Báo cáo thực hành lý sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Báo cáo thực hành Lý sinh

Giảng viên:

TS. Đỗ Minh Hà
TS. Phạm Thị Bích
TS. Lê Lan Phương
Lớp: K9 Răng hàm mặt
Năm học: 2020-2021

Hà Nội 2021
BÀI 1.....................................................................................................................4
XÁC ĐỊNH NĂNG LƯỢNG HOẠT HÓA CỦA Q TRÌNH CO BĨP TIM ẾCH TÁCH
RỜI.......................................................................................................................4
I.

Cơ sở lý thuyết.................................................................................................................4

II.

Chuẩn bị.......................................................................................................................4

III.

Các bước tiến hành.......................................................................................................5

IV.

Kết quả thực hành........................................................................................................6

V.

Giải thích và kết luận...................................................................................................6


VI.

Tài liệu tham khảo........................................................................................................7

BÀI 2.....................................................................................................................8
TÍNH THẤM MỘT CHIỀU CỦA DA ẾCH.....................................................8
I.

Cơ sở lý thuyết.................................................................................................................8

II.

Chuẩn bị.......................................................................................................................8

III.

Các bước tiến hành.......................................................................................................9

IV.

Kết quả thực hành........................................................................................................9

V.

Giải thích và kết luận.................................................................................................10

VI.

Tài liệu tham khảo......................................................................................................10

BÀI 3...................................................................................................................11
XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN CỦA MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU...........................11
I.

Cơ sở lý thuyết...............................................................................................................11

II.

Chuẩn bị.....................................................................................................................12

III.

Các bước tiến hành:....................................................................................................13

IV.

Kết quả thực hành......................................................................................................13

V.

Giải thích và kết luận.................................................................................................14

VI.

Tài liệu tham khảo......................................................................................................14

BÀI 4...................................................................................................................15
ĐO KÍCH THƯỚC TẾ BÀO TRÊN KÍNH HIỂN VI...................................15
I.

Cơ sở lí thuyết................................................................................................................15

II.

Chuẩn bị.....................................................................................................................16

III.

Các bước tiến hành.....................................................................................................16

IV.

Kết quả thực hành......................................................................................................16

V.

Giải thích kết quả.......................................................................................................16

VI.

Tài liệu tham khảo......................................................................................................17

BÀI 5...................................................................................................................18

XÁC ĐỊNH THẾ DZETA CỦA TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI ĐIỆN
DI.........................................................................................................................18
I.

Cơ sở lý thuyết...............................................................................................................18

II.

Chuẩn bị.....................................................................................................................20

III.

Các bước tiến hành.....................................................................................................20

IV.

Kết quả thực hành......................................................................................................21

V.

Giải thích và kết luận.................................................................................................21

VI.

Tài liệu tham khảo......................................................................................................21

BÀI 6...................................................................................................................22
ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD
(PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ)................................................22
2

I.

Cơ sở lý thuyết...............................................................................................................22

II.

Chuẩn bị.....................................................................................................................23

III.

Các bước tiến hành.....................................................................................................23

IV.

Kết quả thực hành......................................................................................................23

V.

Giải thích và kết luận.................................................................................................23

VI.

Tài liệu tham khảo......................................................................................................24

BÀI 7...................................................................................................................25
QUAN SÁT HIỆN TƯỢNG HUỲNH QUANG KHI CHIẾU TIA CỰC TÍM
.............................................................................................................................25
I.

Cơ sở lý thuyết...............................................................................................................25

II.

Chuẩn bị.....................................................................................................................27

III.

Các bước tiến hành.....................................................................................................27

IV.

Kết quả thực hành......................................................................................................27

V.

Quan sát và kết luận...................................................................................................28

VI.

Tài liệu tham khảo......................................................................................................28

3


BÀI 1
XÁC ĐỊNH NĂNG LƯỢNG HOẠT HĨA CỦA Q
TRÌNH CO BÓP TIM ẾCH TÁCH RỜI
I. MỤC

CơTIÊU
sở lý thuyết
 Năng lượng hoạt hóa: Năng lượng tối thiểu của các nguyên tử, phân tử phá vỡ trạng thái ban đầu
Những
cầu
nắmphản
được
sauđó.khi nghiên cứu bài thực tập này:
để thamu
gia vào
mộtcần
q trính
ứng nào
Hệ thống
sống,nghiên
cơng thức cứu
xác định
năng
lượnghọc.
hoạt hóa được ghi như sau:
 Đối
tượng
của
động
 Thế nào là năng lượng hoạt hóa của một phản ứng (một quá
Ehh 2  0, 46.T1.T3 .lg Q10
Ehh1  0, 46.T1.T2 .lg Q10
trình)?
 Mối liên quan giữa hằng số tốc độ của phản ứng với nhiệt độ
Q10 và ý nghĩa của nó.

 Đại
o
T1 : lượng
Nhiệt độ tại thời điểm t ( C ) .
 Thành thạo phương pháp cô lập tim ếch và tính năng lượng hoạt
(oC ) .
t  10học.
2 : Nhiệt
hóa Tcủa
mộtđộq
trình
sinh
tại thời
điểm
T3 : Nhiệt độ tại thời điểm t  10 (oC ) .
KT 10
KT
Q10 : Tỉ số KT hay KT 10 .

KT : Số lần nhịp đập của tim ếch tách rời trong 1 phút tại nhiệt độ t .
KT 10 : Số lần nhịp đập của tim ếch tách rời trong 1 phút tại nhiệt độ t  10 .
KT 10 : Số lần nhịp đập của tim ếch tách rời trong 1 phút tại nhiệt độ t  10 .

II.

Chuẩn bị
 Đối tượng: ếch sống.
 Dụng cụ: 1 kéo to, 1 kéo con, 1 chọc tủy, 1 khay mổ (gỗ), định ghim, cốc thủy tinh, canuyl, cuộn
chỉ, giấy ăn.
 Vật liệu: bàn ghim, công tơ hút, bình tam giác có nút cao su dùi 2 lỗ, khay nước đá, nồi nước cách

thủy, nhiệt kế, đồng hồ bấm giây.
 Hóa chất: dung dịch sinh lý máu người (NaCl 0,9%, glucose, …).

III.

Các bước tiến hành
 Bước 1: Bắt ếch, chọc tủy ếch để ếch bất động.
 Bắt ếch, để mặt lưng lên trên.
Lưu ý: Không được ôm vào bụng ếch nếu không ếch sẽ chết.
 Ấn đầu ếch xuống, tìm nơi tiếp giáp giữa xương sống và hộp sọ, đó là chỗ lõm nằm ở đỉnh của
tam giác đều có đáy là đường nối giữa hai mắt ếch.

4


 Ấn mạnh kim chọc và đâm sâu xuống tủy sống, nếu phá đúng tủy thì hai chân ếch sẽ duỗi
thẳng ra.
Hình 1-1. Mổ phanh ngực ếch

 Bước 2: Cố định ếch.
 Dùng ghim cố định 4 chi ếch vào bàn mổ.
 Bước 3: Mổ lộ tim ếch.
 Dùng kéo to mở rộng khoang ngực ếch cắt bỏ một mảnh da ngực hình tam giác. Tiếp đó dùng
panh kẹp vào mỏm sụn xương ức, nhấc thành trước lồng ngực lên và cắt bỏ đi một mảnh lồng
ngực theo hình tam giác như đã cắt ở da trước đó.
 Thấy tim lộ rõ trong xoang bao tim. Dùng panh kẹp nâng màng bao tim lên và dùng kéo cắt
đứt màng bao tim.

Hình 1-2. Đưa
mạch trái (đã được cắt vát)

đầu canuyl vào động

 Bước 4: Tách rời tim ếch.
 Dùng kéo và panh nhỏ,
luồn sợi chỉ 1 xuống
dưới động mạch trái, sợi
chỉ 2 xuống dưới
động mạch phải, sợi chỉ 3
xuống dưới tĩnh mạch
chủ lên.
 Đặt các sợi chỉ sao cho ro ràng, thắt sợi chỉ 2 và 3
 Nhẹ nhàng dùng sợi chỉ 1 nâng động mạch trái lên xong dùng kéo cắt vát động mạch trái, cách
1 lỗ nhỏ để luồn canuyl (có chứa dung dịch sinh lý) qua tâm nhĩ vào sâu tâm thất.
 Dùng ống hút hút bỏ máu trong canuyl, tiếp tục cho dung dịch sinh lý vào, lại hút bỏ, rửa sạch
tim cho đến khi toàn bộ máu trong tim được thay bằng dung dịch sinh lý. Khi thấy tim trắng,
nước sinh lý trong canuyl dâng lên, hạ xuống theo nhịp tim thì được.
 Thắt chặt chỉ, buộc động mạch trái vào canuyl, dùng kéo cắt rời tim ra khỏi lồng ngực ếch.
 Gắn canuyl có tim ếch vào lỗ nhỏ trên nút bình tạo ẩm.
 Bước 5 : Đếm nhịp tim ếch và ghi lại kết quả.
5


 Chuẩn bị ba bình tam giác đựng dung dịch sinh lý, đặt vào ba môi trường khác nhau, gắn nhiệt
o
o
kế vào một lỗ trên nắp cao su: nhiệt độ phòng ( 31 C ), khay nước đá ( 21 C ), nồi đun sôi
o
cách thủy ( 41 C ).
 Gắn canuyl có tim ếch vào lần lượt ba mơi trường nhiệt độ, đồng thời đếm nhịp tim thông qua

nhịp lên xuống của nước sinh lý trong canuyl. Ở mỗi môi trường đếm số nhịp trong 1 phút.
 Ghi kết quả thu được.

Hình 1-3.

Đưa tim ếch rời vào bình đựng dung

dịch sinh lý

IV.

V.

Kết quả thực hành
Thời gian

Số
th
ứ
tự

Nhiệt
độ

Số
nhịp
đập

Lần
1

Lần
2

Lần
3

1
2
3

21oC
31oC
41oC

20
20
20

41
48
54

36
45
51

33
39
48

Trung
bình

Hằng số
tốc độ KT

Đại
lượng
Q10

Năng
lượng
hoạt
hóa
Ehh

38
44
51

38
44
51

1,1578
1,159
1,1578

2617

2815
2617

Giải thích và kết luận
1) Giải thích
 Khi tim ếch được tách rời khỏi cơ thể, vẫn có khả năng co bóp là nhờ hệ thống nút tự phát các
xung động và dẫn truyền xung động. Hệ thống nút là nút xoang, nút nhĩ thất, bó His, mạng lưới
Purkinje. Hệ thống nút nếu tự động phát xung thì tần số khoảng 40-50 nhịp/phút.
 Nhiệt độ càng cao thì sự chuyển động của các phân tử càng lớn, các phân tử va chạm
càng nhiều và mạnh làm phản ứng diễn ra nhanh, do đó sự tạo nhịp của nút xoang và lan
truyền các xung nhanh và mạnh mẽ. Vì thế, số nhịp tim đập trong một phút cũng nhiều
o
hơn ở nhiệt độ thấp hơn 10 C .
 Năng lượng hoạt hóa: Tốc độ phản ứng xảy ra càng nhanh khi nhiệt độ cao thì năng lượng hoạt
hóa càng lớn. Nói cách khác là nhiệt độ cao, số lượng các phân tử có năng lượng bằng hoặc lớn
hơn năng lượng hoạt hóa sẽ tăng lên làm tốc độ phản ứng tăng lên, năng lượng hoạt hóa cũng tăng
lên. Năng lượng hoạt hóa ở T1 khi nhiệt độ tăng T2 lớn hơn khi giảm xuống T3 .

6


2) Kết luận
 Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng và năng lượng hoạt hóa. Nhiệt độ càng cao, tốc
độ phản ứng càng lớn và năng lượng hoạt hóa càng nhiều.

VI.

Tài liệu tham khảo
 Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005.
 Lương Duyên Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập), NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội,

2010.
 Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2002.

7


BÀI 2
TÍNH THẤM MỘT CHIỀU CỦA DA ẾCH
TIÊU
I. MỤCCơ
sở lý thuyết
 Cấu trúc
màng
tế bào:
Những
yêu
cầu
cần nắm được sau khi nghiên cứu bài thực tập này:
 Cơ
chếlà
vậntính
chuyển
thụ động
 Thế
nào
thấm
của tế bào và mơ?
 Cơ chế vận chuyển tích cực: Tốc độ cũng như chiều hướng thâm nhập của các chất vào tế
 Cơ sở
của hiện tượng màng có tính thấm chọn lọc?

bào và mơ khơng những chỉ phụ thuộc vào tính thấm chọn lọc của màng mà cịn phụ thuộc
 Haivào
cơbản
chế
chuyển
vậtmức
chất
quađổimàng
tếhóa
bào?
chấtvận
của các
chất và vào
độ thay
tính chất
lý của các chất đó.
 Nếu
có một
chất nào
đó khi
đã thâmthấm
nhập vào
nội bào
nó tham
phảnvà
ứngmơ.
hóa học
 Giải
thích
được

hiện
tượng
một
chiều
củagiatếvàobào
thành một chất khác, hoặc nếu nó chuyển từ trạng thái tự do sang trạng thái liên kết, thì khả
 Nắmnăng
vững
phương pháp dùng chất màu để nghiên cứu tính thấm.
khuếch tán trở lại mơi trường ngồi của nó rất khó xảy ra.
Ví dụ: một axit yếu hoặc kiềm yếu ở ngồi mơi trường chúng không phân li nên dễ dàng
khuếch tán vào trong tế bào. Khi vào bên trong nội bào, do điều kiện môi trường đã thay đổi
nên chúng bị phân li thành các ion, dễ tham gia vào các liên kết hóa học nên mất khả năng
khuếch tán ra ngồi, nên acid yếu và kiềm yếu chỉ có khả năng thấm theo một chiều nhất định.
 Cấu trúc da ếch:

1. Màng cutin
2. Lớp tế bào sừng
3. Các lớp tế bào sinh trưởng biểu mô
4. Lớp tế bào nền
5. Các sắc tố
6. Lớp mơ liên kết

Hình 2-1. Cấu tạo mơ da ếch


Phía ngồi là lớp biểu mơ: tính hấp
thụ cao, acid yếu

Phía trong là lớp mơ liên kết: tính hấp

thụ yếu, kiềm yếu.

Tính thấm máu vào cấu trúc tế bào.

Tính thấm phụ thuộc thế nào vào
trạng thái tế bào?

VII.

Chuẩn bị

Đối tượng: Da đùi ếch.
 Dụng cụ, hóa chất:
 1 kim chọc tủy.
 1 kéo to sắc.
 1 cuộn chỉ.
 1 khay mổ.
 4 ống thủy tinh hình trụ có chiều dài 7-8 cm .
 4 nắp đậy bằng lá nhôm hoặc nhựa, ở giữa được đục một lỗ có đường kính bằng đường kính
ống thủy tinh.
 6 cốc thủy tinh loại 100 ml .
8


 1 máy so màu để xác định mật độ quang học của dung dịch.
o
 100 ml cồn 90 .
 100 ml dung dịch xanh methylene 0.05% trong dung dịch sinh lý.
 100 ml dung dịch sinh lý.
 2 pipet loại 5-10 ml và giá để pipet.

VIII.

Các bước tiến hành
 Bước 1: Chuẩn bị túi da ếch.
 Cẩn thận lột lấy da của 4 bắp chân ếch sao cho không bị thủng để làm các túi da ếch. Dùng 2
chiếc, 1 để nguyên (bình 1), chiếc kia lộn ngược lại (bình 2) cho biểu mơ vào trong rồi ngâm
vào dung dịch sinh lý cho da ếch giữ nguyên trạng thái sinh lý bình thường. 2 chiếc cịn lại làm
o
như trên nhưng ngâm trong dung dịch cồn 96 với thời gian �15 phút nhằm giết chết da ếch.
(bình 3 xi chiều, bình 4 lộn ngược lại).
 Dùng chỉ buộc một đầu những túi da ếch đã chuẩn bị trên vào các ống thủy tinh hình trụ, cịn
đầu kia buộc kín. Cho dung dịch sinh lý vào các túi để kiểm tra xem túi có bị rị rỉ khơng. Nếu
khơng, đổ dung dịch sinh lý đi rồi cho dung dịch xanh methylene 0,05% vào và nhúng các túi
này vào các cốc đựng một lượng dung dịch sinh lý bằng nhau.
Chú ý : Mức xanh methylene trong túi cao bằng mức dung dịch sinh lý trong cốc
 Bước 2: Quan sát hiện tượng thấm của xanh methylene qua các túi da ếch.
 Bước 3: Định lượng xanh methylene đã thấm qua da ếch.

IX.

Kết quả thực hành
Hình 2-2. Kết quả thí nghiệm thu được






Bình 1: Màu trắng trong, khơng có xanh methylene thấm qua.

Bình 2: Màu xanh ở lớp da, có xanh methylene thấm qua 1 chút.
Bình 3: Màu xanh nhiều, xanh methylene thấm qua nhiều hơn bình 4.
Bình 4: Màu xanh nhiều, lượng xanh methylene thấm qua tương đối.

X.

Giải thích và kết luận
1) Giải thích
 Đối với bình 1 và 2: Với cấu tạo của da ếch, lớp tế bào biểu mô ở ngồi và là lớp có tính hấp
thụ cao và có tính acid yếu. Ngược lại, lớp mơ liên kết có tính chất hấp thụ yếu và kiềm kém. Với
dung dịch xanh methylene là dung dịch kiềm yếu nên lớp tế bào biểu mơ và lớp mơ liên kết có
9


tính chất hấp thụ khác nhau. Vì lớp tế bào mơ liên kết có tính hấp thụ cao và dung dịch acid yếu
nên sẽ hấp thụ yếu dung dịch kiềm yếu xanh methylene và đưa dung dịch ra ngồi. Cịn lớp biểu
mơ có tính acid nên các chất bị phân li và bị hấp thụ mạnh dung dịch xanh methylene nên lớp
biểu mô sẽ hấp thụ tốt và giữ lại.
 Bình 2: bị lộn ngược lại nên lớp mơ liên kết sẽ ở phía ngồi và chúng có tính hấp thụ yếu nên
bình khơng có màu xanh .
 Bình 1: lớp da ếch giữ nguyên nên lớp tế bào biểu mơ ở phía ngồi và hấp thụ tốt xanh
methylene nên bình có màu xanh .
 Đối với bình 3 và 4 : Cồn đã giết chết tế bào trên da ếch. Làm cho dung dịch tự do khuếch tán
theo 2 chiều.

3) Kết luận
 Tính thấm khơng những chỉ phụ thuộc vào cấu trúc đặc trưng của từng loại tế bào và mơ mà cịn
phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái chức năng của chúng.

XI.

Tài liệu tham khảo
 Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005.
 Lương Duyên Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập), NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội,
2010.
 Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2002.

10


BÀI 3
XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN CỦA MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU
I. MỤCCơ
sở lý thuyết
TIÊU
 Màng tế bào có một ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong đời sống của tế bào. U.B.Frank - một nhà lý
Những
yêu
cầu
cần
nắm
sau
khi
cứu
tậpMàng
này:ở đây
sinh nổi
tiếng
đã nói
rằng:

“Mọiđược
hoạt động
sống
đềunghiên
diễn ra trên
“sânbài
khấu”thực
- màng”.
được hiểu
ý nghĩa
rộng, gồm
các loạiưu
màng
có mặt ởnhược
bên trongtrương
tế bào (màng
bào) và
 Phân
biệttheo
thếmộtnào
là môi
trường
trương,
vànội
đẳng
màng sinh chất, màng bao quanh tế bào.
trương.
 Màng sinh chất giữ nhiệm vụ bảo vệ, trao đổi thông tin và vật chất giữa tế bào với mơi trường bên
 Phản
động

vậtđiển
vàhình
thực
vật trong
các
mơi
ngồi.ứng
Tế bàocủa
hồngtế
cầubào
là một
đối tượng
để chúng
ta nghiên
cứuloại
cấu tạo,
tính trường
chất và
đó. chức năng của màng tế bào.
 Thành phần cấu trúc nào của màng tế bào hồng cầu giúp nó có thể
thay đổi thể tích trong một giới hạn nhất định.
 Thế nào là độ bền của màng tế bào hồng cầu. Ý nghĩa.
 Thành thạo phương pháp sử dụng dung dịch nhược trương xác định
độ bền của màng tế bào hồng cầu.

Hình 3-1. Tế bào hồng cầu người dưới kính hiển vi điện tử

 Tế bào hồng cầu có bề mặt lõm để tăng diện tích tiếp xúc với mơi trường ngồi. Hồng cầu trưởng
thành là một loại tế bào không nhân. Cấu tạo màng tế bào hồng cầu, nhìn chung giống như màng
sinh chất của các loại tế bào khác, bao gồm lớp phospholipid kép cùng với các protein bám màng

và xuyên màng. Có một điểm khác biệt là ở bề mặt bên trong màng tế bào hồng cầu tồn tại một
mạng lưới vật chất được gọi là spectrin, có nguồn gốc là protein dạng sợi.
 Spectrin chiếm một tỉ lệ là 30% tổng số protein của màng và là phức hợp của hai sợi polypeptit có
trọng lượng phân tử khoảng 220.000 – 240.000 Da. Cùng với một vài loại protein khác, spectrin
tham gia vào q trình biến đổi hình dạng hồng cầu thơng qua việc co ngắn hay duỗi dài dạng sợi
của mình. Bằng cách đó tế bào hồng cầu có thể biến đổi hình dạng giúp cho nó đi qua được các
mao mạch nhỏ li ti, ở khắp cơ thể. Đặc biệt là ở lách, những tế bào hồng cầu đã già hoặc bị thối
hóa chức năng, khả năng đàn hồi co giãn các sợi spectrin kém, khơng có khả năng đi qua mao
mạch kiểm soát của cơ quan màng và bị tiêu hủy.
� Thành phần cấu trúc của màng tế bào hồng cầu giúp cho nó có thể thay đổi thể tích trong một
giới hạn nhất định là spectrin.

11


Mạng lưới Spectrin
bào hồng cầu cừu

Hình 3-2.
bên trong màng tế

 Ở trạng thái sinh
lí bình thường,
màng hồng cầu
khá bền vững. Thể
tích của tế bào
thường khơng thay
đổi và được điều
tiết bởi tỉ lệ lượng
các chất hịa tan

bên trong và bên
ngồi tế bào. Lượng các ion của các muối hòa tan trong tế bào là một hằng số ổn định, do đó thể
tích tế bào phụ thuộc vào lượng ion của mơi trường bên ngồi. Chúng ta biết có ba loại mơi
trường:

Hình 3-3.
trường

Các môi



Môi
trường ưu
trương: tế

bào nhăn nhúm lại do chịu tác động của áp suất thẩm thấu từ bên ngoài vào.
 Môi trường đẳng trương: màng tế bào hồng cầu bền.
 Môi trường nhược trương: tế bào trương phồng lên và màng của nó bị bung ra do chịu tác
động của một lực gây ra bởi áp suất thẩm thấu từ bên trong làm cho lượng nước trong tế bào
ngày càng tăng cao và cuối cùng giải phóng các chất từ nội bào ra bên ngoài.
� Độ bền của màng hồng cầu chính là nồng độ dung dịch muối trong mơi trường nhược
trương, tại đó khơng xảy ra hiện tượng tế bào hồng cầu bị huyết tiêu.

XII.

Chuẩn bị
 Đối tượng thí nghiệm: Hồng cầu động vật (gà).
 Hoá chất:
 Dung dịch NaCl 1%.

 Nước cất.
 Dụng cụ:
 10 ống nghiệm dùng cho máy ly tâm.
12


 1 pipet.
 Máy ly tâm.

XIII.

Các bước tiến hành
 Bước 1: Lấy mẫu tế bào hồng cầu gà đã tách và rửa sạch huyết tương.
 Bước 2: Chuẩn bị 10 ống li tâm, đánh số từ 1 đến 10.
 Bước 3: Pha vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch muối NaCl tương ứng với các nồng độ 0; 0,1;
0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9%, sau đó thêm vào mỗi ống nghiệm 0,1 ml dịch hồng cầu đã
chuẩn bị trên.

Hình 3-4.
nghiệm
tâm

Các ống
trước khi li

 Bước
4: Để các ống
nghiệm
nghỉ trong
vòng 3-5 phút.

 Bước 5: Quay li tâm với vận tốc 3000 vòng/phút.
 Bước 6: Sau khi li tâm, quan sát màu của dịch. Màu đỏ là màu của huyết sắc tố thoát ra sau khi
màng tế bào hồng cầu bị vỡ. Nồng độ thấp nhất của các ống không có màu đỏ là giới hạn bền của
màng tế
bào
hồng cầu.

XIV.

Kết
thực

quả
hành

Hình 3-5. Các ống từ 1 � 10 từ trái qua phải

Ống

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10
13


Nồng độ
(%)
Màu sắc

XV.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Đỏ

Đỏ

Đỏ

Hồng
nhạt

Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng

Giải thích và kết luận
1) Giải thích
 Do nồng độ NaCl trong mơi trường ít hơn so với trong tế bào hồng cầu (môi trường nhược
trương) làm cho nước đi vào tế bào khiến thể tích tế bào tăng, chúng trương phồng lên rồi bị vỡ ra,
và giải phóng các chất ra ngồi môi trường gây ra hiện tượng huyết tiêu.
 Khi ly tâm, tế bào hồng cầu nguyên vẹn và tế bào hồng cầu bị vỡ sẽ bị lắng xuống dưới đáy. Tuy
nhiên tế bào hồng cầu bị vỡ giải phóng hemoglobin. Ở tốc độ li tâm 3000 vịng/phút khơng đủ
cho hemoglobin lắng xuống nên khuếch tán nên tạo ra màu đỏ của dung dịch. Càng nhiều tế bào
hồng cầu bị vỡ, lượng hemoglobin khuếch tán càng nhiều và dung dịch có màu càng đậm. Trong
khi tế bào hồng cầu nguyên vẹn lắng đọng dưới đáy và không khuếch tán được do quá trình ly
tâm.
 Lượng nước đi vào các ống nghiệm giảm dần từ ống 1 đến ống 10 (vì nồng độ NaCl tăng dần từ

ống 1 đến ống 10 và thể tích ở mỗi ống nghiệm khơng đổi) nên các tế bào trong ống 1 bị vỡ nhiều
nhất làm cho dung dịch có màu đậm nhất. Ở ống 5, tuy nước đi từ môi trường vào trong tế bào
nhưng chưa đủ để gây ra hiện tượng huyết tiêu tức là tế bào hồng cầu trương lên tới mức tối đa
nhưng chưa vỡ.
 Nồng độ nhược trương lớn nhất mà chưa gây ra hiện tượng huyết tiêu là 0,4%.
 Các ống 5, 6, 7, 8, 9 hồng cầu không bị vỡ hoặc trương lên nhưng chưa vỡ lắng xuống đáy dung
dịch, phần trên dung dịch có màu trong suốt.

4) Kết luận
 Giới hạn bền của màng tế bào hồng cầu là 0,4%.

XVI.

Tài liệu tham khảo
 Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005.
 Lương Duyên Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập), NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội,
2010.
 Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2002.

14


BÀI 4
ĐO KÍCH THƯỚC TẾ BÀO TRÊN KÍNH HIỂN VI
I.

Cơ sở lí thuyết
MỤC
TIÊU
 Muốn đo kích thước của những vật nhỏ đang quan sát dưới kính hiển vi như phấn hoa, tế bào hay

Những
u sợi
cầu
nắm được
sau
khi
bài những
thựcthước
tập này:
kích thước
tóc,cần
sợi bơng,…
thì khơng
thể đo
trựcnghiên
tiếp bằngcứu
cách dùng
đo chiều
dài bình
thường
mà phải
cách gián
qua một
đo chiều
dài bình
thường mà
 Quan
sát
thước
đo đo

vậtmộtkính
và tiếp
biếtthơng
được
giáthước
trị độ
dài của
mỗi
phải đo một cách gián tiếp thông qua một thước đo khác được gắn vào thị kính của kính hiển vi là
vạch.
thước đo thị kính hoặc sử dụng máy quay gắn vào kính hiển vi đo qua máy tính.
 Cách
đothước
kíchđothước
tế bào
trên kính hiển vi.
Sử dụng
thị kính hoặc
máy tính.
 Cách
1: sử
dụng thước
thị kính.
 Xác
định
được
hệ sốđodài
của một khoảng thị kính và kích thước
Thường
gặp

2
loại:
trung bình của tế bào hồng cầu.
mm

o
Loại đơn giản là một miếng hình trịn ở giữa có 1 vạch dài 5
được chia ra làm 50
khoảng bằng nhau khi sử dụng được đặt vào một cái gờ giữa 2 thấu kính của thị kính.
o
Loại cải tiến được dùng phổ biến trong các phịng thí nghiệm là loại AM-9-2. Nó được
cấu tạo từ 1 thị kính 15x và một hệ thống chia vạch để đo. Hệ thống chia vạch gồm một kính
hình phẳng cố định, trên đó khắc các vạch cách đều nhau đánh số từ 0 đến 8. Ngồi ra, cịn có
một kính di động có khắc hai vạch chéo nhau đi kèm với hai vạch song song. Kính di động
này được gắn liền với một trống chia độ bên ngồi. Xung quanh vịng trịn trống chia thành
100 vạch bằng nhau. Khi vận trống chia độ hết 1 vịng (đi hết 100 vạch) thì sẽ làm chuyển dịch
1 vạch trên kính cố định (dịch được 1 mm ). Như vậy mỗi vạch trên trống chia độ tương ứng
với 1/100 vạch ở kính cố định.
 Cách 2: sử dụng máy tính.
o
Sử dụng máy quay gắn vào kính hiển vi chuyển hình ảnh các tế bào lên máy tính. Thực
hiện thao tác đo trên máy tính.
Hình 4-1. Thước đo thị kính (ở trên) và vật kính (dưới) nhìn trên kính hiển vi quang học

 Thước đo vật kính
 Thước đo vật kính lị một phiến kính có kích thước 267615 mm . ở chính giữa phiến kính có
khắc một thước đo dài 1 mm thành 100 vạch bằng nhau. Chiều dài mỗi vạch là 0,01 mm .
Thước đo này được bảo vệ bởi một miếng kính nhỏ tròn bằng cách gắn lên trên thước đo.
Xung quanh thước đo được đánh dấu bằng một vòng tròn màu đen. Thước đo này được đặt
lên bàn kính hiển vi để xác định độ dài của các vạch chia trên thước đo thị kính đo thị kính đã

được dùng để đánh dấu khoảng cách hoặc kích thước vật muốn đo.

XVII.

Chuẩn bị
 Đối tượng : tiêu bản tế bào .

 Dụng cụ: Kính hiển vi.
 Thước đo vật kính.
 Hệ thống máy tính máy quay.

15


XVIII.

Các bước tiến hành
 Bước 1: Gắn thiết bị vào kính hiển vi có kết nối với máy tính để chuyển hình ảnh của kính hiển vi
thành hình ảnh trên màn hình máy tính. Chuyển trường nhìn từ kính hiển vi thành trường nhìn
trên máy tính.
 Bước 2: Lắp thước đo vật kính vào kính hiển vi (trên thước đo vật kính có 10 khoảng tổng độ dài
1 mm ).
 Bước 3: Điều chỉnh kính hiển vi với độ phóng đại theo ý muốn (x40). Sau đo, quy đổi đơn vị độ
dài theo đơn vị trên máy tính. Dùng con trỏ chuột kéo thả từ vạch đầu tiên đến vạch liền kề. Máy
tính sẽ hiện lên 1 khoảng trên thước đo vật kính (100  m ) tương đương với độ dài bao nhiêu trên
máy tính (pixel).
 Bước 4: Thay thước đo vật kính bằng tiêu bản tế bào muốn đo kích thước. Lấy nét hình ảnh, tìm
các tế bào muốn đo kích thước, tiến hành đo đường kính của tế bào (kéo thả chuột từ điểm đầu
đến điểm cuối của tế bào) thông qua đơn vị trên máy tinh (pixel).
 Bước 5: tính tốn chuyển từ đơn vị trên máy tính (pixel) thành đơn vị độ dài (  m ) theo yêu cầu.

XIX.

Kết quả thực hành
 Với độ phóng đại x40.
 Ta được 100  m (1 vạch trên thước đo vật kính) tương đương với 482 pixel

XX.

Giải thích kết quả
 Do kích thước tế bào rất bé nên khơng thể quan sát bằng mắt thường vì vậy muốn quan sát tế bào
chúng ta phải quan sát dưới kính hiển vi. Tuy nhiên, kính hiển vi với mỗi độ phóng đại khác nhau
thì lại khác nhau trên cùng một đơn vị độ dài.
STT
Đơn vị trên máy tính (pixel)
Đơn vị độ dài (  m )
1
2
3
4
5

93,02
88,09
95,05
120
152,16

19,30
12,28

19,72
24,9
31,57

 Vì vậy trước khi đo cần phải kiểm tra xem với một đơn vị độ dài cho trước tương đương với bao
nhiêu đơn vị trên máy tính (pixel)
 Với độ phóng đại x40 ta có:
 482 pixeltương đương 100  m
 Khi đo kích thước tế bào theo đơn vị trên máy tính ta được 93,02 pixel thì bằng bao nhiêu theo
đơn vị độ dài:
93, 02 �100
 19,30 m
482
 Tương tự với các tế bào khác ta sẽ tính được đường kính của các tế bào có kết quả như bảng trên.

XXI.

Tài liệu tham khảo
 Bài giảng “ Đo kích thước tế bào trên kính hiển vi ” - TS. Đỗ Minh Hà, khoa Sinh học, Đại học
Khoa học tự nhiên.
 Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2002.

16


BÀI 5
XÁC ĐỊNH THẾ DZETA CỦA TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG
PHÁP VI ĐIỆN DI
I. MỤC
CơTIÊU

sở lý thuyết
1) Khái niệm điện di
Những
yêu
nắm
được
khisinh
nghiên
bài
tập này:
 Trong các
hệ cầu
dị thể cần
- đặc biệt
là trong
các sau
đối tượng
vật lncứu
xảy ra
qthực
trình chuyển
động
 Hiểu
được
khái
niệm
vi
điện
di.
tương đối giữa các pha phân tán so với môi trường phân tán dưới dạng tác dụng của điện trường

khơngthích
đổi. Hayđược
có sự chênh
lệch về
áp suất
tĩnh hoặc
lực thường
xuất hiện
 Giải
tại sao
một
số thủy
tế bào
rời gradient
và đatrọng
số các
đại phân
tử
hiệu điện thế giữa các pha phân tán với môi trường phân tán. Những hiện tượng này được gọi là
sinh
chuyển
được
dưới
dụng
củahọc
điện
trường.
cácvật
hiện lại
tượng

điện độngđộng
học. Một
trong các
hiệntác
tượng
điện động
là điện
di.
 Hiểu
nguồn
điện
bềtrường
mặt phân
tế bào.
Điện diđược
là sự chuyển
độnggốc
của pha
phântích
tán sotrên
với mơi
tán dưới tác dụng của điện
trường khơng
đổi. Chẳng
trongniệm:
hệ dị thể ion
gồm các
bào nấm
và môi trường
sống của

 Phân
biệt được
cáchạnkhái
tạotếthế,
ionmen
nghịch,
lớp hấp
tế bào được coi là pha phân tán, nó sẽ chuyển động khi có tác dụng của dịng điện
phụchúng
và thì
lớpcáckhuếch
tán.
một chiều bên ngồi so với mơi trường sống của nó – mơi trường phân tán. Sở dĩ tế bào có thể di
 Hiểu
bảnđược
chất
và ýcónghĩa
của
thếNếu
điện
(thế
Dzeta).
chuyểnđược
định hướng
vì chúng
điện tích
bề mặt.
trên động
bề mặt tích
điện

dương thì chúng
sẽ chuyểnthạo
động về
phía cực âm
của điện
lại nếu
tích điện
âm điện
thi chúng
sẽ
 Thành
phương
pháp
xáctrường
địnhngồi,
thếngược
Dzeta
điểm
đẳng
của
chuyển động về phía cực dương. Như vậy một cách cụ thể hơn có thể nói rằng vi điện di là sự
loạichuyển
tế bào
dấuphân
của
bề có
mặt.
độngrời
của và
các pha

tánđiện
về phíatích
điện cực
dấu trái với dấu điện tích bề mặt của
chúng.
 Sở dĩ trên bề mặt của pha phân tán có điện tích là do 2 nguyên nhân cơ bản sau:
 Do chúng có khả năng hấp phụ các ion lên bề mặt.
 Do chúng có khả năng ion hóa các nhóm phân li của phân tử cấu thành nên chúng.
 Những ion bám chặt trên bề mặt hạt được gọi là ion tạo thế. Chúng có ái lực đối với các ion khác
dấu phân bố trong môi trường phân tán. Loại ion này được gọi là ion nghịch. Càng xa bề mặt các
ion tạo thế, lượng ion phân bố càng thưa dần.

5) Thế điện động (thế Dzeta)
 Do lực hút tĩnh điện giữa hai loại ion tạo thế và ion nghịch đã tạo nên trên bề mặt hạt một lớp điện
kép. Chiều dày lớp điện kép này phụ thuộc vào nồng độ của dung dịch, điện tích của hạt và nhiệt
o
độ của mơi trường, nó có thể biến thiên từ vài A đến vài  m .
 Cấu trúc lớp điện tích kép khá phức tạp, có thể cho rằng ngồi các ion tạo thế gắn chặt trên bề mặt
hạt còn có một số các ion nghịch bám xung quanh do lực hút tĩnh điện. Lớp chất lỏng của mơi
trường có các ion nghịch bám quanh bề mặt hạt, chuyển động cùng với hạt dưới tác động của điện
trường ngoài được gọi là lớp hấp phụ. Lớp chất lỏng của môi trường ion nghịch còn lại được gọi
là lớp khuếch tán. Khi hạt chuyển động trong điện trường giữa lớp hấp phụ và lớp khuếch tán
xuất hiện một bước nhảy điện thế. Điện thế này được gọi là thế điện động hay thế Dzeta, ký hiệu
là  .

 Dấu của thế ζ do dấu của ion tạo thế quyết định, còn giá trị của thế  tỷ lệ với hiệu số điện thế do
ion tạo thế với ion nghịch trong lớp hấp thụ. Nói một cách khác, giá trị của thế  bằng giá trị thế
do các ion nghịch trong lớp khuếch tán tạo nên. Vì vậy lượng ion nghịch trong lớp khuếch tán
càng lớn thì thế  càng cao.

  - điện thế của mỗi loại tế bào ở trạng thái sinh lý bình thường là một đại lượng cố định. Khi bị
tổn thương hay biến đổi trạng thái thì giá trị thế  thay đổi. Dựa vào giá trị  điện thế có thể
đánh giá về trạng thái chức năng của tế bào.

17


 Khơng có một phương pháp nào có thể đo giá trị thế  một cách trực tiếp. Người ta thường sử

dụng phương pháp vi điện di để xác định giá trị  một cách gián tiếp.
 Nguyên lý của phương pháp vi điện di là sử dụng nguồn điện một chiều (80-100V) làm cho tế
bào chuyển động. Quan sát sự chuyển động của tế bào dưới kính hiển vi và xác định tốc độ di
động v của chúng để tính giá trị thế  .
 Đối với một hạt tích điện q dưới tác động của điện trường E lực f1 làm cho hạt chuyển động là:
f1  q.E
 Khi chuyển động, hạt chịu tác dụng của lực cản f 2 , theo định luật Stocxơ thì:
f 2  6 vr (đối với hình cầu).
f 2  4 vr (đối với dạng gần giống hình cầu).
Trong đó:
 là độ nhớt của mơi trường trong đó hạt chuyển động (puazo).
v là tốc độ chuyển động của hạt (  m / s ) .
r là bán kính của hạt.
 Khi hạt chuyển động đều thì f1  f 2 nghĩa là q.E  6 vr .
 Đối với một hạt hình cầu có thể xem:
q   r
Trong đó:

 là điện thế trên bề mặt hạt hình cầu.
 là hằng số điện mơi.

r là bán kính của hạt.
Ta có thể viết:  rE  6 vr .
 Để cho đơn giản, coi mơi trường phân tán là nước thì hằng số điện môi   81 ;   0, 01 puazơ.
Theo cơng thức trên thì thế  được tính bằng đơn vị tĩnh điện (đvtđ). Thay các giá trị vào ta sẽ
được biểu thức để tính giá trị thế  đối với các tế bào nấm men:
v
  140 ( mV )
E
v

s
t ( s - quãng đường, t -thời gian hạt đi được quãng đường S) gradient điện thế

 Ta biết tốc độ
u
E  (V / cm)
l
( u - hiệu điện thế giữa hai đầu cầu aga hình chữ L trong buồng đo, l - khoảng
cách giữa hai đầu cầu đó).
S .l
  140
u.t
Từ đó:

18


XXII.

Chuẩn bị

1) Đối tượng nghiên cứu
 Đối tượng nghiên cứu của bài này: tế bào nấm men.

6) Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
 1 kính hiển vi quang học có trắc vi vật kính
và trắc vi thị kính.
 Nguồn điện một chiều 150V và
điện cực bằng đồng và dây dẫn.
 1 khóa 6 chốt để đảo mạch.
 2 cầu agar hình chữ U.
 1 panh.









XXIII.

 Giấy thấm, khăn lau thấm nước.
 1 ống tế bào nấm men.
 250ml dung dịch KCl bão hòa.
 250ml dung dịch CuSO4 10%.
 250ml glucose 8%.
 250ml Na2 HPO4 .

1 buồng đo điện di.

2 cầu agar hình chữ L.
2 cơng tơ hút.
2 pipet loại 2 ml và 5 ml .
250 ml dung dịch acid citric 0,1M.
10 ống nghiệm loại 10 ml .
1 giá pipet.
1 giá ống nghiệm.

 1 đèn cồn.
 1 đũa thủy tinh.
 1 đồng hồ bấm giây.
 1 đồng hồ đo điện thế vạn năng.
 1 mẫu giấy kẻ oli dài 5cm đến 7cm.
 2 đĩa đồng hồ loại to.

Các bước tiến hành
1) Mắc mạch điện theo hình
Trong đó:
E - nguồn điện một chiều có hiệu điện thế giữa
K - khóa 6 chốt để đảo chiều dòng điện
1 - buồng đo vi điện di

2 điểm AB bằng 100-120V

2 - cầu agar hình chữ L
3 - cốc đựng dung dịch KCl bão hòa
4 - cầu agar hình chữ U
5 - cốc đựng dung dịch CuSO4 10%
6 - điện cực bằng đồng
Hình 5-1. Sơ đồ buồng đo vi điện di

7) Pha dung dịch Mac-in-ven và
dung dịch đệm Mac-in-ven
 Pha dung dịch Mac-in-ven có các pH =
2,4; 4,0; 5,2; 6,2; 7,0 bằng cách trộn hai
dung dịch Na2 HPO4 0,2M và dung
dịch acid citric 0,1M theo tỉ lệ. Lấy dung
dung dịch glucose 8% tỉ lệ 1:9 sẽ được dung dịch đệm Mac-in-

dịch pH vừa pha trên trộn với
ven có pH tương ứng.
Na2 HPO4 0,2M (  l )
pH
2,4
31

Acid citric 0,1M ( l )
469

Glucose 8% ( l )
4500
19


4,0
5,2
6,2
7,0

192,5

268
330,5
412

307,5
232
169,5
88

4500
4500
4500
4500

8) Xác định dấu điện tích bề mặt tế bào và giá trị thế dzeta của chúng
9) Xác định điểm đẳng điện của tế bào

XXIV.

Kết quả thực hành
Kết quả thu được lập thành bảng số liệu
STT
1
2
3
4

XXV.

pH

3,0
4,2
6,0
7,0

S (cm)
0,05
0,05
0,05
0,05

L(cm)
3,5
3,5
3,5
3,5

U (mV )
63,4
69,2
83,8
87

t ( s)
3,25
4
6,5
9,6



0,085
0,063
0,032
0,021

Giải thích và kết luận
1) Giải thích

 pH của dung dịch càng tăng thì thế  của tế bào càng giảm do vời pH càng thấp tức nồng độ ion
H  càng cao thì điện tích Q chạy qua tế bào càng nhiều. Trong khi khoảng cách giữa 2 lớp hấp
phụ và lớp khuyếch tán không đổi, điện thế Q được chuyển đến tế bào giảm dần từ pH thấp đến
pH cao do vậy thế  của giảm dần.

10) Kết luận

 Với pH càng tăng thì thì tế bào di chuyển càng chậm và thế  của chúng càng nhỏ. Vì vậy điểm
đẳng điện của chúng là pH �7,0.

XXVI.

Tài liệu tham khảo
 Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005.
 Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2002.

20


BÀI 6
ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BRADFORD (PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ)

I. MỤCCơ
sở lý thuyết
TIÊU
Những
được sau khi nghiên cứu bài thực tập này:
I 0 yêu cầu cần
I1 nắm
 I1  I 0 � khối vật chất đó hấp thụ một phần ánh sáng.
 Hiểu được phản ứng của thuốc
nhuộm Commasie xanh và ứng dụng
 Đối với  khác nhau � sự hấp thụ khác nhau.
trong xét nghiệm nồng độ.
 Thay đổi vật chất � thay đổi sự hấp thụ.
 Biết được thao tác sử dụngI máy
 I1 . và đọc kết quả quang phổ kế.
l (độ dày)
 Ihấp thụ= 0
Hiểu
được áp dụng định luật Lambert-Beer trong việc xác định
Nguyên tắc: so màu dựa trên sự thay đổi cực đại hấp thụ của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant
nồng
độkhichất.
Blue
tạo liên kết với thành phần Tyrosin, Tryptophan, Phenyalanin, Histidin, Arginin, Lysin
của protein.
 Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie
Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Thuốc nhuộm tồn tại ở 3 dạng: cation (đỏ), trung tính
(xanh lá), và anion (xanh dương) (Compton và Jones 1985). Trong dung dịch mang tính acid khi
chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thu cực đại là 465 nm
và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại

ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm . Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực
tiếp với nồng độ protein.

Hình 6-1. Sự thay
thu cực đại của

đổi bước sóng hấp
thuốc nhuộm

Coomassie Brilliant

Blue

 Các thí
nghiệm với acid
polyamino
tổng hợp chỉ ra
rằng thuốc
nhuộm Coomassie
Brillant Blue
G-250 gắn chủ yếu
với amino
acid đơn giản (đặc
biệt là
arginine) và amino
acid thơm
(Compton và Jones
1985).
Spector (1978) phát
hiện ra rằng hệ số tận diệt của dung dịch phức hợp thuốc nhuộm albumin là không đổi trong

phạm vi nồng độ 10 lần. Do đó, định luật Beer có thể được áp dụng để định lượng protein một
cách chính xác bằng cách chọn tỉ lệ thích hợp của thể tích thuốc nhuộm để lấy mẫu nồng độ.
 Một vài loại tương tác giữa protein hóa học và thuốc nhuộm hóa học làm ảnh hưởng đến thí
nghiệm. Các chất khơng phải protein cũng có thể ảnh hưởng đến thí nghiệm nếu làm thay đổi cân
21


bằng giữa ba dạng của thuốc nhuộm. Một vài loại chất tẩy rửa, chất tạo mùi, một số chất kích
thích protein đơn giản làm ổn định màu xanh lá cây của thuốc nhuộm bằng cách gắn trực tiếp
hoặc làm thay đổi pH (Compton và Jones 1985, Fanger 1987). Mặc dù vậy nhiều tác nhân hóa
học khơng ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của màu thuốc nhuộm khi sử dụng trong quy
trình chuẩn.

XXVII.

Chuẩn bị
 Dung dịch thuốc nhuộm xanh Commasie 1x.
 Quang phổ kế.
 Dung dịch BSA (1 mg / ml ).
 Protein chưa xác định nồng độ.

XXVIII.

Các bước tiến hành
 Bước 1: Pha hóa chất: Dung dịch Albumin chuẩn (BSA) có nồng độ 10 mg / ml trong PBS.
 Bước 2: Dung dịch thuốc thử Bradford (1 l ):
 CBB G-250 0,1 g được làm tan trong 50 ml methanol, pha với nước cất tới 500 ml để được
dung dịch A (đựng trong chai màu tối có nắp).
 100 ml H3PO4 85% pha loãng tới 500 ml được dung dịch B.
 Pha 1V dung dịch A với 1V dung dịch B rồi lọc lấy dung dịch trong bằng giấy Whatman.

 Bước 3: Dùng piptet hút 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 ml dung dịch BSA vào các ống falcon up tới 1
ml bằng PBS.
 Bước 4: Thêm dung dịch nhuộm vào các ống falcon theo tỉ lệ 2:8.
 Bước 5: Lắc đều, sau đó tắt đèn để phản ứng diễn ra. Tối thiểu 5 phút và không quá 20 phút (bấm
giây đồng hồ để xác định thời gian).
 Bước 6: Xây dựng đường chuẩn và xác định nồng độ của mẫu cần phân tích. Đo bằng quang phổ
kế ở 595 nm để xác định độ hấp thụ (Absorption).

XXIX.

Kết quả thực hành

Ta có bảng kết quả độ hấp thụ quang ở bước sóng 595 nm đo được và nồng độ dung dịch
( mg / ml ) tính được như sau:
o
Nhiệt độ ( C )

Mẫu 1

Mẫu 2

18,9

19

Độ hấp thụ quang ở
0,2732
bước sóng 595 nm

XXX.

0,2714

Giải thích và kết luận
1) Giải thích
 Nếu quang phổ kế trả ra kết quả khác không ở mẫu trắng, ta lấy giá trị trung bình của mẫu trắng
này và trừ giá trị mẫu chuẩn và mẫu cần đo với giá trị này.
 Xây dựng đường chuẩn với độ hấp thụ ở bước sóng 595nm ở trục y và nồng độ ở trục x. Xác định
nồng độ dung dịch mẫu chưa biết bằng đường chuẩn. Nếu mẫu đã được pha loãng ta xác định
nồng độ mẫu bằng cách nhân với hệ số pha loãng đã dùng.
 Dùng phần mềm Excel, ta xây dựng được đường chuẩn BSA:

22


Đường chuẩn BSA
y = 0.0026x + 0.0174
R2 = 0.9919

0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1

0

50

100

150

200

250

300

350

0

Nồng độ BSA (ug/ml)
Đường chuẩn BSA của Bộ giáo dục và đào tạo trường Đại học Cần Thơ khoa Khoa
học
– Viện NC&PT Công nghệ sinh học (nguồn ở tài liệu tham khảo)
 Thay giá trị vào đồ thị ta thấy:
o
 Tại 18,9 C , OD = 0, 2732 � C0 =157 ug / ml = 0,157 mg / ml .
o
 Tại 19 C , OD = 0, 2714 � C0 =153 ug / ml = 0,153 mg / ml .

11) Kết luận
o
 Tại 18,9 C , nồng độ protein là xấp xỉ 0, 157 mg / ml .
o

 Tại 19 C , nồng độ protein là xấp xỉ 0, 153 mg / ml .

XXXI.

Tài liệu tham khảo
 Đường chuẩn BSA, nguồn: /> Bài giảng Chương quang sinh học - TS. Đỗ Minh Hà, khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên.
 Nguyễn Thị Kim Ngân, Lý sinh học, NXB Đại học quốc gia Hà Nội, 2001.

23


BÀI 7
QUAN SÁT HIỆN TƯỢNG HUỲNH QUANG KHI
CHIẾU TIA CỰC TÍM
I.MỤC TIÊU
Cơ sở lý thuyết
Nguồn năng lượng chủ yếu của sinh vật trên trái đất là năng lượng bức xạ mặt trời.
Những
yêu của
cầuánh
cần
nắm
sau khi
nghiên
cứu
bàiphát
thực
tập
Dưới tác dụng
sáng

mặt được
trời sự sống
đã phát
sinh, duy
trì và
triển.
Đểnày:
tồn tại và
hóa, sinh
vậtbản
thu nhận
từ ánh sáng mặt trời rồi chuyển hóa nó sang dạng năng
tiếnNắm
được
chấtnăng
ánhlượng
sáng
lượng khác cần thiết cho sự sống qua những phản ứng đặc hiệu.
 HiểuÁnh
được
quy luật hấp thụ ánh sáng
sáng là bức xạ điện từ trường lan truyền trong không gian với vận tốc vô cùng lớn
(trong chân không vận tốc ánh sáng đạt 300000 ( km / s ). Ánh sáng được chia thành 3 vùng cơ
bản:
 Vùng nhìn thấy (vùng khả kiến) có bước sóng (  ) từ 400 – 700 nm .
 Vùng tử ngoại có   200  400nm .
 Vùng hồng ngoại có   700  1000nm .

Hình 7-1. Vùng ánh sáng nhìn thấy

Trong hệ sinh vật, các lồi có vùng khả kiến khơng giống nhau. Ví dụ, với người vùng
khả kiến có   400  700nm nhưng với cơn trùng vùng khả kiến lại có   320  500nm .
Giai đoạn hấp thụ lượng tử ánh sáng và giai đoạn khử trạng thái kích thích điện tử của
phân tử, đặc trưng chung cho tất cả các phản ứng quang sinh học:
24


Hình 7-2. Sơ đồ biểu diễn mức năng lượng phân tử và các bước chuyển

Mô tả:
 Đường A, a : Khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng để chuyển từ mức năng lượng cơ bản
ban đầu ( S0 ) lên mức năng lượng cao hơn ( S1 hoặc S2 ).
 Theo cơ học lượng tử thì khơng có bước chuyển phát xạ (phát sóng ánh sáng) khi phân tử
chuyển từ mức S 2 về mức S0 và cũng khơng có bước chuyển thẳng từ mức S0 lên mức
triplet (bước cấm).
 Khi phân tử chuyển từ mức S1 về mức cơ bản sẽ phát huỳnh quang ( b ) hoặc chuyển từ mức
triplet về mức cơ bản S0 sẽ phát lân quang ( c ).
 Các đường 1, 2, 3, 4 là phân tử thải hồi năng lượng dưới dạng tỏa nhiệt ra mơi trường. Q
trình phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng để chuyển lên trạng thái kích thích và sau đó trở về
trạng thái ban đầu là một quá trình bất thuận nghịch.
 Phát quang sinh học là hiện tượng các sinh vật tạo ra ánh sáng thơng qua một phản ứng hóa học.
 Huỳnh quang sinh học là sự phát quang cơ thể sống do các phản ứng hóa học mà trong đó một
phần hóa năng chuyển thành quang năng.
 Một số hiện tượng phát quang ở sinh vật như:

Hình 7-3. Nấm phát quang
Hình 7-4. Nhuyễn thể phát quang
Hình 7-5. Sứa phát sáng
 Bức xạ lượng tử do các phân tử phát ra khi chúng chuyển từ trạng thái singlet kích thích thấp nhất

về trạng thái cơ bản S1 � S0.
 Vì thời gian sống của các phân tử trạng thái singlet khoảng 10-8 đến 10-9 (s) nên sự phát huỳnh
quang chỉ xảy ra trong thời gian chiếu sáng mẫu vật. Vì vậy cần tách phần ánh sáng kích thích khi
xác định phổ huỳnh quang.

25