Thử nghiệm khả năng kháng nấm phân lập từ trứng cá chép của một số chất hóa học và dịch chiết rút từ thảo dược

1

MỞ ĐẦU
Tại Việt Nam có hàng nghìn trại sản xuất giống nhân tạo cá nước ngọt, phân
bố ở khắp nơi: Miền núi phía Bắc, Đồng bằng Bắc Bộ, miền Trung, Tây Ngun và
Đồng bằng sơng Cửu Long. Có rất nhiều các đối tượng cá nước ngọt như: Cá chép,
cá trê, cá trôi, trắm, cá rô phi, cá tra, cá basa…Đã và đang được cho sản xuất nhân
tạo tại các trại này. Có một loại bệnh vẫn thường xuyên xuất hiện và gây hại, ảnh
hưởng lớn tới sự phát triển phôi của cá, gây chết phôi, chết cá ảnh hưởng lớn tới
hiệu quả xuất.
Từ trứng cá chép đã bị nhiễm nấm được thu gom từ trại thực nghiệm Ninh
Phụng –Ninh Hoà. Đồng nghiệp của tôi -bạn Trịnh Thị Ngà đã phân lập được một
giống nấm và đã định danh là Saprolegnia.
Để hồn thành khố học đào tạo Cử nhân Bệnh học Thuỷ sản, tôi đã được
nhà trường, khoa và Bộ môn giao cho thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp với tiêu
đề “Thử nghiệm khả năng kháng nấm phân lập từ trứng cá chép của một số chất
hoá học và dịch chiết rút từ thảo dược”. Với các nội dung như sau:
1. Chiết rút chất kháng nấm từ một số cây cỏ phổ biến tại địa phương
2. Thử nghiệm khả năng kháng nấm của dịch chiết rút từ thảo dược trong
các dung môi khác nhau lên sự phát triển hệ sợi nấm
3. Thử nghiệm khả năng kháng nấm của dịch chiết rút từ thảo dược ở các
nồng độ khác nhau lên sự phát triển hệ sợi nấm.
4. Thử nghiệm khả năng kháng nấm của một số hoá chất lên sự phát triển
của hệ sợi nấm
Chúng tôi mong muốn rằng, kết quả nghiên cứu từ luận văn này có thể cung
cấp các cơ sở khoa học để lựa chọn loại thuốc phòng và trị bệnh do nấm ký sinh ở
cá, trứng cá chép nói riêng và cá nước ngọt nói chung.
Do thời gian và kinh phí nghiên cứu cịn hạn hẹp, bản thân còn thiếu kinh
nghiệm trong tổ chức nghiên cứu và viết báo cáo khoa học. Do vậy luận văn này sẽ

2

khơng thể tránh được những thiếu sót. Chúng tơi rất mong nhận được sự góp ý của
thầy cơ và bạn bè đồng nghiệp.
Nha Trang, tháng 6 năm 2009
Sinh viên thực hiện:
Lê Thị Yến Mi


3

Phần 2: TỔNG QUAN
2.1 Đặc điểm chung của nấm
Nấm là nhóm sinh vật khơng có khả năng tự dưỡng như thực vật nên chúng
thường có phương thức sống hoại sinh, cộng sinh hay kí sinh gây bệnh ở động vật
và thực vật [5].
Cấu tạo cơ thể là một tản (thallus) tức là cơ thể có bộ máy dinh dưỡng chưa
phân hoá thành các cơ quan riêng biệt. Nấm gây bệnh ở động vật thuỷ sinh thường
có cấu tạo hình sợi phân nhánh, những nấm này sinh trưởng ở đầu mút sợi nấm và
phát triển rất nhanh tạo thành những đám rất chằn chịt gọi là hệ sợi nấm (mycelya).
Từng sợi nấm gọi là khuẩn ty (hyphae) [2]. Cấu tạo của nấm có thể là đơn bào hoặc
đa bào. Ở nấm đa bào có hai loại, một loại giữa các tế bào khơng có vách ngăn, tồn
bộ sợi nấm như một tế bào khổng lồ đa hạch gọi là nấm bặc thấp, đại diện là nấm
Lagedinium, Saprolegnia, Achlya. Một loại khác giữa các tế bào có vách ngăn gọi
là nấm bậc cao, đại diện là nấm Fusadium [5].
Hình thức sinh sản của nấm: có nhiều hình thức sinh sản khác nhau :
- Sinh sản sinh dưỡng tạo nên các phân sinh bào tử. Đó là các tế bào sinh
trưởng ở đầu mút của khuẩn ty, có vách tế bào dày lên hình thành các tế bào màng
dày, các hạch nấm. Các tế bào màng dày này đứt ra khỏi cơ thể mẹ và phát triển
thành sợi nấm mới [5].

- Sinh sản vơ tính: Các bào tử vơ tính khác nhau ở hình thái và nguồn gốc phát
sinh. Căn cứ vào đặc điểm phát sinh người ta phân thành bào tử kín và bào tử trần.
Một dạng bào tử vơ tính khác không phải là dạng sinh sản được gọi là bào tử màng
dày hay bào tử áo. Chúng do một đoạn sợi nấm tích luỹ nhiều chất dinh dưỡng và
có thành tế bào dày lên mà tạo thành nhằm mục đích thích ứng với các điều kiện bất
lợi của mơi trường. Một kiểu bào tử vơ tính khác đó là bào tử có roi có khả năng bơi
lội trong nước, người ta gọi là các bào tử động [2].
- Sinh sản theo hình thức hữu tính: Nấm hình thành các túi giao tử
(gamentagia). Túi giao tử đực gọi là hùng khí (antheridium), túi giao tử cái gọi là


4

nỗn khí (oogonium). Trên khuẩn ty thường quan sát thấy những cơ quan sinh sản
đực và cái của nấm nằm vng góc với sợi nấm. Túi giao tử đực nhỏ, thường có
hình ống và túi giao tử cái thường là mép túi phình to dạnh hình cầu. Một số giống
nấm sinh sản hữu tính theo hình thức tiếp hợp, túi giao tử đực uốn cong và bao lấy
túi giao tử cái, giữa chúng xuất hiện cầu nối nguyên sinh chất. Qua cầu nối này giao
tử đực và cái gặp nhau tạo thành hợp tử. Hợp tử này nảy nầm phát triển thành sợi
nấm mới [5].
2.2 Một số thuốc và hoá chất phịng trị nấm thường dùng trong Ni trồng
Thuỷ sản
2.2.1 Thuốc trị nấm
Dựa vào cơ chế tác dụng, thuốc trị nấm hiện nay đ ược chia thành 3 nhóm như
sau:
1. Nhóm Polyen (Nystatin, amphotericin B): phát hi ện 1954 hoạt tính của
nhóm thuốc này là làm thay đổi cấu trúc màng tế bào nấm, các chất điện
giải, nhất là Kali thốt ra ngồi; làm xáo tr ộn hơ hấp và thủy phân glycogen
[8].
2. Nhóm Griseophuvin (Fulcine, Fulgicin, Fungivin): phát hi ện 1939 từ nấm

Penicillium griseofulvum thuốc có hoạt tính ức chế sự phân b ào của nấm, tạo
thành những tế bào nhiều nhân mà không phân bào được. Tác dụng mạnh ở tế
bào còn non và đang ở giai đoạn chuyển hố mạnh [8].
3. Nhóm Chidazol (Ketoconazol): Có kh ả năng dính vào các sterol làm thay
đổi cấu trúc màng tế bào giống như nhóm polyen. Làm thay đ ổi chuyển hố
DNA và RNA, làm tích tụ các peroxyd gây độc cho tế bào [8].
2.2.2. Hố chất trị nấm
Đã có rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về các hố chất phịng
và trị nấm. Nó mang lại hiệu quả cao trong ph òng, trị bệnh cho cá đặc biệt l à trong
quá trình sản xuất giống. Như Malachite Green là m ột chất kháng nấm hiệu quả.
MG có thể can thiệp vào q trình sinh tổng hợp protein của c ơ thể sinh vật gây
bệnh, và đi đến tiêu diệt chúng [8]. Mặc dù có nhiều ưu điểm là chất rẻ tiền, dễ tìm


5

lại có kết quả điều trị tốt nh ưng trên thế giới hiện nay rất nhiều n ước đã cấm sử
dụng trong đó có Việt Nam ( theo danh mục các chất cấm sử dụng của Bộ Thuỷ sản
Việt Nam trong sản xuất kinh doanh Thuỷ sản kí ngày 2/2/2005) do có ti ềm năng
gây ung thư cho người [14]. Vì vậy việc tìm ra những hố chất thay thế là một mối
quan tâm.
 Formalin ( Formadehyde 36-38%)
Formalin hay còn gọi là Formol có cơng thức phân tử CH 2O, Công thức cấu tạo
H-CH= O
Formol là chất lỏng dễ bay hơi, có mùi hắc, có tính khử rất mạnh, phổ diệt trùng
mạnh là một chất thường được sử dụng để trị bệnh nấm trên trứng cá và cá nước
ngọt và có hiệu quả rất cao, cơ chế tác dụng của chúng l à làm biến đổi các
aminoacid của sinh vật gây bệnh và tiêu diệt nó [8].
Dùng formol phun vào ao ở nồng độ 20-30 ppm có thể tiêu diệt rất tốt tác
nhân gây bệnh vi khuẩn, nấm …[5]

 Xanh Methylen - Methylen Blue
Tên khác của xanh Methylen là Methylene Blue B; Methy lthiomin Chloride; Urolen
Blue. Xanh methylen có cơng th ức phân tử: C16H18N3SCl. 3H 2O. Xanh Methylen có
màu xanh nước biển đậm, kết tinh hạt dạng h ình trụ sáng bóng, khơng có m ùi vị, để
ra khơng khí khơng bị biến đổi, dễ tan trong nước và trong rượu.
Methylen Blue có tính oxy hố mạnh làm mất hoạt tính của các men trong tế
bào vi sinh vật và tiêu diệt nó [8].
Theo Đỗ Thị Hồ Methylen blue 2-3 ppm có thể phịng và trị bệnh nấm trên
cá và trứng cá [5].
 Hydrogen Peroxite (nước oxy già)
H 2O 2

→

H2O + [O]

[O] Có tính diệt trùng mạnh. Dùng nước oxy già có thể làm tăng hàm lượng
oxy hịa tan trong nước. Cần tăng 1mg oxy/L thì cần 4ml/m3 H 2O2 nồng độ 50%
[8].


6

Theo Kishio Hatai (1997), nư ớc oxy già dùng để trị nấm với liều 1000 µg/lít
có thể diệt được hầu hết các loài nấm ký sinh gây bệnh ở ĐVTS trong điều kiện thí
nghiệm. Khi dùng nước oxy già chữa bệnh nấm cho trứng cá hồi, với nồng độ 1000
µg/ml, đã có tác dụng giảm 90% tỷ lệ trứng nhiễm nấm, tỷ lệ nở vẫn đạt gần 70% .
 Khí Ozon (O 3)
O3

→ O2 + [O]

Dùng khí ozon với liều 0,5mg/l trong 15 -30 giây, hoặc 0,1 mg/l trong 60
giây đã giết được >99,9% các loại vi khuẩn Vibrio anguillarum, Aeromonas
salmonicida, A. hydrrophila, Streptococcus sp và >99% Rhabdovirus. Với một
số loại virus khác, cần dùng ozon có nồng độ cao hơn 0,5-1,0 mg/ml trong 1
phút có thể diệt được >99%.
Tuy vậy, những tác dụng phụ của loại khí n ày tới môi trường nuôi động vật
thủy sản vẫn chưa được nghiên cứu.
 Chlorine
Chlorine có dạng bột màu trắng, sặc mùi clo, có khả năng oxy hóa rất mạnh,
nên có tính diệt trùng cao, phổ diệt trùng rộng.
Phản ứng hóa học xảy ra nh ư sau:
2 Ca(OCl) 2+ 2 H 20 = Ca(OH) 2 + 2HOCl + CaCl 2
HOCl

→

H + + OCl-

HOCl có khả năng diệt vi khuẩn mạnh hơn OCl -, nó có thể oxy hố và ức
chế men trong tế bào vi khuẩn làm cho trao đổi chất bị rối loạn, ức chế sinh
trưởng và sinh sản của vi khuẩn, Ca(OCl) 2 làm ức chế nhiều loài vi khuẩn ở thể
dinh dưỡng và nha bào
 Thuốc tím- Potassium permanganate -KMnO4
Thuốc tím có dạng tinh thể nhỏ, m àu tím khơng có mùi vị, dễ tan trong nước
ngọt và nước mặn
2KMnO 4 + H2O = 2KOH + 2MnO 2 +3O
KMnO4 + R-COH = MnO 2 + KOH + CO 2 + H2O
KMnO4 +H2S

=

MnO 2+ K2SO4 + MnO + H 2O + S


7

KMnO4 + Fe(HCO 3)2+ H2O = MnO 2 +Fe(OH) 2 + KHCO 3+ H2CO3
Là chất oxy hố mạnh có phổ diệt tr ùng mạnh.
Tuy nhiên việc quá lạm dụng các thuốc v à hoá chất để diệt nấm đã khiến tạo ra
nhiều chủng nấm kháng thuốc, đồng thời có một số tác dụng phụ gây độc cho vật
nuôi và người sử dụng cũng như ảnh hưởng đến mơi trường. Vì vậy hướng đi quay
về với những sản phẩm từ tự nhi ên ngày càng được quan tâm chú ý. Một trong
những sản phẩm đó là các chất kháng khuẩn, kháng nấm từ các thảo d ược.
2.3. Một số chất kháng nấm có nguồn gốc từ thả o dược
Theo tác giả Maria José Abad 2007 [19] thông báo các hoạt chất kháng nấm
trong thực vật đã được nghiên cứu nhiều đặc biệt là những năm gần đây. Tác giả đ ã
tổng kết rằng trong thực vật có 5 hoạt chất th ường thấy là: Tinh dầu, terpenoid,
saponines, các hỗn hợp phenolic, alkaloids.
● Saponins
Theo Nguyễn Đức Minh đã viết trong cuốn “Thuốc chữa bệnh đường ruột từ
các cây cỏ trong nước” năm 1980 thì hiện nay đã có nhiều cơng trình nghiên cứu
các chất saponin có hoạt tính sinh học. Nhiều chất saponin được sử dụng trong các
đơn thuốc và một số saponin steroid là nguyên liệu không thể thay thế được để tổng
hợp các chất hormon steroid có hoạt tính cao [15].
Saponin của rễ cây Hedera belix L có tác dụng với tụ cầu khuẩn vàng và một
số loài nấm. Saponin steroid của Smilax regelie killip có tác dụng với Clavicep
purpurea, E. coli, penicillium notatum, Micrococcus pyogenes var aureus,
Aspergillus niger; các loài nấm men, phổ tác dụng kháng khuẩn v à nồng độ hoạt

tính của saponin phụ thuộc vào cấu trúc hố học của chúng. Ví dụ: nhiều saponin
triterpen và steroid có tác d ụng đối với Trichotecium róeum Link. chất tomatin có
tác dụng kháng E. coli, Penicillium notatum, Micrococcus pyogenes var aureus,
Aspergillus niger, các lồi nấm men. Chất solanin có tác dụng vớ i Fusarium solani,
Corynebacterium sepedonium…
Cơ chế tác dụng chống nấm men của saponin phụ thuộc v ào sự có mặt của
các nhóm OH tự do trong phân tử của chúng, nếu đem acetyl hoá hay metyl hoá các


8

nhóm OH thì hồn tồn mất hoạt tính, đem thuỷ phân để giải phóng trở lại các
nhóm OH thì lại có hoạt tính [15].
Maria José Abad và ctv [19] đã trích dẫn nghiên cứu của Renault 2003 về
một triterpene saponin từ cây Capsicum frutescens L. (Solanaceae) còn gọi là cây ớt
Cayen có tên là CAY-1. Trong điều kiện thí nghiệm CAY-1 có hoạt tính kháng với
16 chủng nấm khác nhau gồm Candida spp. và Aspergillus fumigatus, và có hoạt
tính đặc biệt mạnh đối với Cryptococcus neoformans . Cụ thể là CAY-1 thể hiện
hoạt tính bằng cách phá vỡ m àng của tế bào nấm.
Cũng theo Maria José Abad trích dẫn năm 2004 Sauton đã tách chiết từ thân
rễ của cây Dioscorea cayenensis Lam. Holl (Dioscoreaceae), những steroid saponin
với hoạt tính kháng nấm đối với nấm men gây bệnh tr ên người Candida albicans,
Candida glabrata và Candida tropicalis. Đến 2005 Sauton lại tách chiết được 3
chất steroidal saponin kháng nấm mới từ rễ của cây Smilax medica L. (Liliaceae)
[19].
● Alkaloids
Alkaloid là nhóm hợp chất nitơ dị vịng (gồm hơn 6000 chất). Có hoạt tính
sinh học do sự bắt chước (mimetisme) các hormon cũng như sự can thiệp của chúng
trong sự trao đổi chất quan trọng của tế bào. Nhiều alkaloid có tác dụng ức chế thần
kinh trung ương như morphin, codein, scopolamin, reserpin… kích thích th ần kinh

như Strychnin, cafein, lobelin [15]. Những báo cáo về alkaloids kháng nấm từ
những loài cây thuốc cũng được tìm thấy trong nhiều tài liệu. Một số cây trong số
đó đã được báo cáo là đã từng được sử dụng trong dược cổ truyền như một tác nhân
kháng các bệnh truyền nhiễm [19].
Các alkaloid rất phổ biến trong giới thực vật (25% thực vật có chứa
Alkaloid), ở một số thực vật nồng độ alkaloid có thể l ên tới 10% (trong hoa).


9

Hình 2.1. cấu trúc của berberine
Maria José Abad 2007 dẫn theo nghiên cứu Slobodnikova 2004 dịch chiết
thô từ vỏ thân cây của Mahonia aquifolium (Pursh) Nutt. (Berberidaceae) và hai
protoberberine alkaloids chính c ủa nó, Berberine (Hình 4) và jatorrhizine, đã được
kiểm tra về hoạt tính kháng nấm trong điều kiện thí nghiệm. Hai m ươi chủng
Candida spp phân lập từ bệnh vulvovaginal candidoses mãn tính được dùng để
kiểm tra độ nhạy cảm của chúng đối với dịch chiết th ô và 2 alkaloid đã được tách
chiết. Kết quả đưa ra cơ sở giải thích cho truyền thống sử dụng M. aquifolium nh ư
các liệu pháp điều trị các Bệnh nấm da ở ng ười [1], [19].
● Các tinh dầu
Tinh dầu bao gồm các chất thơm, dễ bay hơi chứa trong cây. Từ xưa người ta
đã biết các dược liệu chứa tinh dầu đặc biệt l à các gia vị như hồ tiêu, gừng, nhục
đậu khấu, đinh hương v.v … Ngoài mùi v ị làm cho chúng có giá trị trong ngành ăn
uống và chế biến rượu với liều nhỏ, các gia vị n ày khơng những kích thích sự ăn
ngon và tiêu hố, mà chúng cịn c ó tác dụng diệt khuẩn, diệt nấm [4].
Năm 1994 nhóm tác giả A. Y. Abdel-mallek; M. M. K. Bagy; H. A. H.
Hasan nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của một số tinh dầu trong điều kiện thí
nghiệm. Nghiên cứu đã thực hiện đánh giá hoạt tính của 12 tinh dầu có tr ên thị
trường đối với 5 chủng nấm Candida albicans, C. stellatoidea, C. tropicalis,
Torulopsis candida và T. versitilis. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong 12 tinh dầu

được đưa vào thí nghiệm có 5 tinh dầu có khả năng kháng tất cả các nấm đ ược kiểm
tra đó là cinnamon (quế), clove (đinh hương), horseradish, marjoram (kinh giới ô)
và peppermint (bạc hà). Trong đó cinnamon có tác dụng tốt nhất [16].


10

Theo Erica A. Soto-Mendivil và ctv 2006 trong c ỏ xạ hương (thymus
vulgaris L.) có thành phần tinh dầu gồm có borneol (28.4%), thymol (16.6%),
carvacrol methyl ether (9.6%), camphene (6.9%), -humulene (6.4%) và carvacrol
(5.0%). Các tinh dầu này có tác dụng kìm hãm sự phát triển của nấm Alternaria
citri ở nồng độ 1000 ppm [1].
● Terpenoid
T.R. Govindachari và ctv năm 1998 [ 26] đã tiến hành tách chiết một số hợp
chất kháng nấm trong dầu hạt của lo ài Azadirachta indica. Các tác giả này đã thu
được một số terpenoids chính như 6-deacetylnimbin, azadiradione, nimbin, salannin
và epoxyazadiradione. Các terpenoid nguyên ch ất khơng có hoạt tính kháng nấm,
nhưng khi trộn chúng thành hỗn hợp thì chúng thể hiện hoạt tính khá mạnh .
● Những hỗn hợp Phenolic
Maria José Abad và ctv 2007 [ 19] cho biết trong vài năm gần đây, một số
lượng lớn các nghiên cứu đã được thực hiện về hoạt tính kháng nấm của những hợp
chất phenolic có nguồn gốc tự nhi ên. Những hợp chất phenolic đ ơn giản là,
flavonoids và các glycosides liên quan đến flavonoid, anthraquinones, các coumarin
và các dẫn xuất của nó. Một số flavonoid đ ược tìm ra từ các dịch chiết từ thảo d ược
và được đánh giá về hoạt tính kháng nấm.
Nghiên cứu của Svetaz. L tìm ra được 1 flavonoid từ dịch chiết methanol
của loài cây Zuccagnia punctata Cav [1].
2.4 Những bệnh nấm thường xảy ra trên trứng cá, cá nước ngọt
Theo Đỗ Thị Hòa (2004) trên cá và trứng cá nước ngọt thường xảy ra các
bệnh: bệnh nấm hạt Dermocystidiosis, nấm tr ên mang Branchiomycosis, b ệnh nấm

thuỷ my, hội chứng lở loét [5 ]
*Bệnh nấm hạt Dermocystidiosis
Do nấm hạt Dermocystidium spp. Thường kí sinh trên vây, mang, da cá chép, cá
lóc, cá trắm [5] và tìm thấy những u hạt cả trong nội tạng của cá cảnh, cá rô phi, cá
chép, cá hồi [14]. Những chỗ bị bệnh sưng tấy màu hồng, hình dạng khác nhau
(trịn, ovan hoặc hình dài), kích thước nấm hạt khác nhau từ 1 -2cm có khi lên tới


11

10cm. Xung quanh chỗ xưng tấy có các đốm viêm nhỏ, chứa các bào tử. Bệnh bùng
phát lần đầu tiên vào mùa xuân 1991, gây ch ết 80 con cá bố mẹ ở Estonia [7]. Và
bệnh không xảy ra ở Châu Phi [1 4]. Bệnh không gây chết hàng loạt cho Động vật
Thuỷ sản, nhưng khi bị nhiễm nấm hạt sẽ tạo điều kiện cho các tác nhân gây bệnh
khác dễ xâm nhập. Bệnh thường xuất hiện vào mùa xuân [5].
*Hội chứng lở loét ở cá:
EUS là bệnh do hỗn hợp nhiều tác nhân gây ra nh ưng trong đó nấm
Aphanomyces invadans là tác nhân chính gây những tổn thương nặng nề cho cơ thể
cá bệnh [5]. Một số nấm bậc thấp nh ư Saprolegnia spp và Achlya cũng được tìm
thấy trên cơ thể cá bệnh EUS. Cá bệnh da cá sẫm lại, có vết m ịn màu xám hoặc các
đốm đỏ phát triển ở đầu, thân, các vây v à đi. Những vết mịn lan rộng và sâu
thành những vết loét, vẩy rụng xuất huyết và viêm. Các cơ quan n ội tạng rất bình
thường. Bệnh EUS được thơng báo lần đầu tiên tại Úc vào tháng 3/1972 sau đó
bệnh lây lan ra nhiều quốc gia khác nhau ở khu vực Đông Nam v à Nam Châu Á [5].
Kết quả nghiên cứu ở Úc và Philippines cho thấy sự bùng phát EUS liên quan
tới pH thấp, nhiệt độ thấp kéo d ài và sự tồn tại của các loài cá nhạy cảm cá lóc, cá
trơi, cá trê…và sự có mặt của Aphanomyces invadan [5].
*Bệnh nấm thuỷ my
Gây bệnh là một số loài thuộc giống Legtolegnia, Saprolegnia, Achlya thuộc
họ Saprolegniaceae bộ Saprolegniales.

Cá bị bệnh trên da cá xuất hiện các vùng màu trắng xám, sau vài ngày tại đó
mọc lên các sợi nấm mảnh và phát triển lên thành búi nấm trắng như bông. Một đầu
sợi bám vào da cá, đầu kia tự do trong môi tr ường nước [5].
Nấm thuỷ my cịn có thể kí sinh gây ung trứng cá. Phần gốc của sợi nấm cắm
sâu vào màng trứng, phần ngoài của sợi nấm lơ lửng trong nước tủa ra xung quanh,
nhìn trứng cá bị nhiễm nấm giống như hoa gạo. Trứng bị nhiễm nấm th ường chết
(ung) với nhân trứng chuyển sang m àu trắng đục. Trong bể ấp nấm thuỷ my th ường
phát triển đầu tiên ở trứng ung do không đ ược thụ tinh, sau lây qua các trứng khỏe


12

làm trứng bị chết. Nếu khơng có tác động kịp thời có thể l àm giảm đáng kể tỷ lệ cá
bột, hoặc đơi khi phải xả bỏ ho àn tồn [5].
Bệnh thường xảy ra vào mùa xuân có nhiệt độ thấp 18-25oC. Tuy vậy có một
số lồi Achlya phát triển tốt ở nhiệt độ cao hơn [5].
*Bệnh nấm mang ở cá
Gây bệnh nấm mang ở cá là một số loài thuộc giống Branchiomyces có cấu tạo
dạng sợi, thuộc nhóm nấm bậc thấp v à phân nhánh. Trong khu v ực Châu Á thường
gặp 2 loài B. sanguinis và B. demigrans. Các bào tử nấm bám vào mang và phân
nhánh luồn vào các mao huyết quản, phá hoại các tổ chức mang lấp kín các mao
huyết quản làm mất tác dụng hô hấp của mang. Mang chuyển m àu hồng nhạt hoặc
trắng bạc cùng với sự phát triển của bệnh. Khi bệnh nặng các khuẩn ty v à bào tử
nấm theo mạch máu di chuyển đến tim v à một số bộ phận khác [5]. Bệnh thường
xảy ra ở dạng cấp tính, làm cá giống có thể chết hàng loạt. Bệnh thường xảy ra trên
các loài cá nước ngọt như cá trắm, cá trôi, cá mè, cá diếc… Bệnh thường phát triển
vào mùa có nhiệt độ cao [5].
2.5. Tình hình nghiên cứu các hoá chất và thảo dược trị nấm ở ĐVTS trên thế
giới và tại Việt Nam
2.5.1 Tình hình nghiên cứu các hoá chất trị nấm ở ĐVTS trên thế giới và

Việt Nam
* Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về các hố chất trị nấm tr ên ĐVTS. Năm
2005 C M. Gieseker và ctv đ ã sử dụng formalin với nồng độ 50, 100, 150 ppm trị
nấm trên trứng cá hồi vân nhiễm Saprolegnia parasitica và kết quả cho thấy tỷ lệ
chết khi điều trị lần lượt ở 3 nồng độ là 35%, 29%, 40% trong khi khôn g điều trị tỷ
lệ chết là 67% [20].
Kishio Hatai và ctv đã thử nghiệm hiệu quả kháng nấm của n ước oxy già ở tỷ
lệ hoạt tính là 31% trên trứng cá hồi. Kết quả cho thấy ở nhiệt dộ 13oC, trong thời
gian 60 phút, H 2O2 ở nồng độ ≤ 1000 ppm không gây hại cho trứng cá hồi. Đặc biệt
là khi dùng ở nồng độ 250-1000 ppm có khả năng ức chế kiềm hãm, tiêu diệt sự


13

phát triển của nấm Saprolegnia v à Achlya. Vậy H 2O2 là một loại hố chất có tác
dụng tiêu diệt nấm ở ĐVTS. Tuy vậy tác giả cũng khẳng định tuỳ theo nhiệt độ m à
lựa chọn nồng độ cho phù hợp [5].
Theo Kitancharoen và ctv (1997) n ếu bằng phương pháp ngâm trứng cá hồi
(trong 1h, 2 lần trên tuần và có sục khí) thì với NaCl 25 ppt thì tỷ lệ trứng nở cao
nhất (78.7%), trứng bị nghiễm nấm ít nhất (chỉ 2.3%); c ịn nếu ấp trứng bằng nước
với nồng độ NaCl 3, 5, 7 ppt th ì đều có hiệu quả phịng, trị nấm nhưng hiệu quả
nhất ở 7 ppt [14].
Nghiên cứu của Hatai và ctv (2005) cho rằng Saprolegnia sp có khả năng
phát triển ở khoảng nồng độ NaCl từ 0 -3 %, nhưng nấm có khả năng phát tiển mạnh
nhất ở 0-0.5 %, >1.5 % nấm phát triển kém và hầu như không mọc ở 3 % [21].
Thường trị nấm này trên trứng bằng cách tắm trứng trong NaCl 2 -3 % trong 5-15
phút, tắm 2 lần trên ngày [5].
Năm 1998, Nilubol Kitancharoen, Atsushi Yamamoto và Kishio Hatai đ ã thử
nghiệm về ảnh hưởng của NaCl, H 2O2, và MG trên trứng cá hồi nhiễm nấm đã kết

luận khơng có sự khác biệt đáng kể trong nghi ên cứu giữa H 2O2 1000 µl/mL và MG
2 µl/mL. Đối với NaCl 25 ppt kém hiệu quả hơn MG 2 µl/mL [14].
Năm 2003, Brian C. Small và William R. Wolters đ ã thử nghiệm sử dụng
H2O2 trong bể ấp trứng da trơn và kết quả nghiên cứu cho thấy những cải tiến quan
trọng bằng việc sử dụng H 2O2 như một chất có hiệu quả kinh tế trong việc gia tăng
tỷ lệ nở của trứng cá da tr ơn thay cho việc sử dụng formalin [14].
Đối với bệnh ở giáp xác cũng có nhiều nghi ên cứu về thử nghiệm hố chất để
phịng và trị bệnh nấm. Hatai (1974) đ ã thử nghiệm 40 loại hoá dược khác nhau
trong điều kiện thí nghiệm và đã tìm được một số hố chất có hiệu quả với
Fusarium nhưng lại khơng có thơng tin về độc hại của hố dược này [11].
Lightner & ctv (1979) cũng đã thử nghiệm 21 loại hố dược để chống lại nấm
trong phịng thí nghiệm, đã xác định được một số hợp chất có hiệu quả diệt nấm
Fusarium nhưng chưa được áp dụng gì trong thực tế [11].
*Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam


14

Ở Việt Nam cũng có một số nghi ên cứu về các hoá chất trị nấm trên ĐVTS:
Năm 2006, Nguyễn Thị Huyền đã nghiên cứu “xác định nấm thuỷ mi nhiễm
trên trứng cá tra, cá basa và thử nghiệm hiệu quả phịng”. Ngồi ra cũng trong năm
2006 trong hội thảo quốc tế Thuỷ sản tại Nha Trang, TS. Lý Thị Thanh Loan đã báo
cáo kết quả khảo sát vòng đời của Achlya sp. nhiễm trên trứng cá tra và basa, trong
hội thảo quốc tế Công nghệ sinh học Nông nghiệp, đ ã báo cáo kết quả thử nghiệm
sàng lọc một số loại hố dược có khả năng ức chế sự phát triển của Achlya sp.
nhiễm trên trứng cá tra và basa. Kết quả cho thấy H 2O2 ở 500 ppm và Gentian
Violet 1.5 ppm có tác dụng kìm hãm sự phát triển của nấm nhất [14], [22].
Năm 2007 nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang trong luận văn tốt nghiệp tr ường
Đại học Nha Trang đã sử dụng một số hoá chất trị nấm Helicostylum tr ên trứng cá
nàng hai và kết quả cho thấy H 2O2 1000 ppm là có hiệu quả nhất, tiếp đến là Milian

100 ppm [14].
2.5.2 Tình hình nghiên cứu một số loại thảo dược trị nấm ở ĐVTS trên thế
giới và Việt Nam
*Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Theo xu hướng hiện nay trên thế giới, để đảm bảo vệ sinh an to àn thực phẩm,
hầu hết kháng sinh đều bị cấm hoặc hạn chế sử dụng trong ni trồng thuỷ sản. V ì
vậy việc nghiên cứu tìm ra thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng trị bệnh cho đối
tượng thuỷ sản thay thế cho các loại kháng sinh v à hoá chất bị cấm và hạn chế sử
dụng là vấn đề được quan tâm.
Trên thế giới đã có những nghiên cứu về các lồi thảo dược về hoạt tính
kháng nấm của nó trên ĐVTS. Tuy nhiên vẫn chưa nhiều.
Pareeya Udomkusonsri [23] đ ã thực hiện nghiên cứu hoạt tính kháng nấm
của dịch chiết nghệ bằng ethanol đối với nấm gây bệnh trên cá trong điều kiện thí
nghiệm. Kết quả thu được cho thấy đối với nghi ên cứu kháng nấm, sự phát triển của
Saprolegnia diclina, Saprolegnia parasitica H2, Achlya channae và Aphanomyces
piscicida giảm có ý nghĩa với các dịch chi ết có nồng độ tương ứng 500, 500, 500 và
40 μg/ml so với hai nghiệm thức đối chứng (môi tr ường và DMSO 1%). Nồng độ


15

nhỏ nhất của dịch chiết có tác dụng ức chế ho àn toàn sự phát triển của S. diclina, S.
parasitica H2, A. channae, A. piscicida lần lượt là 2.500, 2.500, 1.250 và 62.5
μg/ml. Đối với nghiên cứu diệt nấm, các chủng S. diclina, S. parasitica H2 và A.
Channae bị tiêu diệt sau khi ngâm trong dịch chiết có nồng độ 5.000 μg/ml. Dịch
chiết có nồng độ 62.5 μg/ml cũng có tác dụng diệt đối với A. piscicida
F. Macchioni 1999 [24] nghiên cứu khả năng kháng lại nấm Saprolegnia
ferax của loài cây Artemisia verlotorum (ngải cứu), và Santolina etrusca. Kết quả
nồng độ thấp nhất của dịch chiết bằng dung môi n ước có khả năng ức chế nấm
Saprolegnia ferax là 1%, và của dịch chiết bằng dung môi l à ethanol là 0.25%.

Trong họ Liliaceae, những báo cáo về hoạt tính kháng nấm chủ yếu li ên quan
đến giống Allium. Masoomeh Shams Ghahfarokhi v à ctv năm 2003 thực hiện
nghiên cứu hiệu quả của dịch chiết h ành và tỏi trong việc ức chế sự phát triển và
hoạt tính của enzyme kitinase của lo ài nấm Trichophyton mentagrophytes . Sự phát
triển của T. mentagrophytes bị ức chế bởi dịch chiết tỏi ở tất cả các nồng độ thí
nghiệm. Đây là báo cáo đầu tiên về khả năng ức chế hoạt tính của enzym e kitinase
của hai dịch chiết hành và dịch chiết tỏi [25]
*Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Việt Nam có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng, theo số liệu điều tra từ
năm 1961 đến nay đã ghi nhận được 3948 loài cây thuốc thuộc 307 họ thực vật và
nấm. Mặt khác Việt Nam cũng đã có kinh nghiệm sử dụng cây thuốc từ lâu đời để
chữa bệnh trong y học cổ truyền do đó xu h ướng đi sâu nghiên cứu để xác minh các
kinh nghiệm của y học cổ truyền v à tìm kiếm các hợp chất tự nhi ên có hoạt tính
sinh học cao từ dược liệu để làm thuốc ngày càng được quan tâm.
Theo Đỗ Thị Hoà và ctv (2004) một số bệnh nấm được biết đến ở ĐVTS như :
bệnh EUS, bệnh nấm hạt, bệnh nấm thuỷ my, bệnh nấm mang ở cá, bệnh nấm ấu
trùng ở giáp xác, bệnh nấm ở giáp xác tr ưởng thành. Tuy nhiên các cơng trình
nghiên cứu về các thảo dược trong phòng và trị các bệnh này vẫn chưa nhiều. Một
số nghiên cứu chủ yếu trong trị các bệnh nhiễm khuẩn.


16

Theo Đỗ Thị Hoà (2004) một số thuốc từ thảo d ược dùng trong ni trồng
thủy sản đã có như KN-04-12 của Hà Ký năm 1990 – 1995. Thành phần thuốc gồm
các cây chứa chất kháng khuẩn nh ư: tỏi, sài đất, nhọ nồi, cỏ sữa, chó đẻ răng c ưa…,
thuốc có tác dụng trị bệnh nhiễm khuẩn: xuất huy êt đốm đỏ, thối mang, viêm ruột ở
cá thương phẩm nuôi lồng bè, trong ao tăng sản và cá bố mẹ. Bên cạnh đó cịn có
Saponin chế biến từ rễ dây thuốc cá, hạt ch è dại, hạt bồ hòn, được dùng để diệt cá
tạp trong ao nuôi giáp xác. De -Odoase cũng là sản phẩm chiết rút từ thảo d ược có

tên Yucca schidigera và thành ph ần chiết rút từ sự lên men của vi khuẩn có lợi
Bacillus subtilis có tác dụng khử amoniac và các khí độc khác trong ao ni [5].
Cũng theo Đỗ Thị Hồ (1990) và Bùi Quang Tề (1997) đã đưa ra 13 cây thuốc
nam có tác dụng phịng và trị bệnh cho cá. Như Cây sở, sòi, tỏi, cỏ sữa lá nhỏ,
xuyên tâm liên, sài đất, chó đẻ răng cưa, nhọ nồi, xoan...
Dựa vào nghiên cứu của Nguyễn Thị Bạch Li ên (1997) cho thấy đã chiết được
thành phần hỗn hợp có trong cây chó đẻ răng c ưa (Phyllanthus urinaria) và đặt tên
là Coderaxin có tác dụng diệt khuẩn vá nấm rất tốt ở nồng độ 0.5% [12].
Năm 2008 Nguyễn Thị Mai Anh trong luận văn tốt nghiệp Đại học Nha
Trang “Đánh giá tác động kháng nấm phân lập từ trứng cá n àng hai (Chilata
ornata Gray, 1831) của một số dịch chiết từ cây cỏ ” và kết quả cho thấy dịch chiết
tỏi từ dung môi methanol và dịch ép nghệ trực tiếp có tác dụng k ìm hãm nấm
Helicostylum nhất.
Gần đây có báo cáo của L ê Văn Yên, viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản III
nghiên cứu về thảo dược trị nấm Fusarium gây bệnh đen mang tr ên cua xanh. Kết
quả cho thấy dịch chiết củ tỏi, cây chó đẻ răng cưa và lá mồng trầu có thể trị bệnh
đen mang ở cua xanh trong đó dịch chiết tỏi 60ppm có hiệu quả tốt nhất [12].
Ngồi ra cũng có một luận văn tốt nghiệp đại học Nha Trang của Trần Thị
Thu Huyền năm 2007 tìm hiểu hiệu quả trị bệnh đen mang và đốm vỏ trên cua biển.
Tác giả kết luận tỏi, thảo quyết minh v à cây chó đẻ răng cưa đều có tác dụng kháng
nấm. Trong đó tỏi có tác dụng mạnh nhất sau đó đến thảo qu yết minh và cây chó đẻ
răng cưa [10].


17

2.6 Một số tìm hiểu về các thảo dược đã được chọn nghiên cứu
☺ Củ tỏi (Allium sativum L.)
Thuộc họ Hành Alliaceae, cịn có tên khác là Đại tốn
Đặc điểm hình thái: Lá hình cuống nhỏ, dài 15 – 20 cm. Củ tỏi có

nhiều nhánh mọc dưới mặt đất và có màu trắng đục.
Đặc điểm phân bố: Thường gặp ở vùng đất cát, cát pha sét, được trồng
phổ biến trong nước.
Một số hoạt chất: Trong tỏi có một ít iot, v à tinh dầu (100kg tỏi chứa
chừng 60g đến 200g tinh dầu). Th ành phần chủ yếu của tỏi là chất alixin
C6H10OS2, một hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh có tác dụng diệt khuẩn mạnh
[15]. Một nghiên cứu gần đây tìm thấy rằng trong tỏi cịn có một hoạt chất có
tác dụng kháng nấm có tên là Ajoene [23]
☺ Nghệ (Curcuma longa L)
Thuộc họ gừng: Zingiberaceae
Đặc điểm hình thái: Nghệ là một loài cây cỏ cao 0.6 – 1m. Thân rễ
thành củ hình trụ hơi dẹt, lá hình trái xoan thon nhọn ở hai đầu, hai mặt đều
nhẵn
Đặc điểm phân bố: Được trồng nhiều ở khắp n ước ta, còn mọc hoang
và được trồng ở các nước Ấn Độ, Indonexia, Campuchia, L ào, Trung Quốc
và các nước nhiệt đới.
Một số hoạt chất: Trong nghệ ng ười ta phân tích được: chất màu
curcumin 0.3%, tinh thể màu nâu đỏ, ánh tím, ete, clorofoc, dung dịch có
huỳnh quang màu xanh lục; tinh dầu 1 – 5% màu vàng nhạt, thơm; ngoài ra
cịn có tinh bột, canxi oxalat, chất béo. Tinh dầu trong nghệ có tác dụng diệt
nấm sát khuẩn [27].
☺ Lá cà chua (Lycopersicon esculentum Mill), thuộc họ cà Solanaceae.
Phân bố: Mọc hàng năm.
Đặc điểm hình thái: Cây thảo hằng năm, có khi mọc dại cao khoảng 1m hay
hơn. Thân mọng nước có lơng mềm dính. Lá có cuống mọc so le xếp lông


18

chim không đều hay kép lông chim 2 lần dài 10-40cm. Lá chét thay đổi hình

trứng hay hình trứng mũi mác mép có răng. Hoa thành chùm xim ở nách lá.
Một số hoạt chất: Theo GS. Đỗ Tất Lợi trình bày trong cuốn “Những
cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” Trong lá cà chua có chất tomatin là chất
kháng khuẩn chống nấm.


19

Phần 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU
3.1 Thời gian, đối tượng và địa điểm nghiên cứu
 Thời gian: Đề tài được thực hiện từ 2/3/2009 đến ngày 30/6/2009
 Đối tượng: Tính kháng nấm của một số hố chất và thảo dược
 Địa điểm: Phịng thí nghiệm Bệnh học Thuỷ sản, trường Đại học Nha
Trang.
3.2 Sơ đồ khối nghiên cứu của đề tài
Nấm gây bệnh ở trứng cá
chép -Saprolegnia
ĐC 1 Nước cất

Hố chất

TN 1 H2O2
TN 2 MB
TN3Gryseofuvyl

ĐC 2 Nước cất

- Mơi trường PDA
- Ni ở nhiệt độ 30oC
-Ảnh hưởng của hố chất,

dịch chiết rút từ thảo dược
lên sự sinh trưởng của hệ
sợi nấm

ĐC3 DM ethanol

Dịch chiết rút
từ thảo dược

ĐC4 DM aceton
TN4 Tỏi
TN5 Nghệ
TN6 Lá cà chua

Hình 3.1 Sơ đồ khối nghiên cứu của đề tài


20

3.3 Vật liệu dùng cho nghiên cứu:
3.3.1 Thiết bị :
- Kính hiển vi quang học với các vật kính 4X, 10X, 40X, 100X.
- Tủ lạnh
- Tủ ấm
- Tủ sấy
- Máy hấp tiệt trùng
- Cân điện tử có độ chính xác 0.1g
- Máy khuấy từ
- Hộp lồng, bình nón được hấp tiệt trùng ở 180oC. Đèn cồn, pank.
3.3.2 Hoá chất, nấm và loại thảo dược

Các hoá chất trị nấm :
-

Hydrogen peroxide (oxy già)

-

Gryseofuvyl

-

Methylen Blue

Nấm Saprolegnia phân lập trên trứng cá chép (Cyrinus capio Linnaeus)
Ba loại thảo dược được lựa chọn:
Bảng 3.1 Các thảo dược được lựa chọn nghiên cứu

STT

Tên thảo dược

Tên khoa học

1

Tỏi

Allium sativum L.

2

Nghệ

Curcuma longa

L.(Curcuma domestica

Lour)
3

Lá cà chua

Lycopersicon esculentum Mill

3.3.3 Môi trường nuôi cấy nấm
Sử dụng môi trường tổng hợp bán ngoài thị trường là PDA (Potato 10%
Dextrose 51% Agar 39%) để nuôi cấy nấm. Đỗ môi trường theo hướng dẫn trên


21

nhãn, bổ xung thêm kháng sinh (Ampicilin và Streptomycin 0.5g/L mỗi loại), với
pH=7.5.
3.4 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số hoá chất l ên sự sinh
trưởng của hệ sợi nấm trong ph ịng thí nghiệm
Với mục đích tìm ra một số chất có hiệu quả kìm hãm, tiêu diệt nấm thí nghiệm
được bố trí như sau:
-

Hydrogen peroxide : 250, 500, 1000 (ppm)

-

Methylen Blue : 2, 3, 5 (ppm)

-

Griseofuvyl : 2.5, 5, 7.5 (ppm)

Nấm thuần chủng được ni cấy trên mơi trường PDA ở nhiệt độ phịng trong 2
ngày để tạo những khuẩn lạc lớn. Cắt môi trường thạch có chứa khuẩn lạc thành
những lát trịn có đường kính 5 mm từ viền của các khuẩn lạc, ngâm vào trong
các hoá chất đã pha nồng độ trong các thời gian ngâm 30 phút. Sau đó lấy các
khuẩn lạc đó đặt vào những hộp lồng có chứa mơi trường PDA. Đặt tất cả ở
nhiệt độ 30oC. Theo dõi sự phát triển của nấm bằng cách đo các đường kính
khuẩn lạc hằng ngày sau 12h, 24h, 36h. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.


22

Nấm nghiên cứu

Đối chứng

PDA

H2O2
250,500,1000 ppm

PDA

PDA

PDA

Gryseofuvyl
2.5, 5, 7.5 ppm

MB
2, 3, 5 ppm

PDA

PDA

PDA

PDA

- Mơi trưịng PDA
- Ni ở nhiệt độ 30 oC
-Ảnh hưởng của hố chất,
lên sự sinh trưởng của hệ
sợi nấm

Hình 3.2 Sơ đồ mơ tả thí nghiệm ảnh h ưởng của các loại hoá chất đến hệ sợi nấm.

PDA

P

23

3.5 Tách chiết dịch thô của các loại thảo dược
3.5.1 Cơ sở lựa chọn các thảo dược.
 Dựa vào một số nghiên cứu về thảo dược trị nấm trên thế giới và Việt
Nam
 Dựa vào kinh nghiệm lâu đời của nhân dân trong việc sử dụng thảo
dược trị bệnh cho người và động vật được ghi chép trong một số t ài
liệu như:
+ Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của GS.TS Đỗ Tất
Lợi
+ Tính kháng khuẩn của cây thuốc Việt Nam của Nguyễn Đức
Minh
3.5.2 Phương pháp thu mẫu, chiết rút dịch thô của thảo d ược
Vật liệu:
 Thảo dược: gồm tỏi, nghệ, lá cà chua
 Dung môi: gồm Ethanol và Acetone
Thu mua thảo dược: Thảo dược được thu mua ngồi chợ, được đem rửa sạch
để khơ nước để chuẩn bị cho việc chiết rút.
Phương pháp chiết rút dược chất:
Dụng cụ chiết rút: Máy xay sinh tố, cối, ch ày sứ, dao, thớt, khăn vải màn, lọ
thuỷ tinh, hộp lồng sạch.
Các bước tiến hành:
-

Các thảo dược cắt nhỏ được xay nát bằng máy xay sinh tố. Sau đó
được giã nhuyễn bằng cối, chày sứ.

-

Cho dung môi chiết rút theo tỉ lệ 1g thảo d ược : 1ml dung môi.

-

Để hỗn hợp thảo dược và dung môi ở nhiệt độ phòng, cứ 10 phút
trộn đều một lần để tăng khả năng khuyếch tán của các hoạt chất
vào dung môi, sau 4h vắt lấy dịch chiết.

-

Loại bỏ dung môi bằng cách cho dịch chiết v ào hộp lồng miệng
rộng để dung mơi bay hơi ở nhiệt độ phịng trong 24h.


24

-

Dịch chiết được sử dụng ngay sau khi đ ã cho bay hơi hết dung
môi.

3.6 Phương pháp xác định tác dụng kháng nấm của các dịch chiết thảo d ược
với các dung môi khác nhau
Vật liệu:
 9 loại dịch chiết từ 3 loại thảo dược và các cách chiết (ép trực tiếp
và dùng dung môi chiết rút ethanol, aceton)
 Dung dịch ethanol và aceton còn lại sau khi để bay hơi sau 24h
giống như dịch chiết.

 Nấm phân lập từ trứng cá chép Saprolegnia
 Môi trường nuôi cấy: PDA
Các bước tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau:


25

Nấm NC

Ngâm nấm trong dịch chiết và đối chứng 30 phút

Nước cất

PDA

DM
Ethanol
cịn lại
Ethanol

PDA

DM
Aceton

Dịch ép

PDA

PDA

Dịch chiết
Dịch chiết
trong ethanol trong Aceton

PDA

PDA

Ni cấy ở nhiệt độ 30oC

Đo đường kính khuẩn lạc
nấm sau 12h, 24h, 36h

Hình 3.3 Sơ đồ thí nghiệm xác định tác dụng của các loại thảo d ược chiết
bằng các dung môi khác nhau l ên sự phát triển của hệ sợi nấm
 Dịch chiết thảo dược sau khi cho bay hơi hết dung môi được coi là dịch chiết
đậm đặc. Dịch đậm đặc được pha loãng bằng nước cất ra các nồng độ cần d ùng.
 Cắt các khối nấm đường kính 5mm ngâm 30 phút v ào trong các loại dịch chiết
nồng độ 2500 ppm, nghiệm thức đối chứng ngâm v ào nước cất, ethanol và
aceton còn lại sau khi để bay hơi cùng dịch chiết.