báo cáo thực hành lý sinh (bản chính thức)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
Giảng viên: Đỗ Minh Hà
Thành viên nhóm:
1) Bùi Đức Thành An
2) Nguyễn Tuấn Anh
3) Hồ Cơng Bình
4) Hồng Văn Hiến
5) Nguyễn Kim Huy
6) Phan Đình Thức
Lớp: K9 Răng hàm mặt
Năm học: 2020-2021
Bài 1...............................................................................................................................................................4
XÁC ĐỊNH
LƯỢNG
CỦA Q
BĨP TIM
RỜI 4
I.

NĂNG
HOẠT HĨA
TRÌNH CO
ẾCH TÁCH

Cơ sở

lý thuyết

4

II.
Đối
cứu và

tượng nghiên
dụng cụ
5

III. Các
hành 5

bước tiến

Báo cáo
thực
hành Lý
Sinh
Nhóm 1

IV.

Kết quả thực hành.......................................................................................................................6

V.

Giải thích và kết luận..................................................................................................................7

VI.

Tài liệu tham khảo......................................................................................................................7

BÀI 2..............................................................................................................................................................8
TÍNH THẤM MỘT CHIỀU CỦA DA ẾCH............................................................................................8
I.

Cơ sở lý thuyết...............................................................................................................................8

II.

Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ............................................................................................10

III.

Các bước tiến hành...................................................................................................................10

IV.

Kết quả thực hành.....................................................................................................................11

V.

Giải thích và kết luận................................................................................................................11

VI.

Tài liệu tham khảo....................................................................................................................11

BÀI 3............................................................................................................................................................12
XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN CỦA MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU.................................................................12
I.

Cơ sở lý thuyết.............................................................................................................................12

II.

Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ............................................................................................13

III.

Các bước tiến hành...................................................................................................................13

IV.

Kết quả thực hành.....................................................................................................................14


V.

Giải thích và kết luận................................................................................................................14

VI.

Tài liệu tham khảo....................................................................................................................15

BÀI 4............................................................................................................................................................16
ĐO KÍCH THƯỚC TẾ BÀO TRÊN KÍNH HIỂN VI.........................................................................16
I.

Cơ sở lý thuyết.............................................................................................................................16

II.

Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ............................................................................................17

III.

Các bước tiến hành...................................................................................................................17

IV.

Kết quả thực hành.....................................................................................................................18

V.

Giải thích và kết luận................................................................................................................18

VI.

Tài liệu tham khảo....................................................................................................................18

BÀI 5............................................................................................................................................................19
XÁC ĐỊNH THẾ DZETA CỦA TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI ĐIỆN DI............................19
I.

Cơ sở lý thuyết.............................................................................................................................19

II.

Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ............................................................................................21

III.

Các bước tiến hành..................................................................................................................21

IV.

Kết quả thực hành.....................................................................................................................22

V.

Giải thích và kết luận................................................................................................................22

VI.

Tài liệu tham khảo....................................................................................................................22

ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD (PHƯƠNG PHÁP QUANG
PHỔ HẤP THỤ)........................................................................................................................................23
I.

Cơ sở lý thuyết.............................................................................................................................23

II.

Đối tượng nghiên cứu và dụng dụ............................................................................................23

III.

Các bước tiến hành...................................................................................................................23

IV.

Kết quả thực hành.....................................................................................................................24

V.

Giải thích và kết luận................................................................................................................24

VI.

Tài liệu tham khảo....................................................................................................................25

BÀI 7............................................................................................................................................................26
QUAN SÁT HIỆN TƯỢNG HUỲNH QUANG....................................................................................26
I.

Cơ sở lý thuyết.............................................................................................................................26

II.

Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ............................................................................................27

III.

Các bước tiến hành...................................................................................................................28

IV.

Kết quả thực hành.....................................................................................................................28

V.

Giải thích và kết luận................................................................................................................29

VI.

Tài liệu tham khảo....................................................................................................................29

2


Bài 1
XÁC ĐỊNH NĂNG LƯỢNG HOẠT HĨA CỦA Q TRÌNH
CO BÓP TIM ẾCH TÁCH RỜI
I.MỤC TIÊU
Cơ sở lý thuyết
1) Năng lượng hoạt hóa
Những
yêu cầu cần nắm được sau khi nghiên cứu bài thực tập này:
• Để một phản ứng hóa học xảy ra, các nguyên tử, phân tử của chất tham gia phản ứng phải thay
 Đốiđổi,
tượng
nghiên
cứuvàcủa
sắp xếp
lại cấu trúc
hìnhđộng
thành học
một trật tự cấu trúc mới trong sản phẩm của phản ứng.
Muốn

thế
cần
phải
có
một
năng
lượng
tối
để phản
vượt qua
hàng
rào lực
đẩytrình)?
giữa các lớp vỏ
 Thế nào là năng lượng hoạt hóa củathiếu
một
ứng
(một
quá
điện tử để liên kết với nhau, đó là năng lượng hoạt hóa
 Mối
liênlượng
quan
giữa
hằng
tốctốiđộ
của
ứng
vớitử,
nhiệt

• Năng
hoạt
hóa là
năng số
lượng
thiểu
cầnphản
thiết để
nguyên
phânđộ
tử có thể tham gia vào
Q
10
phản
ứng
 Đại lượng
và ý nghĩa của nó
E
• Giả sử
là năng lượng
tối thiểu
cần tim
thiết ếch
để phân
của một
chất
có thể tham
vàocủa
một
 Thành

thạohh phương
pháp
cơ lập
vàtửtính
năng
lượng
hoạtgia
hóa
E
một q
trìnhứng,
sinh
loại phản
chỉhọc
những phân tử có năng lượng lớn hơn hoặc bằng hh thì mới có khả năng
tham gia phản ứng tạo thành sản phẩm

2) Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tốc độ phản ứng
• Để tăng tốc độ của phản ứng hóa học, ta thường tăng nhiệt độ. Và sự phụ thuộc tốc độ phản ứng
vào nhiệt độ được thể hiện qua phương trình Arhenius:

� Ehh �
KT  P.z.exp �

�
� RT �
Trong đó:
KT là tốc độ của phản ứng
z là hệ số va chạm giữa các nguyên tử, phân tử
P là yếu tốc lập thể (phụ thuộc vào cấu hình khơng gian của nguyên tử, phân tử)

R là hằng số khí R  8,314 J / mol.K
Ehh là năng lượng hoạt hóa
• Ngồi ra ta cịn có định luật Vanhoff:
KT 10
KT
o
Trong đó: Q10 là tỉ số của tốc độ phản ứng hóa học ở hai mức nhiệt độ chênh nhau 10 C
Từ phương trình Arhenius và định luật Vanhoff , tìm cơng thức của Ehh , ta có:
Q10 

Ehh  RT .

T  10
.ln Q10  0, 46.T .(T  10).lg Q10
10

3


II.

Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ
1) Đối tượng nghiên cứu
• Đối tượng nghiên cứu là ếch, thuộc lớp lưỡng cư
• Thuận lợi: phổ biến ở Việt Nam nên dễ tìm, rẻ tiền, có thể thực hiện nhiều thí nghiệm, bên cạnh
đó, cơ tim khỏe, co bóp mạnh, tính tự động của tim cao, tính chống chịu tốt, phù hợp cho việc
nghiên cứu

3) Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
•

•
•
•
•
•

1 kéo to
1 kéo con
1 chọc tủy
1 khay mổ
10 đinh ghim
4 cốc thủy tinh

• 4 canuyl
• 1 cuộn chỉ
• 2 khăn lau để mổ

III.

 4 con ếch/nhóm
 1 bàn xốp để ghim ếch
 2 cơng tơ hút
 3 bình tam giác có nút cao su dùi hai lỗ
 1 nồi cách thủy
 1 khay (chậu) nước đá
o
 2 nhiệt kế loại 0  50 C
 1 lít dung dịch Ringer dùng cho động vật biến nhiệt
 1 đồng hồ bấm giây

Các bước tiến hành
1) Tách rời tim ếch
• Chọc tủy ếch:
• Cầm tim ếch bằng tay trái, để mặt lưng lên trên
• Tìm nơi tiếp giáp giữa xương sống và hộp sọ, đó là chỗ lõm nằm ở đỉnh của tam giác đều có đáy
là đường nối giữa hai mắt ếch
• Ấn mạnh kim học và đâm sâu xuống tủy sống, nếu chọc đúng tủy thì hai chân ếch sẽ duỗi thẳng
ra
• Cố định ếch: dùng ghim cố định 4 chân ếch vào bàn mổ
• Mổ lộ tim ếch
• Dùng kéo to mở rộng khoang ngực ếch cắt bỏ một mảnh da ngực hình tam
giác (có đỉnh là mỏm xương ức và đáy là đường nối hai khớp vai). Tiếp đó
dùng panh kẹp vào mỏm sụn xương ức, nhấc thành trước lồng ngực lên và
cắt bỏ đi một mảnh lồng ngực theo hình tam giác như đã cắt ở da trước đó
• Thấy tim lộ rõ trong xoang bao tim. Dùng panh kẹp nâng màng bao tim
lên và dùng kéo cắt đứt màng bao tim
• Tách rời tim ếch
• Dùng kéo và panh nhỏ, luồn chỉ xuống dưới tĩnh mạch chủ, hai động
mạch trái và phải
• Thắt chặt tĩnh mạch chủ và động mạch phải của ếch
• Nhẹ nhàng kéo sợi chỉ nâng động mạch trái lên, cách một lỗ nhỏ để luồn
canuyl (có chứa dung dịch sinh lý) vào sâu tâm thất

4


• Dùng ống hút bỏ máu trong canuyl, tiếp tục cho dung dịch sinh lý vào, lại hút bỏ, rửa sạch tim
cho đến khi toàn bộ máu trong tim được thay bằng dung dịch sinh lý. Khi thấy tim trắng, nước
sinh lý trong canuyl dâng lên, hạ xuống theo nhịp tim là được
• Thắt chặt chỉ, buộc động mạch trái vào canuyl, dùng kéo cắt rời tim ra khỏi lồng ngực ếch

• Gắn canuyl có tim ếch vào lỗ nhỏ trên nút bình tạo ẩm
4) Xác định đại lượng Q10 và năng lượng hoạt hóa của q trình co bóp tim ếch tách

rời
• Chuẩn bị ba bình ẩm chứa khoảng 50ml dung dịch Ringer ở ba nhiệt độ khác nhau
• Bước 1: Đặt ở nhiệt độ của phịng thí nghiệm
o
• Bước 2: Đặt trong máy điều nhiệt có nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phịng 10 C
o
• Bước 3: Đặt vào chậu nước đá để hạ nhiệt độ xuống thấp hơn nhiệt độ phịng 10 C
• Khi nhiệt độ đã ổn định, đặt tim ếch đã cơ lập vào bình ẩm ở nhiệt độ phòng, đếm số nhịp đập
của tim trong thời gian 1 phút đó chính là hẳng số tốc độ của q trình co bóp tim ếch tách rời
( KT ) . Đếm ít nhất 5 lần để lấy giá trị trung bình

Lưu ý: Có thể xác định hằng số tốc độ của quá trình này bằng cách xác định thời gian mà tim đập
được 20 nhịp. Suy ra 60 giây đập được bao nhiêu nhịp. Làm như vậy có thể tiết kiệm được thời
gian hơn
o
• Tiến hành tương tự như trên ở nhiệt độ cao hơn và thấp hơn 10 C so với nhiệt độ phòng để xác
định được KT 10 và KT 10 . Cần chú ý mỗi lần thay đổi nhiệt độ phải chờ 3 phút cho tim thích
ứng với điều kiện nhiệt độ mới trong bình ẩm
• Áp dụng cơng thức để tính đại lượng Q10 trong điều kiện tăng nhiệt độ:
Q10 

KT 10
KT

Từ đó tính được năng lượng hoạt hóa của q trình co bóp tim ếch tách rời trong điều kiện này
là:
Ehh  0, 46.T1.T2 .lg Q10

Còn ở điều kiện giảm nhiệt độ giảm thì:
Q10 ' 

KT
KT 10

và năng lượng hoạt hóa là:
Ehh '  0, 46.T1.T2 .lg Q10

IV.

Kết quả thực hành
Kết quả thu được lập thành bảng số liệu

5


Bảng tổng hợp số liệu trung bình

V.

Thời gian

Số
th
ứ
tự

Nhiệt
độ

Số
nhịp
đập

1
2
3

21oC
31oC
41oC

20
20
20

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

Hằng số tốc
độ KT

41
48

54

36
45
51

33
39
48

38
44
51

38
44
51

Đại
lượng
Q10

Năng
lượng
hoạt
hóa
Ehh

1,1578
1,159

1,1578

2617
2815
2617

Giải thích và kết luận

1) Giải thích:
• Khi tim ếch được tách rời khỏi cơ thể, vẫn có khả năng co bóp là nhờ hệ thống nút tự phát các
xung động và dẫn truyền xung động. Hệ thống nút là nút xoang, nút nhĩ thất, bó His, mạng lưới
Purkinje. Hệ thống nút nếu tự động phát xung thì tần số khoảng 40-50 nhịp/phút
• Nhiệt độ càng cao thì sự chuyển động của các phân tử càng lớn, các phân tử va chạm càng nhiều
và mạnh làm phản ứng diễn ra nhanh, do đó sự tạo nhịp của nút xoang và lan truyền các xung
nhanh và mạnh mẽ. Vì thế, số nhịp tim đập trong một phút cũng nhiều hơn ở nhiệt độ thấp hơn
10oC
• Năng lượng hoạt hóa: Tốc độ phản ứng xảy ra càng nhanh khi nhiệt độ cao thì năng lượng hoạt
hóa càng lớn. Nói cách khác là nhiệt độ cao, số lượng các phân tử có năng lượng bằng hoặc lớn
hơn năng lượng hoạt hóa sẽ tăng lên làm tốc độ phản ứng tăng lên, năng lượng hoạt hóa cũng
tăng lên. Năng lượng hoạt hóa ở T1 khi nhiệt độ tăng T2 lớn hơn khi giảm xuống T3

5) Kết luận:
• Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng và năng lượng hoạt hóa. Nhiệt độ càng cao, tốc
độ phản ứng càng lớn và năng lượng hoạt hóa càng nhiều

VI.

Tài liệu tham khảo
• Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005
• Lương Dun Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập), NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội,

2010
• Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2002

6


BÀI 2
TÍNH THẤM MỘT CHIỀU CỦA DA ẾCH
I. MỤCCơ
sở lý thuyết
TIÊU
Là một hệ thống hở, tế bào sống luôn thực hiện q trình thay đổi chất với mơi trường bên
Những
cần
khi nghiên
cứu
thực
tậpnhập
này:
ngồi.
Q u
trình cầu
này chỉ
có nắm
thể xảyđược
ra nhờsau
khả năng
màng tế bào
và bài
mơ cho

thâm
hoặc thải hồi
các
nước
cácthấm
chất hịa
tantế
đi qua.
 chất
Thếkhí,
nào
là và
tính
của
bàoKhả
và năng
mơ?đó được gọi là tính thấm của tế bào và mơ
(tham khảo thêm về lý thuyết màng tế bào).
 CơTính
sở của
hiện tượng màng có tính thấm chọn lọc?
thấm khơng những chỉ phụ thuộc vào cấu trúc đặc trưng của từng loại tế bào và mơ mà
 Hai
cơ chế
vận vào
chuyển
vậtchức
chất
qua
bào?

cịn
phụ thuộc
rất nhiều
trạng thái
năng
củamàng
chúng. tế
Chính
cấu trúc đặc trưng và trạng thái
chức
năng
của
các
loại
tế
bào
và
mơ
quy
định
tính
thấm
có
chọn
lọc
đốibào
với các
 Giải thích được hiện tượng thấm một chiều của tế
và chất
môkhác nhau từ môi

trường vào tế bào. Một khi tế bào và mơ khơng cịn khả năng hoạt động thực hiện các chức năng (tế
 Nắm vững phương pháp dùng chất màu để nghiên cứu tính thấm
bào bị chết) thì tính thấm chọn lọc cũng khơng cịn nữa, khi tính thấm của màng tế bào thay đổi, luồng
vật chất đi vào hoặc ra khỏi tế bào cũng thay đổi theo.
Ngày nay ngoài thực bào, uống bào (cịn gọi là ẩm bào) có hai cơ chế vận chuyển vật chất qua
màng tế bào đã được làm sáng tỏ, đó là:

1) Cơ chế vận chuyển thụ động
• Là cơ chế vận chuyển vật chất qua màng theo tổng các loại gradient, không tiêu tốn năng lượng.
Quá trình vận chuyển này diễn ra như một quá trình khuếch tán, tuân theo định luật Fick:
dm
dc
  DS
dt
dx
Trong đó:
dm
dt là tốc độ khuếch tán của vật chất qua màng ( g / s )
dc
3
dx là gradient nồng độ ( g / cm )
2
S là tiết diện mà vật chất khuếch tán qua (cm )
2
D là hệ số khuếch tán ( g / cm .s)

• Dấu () trong công thức nêu lên ý nghĩa vật lý của quá trình là sau thời gian khuếch tán (t )
lượng vật chất đã bị giảm đi so với giá trị ban đầu. Tốc độ khuếch tán càng lớn thì nồng độ chất
ban đầu càng giảm nhanh

6) Cơ chế vận chuyển tích cực

7


• Là cơ chế vận chuyển vật chất qua màng ngược tổng gradient có tiêu phí năng lượng của q
trình trao đổi chất. Cơ chế này gắn liền với hoạt động của các chất mang là các phân tử
lypoprotein trong thành phần cấu trúc màng. Hoạt động của một trong các protein chất mang




vận chuyển tích cực ion K và Na ngược gradient nồng độ của chúng là Na  K  ATPaza


đã được nghiên cứu khá chi tiết và đươc mô tả như hoạt động của “bơm ion Na  K ”. Bằng
cơ chế này, tế bào và mô đã duy trì được gradient nồng độ các chất, nhờ đó mà chúng có khả
năng sinh cơng dồi dào trong q trình sống
• Tốc độ cũng như chiều hướng thâm nhập của các chất vào tế bào và mô không chỉ phụ thuộc
vào tính thấm chọn lọc của màng mà còn phụ thuộc vào bản chất của các chất và vào mức độ
thay đổi tính chất hóa lí của các chất đó. Chẳng hạn, nếu có một chất nào đó khi đã xâm nhập
vào nội bào nó tham gia vào phản ứng hóa học thành một chất khác, hoặc nếu nó chuyển từ
trạng thái tự do sang trạng thái liên kết, thì khả năng khuyếch tán trở lại mơi trường ngồi của
nó rất khó xảy ra. Ví dụ một axit yếu hoặc kiềm yếu ở ngồi mơi trường chúng khơng phân li
nên dể dàng khuếch tán vào trong tế bào. Khi vào bên trong nội bào, do điều kiện môi trường đã
thay đổi nên chúng bị phân li thành các ion, dễ tham gia vào các liên kết hóa học nên mất khả
năng khuyếch tán ra ngồi, nên axít yếu và kiềm yếu chỉ có khả năng thấm theo một chiều nhất
định
• Da ếch là một đối tượng thuận lợi để quan sát và nghiên cứu tính thấm một chiều đối với một số
chất (trong đó có xanh methylene, một thuốc nhuộm có tính kiềm yếu). Da ếch bao gồm biểu

mơ ở phía ngồi và mơ liên kết ở bên trong. Biểu mô được cấuu tạo từ 5 đến 8 lớp tế bào. Ngồi
cùng, phủ lên biểu mơ là một màng cutin mỏng có nguồn gốc từ dịch của các tuyến nhầy và một
lớp tế bào sừng. Tiếp theo là các lớp tế bào biểu mơ có dạng hình trịn, xếp hơi thưa tạo thành
các khe gian bào. Trong cùng là lớp tế bào có hình lăng trụ, nhân của chúng có hình ơ van, xếp
xít nhau được gọi là tế bào màng nền. Tất cả các lớp tế bào này được gọi là lớp tế bào sinh
trưởng, chúng có khả năng phân chia mạnh để thay thế các tế bào biểu mô già. Dưới màng nền
là lớp mô liên kết. nơi định vị các sắc tố màu xanh đen

Cấu tạo mô da ếch
1. Màng cutin
2. Lớp tế bào sừng
3. Các lớp tế bào sinh trưởng biểu mô
4. Lớp tế bào nền
5. Các sắc tố
6. Lớp mơ liên kết
• Tính thấm một chiều của tế bào và mô không phải là bất biến mà cũng có thể bị thay đổi tính
chất hóa lý của mơi trường

8


• Biểu mơ da ếch có khả năng hấp thụ cao, phản ứng acid yếu (có tính acid yếu), cịn lớp mơ liên
kết có khả năng hấp thụ yếu và phản ứng kiềm yếu. Với cấu trúc mô đặc trưng như vậy, da ếch
thấm một chiều từ mô liên kết ra biểu mơ đối với một số thuốc nhuộm có tính kiềm yếu như
xanh methylene. Bởi vì ở lớp mơ liên kết có tính kiềm yếu, các chất này khơng bị phân li thành
các ion. Chúng cũng không bị hấp thụ mạnh nên dể dàng khuyếch tán ra lớp biểu mơ. Ở lớp biểu
mơ do có tính acid nên các chất bị phân li và bi hấp thụ mạnh do đó chúng khơng có khả năng
khuyếch tán theo chiều ngược lại

VII.

Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ
1) Đối tượng nghiên cứu
• Đối tượng nghiên cứu là ếch, thuộc lớp lưỡng cư

7) Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

VIII.

1 kim chọc tủy
1 kéo to sắc
1 cuộn chỉ
1 khay mổ hoặc bàn mổ
4 ống thủy tinh hình trụ có chiều dài 7-8 cm
4 nắp đậy lá nhôm hoặc nhựa, ở giữa được đục lỗ có đường kính bằng đường kính ống thủy tinh
6 cốc thủy tinh loại 100 ml

1 máy so màu để xác định mật độ quang học của dung dịch
o
100 ml cồn 96
100 ml dung dịch xanh methylene 0,1% trong dung dịch sinh lí
1000 ml dung dịch sinh lí dung cho động vật biến nhiết
2 pipet loại 5 -10 ml và giá để pipet
2 khăn lau dùng để mổ
2 con ếch/nhóm sinh viên

Các bước tiến hành
1) Chuẩn bị túi da ếch
• Mỗi nhóm bắt hai con ếch, dung kim chọc tủy ếch cho ếch bất động. Cẩn thận lấy da của bốn
bắp chân ếch sao cho không bị thủng để làm các túi da ếch. Dùng hai chiếc, một để nguyên,
chiếc kia lộn ngược lại cho biểu mô vào trong rồi
ngâm vào dung dịch sinh lý cho da ếch giữ
nguyên trạng thái sinh lý bình thường. hai chiếc
o
cịn lại làm như trên nhưng ngâm trong cồn 96
với thời gian là 120 phút nhằm giết chết da ếch
• Dùng chỉ buộc một đầu của những túi da ếch đã
chuẩn bị trên vào các ống thủy tinh hình trụ, cịn
đầu kia buộc túm lại. cho dung dịch sinh lý vào túi
để kiểm tra xem túi có bị rị rỉ khơng. Nếu khơng,
đổ dung dịch sinh lý đi rồi cho 5 ml dung dịch
xanh methylene 0,1% vào và nhúng các túi này
vào các cốc đựng một lượng 100 ml dung dịch sinh
lý bằng nhau. Chú ý sao cho mức xanh methylene trong túi cao bằng mức dung dịch sinh lí
trong cốc

8) Quan sát hiện tượng thấm của xanh methylene qua các túi da ếch

9


• Đặt các
trên vao
22o trong
nhận xét
xem xanh
tán từ
chiều nào:
biểu mô
biểu mô ra
thời so
đã ngâm
nhận xét
vào vở và
cán bộ hướng dẫn thực hành

cốc có túi da ếch
bình ổn nhiệt độ
40 phút. Sau đó
bằng mắt thường
methylene khuyếch
trong ra ngồi theo
từ mơ liên kết ra
hay ngược lại từ
mô liên kết? Đồng
sánh với những túi
trong cồn xem có

gì, ghi các nhận xét
báo cáo kết quả với

9) Định lượng xanh methylene đã thấm qua da ếch
• Dựng đồ thị chuẩn
• Sau khi đặt các túi da ếch vào bình ổn nhiệt, trong khi chờ đợi kết quả, nhanh nhóng chuẩn bị
các dung dịch xanh methylene có các nồng độ: 0,002; 0,004; 0,006; 0,008; 0,01; 0,02% trong
dung dịch sinh lí. Dùng máy so màu xác định mật độ quang học (D) của các dung dịch vừa pha.
Dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang học vào nồng độ, ta có đồ thị chuẩn
• Xác định lượng xanh methylene đã thấm qua da
• Sau 40 phút (hoặc lâu hơn nếu có thời gian) nhấc bỏ các túi da ếch ra khỏi các cốc, dùng đũa
thủy tinh khuấy đều dung dịch trong cốc rồi đem xác định mật độ quang học trên máy so màu,
Dựa vào đồ thị chuẩn xác định nồng độ xanh methylene đã thấm qua da ra ngồi

IX.

Kết quả thực hành





Bình 1: Màu trắng trong, khơng có xanh methylene thấm qua
Bình 2: Màu xanh ở lớp da, có xanh methylene thấm qua 1 chút
Bình 3: Màu xanh nhiều, xanh methylene thấm qua nhiều hơn bình 4
Bình 4: Màu xanh nhiều, lượng xanh methylene thấm qua tương đối

10

X.

Giải thích và kết luận

1) Giải thích
• Với cấu tạo của da ếch , lớp tế bào biểu mô ở ngồi là lớp có tính hấp thụ cao và có tính acid
yếu. Ngược lại, lớp mơ liên kết có tính chất hấp thụ yếu và kiềm kém
• Với dung dịch kiềm yếu methylene nên lớp tế bào biểu mô và lớp liên kết có tính hấp thụ khác
nhau. Vì tế bào biểu mơ có tính hấp thụ cao và acid yếu sẽ hấp thụ mạnh dung dịch kiềm yếu
methylene và đưa dung dịch ra ngồi
• Lớp mơ liên kết có tính hấp thụ yếu và kiềm yếu nên hấp thụ tốt đưa dung dịch methylene và
lớp mô liên kết sẽ hấp thụ và giữ lại

10)

Kết luận

• Tính thấm khơng những chỉ phụ thuộc vào cấu trúc đặc trưng của từng loại tế bào và mơ mà cịn
phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái chức năng của chúng

XI.

Tài liệu tham khảo
• Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005
• Lương Dun Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập), NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội,
2010
• Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2002

BÀI 3
XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN CỦA MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU

MỤC TIÊU
Những yêu cầu cần nắm được sau khi nghiên cứu bài thực tập này:
 Phân biệt thế nào là môi trường ưu trương, nhược trương và đẳng trương
 Phản ứng của tế bào động vật và thực vật trong các loại mơi trường đó
 Thành phần cấu trúc nào của màng tế bào hồng cầu giúp nó có thể thay đổi
thể tích trong một giới hạn nhất định
 Thế nào là độ bền của màng tế bào hồng cầu. Ý nghĩa
 Thành thạo phương pháp sử dụng dunh dịch nhược trương xác định độ bền
của màng tế bào hồng cầu

11


I.

Cơ sở lý thuyết
1) Màng tế bào
• Chúng ta biết màng tế bào có một ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong đời sống của tế bào.
U.B.Frank – một nhà lý sinh nổi tiếng đã nói rằng: “Mọi hoạt động sống đều diễn ra trên “sân
khấu” – màng”. Màng ở đây được hiểu theo một ý nghĩa rộng, gồm các loại màng có mặt ở bên
trong tế bào (màng nội bào) và màng sinh chất, màng bao quanh tế bào.
• Màng sinh chất giữ nhiệm vụ bảo vệ, trao đổi thông tin và vật chất giữa tế bào với môi trường
bên ngoài. Tế bào hồng cầu là một đối tượng điển hình để chúng ta nghiên cứu cấu tạo, tính chất
và chức năng của màng tế bào

11)

Màng tế bào hồng cầu

• Trên hình là hình ảnh chung về tế bào hồng cầu người quan sát qua kính hiển vi điện tử. Tế bào

có bề mặt lõm để tăng diện tích tiếp xúc với mơi trường ngồi. Hồng cầu trưởng thành là một
loại tế bào không nhân. Cấu tạo màng tế bào hồng cầu, nhìn chung giống như màng sinh chất
của các loại tế bào khác, gồm các protein màng tế bào – lớp lipit kép – protein khảm vào nhau.
Có một điểm khác biệt là ở bề mặt bên trong màng tế bào hồng cầu tồn tại một mạng lưới vật
chất có nguồn gốc là protein dạng sợi và được gọi là spectrin. Spectrin chiếm một tỉ lệ là 30%
tổng số protein của màng và là phức hợp của hai sợi polypeptit có trọng lượng phân tử khoảng
220.000 – 240.000Da (dalton) . Cùng với một vài loại protein khác, spectrin tham gia vào quá
trình biến đổi hình dạng hồng cầu thông qua việc co ngắn hay duỗi dài dạng sợi của mình. Bằng
cách đó tế bào hồng cầu có thể biến đổi hình dạng giúp cho nó đi qua được các mao mạch nhỏ li
ti, ở khắp cơ thể. Đặc biệt là ở lách, những tế bào hồng cầu đã già hoặc bị thối hóa chức năng,
khả năng đàn hồi co giãn các sợi spectrin kém,
khơng có khả năng đi qua mao mạch kiểm soát
của cơ quan màng và bị lách tiêu hủy

12


• Ở trạng thái sinh lí bình thường, màng hồng cầu khá bền vững. Thể tích của tế bào thường
khơng thay đổi và được điều tiết bởi tỉ lệ lượng các chất hịa tan bên trong và bên ngồi tế bào.
Chúng ta biết, lượng các ion của các muối hòa tan trong tế bào là một hằng số ổn định. Do đó
thể tích tế bào phụ thuộc vào lượng ion của mơi trường bên ngồi

12)

Mơi trường của tế bào hồng cầu

• Chúng ta biết có ba loại mơi trường: mơi trường ưu trương, môi trường đẳng trương và môi
trường nhược trương
• Màng tế bào hồng cầu bền trong mơi trường đẳng trương. Trong môi trường ưu trương, tế bào
nhăn nhúm lại do chịu tác động của áp suất thẩm thấu từ bên ngồi vào. Cịn trong mơi trường

nhược trương thì tế bào trương phồng lên và màng của nó bị bung ra do chịu tác động của một
lực gây ra bởi áp suất thẩm thấu từ bên trong làm cho lượng nước trong tế bào ngày càng tăng
cao và cuối cùng giải phóng các chất từ nội bào ra bên ngồi. Độ bền của màng hồng cầu chính
là nồng độ dung dịch muối trong mơi trường nhược trương, tại đó không xảy ra hiện tượng tế
bào hồng cầu bị huyết tiêu

13


XII.

Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ
1) Đối tượng nghiên cứu
• Đối tượng nghiên cứu: tế bào hồng cầu gà

13)

Dụng cụ, hóa chất và vật liệu

10 ống nghiệm loại 10 ml
1 máy so màu
250 ml dung
500 ml nước
250 ml dung
pH = 7,4
• 3 pipet loại 5
• Tế bào hồng
•
•
•

•
•

• 1 pipetman 100
lau

XIII.

Các bước
1) Lấy mẫu tế bào

dịch NaCl 2%
cất
dịch sinh lý máu nóng
ml
cầu gà
 l , giấy thấm, khăn

tiến hành
hồng cầu

• Dùng citrat
natri hoặc heparin để
lấy máu chống
đơng. Rửa tế bào
hồng cầu bằng cách quay li tâm (1200 vòng/phút trong 5 phút) máu chống đông trong dung dịch
90 / 00
sinh lý PBS
(có pH bằng 7,4) ba lần
• Trước khi li tâm dùng ống hút sục nhẹ nhàng cho hồng cầu phân bố đều trong dung dịch, tránh

bị vỡ. Sau lần li tâm thứ ba, phân tán đều hồng cầu trong dung dịch PBS nói trên sao cho có mật
độ là 5.106 tế bào/ ml

14)

Xác định độ bền của màng tế bào hồng cầu

• Chuẩn bị 10 ống li tâm, đánh số từ 0 đến 10. Pha vào mỗi ống nghiệm 5 ml dung dịch muối
NaCl tương ứng với các nồng độ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9%, sau đó thêm vào
o
mỗi ống nghiệm 500  l dịch hồng cầu đã chuẩn bị trên. Để các ống nghiệm vào tủ ấm 37 C
trong 15 phút rồi li tâm 3000 vòng/phút. Sau khi li tâm, quan sát màu của dịch. Màu đỏ là màu
của huyết sắc tố thoát ra sau khi màng tế bào hồng cầu bị vỡ. Nồng độ thấp nhất của các ống
khơng có màu đỏ là giới hạn bền của màng tế bào hồng cầu

14


XIV.

Kết quả thực hành
Kết quả thu được lập thành bảng số liệu
Nồng
độ (%)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Màu
sắc

Đỏ

Đỏ

Hồng
nhạt

Trắng

Trắng

Trắng

Trắng

Trắng

Trắng

Trắng

XV.

Giải thích và kết luận

1) Giải thích
• Do nồng độ NaCl trong môi trường nhiều hơn so với trong tế bào hồng cầu làm cho nước đi vào
làm thề tích tế bào tăng, chúng trương phồng lên rồi bị vỡ ra, và giải phóng các chất ra ngồi
mơi trường gây ra hiện tượng huyết tiêu
• Lượng nước đi vào các ống nghiệm giảm dần từ ống 1 đến ống 10 (vì nồng độ NaCl tăng dần từ
ống 1 đến ống 10 và thể tích ở mỗi ống nghiệm không đổi) nên các tế bào trong ống 1 bị vỡ
nhiều nhất làm cho dung dịch có màu đậm nhất. Ngược lại ở ống 4 tuy nước đi từ môi trường
vào trong tế bào nhưng chưa đủ để gây ra hiện tượng huyết tiêu tức là tế bào hồng cầu trương
lên tới mức tối đa nhưng chưa vỡ
� Nồng độ nhược trương lớn nhất chưa đủ gây ra hiện tượng huyết tiêu là 0,4%. Các ống
4,5,6,7,8,9,10 hồng cầu không bị vỡ ra lắng xuống đáy dung dịch trong suốt dần
• Khi ly tâm, tế bào hồng cầu nguyên vẹn và tế bào hồng cầu bị vỡ sẽ bị lắng xuống dưới đáy. Tuy
nhiên tế bào hồng cầu bị vỡ có kích thước nhỏ dễ khuyếch tán nên tạo ra màu đỏ của dung dịch.
Càng nhiều tế bào hồng cầu bị vỡ, lượng tế bào khuyếch tán càng nhiều và dung dịch có màu
càng đậm. Trong khi tế bào hồng cầu nguyên vẹn lắng đọng dưới đáy và không khuyếch tán
được do q trình ly tâm

15)

Kết luận

• Màng tế bào hồng cầu bền trong mơi trường đẳng trương
• Trong mơi trường ưu trương, tế bào nhăn nhúm lại do chịu tác động của áp suất thẩm thấu từ

bên ngồi vào
• Trong môi trường nhược trương, tế bào trương phồng lên và màng của nó bị bung ra do chịu tác

động của một lực gây ra bởi áp suất thẩm thấu từ bên trong làm cho lượng nước trong tế bào
ngày càng tăng cao và cuối cùng giải phóng các chất từ nội bào ra bên ngồi

XVI.

Tài liệu tham khảo
• Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005
• Lương Dun Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập), NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội,
2010
• Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2002

15


BÀI 4
ĐO KÍCH THƯỚC TẾ BÀO TRÊN KÍNH HIỂN VI
I.

Cơ sở lý thuyết
MỤCMuốn

TIÊU
đo kích thước của những vạch nhỏ đang quan sát dưới kính hiển vi như hạt phấn hoa, tế
bào
hay kích
thước
sợicần
bơng,nắm
sợi tóc…
thìsau
khơng
thểnghiên
đo trực tiếp
bằng
dùng
những
Những
u
cầu
được
khi
cứu
bàicách
thực
tập
này:thước đo
chiều
dài bình
một cách
thơng
quatrị

một
khác
được
gắn vào thị
 Quan
sátthường,
thướcmàđophải
vậtđokính
và gián
biếttiếp
được
giá
độthước
dài đo
của
mỗi
vạch
kính của kính hiển vi. Thước đo đó được gọi là trắc vi thị kính (thước đo thị kính).
 Cách đo kích thước tế bào trên kính hiển vi
1) Thước đo thị kính
 Xác
địnhgặp
được
hệ số dài của một khoảng thị kính và kích thước trung bình
Thường
2 loại:
của tế bào hồng cầu

16

• Loại đơn giản: là một miếng kính hình trịn, ở giữa có một vạch dài 5 mm được chia ra làm 50
khoảng cách đều nhau. Khi sử dụng được đặt vào một cái gờ giữa hai thấu kính của thị kính
• Loại cải tiến: được dùng phổ biến trong các phịng thí nghiệm là loại AM-9-2. Nó được cấu tạo
từ một thị kính 15x và một hệ thống chia vạch để đo. Hệ thống chia vạch gồm một kính phẳng
cố định, trên đó khắc các vạch cách đều nhau đánh số từ 0 đến 8. Ngồi ra, cịn một kính di động
có khắc hai vạch chéo nhau đi kèm với hai vạch song song. Kính di động này được gắn liền với
một trống chia độ bên ngoài. Xung quanh vòng tròn trống chia độ được chia thành 100 vạch
bằng nhau. Khi vặn trống chia độ hết một vòng (đi hết 100 vạch) thì sẽ làm dịch chuyển 1 vạch
trên kính cố định (dịch được 1 mm ). Như vậy mỗi vạch trên trống chia độ tương ứng với 1/100
vạch ở kính cố định

16)

Thước đo vật kính

• Thước đo vật kính là một phiến kính có kích thước 26 x 76 x15 mm . Ở chính giữa của phiến
kính có khắc một thước đo dài 1 mm thành 100 vạch bằng nhau. Ở đó, chiều dài của mỗi vạch là
0,01 mm (10  m ). Thước đo này được bảo vệ bởi một miếng kính nhỏ, trịn bằng cách gắn lên
trên thước đo. Xung quanh thước đo được đánh dấu bằng một vòng tròn màu đen. Thước này
đặt lên bàn kính hiển vi để xác định độ dài của mỗi vạch chia trên thước đo thị kính được dùng

để đánh dấu khoảng cách, hoặc kích thước vật muốn đo
• Muốn đo kích thước của bất kỳ vật hiển vi nào dưới kính hiển vi ở độ phóng đại nào đó, người
ta phải xác định chiều dài (tính ra  m ) của mỗi khoảng cách trên thước đo thị kính khi quan sát
ở độ phóng đại ấy. Muốn vậy, người ta đặt thước đo vật kính vào bàn kính hiển vi, sau đó điều
chỉnh sao cho vạch đầu tiên của thước đo thị kính trùng với vạch đầu tiên của thước đo vật kính,
sau đó đếm xem có bao nhiêu khoảng của thước đo thị kính vừa vặn trùng với bao nhiêu khoảng
của thước đo vật kính
• Ví dụ 1

Ở độ phóng đại 32 (thị kính 10x, vật kính 3,2) thì 5 khoảng cách ở thước đo thị kính (ký hiệu là
a) trùng khít hồn tồn với 22 khoảng cách của thước đo vật kính (ký hiệu b). Như vậy, mỗi
khoảng
cách của
thước đo
vật kính có
độ dài 10
 m , thì
chiều dài
một khoảng
cách trên
thước đo
thị kính ở
độ phóng
đại trên là:

10b 10 m �22

 44  m
a
5
Khi đã biết độ dài một khoảng của thước đo thị kính, lấy thước đo vật kính ra và thay bằng tiêu
bản vật cần đo lên bàn kính hiển vi, xác định xem vật đó có độ dài là mấy khoảng của thước đo
thị kính
• Ví dụ 2
Vật cần đo hoặc tế bào vi sinh vật có độ dài là ba khoảng của thước đo thị kính ở cùng độ
phóng đại nêu trên (là 32) thì giá trị độ dài của nó là:
17

44  m �3  132  m
Muốn đo được chính xác, người ta thường đo nhiều lần rồi lấy giá trị trung bình
Nếu dùng thước đo thị kính loại AM-9-2 ta làm như sau : Nhìn vào thị kính, điều chỉnh trống
chia độ cho giao điểm của vạch chéo chạy về số 0. Đồng thời điều chỉnh cho giới hạn thứ nhất
của vật cần đo rơi vào trùng giao điểm trên. Tiếp theo, vặn trống chia độ cho giao diểm của
vạch
chéo chạy sang điểm giới hạn thứ hai của vật đo. Đọc số chẵn trên thước đo cố định của
thị kính và số lẻ trên trống chia độ
• Ví dụ 3
Chiều dài của vật cần đo ứng với ba vạch trên thước cố định và 25 vạch trên trống chia độ. Giả
sử độ phóng đại đang đo hệ số một khoảng trên thước đo cố định của thị kính là 44  m thì độ
dài của vật đo sẽ là:
44  m �25
44  m �3 
 143 m
100

XVII.

Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ
1) Đối tượng nghiên cứu
• Đối tượng nghiên cứu: tế bào sinh vật

17)
•
•
•
•

Dụng cụ, hóa chất và vật liệu

Kính hiển vi
Thước đo thị kính AM-9-2
Thước đo vật kính
Tế bào sinh vật

XVIII.

Các bước tiến hành
1) Bước 1
Quan sát tế bào trên tiêu bản

18)

Bước 2
Tiến hành đo kích thước của 40 tế bào ở các vị trí khác nhau trên tiêu bản bằng cách đo sử

dụng máy đo gắn với máy vi tính (cách 1) và cách đo trực tiếp (cách 2)

19)

Bước 3
Sử dụng quy tắc toán thống kê tính kích thước trung bình của tế bào

XIX.

Kết quả thực hành
Tính kích thước trung bình của tế bào theo quy tắc của toán thống kê sinh học

1) Kết quả đo theo đơn vị trường nhìn (pixel)
Tế

Bào

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Kích
Thước

111,8

73,76

84,4

38,59

95,86

116,9

92,2

69,18

107,02

121,51

Tế
Bào

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

Kích
Thước

100

106,83

66,48

121,71

130,92

32

97,08

92,65

40,8

96,03

18


20)

XX.

Quy đổi sang mm: 1mm=4900pixels

Tế
Bào

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Kích
Thước

0,0228

0,015

0,0172

0,0079

0,0196

0,0239

0,0188

0,0141

0,0218

0,0248

Tế
Bào

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

Kích
Thước

0,0204

0,0218

0.0136

0,0248

0,0267

0,0065

0,0198

0.0189

0,0083

0,0196

Giải thích và kết luận
1) Giải thích
21) Kết luận
• Kích thước tế bào trung bình: x  0, 018315mm
2
5
• Phương sai mẫu hiệu chỉnh: s  3,3739.10
2
3
• Độ lệch chuẩn:   s  5,8085.10

XXI.

Tài liệu tham khảo
• Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005
• Lương Dun Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập), NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội,
2010
• Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2002

BÀI 5
XÁC ĐỊNH THẾ DZETA CỦA TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG
PHÁP VI ĐIỆN DI
MỤC TIÊU
Những yêu cầu cần nắm được sau khi nghiên cứu bài thực tập này:
 Hiểu được khái niệm vi điện di
 Giải thích được tại sao một số tế bào rời và đa số các đại phân tử sinh vật lại
chuyển động được dưới tác dụng của điện trường
 Hiểu được nguồn gốc điện tích trên bề mặt tế bào
 Phân biệt được các khái niệm: ion tạo thế, ion nghịch, lớp hấp phụ và lớp
khuyếch tán
 Hiểu được bản chất và ý nghĩa của thế điện động (thế Dzeta)
 Thành thạo phương pháp xác định thế Dzeta điểm đẳng điện của loại tế bào
rời và dấu của điện tích bề mặt
19


I.

Cơ sở lý thuyết
1) Khái niệm điện di
• Trong các hệ dị thể - đặc biệt là trong các đối tượng sinh vật ln xảy ra q trình chuyển động
tương đối giữa các pha phân tán so với môi trường phân tán dưới dạng tác dụng của điện trường
không đổi. Hay có sự chênh lệch về áp suất thủy tĩnh hoặc gradient trọng lực thường xuất hiện
hiệu điện thế giữa các pha phân tán với môi trường phân tán. Những hiện tượng này được gọi là
các hiện tượng điện động học. Một trong các hiện tượng điện động học là điện di
• Điện di là sự chuyển động của pha phân tán so với môi trường phân tán dưới tác dụng của điện
trường không đổi. Chẳng hạn trong hệ dị thể gồm các tế bào nấm men và môi trường sống của
chúng thì các tế bào được coi là pha phân tán, nó sẽ chuyển động khi có tác dụng của dịng điện
một chiều bên ngồi so với mơi trường sống của nó – mơi trường phân tán. Sở dĩ tế bào có thể di

chuyển định hướng được vì chúng có điện tích bề mặt. Nếu trên bề mặt tích điện dương thì
chúng sẽ chuyển động về phía cực âm của điện trường ngồi, ngược lại nếu tích điện âm thi
chúng sẽ chuyển động về phía cực dương. Như vậy một cách cụ thể hơn có thể nói rằng vi điện
di là sự chuyển động của các pha phân tán về phía điện cực có dấu trái với dấu điện tích bề mặt
của chúng
• Sở dĩ trên bề mặt của pha phân tán có điện tích là do 2 ngun nhân cơ bản sau:
• Do chúng có khả năng hấp phụ các ion lên bề mặt
• Do chúng có khả năng ion hóa các nhóm phân li của phân tử cấu thành nên chúng
• Những ion bám chặt trên bề mặt hạt được gọi là ion tạo thế. Chúng có ái lực đối với các ion
khác dấu phân bố trong môi trường phân tán. Loại ion này được gọi là ion nghịch. Càng xa bề
mặt các ion tạo thế, lượng ion phân bố càng thưa dần

22)

Thế điện động (thế Dzeta)

• Do lực hút tĩnh điện giữa hai loại ion tạo thế và ion nghịch đã tạo nên trên bề mặt hạt một lớp
điện kép. Chiều dày lớp điện kép này phụ thuộc vào nồng độ của dung dịch, điện tích của hạt và
o
nhiệt độ của mơi trường, nó có thể biến thiên từ vài A đến vài  m

20


• Cấu trúc lớp điện tích kép khá phức tạp, có thể cho rằng ngồi các ion tạo thế gắn chặt trên bề
mặt hạt cịn có một số các ion nghịch bám xung quanh do lực hút tĩnh điện. Lớp chất lỏng của
mơi trường có các ion nghịch bám quanh bề mặt hạt, chuyển động cùng với hạt dưới tác động
của điện trường ngoài được gọi là lớp hấp phụ. Lớp chất lỏng của mơi trường ion nghịch cịn lại
được gọi là lớp khuếch tán. Khi hạt chuyển động trong điện trường giữa lớp hấp phụ và lớp
khuếch tán xuất hiện một bước nhảy điện thế. Điện thế này được gọi là thế điện động hay thế

Dzeta, ký hiệu là 

• Dấu của thế ζ do dấu của ion tạo thế quyết định, còn giá trị của thế  tỷ lệ với hiệu số điện thế

do ion tạo thế với ion nghịch trong lớp hấp thụ. Nói một cách khác, giá trị của thế  bằng giá trị
thế do các ion nghịch trong lớp khuếch tán tạo nên. Vì vậy lượng ion nghịch trong lớp khuếch
tán càng lớn thì thế  càng cao

•  - điện thế của mỗi loại tế bào ở trạng thái sinh lý bình thường là một đại lượng cố định. Khi bị
tổn thương hay biến đổi trạng thái thì giá trị thế  thay đổi. Dựa vào giá trị  điện thế có thể
đánh giá về trạng thái chức năng của tế bào

• Khơng có một phương pháp nào có thể đo giá trị thế  một cách trực tiếp. Người ta thường sử

dụng phương pháp vi điện di để xác định giá trị  một cách gián tiếp
• Nguyên lý của phương pháp vi điện di là sử dụng nguồn điện một chiều (80-100V) làm cho tế
bào chuyển động. Quan sát sự chuyển động của tế bào dưới kính hiển vi và xác định tốc độ di
động v của chúng để tính giá trị thế 
• Đối với một hạt tích điện q dưới tác động của điện trường E lực f1 làm cho hạt chuyển động là:
f1  q.E
• Khi chuyển động, hạt chịu tác dụng của lực cản f 2 , theo định luật Stocxơ thì:
f 2  6 vr (đối với hình cầu)
f 2  4 vr (đối với dạng gần giống hình cầu)

Trong đó:
 là độ nhớt của mơi trường trong đó hạt chuyển động (puazo)
v là tốc độ chuyển động của hạt (  m / s)
r là bán kính của hạt
• Khi hạt chuyển động đều thì f1  f 2 nghĩa là q.E  6 vr
• Đối với một hạt hình cầu có thể xem:

q   r
Trong đó:

 là điện thế trên bề mặt hạt hình cầu
 là hằng số điện mơi

r là bán kính của hạt
Ta có thể viết:  rE  6 vr

21


• Để cho đơn giản, coi môi trường phân tán là nước thì hằng số điện mơi   81 ;   0, 01 puazơ.
Theo cơng thức trên thì thế  được tính bằng đơn vị tĩnh điện (đvtđ). Thay các giá trị vào ta sẽ
được biểu thức để tính giá trị thế  đối với các tế bào nấm men:
v
  140 (mV )
E
v

s
t ( s - quãng đường, t -thời gian hạt đi được quãng đường S) gradient điện thế

• Ta biết tốc độ
u
E  (V / cm)
l
( u - hiệu điện thế giữa hai đầu cầu aga hình chữ L trong buồng đo, l - khoảng
cách giữa hai đầu cầu đó)
S .l

  140
u.t
Từ đó:

22


XXII.

Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ
1) Đối tượng nghiên cứu
• Đối tượng nghiên cứu của bài này: tế bào nấm men

23)

Dụng cụ, hóa chất và vật liệu

• 1 kính hiển vi quang học có trắc vi vật kính
và trắc vi thị kính
• Nguồn điện một chiều 150V và
điện cực bằng đồng và dây dẫn
• 1 khóa 6 chốt để đảo mạch
• 2 cầu agar hình chữ U
• 1 panh
•
•
•
•
•
•

•
•

XXIII.

1 buồng đo điện di
2 cầu agar hình chữ L
2 cơng tơ hút
2 pipet loại 2 ml và 5 ml
250 ml dung dịch acid citric 0,1M
10 ống nghiệm loại 10 ml
1 giá pipet
1 giá ống nghiệm

 Giấy thấm, khăn lau thấm nước
 1 ống tế bào nấm men
 250ml dung dịch KCl bão hòa
 250ml dung dịch CuSO4 10%
 250ml glucose 8%
 250ml Na2 HPO4
 1 đèn cồn
 1 đũa thủy tinh
 1 đồng hồ bấm giây
 1 đồng hồ đo điện thế vạn năng
 1 mẫu giấy kẻ oli dài 5cm đến 7cm
 2 đĩa đồng hồ loại to

Các bước tiến hành
1) Mắc mạch điện theo hình

24) Pha
Mac-indịch đệm

dung dịch
ven và dung
Mac-in-ven

Pha
in-ven có các
5,2; 6,2; 7,0

dung dịch MacpH = 2,4; 4,0;
bằng cách trộn
Na2 HPO4 0,2M

hai dung dịch
và dung dịch

acid citric 0,1M
23


theo tỉ lệ. Lấy dung dịch pH vừa pha trên trộn
với dung dịch glucose 8% tỉ lệ 1:9 sẽ được dung
dịch đệm Mac-in-ven có pH tương ứng
Na2 HPO4 0,2M ( l )
pH
Acid citric 0,1M ( l )
Glucose 8% ( l )
2,4

31
469
4500
4,0
192,5
307,5
4500
5,2
268
232
4500
6,2
330,5
169,5
4500
7,0
412
88
4500

25)
26)

XXIV.

Xác định dấu điện tích bề mặt tế bào và giá trị thế dzeta của chúng
Xác định điểm đẳng điện của tế bào

Kết quả thực hành
Kết quả thu được lập thành bảng số liệu

STT
1
2
3
4

XXV.

pH
3,0
4,2
6,0
7,0

S (cm)
0,05
0,05
0,05
0,05

L(cm)
3,5
3,5
3,5
3,5

U ( mV )
63,4
69,2
83,8

87

t ( s)
3,25
4
6,5
9,6


0,085
0,063
0,032
0,021

Giải thích và kết luận
1) Giải thích

• pH của dung dịch càng tăng thì thế  của tế bào càng giảm do vời pH càng thấp tức nồng độ

ion H càng cao thì điện tích Q chạy qua tế bào càng nhiều. Trong khi khoảng cách giữa 2 lớp
hấp phụ và lớp khuyếch tán không đổi, điện thế Q được chuyển đến tế bào giảm dần từ pH thấp
đến pH cao do vậy thế  của giảm dần

27)

Kết luận

• Với pH càng tăng thì thì tế bào di chuyển càng chậm và thế  của chúng càng nhỏ. Vì vậy điểm
đẳng điện của chúng là pH �7,0

XXVI.

Tài liệu tham khảo
• Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005
• Lương Dun Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập), NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội,
2010
• Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2002

BÀI 6
24


ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BRADFORD (PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ)
I. MỤCCơ
sở lý thuyết
TIÊU
Phương pháp Bradford là phương pháp xác định protein dựa vào sự tạo phức hợp với protein
Những
yêu cầu
cần nắm
được
khi nghiên
cứu nhuộm
bài thực
tậpở 3này:
của
thuốc nhuộm
Coomassie
Brillant

Bluesau
(Bradford
1976). Thuốc
tồn tại
dạng: cation
 Hiểu
được
phản
ứng
của(xanh
thuốc
nhuộm
Commasie
xanhTrong
và ứng
dụngacid,
trong
(đỏ),
trung tính
(xanh
lá), và
anion
dương)
(Compton
và Jones 1985).
mơi trường
nm
thuốc
nhuộm tồnnồng
tại chủ độ

yếu ở dạng cation proton hóa kép có màu đỏ (Amax = 470
). Tuy nhiên,
xét nghiệm
khi thuốc nhuộm gắn với protein, nó bị biến đổi thành dạng ổn định chưa proton hóa có màu xanh
 Biết
được
tácetsử
máy và
kết etquả
quang
phổ kế
nm )thao
(Amax
= 595
(Reisner
al. dụng
1975, Fazekes
de đọc
St. Groth
al. 1963,
Sedmack
and Grossberg
nm ởxác
 Hiểu
được
ápmàu
dụng
định
luật
Lambert-Beer

trong
định
nồng
độ
1977).
Chính
ở dạng
xanh
này nó
bị phát
hiện với bước sóng
595việc
phương
pháp
này bằng
quang
chấtphổ kế hoặc đầu đọc microplate. Các thí nghiệm với acid polyamino tổng hợp chỉ ra rằng thuốc

nhuộm Coomassie Brillant Blue G-250 gắn chủ yếu với amino acid đơn giản (đặc biệt là arginine) và
amino acid thơm (Compton và Jones 1985). Spector (1978) phát hiện ra rằng hệ số tận diệt của dung
dịch phức hợp thuốc nhuộm albumin là không đổi trong phạm vi nồng độ 10 lần. Do đó, định luật Beer
có thể được áp dụng để định lượng protein một cách chính xác bằng cách chọn tỉ lệ thích hợp của thể
tích thuốc nhuộm để lấy mẫu nồng độ. Một vài loại tương tác giữa protein hóa học và thuốc nhuộm
hóa học làm ảnh hưởng đến thí nghiệm. Các chất khơng phải protein cũng có thể ảnh hưởng đến thí
nghiệm nếu làm thay đổi cân bằng giữa ba dạng của thuốc nhuộm. Một vài loại chất tẩy rửa, chất tạo
mùi, một số chất kích thích protein đơn giản làm ổn định màu xanh lá cây của thuốc nhuộm bằng cách
gắn trực tiếp hoặc làm thay đổi pH (Compton và Jones 1985, Fanger 1987). Mặc dù vậy nhiều tác nhân
hóa học khơng ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của màu thuốc nhuộm khi sử dụng trong quy trình
chuẩn

XXVII.

XXVIII.

Đối tượng nghiên cứu và dụng dụ
1) Đối tượng nghiên cứu
• Đối tượng nghiên cứu: dung dịch protein

28)
•
•
•
•

Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
Dung dịch BSA (1mg / ml )
Dung dịch thuốc nhuộm xanh Commasie 1x
Protein với nồng độ chưa xác định
Quang phổ kế

Các bước tiến hành
1) Cách thức thí nghiệm

25