung môi nước
. 1 T11 11 110111111 TT TH HT HT

Tà HH HT

TH TH TH TT TH TH TT

TT

Tà nh 43

Bảng 3.7. Kết quả tinh chế địch chiết sắn đây khơ..............................-2-52 ©5222x+2xs2cse2 44
Bảng 3.8. Kết quả chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi..........................---2-©2257xcccsccsec 45
Bảng 3.9. Hiệu suất và hàm lượng cao đặc sau tinh chế (thu được từ 500 ml dịch

chiết, tương ứng khoảng 150 ø được liệu) ..........................-2 2+ s¿+22+2++2x++zxzzxezxxzscee 46
Bảng 3.10. Dịch tỉnh chế đem vào phun sấy..........................-.-- 2-©52©5222S+22£22S22xzzxxz+scee 47
Bảng 3.11. Một số chỉ tiêu chất lượng của cao khô phun sấy........................--------- 48
Bảng 3.12. Kết quả đo phố hồng ngoại của daidzin .........................--2--52552-55255s
55552 51

Bảng 3.13. Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) của đaiđzin.............................---5- 52
Bảng 3.14. Kết quả đo phô NMR của daidzin..........................5-552522525222S22xszzssscee 52
Bảng 3.15. Kết quả đo phố hồng ngoại của puerarin..........................---2-©2+©5222++2s++55+2 354
Bảng 3.16. Kết quả đo phố khối lượng (ESI-MS) của puerarin..............................- 354
Bảng 3.17. Kết quả đo phô NMR của puerarin........................-2-52 ©5222s+22£+2x22xzzxxzscee 35


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐƠ THỊ
20 0N)

0 -‹£‹-ädjăx,,).....HH.....,.. 2

Hình 2.1. Sơ đồ chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi...........................----2--5¿©2z+cx+2xescse¿ 31
Hình 2.2. Quy trình điều chế cao khơ...........................--- 2-22 ©222©x2+EE+2E22EE2EE2EESExecresrxee 34

Hình 3.1. Phổ UV-VIS của dung dịch chất đối chiếu........................------2-5555+555+¿ 37
Hình 3.2. Đường chuẩn biêu thị mối tương quan giữa nồng độ puerarin và mật độ
50

5.

............................ 38

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ puerarin và diện tích pic
SẮC KẾ...

HH TH HH TH HT TH HH TT To TH TH

TT TH TH

TT ng ch 40

Hình 3.4. Biêu đồ so sánh lượng isoflavonoid chiết được bởi các dung mơi ethanol
S00

0410.

NN.

.......(AAgH..HH...

42

Hình 3.5. Bột cao khơ phun sấy..........................--2-5 55222S22SE22E223223E2212221221212221 221. 2.Xe2 48
Hình 3.6. Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254 nm của dịch chiết.......49
Hình 3.7. Quy trình phân lập daldzim và puerarIn..........................
.-- --- 5 55s5ssss+ses+exsesss+ 50
Hình 3.8. Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm của đaidzin............ 31
Hình 3.9. Cơng thức cấu tạo của đaiđzin.........................----2©252©2222++2x2E2EEezExsrkerrerrkee 5

Hình 3.10. Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm của puerarin........ 33
Hình 3.11. Cơng thức cấu tạo của puerarin......................------¿-s2sz+z++2x+2xxszxezxerrerrseee 35


ĐẶT VẤN ĐỀ
Sắẵn dây từ lâu đã được sử dụng trong dân gian. Theo y học cô truyền, rễ sắn
dây là một vị thuốc mát, có tác dụng giải nhiệt, sinh tân, chống khát, làm ra mô hôi,
dễ tiêu, chỉ tả, chữa các chứng sốt nóng, nhức đầu, mân ngửa, rôm sảy, viêm ruột,

đau đạ dày... Gần đây trên thê giới đã có khá nhiều cơng trình khoa học chứng minh
tác dụng của dịch chiết rễ sắn dây: chữa đau đầu [34]. chống oxy hóa [9], [13], giải

rượu [23]. Thành phần isoflavonoid trong rễ được cho là chất có tác dụng. Trong số
các isoflavonoid sẵn dây, puerarin là chất có hàm lượng lớn và được cho là thành
phần có tác dụng chủ đạo. Hiện nay ở Trung Quốc puerarin đã được chiết xuất và
phân lập thành công từ rễ sắn dây phục vụ cho cho việc bào chế các dạng thuốc quy
ước (viên nén, viên nang, thuốc tiêm) đê chữa bệnh.

Tại Việt Nam, sẵn dây được trồng khá phổ biến nhưng chủ yếu nhằm chế
tỉnh bột. Vai trò của sắn dây trong chiết xuất isoflavonoid chưa được quan tâm đầy
đủ. Hiện nay, isoflavonoid nguyên liệu và puerarin vẫn phải nhập chủ yêu từ Trung

Quốc với giá thành cao. Vì vậy nếu có thể nghiên cứu chiết xuất thành cơng
isoflavonoid và puerarin từ rễ củ sẵn dây song song với việc chế tinh bột có thê giúp
chủ động về nguồn nguyên liệu isoflavonoid cũng như puerarin trong sản xuất và
tận dụng được phế phâm của quá trình sản xuất tinh bột sắn.
Nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ rễ sắn dây

phù hợp với điều kiện thực tiễn ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Xây dựng phương pháp điều chế cao khô và phân lập puerarin từ sắn dây”

với hai mục tiêu chính sau:

1.

Xây dựng quy trình điều chế cao khơ phun sấy từ rễ củ sắn dây.

2.

Phân lập được puerarin từ rễ củ sắn dây.


Chương 1. TỎNG QUAN
1.1.

Vài nét về cây sắn dây

1IL.I. Dặc điểm thực vật và phân bố của cây sắn dây
Sẵắn dây có tên khoa học là Pưeraria
Benth., họ Đậu — Fabaceae.
ghỉ

loài

Pueraria

lobafta

pseudohirsufa Tang et Wang

ghi

nhận

cả

hai

loài

Một

thomsomii

số tài liệu Trung

(WIHd)

Ohwil

Quốc

hoặc

P.

[3]. Dược điển Trung Quốc

Pueraria

lobata

và

Pueraria

thomsonii [32].

Sắẵn dây là một loại dây leo, dài có thê đến 10m, lá
kép gồm ba lá chét. Cuống lá chét giữa dài, cuống lá chét

I
Hình 1.1. Sẵn dây

hai bên ngắn. Lá chét có thể phân thành 2-3 thùy. Về mùa
hạ trổ hoa màu xanh tím, mọc thành chùm ở kẽ lá. Quả loại đậu có nhiều lơng. Củ
đài to nặng có thể tới 20kg, nhiều xơ.

Muốn trồng người ta đào các hỗ sâu 50cm, đồ rác và mùn rồi lấp đất xóp lại.
Đến tháng 1-2 giâm cành vào các hỗ đó. Nhiều nơi ở nước ta thường kết hợp làm
giàn lấy bóng mát. Cũng có những vùng chuyên trồng để chế tinh bột ví dụ làng
Cao Xá thuộc huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh mỗi năm sản xuất khoảng 20 tấn
tĩnh bột [3].
Rễ củ thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 3-4 năm sau. Ở Trung Quốc, người ta
thường thu hoạch sắn dây vào mùa thu và mùa đông [32]. Đề chế vị Cát Căn thì rửa

sạch, bóc bỏ lớp vỏ dày bên ngoài, cắt thành khúc dài 10-15 cm. Nếu củ to thì bổ
dọc đê có những thanh dày khoảng Icm, sau đó xơng diêm sinh rồi phơi hoặc sấy
khơ. Loại trắng ít xơ là loại tốt. Muốn chế tỉnh bột sắn dây thì bóc vỏ, đem giã nhỏ

hoặc mài trên tắm sắt tây có đục thủng lỗ, hoặc xay bằng máy, cho thêm nước rồi

nhào lọc qua rây thưa, loại bã, sau đó lọc lại 1 lần nữa qua rây dày hơn, để lắng gạn
lây tinh bột rồi đem phơi hoặc sây khơ [3].

112.

Thành phần hóa học của rỄ củ sẵn dây
Rễ củ các loài Pueraria đều chứa tinh bột, tỷ lệ khoảng

đến 40%

theo khơ

[4]. Ngồi ra cịn có saponin

12-15% theo tươi [3]

[4], [20] và các flavonoid thuộc


nhóm

isoflavonoid.

Từ

lồi Pueraria

lobafa

người

ta đã phân

lập

được

1soflavonoid sau: puerarin (l), daidzin (2), daidzein (3), formonetin (4). Năm

các
1987

các nhà nghiên cứu Nhật đã phát hiện thêm 13 chất mới, trong đó có genistein và
các glycosid của daidzein, genistein [20]. Các nghiên cứu sau này đều chỉ ra rằng
puerarin, daidzin, daidzein, genistein và genistin là các isoflavonoid chiếm tỷ lệ lớn
trong rễ củ các loài sẵn dây, và cho các tác dụng sinh học đáng chú ý [46], [11],

[37].

RI

R2

R3

R4

Puerarin

H

H

lu

OH

Daidzin

H

lu

H

OH

Daidzein

H

H

H

OH

Genistein

OH

H

H

OH

Genistin

OH

lu

H

OH

Bảng 1.1. Công thức cấu tạo của một số isoflavonoid thường sặp trong sắn dây
Tính đến thời điểm hiện tại, người ta đã tìm ra khoảng 52 flavone từ các lồi
Pueraria [44]. Trong đó Pueraria lobafa là lồi có hàm lượng flavones cao nhất và
có nhiều flavones được phân lập nhất (36 chất) [44].

Hàm lượng isoflavone trong rễ củ sẵn dây phụ thuộc nhiều vào loài, vùng
trồng trọt [44] và thời gian thu hái [11]. Hàm

lượng flavone trung bình ở lồi

Pueraria lobafa là 7,125 trong khi hàm lượng flavone trung bình ở lồi Pueraria
thomsornii chỉ có 0,93%

[44]. Hàm

lượng flavone ở loài Pueraria lobata trồng tại

Shanxi lên tới 10,4% trong khi hàm lượng này khi trồng tại Jiangxi chỉ đạt 3,3%

[44]. Tuôi và thời gian thu hái cũng là yêu tổ ảnh hưởng đáng kê tới hàm lượng
isoflavone của loài Pueraria lobafa trồng tại Huoshan. Rễ củ 3 năm tuôi thu hái vào
khoảng tháng Giêng sẽ cho nồng độ isoflavone cao nhất, đạt 7,26%. Tuổi cao hơn


hoặc thời gian thu hái trước tháng Giêng đều làm giảm nồng độ isoflavone của sẵn
đây [11].
1.1.3.
1.1.3.1.

Tác dụng dược lý
Tác dụng trên tìm mạch

Thử nghiệm tác dụng trên chó bằng cách tiêm flavon tồn phần của sắn dây
cho thấy có tác dụng giãn động mạch vành đồng thời giảm lượng tiêu thụ oxy của
cơ tim và giảm sức kháng mạch vành. Trên chó đã dùng reserpin trước đó đề làm
tiêu kiệt hết lượng catecholamin trong mơ tim, dạng isoflavon tồn phần với liều 30
mg/kg và puerain với liều 20 mg/kg có tác dụng làm tăng lưu lượng mạch vành và
giảm sức kháng mạch vành. Những kết quả này giống với kết quả thí nghiệm trên
chó khơng dùng reserpin. Điều này chứng tỏ hiện tượng làm giãn mạch vành của
sắn dây không liên quan tới catecholamin mà là do tác dụng giãn cơ trực tiếp [8].
1.1.3.2. Tác dụng hạ huyết áp của cao sắn dây
Tiêm tĩnh mạch với liều 5-30 mg trên chó, mèo có tác dụng hạ huyết áp. Cao

sẵn dây với liều 750 mg/kg tiêm tĩnh mạch có khả năng đối kháng với tác dụng kích
thích tim của isoprenalin, ngồi ra cịn làm giảm nhịp tim và gây hạ huyết áp [8].
1.1.3.3. Tác dụng chống loạn nhịp tìm
So sánh tác dụng chống loạn nhịp tim của puerarin, daidzein và dạng chiết
cồn từ sắn dây trên chuột cống trắng và chuột nhắt trắng cho thấy tác dụng của
daidzein tương đối mạnh, cho hiệu quả rõ rệt. Dạng chiết cồn có tác dụng giống với
daidzein; điều này chứng tỏ daidzein là thành phần chủ yêu có tác dụng chống loạn
nhịp tim. Puerarin với liều tương đương có tác dụng kháng rõ rệt với loạn nhịp tim
do aconitin và bari clorid gây nên, giảm nhẹ mức độ loạn nhịp do thiếu máu cơ tim,
tác dụng đối kháng với rung thất không bằng daidzein [8].
1.1.3.4. Tác dụng đối với tuần hoàn não
Thử nghiệm trên chó gây mê, flavon tồn phần của sắn dây bằng đường tiêm
động mạch cảnh với liều 0,1-5.0 mg/kg làm lưu lượng máu qua não tăng §7,7134%, nêu cho thuốc bằng đường tiêm tĩnh mạch flavon toàn phần với liều 10-30
mg/kg chỉ làm lưu lượng máu qua não tăng 20%. Trên bệnh nhân cao huyết áp,


flavon toàn phần tiêm bắp với liều 200 mg giúp cái thiện tuần hoàn não cho 53%
bệnh nhân, làm giảm trợ lực mạch máu não [8].

1.1.3.5. Tác dụng đối với hệ thần kinh
Dịch chiết sẵn dây với liều 2 ø/kg cho thẳng vào đạ dày trên thỏ gây sốt bằng
vaccin thương hàn có tác dụng hạ nhiệt, bột sắn dây có tác dụng tương tự. Nước sắn

dây với liều 6 g/kg cho thăng vào đạ dày trên chuột nhắt trắng, có tác dụng cải thiện
hiện tượng trí nhớ bị tơn thương do scopolamin gây nên [8].
1.1.3.6. Tác dụng đôi với cơ trơn
Trong các dịch chiết bằng aceton, methanol và nước từ sẵn dây thì dạng
PA3, PA4 có tác dụng ức chế co bóp hồi tràng cơ lập chuột lang kiểu papaverin,
dạng PMI, PM3 lại có tác dụng gây co thắt. Daidzein có tác dụng giải co thắt đối
với ruột non đã cô lập của chuột nhất trắng, tác dụng này bằng khoảng 1/3 tác dụng

của papaverin [8].
1.1.3.7. Tác dung hạ đường huyết và lipid huyết
Nước sắc sắn dây với liều 6-§ g/kg cho thăng vào dạ dày thỏ bình thường có
tác dụng hạ đường huyết nhưng khơng thê đối kháng với hiện tượng đường huyết
tăng cao do adrenalin gây nên. Puerain với liều 500 mg/kg hoặc dùng liều thấp phối
hợp với aspirin 100 mg/kg dùng liên tục trong 9 ngày qua đường dạ dày, có tác
dụng làm giảm cholesterol huyết thanh của chuột nhất trắng đã được gây tăng
cholesterol bằng alloxan. Aspirin dùng đơn độc khơng có tác dụng hạ đường huyết

hay lipid huyết [8].
1.1.3.8. Tác dụng chống ung thư

Dịch chiết cồn từ sẵn dây với liều 10 g/kg trên động vật thí nghiệm có tác
dụng ức chế nhất định sự phát triển của tế bào sarcom 180, u báng Ehrlich và tế bào

ung thư phổi Lewis. Daidzein với nồng độ I4ug/ml có tác dụng ức chế sự tăng
trưởng của tế bào ung thư máu HL-60 (promyeloeytic leukemia) [§].
1.1.3.9. Tác dụng chống oxy hóa
Thí

nghiệm

trên

chuột

gây

tiểu

đường

bằng

cách

tiêm

phúc

mạc

strep(tozotocin. Thí nghiệm sử dụng cao sắn dây chứa khoảng 10,42% puerarin và
một vài chất liên quan, với liều 500 mpg/kg, dùng đường uống trong 3 tuần, kết quả


cho thấy nồng độ malondialdehyd trong huyết tương-được sử dụng như một dấu
hiệu của chất béo bị oxy hóa, đã giảm xuống mức tương tự như ở chuột khỏe mạnh,

và giống như trong nhóm được điều trị tích cực hàng ngày bằng tocopherol acetat

với liều 50 mg/kg [8],[9].
1.1.3.10. Các tác dụng khác:
Dung dịch puerarin 0,2-1,6% với liều 0,2 ml tiêm dưới da chuột lang theo
dõi phản ứng giác mạc và da cho thấy tác dụng gây mê cục bộ. Thí nghiệm trên
chuột hamster, cao sắn dây có tác dụng chống nghiện rượu, trên chuột cơng trắng,
daidzein có tác dụng hạ thấp lượng rượu trong máu và rút ngắn thời gian ngủ do
rượu

gây

nên.

Đối

với gan

của chuột

nhắt trắng

gây

nhiễm

độc bằng

CCI¿,

isoflavonoid chiết từ cát căn với liều 250 mg/kg có tác dụng ức chế 30,7% hoạt độ
men GƠT

[8].

Nghiên cứu của Đỗ Thị Hoa Viên đã chứng minh rằng cao chiết isoflavonoid
từ củ sắn dây Pưeraria thomsonii Benth. có hoạt tính nội tiết kiểu estrogen trên
51,5% chuột nhắt trắng cái với liều uống 150 mg/con/ngày. Điều này cho thấy hoạt
tính estrogen của hỗn hợp 1soflavonoid chiết xuất từ củ sắn dây là khá rõ rệt [7].

1.1.4.

Công dụng
Theo y học cô truyền, cát căn là một vị thuốc chữa sốt nhức đầu, khát nước,

kiết ly, ban sởi. Cát căn đã được phi vào dược điên Việt Nam. Tinh bột sẵn dây pha

với nước thêm đường uống để giải khát [3]. Ngồi ra trong y học cơ truyền còn
dùng hoa của dây sắn dây với tên “Cát hoa” để làm thuốc giã rượu [3].
Theo Dược điền Trung Quốc, sắn dây có tác dụng hạ sốt, kích thích tiết dịch

cơ thể, cầm ia chảy. Do vậy, sắn dây được sử dụng để điều trị sốt, đau đầu, khát
nước, tiêu đường, ban sởi, kiết ly hoặc ia chảy cấp, cứng gáy và đau trong tăng

huyết áp [32].
1.1.5.
1.1.5.1.

Các nghiên cứu chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây
Chiết kiểu truyên thông

Mặc dù với sự phát triển của khoa học kỹ thuật hiện đại đã có rất nhiều
phương pháp chiết hiệu quả được đưa vào ứng dụng nhưng chiết xuất theo kiêu


truyền thống vẫn được nghĩ đến đầu tiên khi nghiên cứu về các dược liệu mới.
Chỉ có hiểu rõ đặc điểm chiết các dược liệu này theo phương pháp hồi lưu đơn
giản mới có thể áp dụng các biện pháp cải tiến để nâng cao hiệu suất cũng như
chất lượng sản phẩm chiết. Cũng vì thế, trong rất nhiều nghiên cứu chiết sẵn dây
đã được thực hiện trên thế giới, phương pháp chiết hồi lưu vẫn được các nhà khoa
học quan tâm thực hiện. Mục

tiêu của các nghiên cứu này hầu hết là đề tìm ra

được loại dung mơi, nhiệt độ, thời gian...

tối ưu cho việc chiết isoflavonoid từ

sẵn dây.
Ngay từ năm 1998, L¡ Wehong và cộng sự đã xác định được giữa hai dung

môi nước và cồn, dung môi cồn cho hiệu suất chiết cao hơn và dễ tinh chế sản
phâm hơn. Cũng từ đó, nhóm nguyên cứu đã tìm ra được điều kiện chiết xuất tối
ưu cho sắn dây là chiết bằng ethanol 60% trong 6 giờ ở 60°C [25].
Đến

năm

2007,

Han

lian

và

cộng

sự

vẫn

tiếp

tục

nghiên

cứu

chiết

isoflavonoid từ sẵn dây bằng phương pháp truyền thống nhưng sử dụng dung môi
chiết là nước. Mặc dù không phải là một dung môi được đánh giá cao trong nhiều
nghiên cứu song nếu tiến hành theo phương pháp của Han Jian vẫn có thể chiết
được lượng lớn puerarin từ sắn dây. Chiết nước ở điều kiện tối ưu là chiết 2 lần,

mỗi lần với 10 lần thê tích nước, thời gian chiết lần lượt là 1,5 giờ và 1 giờ [14].
Đề nâng cao hiệu suất chiết người ta đã tiến hành thay đôi dung môi chiết,
sử dụng hệ dung mơi thay vì các dung mơi đơn thơng thường. Đáng kê đến là
chuỗi nghiên cứu của Hua-Neng Xu và cộng sự. Đầu tiên, nhóm nghiên cứu đã
tìm ra hệ dung môi hai pha n-butanol/nước ty lệ 1:1 (v/v) không những dùng
được cho quá trình chiết rắn — lỏng và tỉnh chế lỏng-lỏng mà cịn giúp chiết được
daidzein và isoflavonoid tồn phân với hiệu suất cao hơn nhiều so với dung môi

chiết một pha thông thường [15]. Với hệ dung môi hai pha như trên, daidzein dễ
đàng được tách và tính chế từ pha n-butanol [15]. Puerarin được tính chế từ phần

pha nước bằng cách điều chỉnh pH và lắc với n-butanol. Quá trình tinh chế tương
đối đơn giản nhưng lại cho ra sản phâm

tinh chế sạch khi phân tích sắc ký [16].

Với những kết quả thu được, các tác giả đã tiễn hành tiếp những đánh giá toàn
diện hơn về các u tơ có thê ảnh hưởng đên q trình chiết isoflavonoid từ sẵn


dây bằng hệ dung môi hai pha n-butanol/nước. Cuối cùng, rút ra những kết luận
như sau: thành phần của hệ dung môi hai pha và nhiệt độ chiết là những yếu tố
chính ảnh hưởng tới tốc độ và hiệu suất chiết isoflavonoid tồn phần; hệ dung

mơi n-butanol/nước với tỷ lệ 1:1 là có hiệu quả hơn cả; hiệu suất chiết và hệ số
phân bố tăng lên ở tất cả các hệ dung môi đã khảo sát khi tăng nhiệt độ; những
kết quả tính tốn được từ mơ hình là hồn toàn phù hợp với dữ liệu thực nghiệm

[171.
Tại Việt Nam,

năm

2009

Dược

sĩ Lê

Thùy

Linh

đã nghiên

cứu

chiết

isoflavonoid từ sắn dây bằng dung môi phân cực theo phương pháp chiết hồi lưu.
Khảo sát ba dung môi chiết là ethanol 90°, methanol và ethyl acetat. Dựa vào tỷ
lệ phần trăm hàm lượng cắn thu được và kết quả định tính isoflavonoid trong dịch

chiết tác giả chọn ethanol 90° là dung môi sử dụng để chiết isoflavonoid từ sắn
dây [5].

1.1.5.2. Chiết dưới áp suất cao
So với phương pháp chiết hồi lưu, chiết dưới áp suất cao cho hiệu suất
chiết cao hơn hắn. Khi sử dụng cùng dung môi chiết là ethanol 95%, chiết dưới
áp suất cao giúp chiết được lượng puerarin cao gấp 1,8 - 2,4 lần, lượng daidzin
cao gấp 1,4 — 1,8 lần và lượng daidzein cao gấp 2,6 — 3,7 lần so với phương pháp

hồi lưu [31].
Người ta cũng nhận thấy rằng, hiệu suất chiết isoflavonoid phụ thuộc vào

nhiệt độ chiết khi chiết dưới áp suất cao. Hiệu suất chiết tăng khi tăng nhiệt độ
[31].

1.1.5.3. Chiết bằng siêu âm
Khi so sánh phương

pháp chiết bằng

siêu âm với phương

pháp

chiết

truyền thống, Yang Hu và cộng sự nhận thấy rằng sử dụng siêu âm có thê rút
ngắn thời gian chiết xuống 20 lần so với phương pháp chiết hồi lưu. Hiệu suất
chiết của phương pháp chiết bằng siêu âm đạt 19% sau 20 phút, trong khi hiệu
suất chiết của phương pháp chiết hồi lưu chỉ đạt được 14,3% và 16,5% sau 1 và 2
giờ. Chiết bằng siêu âm đạt được hiệu suất này sau 5 phút. Mặt khác, siêu âm
không làm phân hủy tới các thành phần hoạt chất có trong dịch chiết [45].


Cũng trong nghiên cứu này, Yang Hu và cộng sự đã chứng minh rằng,

hiệu suất chiết khi sử dụng siêu âm bị ảnh hưởng bởi dung môi chiết [45], tỷ lệ
dung

môi

và năng

lượng

siêu

âm

[31].

Trong

các dung

môi

chiết:

nước,

methanol, ethanol và ethyl acetat người ta nhận thấy dung môi chiết tối ưu là
ethanol : nước tỷ lệ 7:3. Mặc dù nước là dung môi chiết cho hiệu suất cao nhưng
lại hòa tan nhiều tinh bột trong dịch chiết gây khó khăn cho q trình lọc, dịch
chiết thu được khơng trong và cao dẻo dính khó thu hồi [45].

Khơng chỉ có hiệu quả hơn phương pháp chiết hồi lưu truyền thống, MeiHwa và cộng sự còn chứng minh được rằng, chiết bằng siêu âm còn cho hiệu suất
chiết cao hơn phương pháp chiết dưới áp suất cao [31]. Dưới đây là bảng so sánh
ba phương pháp chiết hồi lưu truyền thống, áp suất cao và siêu âm:
Bảng 1.2. So sánh ba phương pháp chiết xuất sắn dây thường dùng
Yếu tố

Truyền thống |

Dưới áp suất cao

Thời gian chiết | Tốn thời gian | Ngắn (< l giờ)

Siêu âm

Trung bình (1-2h)

Hiệu suất chiết | Thấp

Trung bình hoặc cao | Cao

Dung mơi

Tộ n nhiều áp suất cao

Trung bình

Cao

Trung bình

Tốn kém

Chỉ phí
Năm

Thấp
2007,

Xu

Huaneng

và

cộng

sự

đã

tiến

hành

nghiên

cứu

chiết

isoflavonoid từ rễ Pweraria lobafa bằng siêu âm (20kHz, điện năng đầu vào thay

đôi từ 0-650W). Tác giả nhận thấy điện năng đầu vào và thời gian chiết là các
yêu tố chính ảnh hưởng tới hiệu suất chiết khi sử dụng dung môi chiết là nước, nbutanol, ethanol 96% và ethanol 50%. Dung môi chiết là ethanol 50% và nước

cho hiệu suất chiết cao ethanol 95% và n-butanol. Tốc độ chiết và hiệu suất chiết
tăng lên rõ rệt khi phối hợp thêm siêu âm với tất cả các dung môi chiết kể trên.
Năng lượng điện đầu vào càng lớn trong khoảng 0-650W thì hiệu suất chiết đạt


được

càng

cao.

Đồng

thời,

nghiên

cứu

cũng

chỉ

ra rằng

hiệu

suất

chiết

1sofÏavonoid toàn phần cao hơn khi sử dụng siêu âm [41].

1.1.5.4. Chiết bằng vi sóng
Năm 2001, Zhenku €uo và cộng sự

đã tiễn hành chiết isoflavonoid từ sắn

dây bằng vi sóng. Kết quả gây bất ngờ khi thời gian chiết của phương pháp chỉ
kéo dài 1 phút, ngắn hơn rất nhiều so với các phương pháp chiết truyền thống.

Nhóm nghiên cứu cũng nhận thấy rằng dung môi chiết, thời gian chiết, nhiệt độ
và áp suất chiết là những

yếu tổ ảnh hưởng

đáng kế tới hiệu suất chiết của

phương pháp. Trong số các dung môi thử nghiệm, ethanol 70% cho là dung môi
hiệu suất chiết isoflavonoid cao nhất, song đề chiết puerarin thì nước lại là dung

mơi tốt hơn [47].
Vi sóng khơng chỉ giúp rút ngắn thời gian chiết mà còn làm cho q trình cơ
cao trở nên nhanh chóng hơn rất nhiều. Yang Hu và cộng sự đã chứng minh được

rằng, sử dụng vi sóng có thê rút ngắn thời gian sấy khô dịch chiết xuống 10 lần
so với phương pháp cất thu hồi dung môi thông thường [45]. Hơn nữa, sóng viba
khơng gây ra những tác động nào làm ảnh hưởng tới cấu trúc và thành phần các
chất trong dịch chiết sắn đây thu được [45].

1.1.5.5. Chiết bằng dung môi siêu tới hạn
Trong những năm gần đây chiết xuất bằng dung môi tới hạn đã được áp dụng
rộng rãi trong thực phâm và y học. CO

siêu tới hạn là dung môi chủ yếu được sử

dụng trong phương pháp này. Ưu điểm của CO; siêu tới hạn là không độc, không
gây cháy nô, giá thành rẻ và đễ loại khỏi sản phẩm cuối.
Nghiên cứu chiết puerarin từ rễ củ sắn dây Peraria lobara, Lingzhao Wang
và cộng sự nhận thấy bốn yếu tơ chính ảnh hưởng tới hiệu suất chiết puerarin từ

tễ củ Pueraria lobara là áp suất, nhiệt độ, thời gian chiết và thể tích đồng dung
mơi. Ở áp suất 20 Mpa hiệu suất chiết đạt được là 5,8 + 0,3 mg/ø, áp suất cao hơn
và thấp hơn đều làm giảm hiệu suất chiết puerarin. Tương tự như vậy, chiết ở

nhiệt độ 50°C sẽ cho hiệu suất chiết cao nhất, nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn đều
làm giảm hiệu suất. Thời gian chiết càng lớn, khả năng chiết kiệt puerarin càng
cao, đặc biệt là trong khoảng thời gian dưới 100 phút. Hiệu suất chiết puerarin
10


tăng lên không rõ rệt khi kéo dài thời gian hơn 100 phút. Điều này có thê giải
thích do độ tan của puerarin trong dung môi tới hạn và tốc độ chuyên khối đều là
các yếu tốt phụ thuộc vào thời gian. Do vậy, thời gian chiết xuất càng lớn sẽ giúp
hịa tan được nhiều dược chất vào dung mơi chiết hơn, và do đó tăng hiệu suất

chiết lên. Đồng dung môi được sử dụng là ethanol tuyệt đối. Người ta thấy rằng
hiệu suất chiết puerarin sẽ đạt giá trị tối đa khi thêm một lượng xác định ethanol

(120 g) [26].
Từ những kết quả kề trên, các tác giả đã thực hiện tối ưu hóa và tìm được

điều kiện chiết puerarin tối ưu từ rễ củ P„eraria lobafa bằng dung mơi siêu tới

hạn ở 20,04 Mpa, 50,24°C và thể tích đồng dung môi sử dụng là 181,24 ml
ethanol trong tổng khoảng thời gian chiết là 90 phút [27].
1.1.5.6. Chiết bằng dung mơi ion
Dung mơi ion lỏng là dạng muối nóng chảy do trong thành của nó có cả
cation và anion ở dạng không phân ly. Phần cation thường là các cation hữu cơ
[381].
Dung mơi ion lỏng có nhiệt độ nóng chảy khá thấp, thường là dưới 100°C và

thường ở dạng lỏng ở nhiệt độ phòng [38].
Trong chiết xuất hiện đại, dung môi ion lỏng được sử dụng thay thế cho các
dung mơi hữu cơ thơng thường nhờ tính chọn lọc cao hơn các dung môi phân cực
như nước, methanol; chiết được các phân tử hữu cơ phức tạp như cyclodextrins,
glycolipid, kháng sinh, artermisinin và alkaloid ...: dễ dàng rửa sạch hoặc loại đi
khỏi sản phâm chiết cuối [38].

Tuy nhiên, dung mơi ion lỏng có nhược điểm là trong q trình chiết xuất,
một lượng lớn dung môi ion lỏng ky nước có thể bị lẫn nước tạo thành hệ hai pha
dung môi ion/nước làm thay đổi độ nhớt, tỷ trọng, giảm dung lượng chiết và tính
chọn lọc của dung mơi trong quá trình chiết [18], [ 38]. Đề hạn chế nhược điểm
này, Jie-Ping Pan và cộng sự đã tạo ra các hệ dung môi hai pha thân nước đề
chiết puerarin từ rễ Pweraria lobafae từ các dung môi ion 1-carboxymethyl-3methylimidazolium
methylimdazioliun

tertrafluoroborat

([COOHMIMI]BE¿),

tertrafluoroborat

11

([CaOHMIM|

1-hydroxyethyl-3BE¿),

1-butyl-3-

methylimidazolium
bromua ([BMIM]Br)

hydroxid

({BMIM]OH)

và

1-butyl-3-methylimidazolium

với các muối vô cơ KạCOa, Na;COa, K;HPO,, (NH/);SO¿,

Na;SO¿,

NaCL,

NaH;POx.

K;HPO¿

0,30-0,42 g/mL,

Trong

các

[BMIM|Br

hệ hai pha

0,30-0,36

dung

môi

lon khảo

g/ml và 1,0 mÏl dung

sát, hệ
dịch gốc

puerarin, cho hiệu suất chiết puerarin cao nhất đạt trên hơn 99% với một lần chiết

duy nhất [18].
Lợi dụng ưu điểm của phương pháp chiết bằng siêu âm và phương pháp
chiết bằng dung môi ion, Jie-Ping Pan và cộng sự tiếp tục nghiên cứu chiết
puerarin từ rễ củ sấy khô Pweraria
[BMIMJ|BE¿,

[CạOHMIMICI,

lobata với các dung môi ion [BMIMI]Br,

[C:OHMIM]BE¿,

[COOHMIM]|BE¿ kèm siêu âm.

Sử dụng phương pháp phân tích mặt đáp để đánh giá các yêu tô ảnh hưởng tới

hiệu suất chiết puerarin và tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất. Kết quả chiết xuất
tối ưu thu được với 0,43g dược liệu trong 10ml dung môi ion [BMIM]Br

1,06

mol/L, siêu âm trong 27,43 phút ở 480W [19].
1.2.

Puerarin

1.2.1.

Cơng thức hóa học

—_

Cơng thức phân tứ [33]: C›¡H›sỊo

—_

Tên khoa

học:

7-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-8-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,

5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl |chromen-4-one [33]
—_

Tên khác: Kakonein, 3681-99-0, 8-(beta-D-Glucopyranosyl-7-hydroxy-3(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one,AC1NQZAN,

SureCN8581666, MLS002473178 [33].

12.2. Tính chất lý hóa

12


1.2.2.1.

Lý tính: Puerarin là một isoflavonoid tự nhiên, được tìm thấy trong rễ

sẵn dây Pueraria lobata và Pueraria thomsonii. Về độ tan, puerarin:
—_

͆ tan trong nước, aceton, độ tan trong nước tăng lên khi tăng nhiệt độ
[39].

—

Tan được trong ethanol, độ tan giảm khi tăng nhiệt độ [39]. Khi thêm một
lượng nhỏ dung dịch CO; siêu tới hạn vào dung dịch ethanol sẽ làm tăng

độ tan của puerarm. Song khi vượt qua giới hạn này, việc thêm CO; siêu
tới hạn lại làm độ tan của puerarin giảm mạnh

[28]. Độ tan của puerarin

trong hỗn hợp ethanol + CO: siêu tới hạn tăng lên khi tăng nhiệt độ [28]
—_

Tan được trong hỗn hợp

methanol — acid acetic, độ tan phụ thuộc vào

nhiệt độ và tỷ lệ của acid acetic trong hỗn hợp. Tăng nhiệt độ làm tăng độ
tan, ngược lại tăng thê tích acid acetic trong hỗn hợp làm giảm độ tan của
puerarin trong hỗn hợp dung mơi [ 12].
1.2.2.2.

Hóa tính: Do cấu trúc phân tử của puerarin có một nhóm carbonyl

(=C=O) và 6 nhóm hydroxyl (—OH) trong đó có 2 nhóm hydroxyl phenol
nên puerarin có thể
—

Tạo liên kết hydro với các hợp chất có nhóm carbonyl và hydroxyl
khác

— _ Thể hiện tính acid của 2 nhóm —OH phenol
Vì vậy, puerarIn có thê tan trong các dung dịch kiềm và acid mạnh [18].

1.2.3.

Kỹ thuật phân tích
Năm 2007, để xác định hàm lượng isoflavonoid

tồn phần

trong rễ củ sẵn

dây nhanh chóng, chính xác Chen Sibao và cộng sự đã tiến hành đánh giá và so
sánh độ chính xác của phương pháp đo UV với phương pháp HPLC. Quét phổ dung
dịch chuẩn của 7 loại isoflavonoid thường gặp và chiếm hàm lượng lớn trong rễ sẵn
dây, các tác giả nhận thấy rằng chỉ trừ genistin có cực đại hấp thụ ở 260nm còn 6
isoflavonoid còn lại đều có cực đại hấp thụ tại 250nm. Nơng độ isoflavonoid toàn

phần trong dịch chiết rễ củ sắn dây tươi được định lượng theo phương pháp đo UV
bằng cách so sánh với mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn puerarin có nồng độ
từ 4/77

— 12,72ug/ml.

Kết

quả

cho

thấy,
13

hệ

số tương

quan

khi

định

lượng


isoflavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang với khi định lượng bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao là 0,975. Điều này chứng tỏ, kết quả định lượng isoflavonoid
toàn phần bằng phương pháp đo quang ở 250nm là tương quan với kết quả khi định
lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [11].
Cùng thời gian này, Xu Huaneng và cộng sự cũng sử dụng phương pháp đo
quang ở 250nm đề định lượng hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong dịch chiết rễ
củ sẵn dây nhờ tác dụng của siêu âm. Hàm lượng isoflavonoid trong mẫu thử được
ngoại suy từ đường chuẩn của dung dịch puerarin [41].
Năm 2008, trong nghiên cứu so sánh khả năng chiết isoflavonoid từ sẵn dây
bằng cách sử dụng siêu âm và bằng cách dùng vi sóng Yang Hu và cộng sự cũng sử
dụng phương pháp đo quang ở 250nm để định lượng isoflavonoid trong các dịch
chiết thu được. Dịch chiết isoflavonoid toàn phần được pha lỗng đến nồng độ thích
hợp rồi đo quang ở 250nm. Nơng độ isoflavonoid trong mẫu thử được tính tốn từ
đường chuẩn puerarin [45].
Như

vậy,

để định lượng

isoflavonoid

toàn phần

từ dịch chiết hoặc

trong

nguyên liệu có thê sử dụng phương pháp đo quang ở 250nm, so sánh với đường
chuân của dung dịch puerarin. Kết quả định lượng bằng phương pháp này có độ
chính xác cao, phương pháp tiên hành nhanh chóng. đơn giản.
Đề định lượng riêng từng hoạt chất hoặc đánh giá kết quả của q trình tinh
chế, phương pháp UV khơng cịn có thê sử dụng được, lúc này HPLC là phương
pháp thích hợp hơn cả.
Năm 2001 Chen Bin và cộng sự đã tiễn hành nghiên cứu xây dựng hương
pháp HPLC đơn giản, nhanh chóng và có độ nhạy cao dùng đề định lượng puerarin
và daidzin trong Pueraria lobaia. Isoflavonoid toàn phần chiết được từ P.lobata
bằng ethanol 70%, vi sóng trong 2 phút. Phân lập bằng cột Symmetry 18. Thời gian
lưu của puerarin và daidzin là 4,38 phút và 8,15 phút. Đường chuẩn trong khoảng
0,115 ~ 1,38ug/ml có R=0,9991 đối với puerarin và trong khoảng 0,12 ~ 1,44 ug/ml

14


có R=0,9998 đối với daidzin. Phần trăm tìm lại trung bình khoảng 103,31% với hệ
số phân tán CV=1,37% puerarin và 98,73% với CV=2,43% daidzin [10].

Đề tách và định lượng puerarin, daidzin và daidzein trong thân và lá của
Pueraria thomsonii, Zhou Hong-Ying và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký
pha đảo RP-HPLC với cột Diamosil TM C18 (4,6 mm x 150 mm, 5um) và gradient
rửa giải, pha động là methanol - 1% dung dịch acid acetic băng.
Iml/phút. Bước sóng phát hiện ở 250nm, nhiệt độ cột 25°C.

Tốc độ dòng

Các tác giả nhận thấy

rằng cả ba hợp chất đều có đường chuẩn với hệ số tương quan tốt (r > 0.9995) và
phần trăm tìm lại trong khoảng 99,0%

- 101,6%.

Hàm

lượng puerarin, daidzin và

daidzein trong thân cao hơn trong lá. Nghiên cứu đã chứng minh được rằng phương
pháp sắc ký pha đảo xây dựng được có độ nhạy cao và có thê sử dụng để sử dụng đề
định lượng puerarin, daidzin và daidzein trong thân và lá của Pueraria thomsonii
[48].
Năm 2008, Man Chen và cộng sự đã xây dựng được phương pháp HPLC khá
đơn giản và chính xác đề xác định hàm lượng puerarin trong rễ Pueraria lobata. Sử
dụng cột sắc ký C18, pha động là methanol/nước (25:75), detector UV ở bước sóng
250nm. Kết quả cho thấy mối quan hệ tương quan chặt chẽ giữa nồng độ puerarin
và mật độ quang trong khoảng 20 ~ 140ug/ml (r=0,9999). Phần trăm tìm lại là
97,40%, RSD = 3,0% [29].
1.2.4.

Tác dụng sinh học của puerarin

1.2.4.1.

Tác dụng trên tìm mạch

Gần đây có rất nhiều báo cáo đã xác minh tác dụng giãn mạch của puerarin trên
chuột. Tác dụng

giãn mạch

của puerarm trên động mạch

chủ ngực của chuột do

hoạt hóa điện áp dẫn lớn và kênh kali canxi kích hoạt đóng vai trị quan trọng trong
điều hịa nhịp tim. Hoạt động của kênh kali canxi kích hoạt gây ra hiện tượng ưu

phân cực trên màng tế bào.
Tác dụng thư giãn nội mạc nguyên vẹn của vòng động mạch chủ ở chuột đã bị

làm hẹp trước đó bởi phenylephrine (10 — 10) hoặc KCI (10 — 100 mM) của

15