Nghiên cứu điều kiện khử trùng và cảm ứng tạo chồi để nhân giống vô tính cây trân châu xanh (nervilia aragoana gaudich)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA
CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014
XÉT GIẢI THƢỞNG "TÀI NĂNG KHOA HỌC TRẺ ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT"
NĂM 2014

Nghiên cứu điều kiện khử trùng và cảm
ứng tạo chồi để nhân giống vơ tính cây
Trân châu xanh (Nervilia aragoana
Gaudich)

Thuộc nhóm ngành khoa học: Khoa học Tự nhiên



TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA
CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014
XÉT GIẢI THƢỞNG "TÀI NĂNG KHOA HỌC TRẺ ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT"
NĂM 2014

Nghiên cứu điều kiện khử trùng và cảm ứng tạo chồi để
nhân giống vơ tính cây Trân châu xanh (Nervilia aragoana
Gaudich)
Thuộc nhóm ngành khoa học: Khoa học Tự nhiên

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Xuân Thùy Nam, Nữ:
Huỳnh Ngọc Anh

Nữ

Dân tộc: Kinh
Lớp, khoa: C11SH02, Khoa Khoa học Tự nhiên Năm thứ: 3 /Số năm đào tạo: 3
Ngành học: Cao đẳng Sƣ phạm Sinh học
Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Nguyễn Thanh Thuận


UBND TỈNH BÌNH DƢƠNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện khử trùng và cảm ứng tạo chồi để nhân giống vơ
tính cây Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich)
- Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Xuân Thùy
Huỳnh Ngọc Anh
- Lớp: C11SH02

Khoa: Khoa học Tự nhiên Năm thứ: 3

Số năm đào tạo: 3

- Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Nguyễn Thanh Thuận
2. Mục tiêu đề tài:
- Xác định điều kiện khử trùng để thu đƣợc các mẫu vô trùng tốt nhất.
- Xác định điều kiện tối ƣu cho sự tạo chồi trong điều kiện in vitro
3. Tính mới và sáng tạo:
- ây à đối tƣợng nghiên cứu mới, chƣa đƣợc thử nghiệm Việt Nam
4. Kết quả nghiên cứu:
- Xác định đƣợc nồng độ chất khử trùng và thời gian tối ƣu cho khử trùng mẫu t củ
cây Trân châu xanh
- Xác định đƣợc các môi trƣờng th ch hợp cho sự tạo chồi của chồi đỉnh và đoạn thân
5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và
khả năng áp dụng của đề tài:
- K t quả của đề tài à kh i đ u cho các nghiên cứu ti p theo để nhân giống vơ t nh đối
tƣợng này, góp ph n tạo nguồn dƣợc iệu chất ƣợng, dồi dào, n định ph c v cơng
tác điều trị ệnh, đồng thời góp ph n ảo tồn một oài thực vật qu hi m.
- Góp ph n th c đ y hoạt động nghiên cứu khoa học, ph c v công tác giáo d c và đào
tạo, nâng cao uy t n, vị th của nhà trƣờng.
6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài
Ngày
tháng
năm
Sinh viên chịu trách nhiệm chính
thực hiện đề tài

Nguyễn Thị Xuân Thùy
Nhận xét của ngƣời hƣớng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực
hiện đề tài


ề tài đ ác định đƣợc chất khử trùng, nồng độ và thời gian khử trùng th ch hợp trên

đối tƣợng cây Trân châu anh. ồng thời ác định đƣợc điều kiện môi trƣờng, nồng
độ chất điều h a sinh trƣ ng c ng nhƣ hàm ƣợng nƣớc d a
sung th ch hợp cho sự
nảy chồi của chồi đỉnh và đoạn thân.
ây à những k t quả ƣớc đ u đáng th ch ệ trong việc nghiên cứu ây dựng qui tr nh
vi nhân giống đối tƣợng, ph c v cơng tác ảo tồn ồi và tạo nguồn dƣợc iệu n định.
K t quả của đề tài đ đóng góp thêm những hiểu i t về k thuật nuôi cấy mơ, rất có
ngh a trong nghiên cứu khoa học c ng nhƣ ứng d ng trong thực t .
ề tài đ hoàn thành đ ng m c tiêu đề ra. Tuy nhiên, do thời gian nghiên cứu ng n
nên các điều kiện thử nghiệm c n hạn ch . Ki n nghị tác giả:
- Ti p t c nghiên cứu khả năng khử trùng của các chất ên các ph n khác nhƣ cuống á,
á để t m hiệu quả khử trùng tốt nhất.
- Ti p t c khảo sát các y u tố ảnh hƣ ng đ n sự tạo rễ của chồi con in vitro.
- Khảo sát thêm các y u tố môi trƣờng và dinh dƣỡng nhƣ: nồng độ khoáng, nồng độ
đƣờng, ánh sáng, nhiệt độ... để t m ra điều kiện tối ƣu cho sự phát triển của chồi in
vitro.
Xác nhận của lãnh đạo khoa

Ngày
tháng
năm
Ngƣời hƣớng dẫn


UBND TỈNH BÌNH DƢƠNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

THƠNG TIN VỀ SINH VIÊN
CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
I. SƠ LƢỢC VỀ SINH VIÊN:

Ảnh 4x6

Họ và tên: Nguyễn Thị Xuân Thùy
Sinh ngày: 08 tháng 04 năm 1993
Nơi sinh: Tịnh Hiệp – Sơn Tịnh – Quảng Ng i
Lớp: C11SH02

Khóa: 2011-2014

Khoa: Khoa học Tự nhiên
ịa chỉ iên hệ: 5/2/11 KP2, P. Ph H a, Tp. Thủ D u Một, tỉnh B nh Dƣơng
iện thoại: 0986 893 511

Email:

II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
* Năm thứ 1:

Ngành học: Sƣ phạm Sinh học
K t quả

Khoa: Khoa học tự nhiên

p oại học tập: X p oại khá

Sơ ƣợc thành t ch:
* Năm thứ 2:
Ngành học: Sƣ Phạm Sinh học
K t quả

Khoa: Khoa học tự nhiên

p oại học tập: X p oại khá

Sơ ƣợc thành t ch:
Xác nhận của lãnh đạo khoa

Ngày
tháng
năm
Sinh viên chịu trách nhiệm chính
thực hiện đề tài


TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA KHOA H C T NHI N

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

ộc ập - Tự do - Hạnh ph c
B nh Dƣơng, ngày

Kính gửi:

tháng

năm

Ban tổ chức Giải thƣởng “Tài năng khoa học trẻ Đại học
Thủ Dầu Một”

Chúng tôi là: Nguyễn Thị Xuân Thùy
Huỳnh Ngọc Anh

Sinh ngày 0 tháng 04 năm 1993
Sinh ngày 15 tháng 08 năm 1993

Sinh viên năm thứ: 3
T ng số năm đào tạo: 3
Lớp, khoa : C11SH02
Khoa : Khoa học tự nhiên
Ngành học: Cao đẳng sƣ pham sinh học

Thông tin cá nhân của sinh viên chịu trách nhiệm chính:
ịa chỉ iên hệ : Tịnh Hiệp – Sơn Tịnh – Quảng Ng i
Số điện thoại : 0986 893 511
ịa chỉ emai : nguyen thuy93@gmai .com
chúng tôi àm đơn này k nh đề nghị Ban t chức cho chúng tôi đƣợc gửi đề tài
nghiên cứu khoa học để tham gia ét Giải thƣ ng “Tài năng khoa học trẻ ại học Thủ
D u Một” năm 2014
Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện khử trùng và cảm ứng tạo chồi để nhân
giống vô tính cây Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich)
Chúng tơi xin cam đoan đây à đề tài do ch ng tôi thực hiện dƣới sự hƣớng
dẫn của ThS. Nguyễn Thanh Thuận; đề tài này chƣa đƣợc trao bất kỳ một giải
thƣởng nào khác tại thời điểm nộp hồ sơ và không phải là luận văn, đồ án tốt

nghiệp.
N u sai, ch ng tôi xin chịu trách nhiệm trƣớc khoa và Nhà trƣờng.
Xác nhận của lãnh đạo khoa

Ngƣời làm đơn


DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
STT

Họ và tên

MSSV

Lớp

Khoa

1

Nguyễn Thị Xuân Thùy

111C840072

C11SH02

KHTN

2

Huỳnh Ngọc Anh

111C840002

C11SH02

KHTN


i

MỤC LỤC
MỤC LỤC.......................................................................................................................... i
DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... iii
DANG MỤC BẢNG BIỂU .............................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................... v
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1
1.

Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài............................................ 1

2.

Lý do lựa chọn đề tài................................................................................................ 2

3.

Mục tiêu đề tài.......................................................................................................... 3

4.

Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 3

4.1.

Phƣơng pháp nghiên cứu tài liệu ......................................................................... 3

4.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.............................................. 3

4.2.1.

Điều kiện và mơi trƣờng ni cấy..................................................................... 3

4.2.2.

Nghiên cứu khả năng khử trùng của mẫu ......................................................... 4

4.2.3.

Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro ............................ 5
Phƣơng pháp xử lý thống kê số liệu .................................................................... 6

4.3.
5.

Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 6

5.1.

Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................................... 6

5.2.

Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................. 6

Chƣơng 1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT ..................................................................................... 8
1.1.

Lƣợc sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật ...................................... 8

1.1.1.

Những ƣu điểm và hạn chế của công nghệ nhân giống vơ tính in vitro ........... 12

1.1.2.

Ƣu điểm của nhân giống vơ tính in vitro .......................................................... 12

1.1.3.

Hạn chế của nhân giống vơ tính in vitro ........................................................... 13

1.2.

Ứng dụng của nhân giống vơ tính in vitro ở một số cây dƣợc liệu .................. 13

Chƣơng 2. QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM ....................................................................... 15
Chƣơng 3. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM ............................................................................ 16

3.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu ............................................................................... 16
3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của BAP đến khả năng tạo cụm chồi của
mẫu .................................................................................................................................. 17
3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của BAP kết hợp với nƣớc dừa lên khả
năng tạo cụm chồi từ chồi đỉnh ...................................................................................... 18


ii
3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của BAP kết hợp với nƣớc dừa lên khả
năng tạo cụm chồi từ chồi nách ...................................................................................... 21
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ................................................................................. 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 26


iii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Ý nghĩa

BAP

Benzyl amino purine

DNA

Deoxyribonucleotid acid

WPM

Woody plant medium

IAA

β – indolacetic acid

INRA

Institut National de la Recherche Agronomique


iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng cơ bản WPM (Woody plant medium) .............. 3
Bảng 3.1 Tỉ lệ (%) mẫu đƣợc vô trùng và nảy chồi sau 8 tuần nuôi cấy.............. 16
Bảng 3.2 Sự thành lập cụm chồi từ chồi đỉnh của cây con in vitro ...................... 17
Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của BAP kết hợp với nƣớc dừa lên khả năng tạo cụm
chồi của chồi đỉnh .................................................................................................. 19
Bảng 3.4 Ảnh hƣởng của BAP kết hợp với nƣớc dừa lên khả năng tạo cụm
chồi của chồi nách.................................................................................................. 21


v

DANH MỤC HÌNH
Hình 5.1 Cây Trân châu xanh .................................................................................... 6
Hình 3.1 Cây chồi in vitro từ củ Trân châu xanh ...................................................... 17
Hình 3.2 Chồi in vitro hình thành sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng WPM bổ

sung 0,5mg/l BAP ...................................................................................................... 19
Hình 3.3 Chồi in vitro hình thành từ đỉnh chồi sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng
WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP và 15% nƣớc dừa ....................................................... 21
Hình 3.3 Chồi in vitro hình thành từ chồi nách sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng
WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP và 15% nƣớc dừa ....................................................... 23


1

MỞ ĐẦU
1.

Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài
Nuôi cấy mô thực vật (nuôi cấy thực vật in vitro) là q trình nhân giống vơ tính

thực vật trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất
cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ quan...) trong môi
trƣờng nhân tạo dƣới điều kiện vô trùng. Kỹ thuật in vitro dựa trên nguyên lý là tế bào
thực vật có tính tồn năng, nghĩa là từ một mô, một cơ quan hay một tế bào của bất kỳ
bộ phận nào của cây đều có thể phát triển thành một cây hồn chỉnh nếu đƣợc ni
trong mơi trƣờng thích hợp [13].
Năm 1960, Morel trong lúc tìm cách làm sạch bệnh cho cây hoa lan bằng kỹ
thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh đã nhận thấy khả năng sinh sản, đâm chồi một cách
tự nhiên của các mô phân sinh ngọn của một số loại hoa lan. Và cuối cùng, Morel
(1966) đã thành công trong việc nhân nhanh in vitro cây hoa lan thuộc chi Cymbidium.
Trên thế giới, nhiều loài lan thuộc các chi nhƣ Cymbidium, Dendrobium, Epidendrum,
Laeliocattleya, Acampe

đã đƣợc nhân giống vơ tính in vitro thành cơng. Đối với chi

Nervilia, có nhiều báo cáo của các tác giả Trung Quốc thành cơng trong việc nhân
giống vơ tính nhƣ He uchang và cs (1990), Pan Xue feng và cs (2001), Chen JennYih và cs (2002), Du Qin và cs (2005), Li Bin (2008) [14, 15, 16, 17]. Năm 2009, báo
cáo của Li ShouLing và cộng sự cho thấy môi trƣờng MS có bổ sung 2.0mg/L 6-BA,
0.1mg/L NAA, 10% nƣớc dừa và 0.1% than hoạt tính thích hợp để tạo chồi, cịn mơi
trƣờng MS bổ sung 2.0mg/L 6-BA và 0.5mg/L NAA thích hợp để tạo rễ [20].
Ngày nay, bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, ngƣời ta đã nhân giống và
phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị nhƣ khoai tây, thuốc lá, dứa, các cây
lƣơng thực, cây ăn quả, cây cảnh, cây dƣợc liệu.... Việc nhân giống này đã trở thành
công nghệ và đã đƣợc áp dụng ở nhiều nƣớc trên thế giới.
Ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật c ng đã đƣợc áp dùng và thành công
trên nhiều đối tƣợng. Đ c biệt, trên đối tƣợng là các loài thuộc họ Lan (Orchidaceae)
đã có nhiều báo cáo nhƣ Dƣơng Tấn Nhựt và Đ Thị Tâm đã tiến hành "Nhân giống
vơ tính một số giống địa lan Cymbidium bằng đỉnh sinh trƣởng" [4], Phan Xuân Huyên
và cs với báo cáo "Phục tráng và nhân nhanh các giống địa lan Cymbidium bằng nuôi


2
cấy đỉnh sinh trƣởng" [12], Dƣơng Mộng Hùng và cs đã "Nhân giống lan tai trâu bằng
phƣơng pháp nuôi cấy trong ống nghiệm" [3], Mai Văn Phơ và Nguyễn Hồng Lộc
báo cáo thành công trong việc nuôi cấy mô lan nghing xuân [6], Nguyễn Quang Thạch
và cs đã xây dựng quy trình kỹ thuật ni trồng cây địa lan Cymbidium spp. cấy mơ
[10].
Sở dĩ việc nhân giống vơ tính in vitro cây hoa lan thành cơng nhanh chóng và mỹ
mãn là do bởi hoa lan có phƣơng thức sinh sản thông qua protocorm. Phƣơng thức này
chủ yếu g p ở các đối tƣợng một lá mầm (monocotyledon) nhƣ phong lan, dứa, huệ...
Cùng một lúc đỉnh sinh trƣởng sẽ tạo thành hàng loạt protocorm và các protocorm này
có thể phân chia thành các protocorm mới ho c phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bằng
phƣơng thức này trong một thời gian ngắn ngƣời ta có thể thu đƣợc hàng triệu cá thể.

2.

Lý do lựa chọn đề tài
Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich) (tên khác: Thanh thiên quỳ xanh,

Lan một lá) thuộc họ Lan (Orchidaceae) là một loại địa lan nhỏ, cao từ 10 – 20 cm.
Thân rất ngắn, củ trịn to, có thể n ng tới 15 – 20 g. Thẳng từ củ, chỉ mọc lên có một lá
riêng lẻ sau khi hoa tàn. Lá hình tim trịn, xếp theo các gân lá hình chân vịt, đƣờng
kính 10 – 25 cm, mép uốn lƣợn. Ra hoa khoảng tháng 3 – 4. Cụm hoa có cán dài 20 –
30 cm. Hoa thƣa 15 – 20 cái, màu trắng hay màu vàng hơi xanh lục. Ra quả tháng 5 6. Loài phân bố ở Nam Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam. Ở nƣớc ta, cây mọc trên núi
đá, ch ẩm mát dƣới bóng cây to ho c dƣới đám cỏ dày đ c ở các tỉnh từ Hồ Bình,
Lạng Sơn, Kon Tum đến Sơng Bé. Ngồi giá trị về thẩm mỹ, đây cịn là một lồi thực
vật dƣợc q hiếm có cơng dụng lợi phổi, chữa lao phổi, ho, mụn nhọt, giải độc. Bộ
phận dùng là tồn bộ cây hay củ, có khi chỉ dùng lá [2]. Do đó, lồi này đã bị khai thác
quá mức, dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên cao trong một tƣơng lai không
xa. Theo ghi nhận của Sách đỏ Việt Nam, Trân châu xanh ở mức V – sẽ nguy cấp (có
thể bị đe dọa tuyệt chủng). Một nghiên cứu mới đây của Reddy và cộng sự cho thấy
cao chiết N. aragoana bằng dung môi ethyl acetate có tác dụng kháng nấm và chống
oxi hóa [19].
Từ những lí do trên, chúng tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu điều kiện khử trùng và
cảm ứng tạo chồi để nhân giống vơ tính cây Trân châu xanh (Nervilia aragoana
Gaudich)”.


3

3.

Mục tiêu đề tài
Xác định điều kiện khử trùng và cảm ứng tạo chồi phục vụ việc vi nhân giống

cây Trân châu xanh

4.

Phương pháp nghiên cứu

4.1

Phương pháp nghiên cứu tài liệu
Chúng tơi tiến hành thu thập, phân tích, tổng hợp những tài liệu có nội dung liên

quan đến lĩnh vực nghiên cứu để có cơ sở lý thuyết, phƣơng pháp nghiên cứu phù hợp
phục vụ cho việc hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình.
Các nguồn tài liệu khác đƣợc sử dụng tham khảo thêm nhƣ: Giáo trình ni cấy
mơ và tế bào thực vật, Tạp chí Sinh học, luận văn, luận án, bài báo khoa học...

4.2

Phương pháp nghiên cứu trong phịng thí nghiệm

4.2.1 Điều kiện và mơi trƣờng ni cấy
Môi trƣờng cơ bản dùng để nuôi cấy là môi trƣờng WPM có bổ sung các chất
điều hịa sinh trƣởng khác nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm. Nguồn carbon
là đƣờng saccharose. Môi trƣờng đƣợc làm đ c bằng agar, pH của môi trƣờng đƣợc
điều chỉnh đến 5,8. Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc khử trùng ở 121 oC trong 18 phút.
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 25 ± 2 oC, cƣờng độ ánh sáng
2000- 3000 lux và thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày.
Bảng 0.2.1 Thành phần môi trƣờng cơ bản WPM (Woody plant medium)
THÀNH PHẦN
HÀM LƢỢNG (mg/L)

1.Đa lƣợng
Ammonium nitrate, NH4NO3

400

Calcium chloride, CaCl2.2H2O

96

Calcium nitrate, Ca(NO3)

556

Magnesium sulfate, MgSO4.7H2O

370

Monopotassium phosphate, KH2PO4

170

Potassium sulfate , K2SO4

990


4
Chelating agent, Na2EDTA

37,3

Iron sulfate, FeSO4.7H2O

27,8

2.Vi lƣợng
Boric acid, H3BO3

6,2

Copper sulfate, CuSO4.5H2O

0,25

Manganese sulfate, MnSO4.4H2O

22,3

Sodium molybdate, Na2MoO4.2H2O

0,25

Zinc sulfate, ZnSO4.7H2O

8,6

3.Vitamin
Niacin (nicotinic acid)

0,5

Pyridoxine (vitamin B6)

0,5

Thiamine (vitamin B1)

1

4. Amino acid
Glycine

2

4.2.2 Nghiên cứu khả năng khử trùng của mẫu
Tìm ra nồng độ chất khử trùng thích hợp và thời gian tối ƣu cho việc khử trùng
mẫu củ cây Trân châu xanh.
Củ cây Trân trâu xanh (chọn những củ có đƣờng kính khoảng 1 cm, trắng, cứng,
khỏe mạnh) lấy từ trong đất đƣợc rửa qua bằng nƣớc máy cho hết bụi bẩn bám vào.
Dùng xà bông rửa qua nhẹ nhàng. Rửa lại bằng nƣớc máy nhiều lần dƣới vịi nƣớc. Để
củ vào trong bình pise vơ trùng và đƣợc rửa nhiều lần bằng nƣớc cất vô trùng. Chuyển
mẫu vào tủ cấy. Trong tủ cấy vô trùng, củ của cây Trân châu xanh đƣợc rửa 3 lần,
mẫu đƣợc xử lí sơ bộ bằng cồn 700 trong thời gian 1 phút. Mẫu đƣợc rửa lại 5 lần nƣớc
cất vô trùng. Tiếp tục tham dò với các chất khử trùng ở nồng độ và thời khác nhau
gồm: Nƣớc javen theo tỉ lệ (1: 3) khử trùng trong thời gian 15 phút. HgCl2 0,1% khử
trùng trong 2 khoảng thời gian là 5 phút và 10 phút. Cancihypochloricl (Ca(OCl)2)
10% khử trùng trong 10 phút để nghiên cứu tỉ lệ phần trăm mẫu bị nhiễm, tỉ lệ phần


5

trăm mẫu vô trùng và tỉ lệ phần trăm mẫu nảy chồi. Tiếp tục rửa mẫu bằng nƣớc cất vô
trùng 5 lần. Củ đƣợc cắt đơi ho c cịn ngun đƣợc cấy lên các mơi trƣờng WPM có
bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau.

4.2.3 Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro
Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP lên khả năng tạo cụm chồi in vitro từ đỉnh
chồi
Tìm nồng độ các chất kích thích sinh trƣởng thích hợp cho q trình tạo cụm chồi
Đỉnh chồi, chồi nách (khoảng 1cm) tách các chồi in vitro mọc từ củ ở thí nghiệm
khử trùng đƣợc cấy lên mơi trƣờng cơ bản WPM có 2% saccharose, 0,7% agar và bổ
sung BAP với các nồng độ từ 0-1 mg/L.
Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm),
khả năng sinh trƣởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
M i môi trƣờng ni cấy 20 mẫu. Thí nghiệm đƣợc l p lại 3 lần.
Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với nước dừa lên khả năng tạo cụm
chồi in vitro từ đỉnh chồi
Đỉnh chồi (khoảng 1cm) tách các chồi in vitro mọc từ củ ở thí nghiệm khử trùng
đƣợc cấy lên mơi trƣờng cơ bản WPM có 2% saccharose, 0,7% agar, bổ sung BAP
với các nồng độ từ 0-1 mg/L.và bổ sung nƣớc dừa với các tỉ lệ thể tích 0%-20%.
Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm),
khả năng sinh trƣởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
M i môi trƣờng ni cấy 20 mẫu. Thí nghiệm đƣợc l p lại 3 lần.
Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với nước dừa lên khả năng tạo cụm
chồi in vitro từ chồi nách
Chồi nách (khoảng 1cm) tách các chồi in vitro mọc từ củ ở thí nghiệm khử trùng
đƣợc đƣợc cấy lên mơi trƣờng cơ bản WPM có 2% saccharose, 0,7% agar, bổ sung
BAP với các nồng độ từ 0-1 mg/L và bổ sung nƣớc dừa với các tỉ lệ thể tích 0%-20%
để thăm dị khả năng tạo chồi của mẫu.
Theo dõi, đánh giá khả năng tạo cụm chồi (số chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm),
khả năng sinh trƣởng và phát triển của chồi sau 8 tuần nuôi cấy.

M i môi trƣờng ni cấy 20 mẫu. Thí nghiệm đƣợc l p lại 3 lần.


6

4.3

Phương pháp xử lý thống kê số liệu
Kết quả thí nghiệm đƣợc xử lý bằng phần mềm SPSS 13.3 (SPSS Inc.

Headquarters, United States, 2004) với mức xác suất có ý nghĩa p < 0,05.

5.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

5.1.

Đối tƣợng nghiên cứu

Cây Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich) thu nhận trong tự nhiên thuộc:
Chi: Nervilia
Họ: Orchidaceae
Bộ: Orchidales
Lớp: Monocotyledonae
Ngành: Magnoliophyta

Hình 5.1 Cây Trân châu xanh
5.2.

Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu điều kiện khử trùng và môi trƣờng tối ƣu nhân giống vơ tính in vitro

cây Trân châu xanh


7
Q trình nghiên cứu đƣợc diễn ra tại phịng thực hành Sinh học, khoa Khoa học
tự nhiên, trƣờng Đại học Thủ Dầu Một.


8

Chƣơng 1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1.1

Lược sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy mơ, tế bào thực vật là q trình ni cấy vô trùng in vitro các

bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật nhanh
chóng đi vào thực tiễn cuộc sống. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
đƣợc bao hàm trong ứng dụng của công nghệ Sinh học. Nó bao gồm nhân giống và
nhân nhanh giống, sản xuất sinh khối các sản phẩm sinh hóa, sản xuất và chuyển hóa
sinh học các dƣợc liệu tự nhiên, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý, cải thiện và
tạo giống cây trồng, nghiên cứu bệnh học thực vật, làm sạch virus...[9].
Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dƣới kính hiển vi và đƣa ra
khái niệm "tế bào - Cell". Anton Van Leuwen Hoek (1632-1723) thiết kế kính hiển vi
khuyếch đại đƣợc 270 lần, lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn, tế bào tinh trùng trong
tinh dịch ngƣời và động vật.
Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xƣớng học thuyết cơ

bản của sinh học gọi là Học thuyết tế bào:
+ Mọi cơ thể sống đƣợc cấu tạo bởi một ho c nhiều tế bào.
+ Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức
nhỏ nhất của sự sống.
+ Tế bào chỉ đƣợc tạo ra từ tế bào tồn tại trƣớc đó.
Năm 1898, Haberlandt tiến hành ni cấy tế bào đơn tính, các tế bào này tách từ
nhu mơ lá, tƣợng tầng biểu bì và lơng hút của nhiều lồi thực vật, kết quả thu đƣợc là
không thành công.
Năm 1902, Haberlandt để chứng minh cho tính tồn năng của tế bào ơng đã đề
xƣớng ra phƣơng pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Theo ông, m i tế bào bất kì của một
cơ thể sinh vật đa bào điều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hồn
chỉnh. Điều đó, theo kiến thức sinh học hiện đại có nghĩa là: M i tế bào riêng lẻ của
một cơ thể đa bào chứa đầy đủ tồn bộ lƣợng thơng tin di truyền cần thiết của cả sinh
vật đó và nếu g p điều kiện thích hợp thì m i tế bào có thể phát triển thành một cơ thể
sinh vật hoàn chỉnh. Tuy nhiên, Haberlandt đã khơng thành cơng trong thí nghiệm
chứng minh tồn năng của tế bào do ơng đã chọn cây một lá mầm là đối tƣợng rất khó


9
nuôi cấy, m t khác do ông lại dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh. Một
nguyên nhân khác nữa của sự thất bại là do vào thời kỳ đó những hiểu biết khoa học về
nhu cầu dinh dƣỡng của mơ thực vật cịn rất hạn chế nên ơng đã khơng tìm ra đƣợc
mơi trƣờng dinh dƣỡng tối thích cho sự phân chia của tế bào [1, 8, 11].
Phải mất hàng chục năm sau mới có những thí nghiệm thành cơng để chứng minh
cho khả năng tồn tại và phát triển đọc lập của tế bào. Nổi bật là các cơng trình sau:
Năm 1922, Kotte và cs đã nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng tách từ đầu rễ của cây hòa
thảo và đã tạo đƣợc một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Nhƣng sau một thời gian ngắn thì hệ
rễ này phát triển chậm dần và ngừng lại [21].
Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định đƣợc vai trò của IAA, 1 hoocmon thực vật
đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trƣởng và phân chia tế bào

[18].
Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi
cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thƣợng tầng (cambium) ở cà rốt và
thuốc lá, mơ sẹo có khả năng sinh trƣởng liên tục [7].
Năm 1941, Overbeek và cs đã sử dụng nƣớc dừa trong nuôi cấy phôi non ở cây
cà rốt Datura.
Năm 1951, Nitsch đã khắc phục đƣợc tính khơng giao hợp tiền giao tử khi nghiên
cứu và thành công trong nuôi cấy mô quả bầu non, cà chua, dƣa chuột và lần đầu tiên
tạo đƣợc hạt trong quả cà chua in vitro có khả năng nảy mầm (hạt có sức sống). Sau
này có rất nhiều nhà khoa học thành công trong nuôi cấy hạt phấn, các quá trình sinh
trƣởng của ống phấn, thụ tinh và tạo thành quả trong điều kiện in vitro.
Năm 1955, Miller và cs đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một
cytokinin đóng vai trị quan trọng trong phân bào và phân hố chồi ở mơ ni cấy. Đến
năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin:
cytokinin trong môi trƣờng đối với sự phát sinh cơ quan (rễ ho c chồi). Khi tỷ lệ
auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có
xu hƣớng tạo chồi. Ngƣợc lại khi nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn,
mơ có xu hƣớng tạo rễ. Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân
hố cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh.


10
Năm 1958, Reinert và Steward tạo đƣợc phôi và cây cà rốt hồn chỉnh từ tế bào
đơn ni cấy trong dung dịch.
Năm 1960, Morel đã thực hiện bƣớc ngo t cách mạng trong sử dụng kỹ thuật
nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu công
nghiệp vi nhân giống thực vật. C ng trong năm 1960, Cocking lần đầu tiên sử dụng
enzym phân giải thành tế bào và đã tạo ra số lƣợng lớn tế bào trần. Kỹ thuật này sau đó
đã đƣợc hồn thiện để tách nuôi tế bào trần ở nhiều cây trồng khác nhau.
Năm 1962, Kante và cs. Thông báo về khả năng thụ phấn trong điều kiện in vitro

của cây thuốc phiện (Papaver inoxia). Năm 1966, ông tạo thành công cây đơn bội từ
nuôi cấy túi phấn cây cà độc dƣợc. Năm 1967, nhóm Bourgin và Nitsch lại thành cơng
khi tạo cây đơn bội từ túi phấn thuốc lá. Những thành công này đã khiến giới khoa học
bắt đầu chú ý đến việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn. Việc
này đã đóng góp rất nhiều kiến thức cho lĩnh vực di truyền thực vật và thực tiễn chọn
giống.
Năm 1966, Morel hoàn thành quy trình nhân nhanh cây hoa lan thuộc chi
Cymbidium. Ý tƣởng của ông đƣợc thai ngén từ năm 1960 khi ông ngẫu nhiên quan
sát sự sinh trƣởng và phát triển của chồi ngọn cây lan trong lúc cố tìm cách để làm
sạch bệnh cây lan giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật..
Năm 1970, Nagata và Takebe đã sử dụng kỹ thuật tế bào của Bergman để nuôi
cấy protoplast của cây thuốc lá và tái sinh đƣợc cây hoàn chỉnh. Cho đến nay, kỹ thuật
protoplast đã đƣợc thực tế xác nhận sau nhiều công bố lai thành công giữa các lồi,
một việc khơng thể thực hiện đƣợc bằng lai hữu tính cổ điển. Protoplast giúp cho sự
nghiên cứu hiện tƣợng nhiễm sắc thể hòa hợp của các tế bào khác loài sau khi dung
hợp, giúp cho viếc nghiên cứu vai của các DNA trong các cơ quan tử và quan hệ của
chúng với DNA trong phân bào. Tính đến ngày 1/1/1985 kỹ thuật dung hợp protoplast
đã thu đƣợc 104 trƣờng hợp lai, bao gồm con lai trong loài, con lai giữa các loài, con
lai giữa các chi và con lai giữa các chi phụ. Đến 1995, con số trên đã gấp hai lần. Điều
đó chứng tỏ kỹ thuật dung hợp protoplast đã trợ giúp rất hiệu quả cho công tác chọn
tạo giống.
Từ năm 1980 đến nay là giai đoạn thành công của lĩnh thực công nghệ gene thực
vật. Đó là kỹ thuật đƣa một gene cần thiết có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật và


11
động vật hay một gene tổng hợp vào các giống cây trồng muốn cải tạo. Chỉ trong một
thời gian ngắn hàng loạt phƣơng pháp đƣa gene ngoại lai vào thực vật đƣợc cơng bố.
Ngồi phƣơng pháp chuyển gene thơng qua vi khuẩn Agrobacterium, các phƣơng pháp
chuyển gene trực tiếp nhƣ kỹ thuật sử dụng điện (electroporation), kỹ thuật vi tiêm

(microinjection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), sử dụng súng bắn gene
(gene gun) đang đƣợc các phịng thí nghiệm trên thế giới phát triển mạnh và đạt đƣợc
kết quả rất chắc chắn. Sau khi đƣa đƣợc gene ngoại lai vào vào tế bào ngƣời ta sử dụng
kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật để nuôi cấy các tế bào đã đƣợc chuyển nạp. Sau
đó cho tái sinh lại thành cây nguyên vẹn mang những đ c tính sinh học mới. Chúng
sinh trƣởng, phát triển, ra hoa, kết hạt bình thƣờng và đƣợc coi nhƣ một giống cây
trồng mới. Lĩnh vực cơng nghệ gene đã có những thành cơng to lớn khơng chỉ trên đối
tƣợng thực vật mà cịn thành công trên đối tƣợng động vật và vi sinh vật. Đối với thực
vật, theo thống kê của Tạp chí Sinh học, thuộc mạng lƣới công nghệ Sinh học Châu Á
– Thái Bình Dƣơng, tính đến tháng 12/1995 đã có hơn 50 giống cây trồng khác nhau
đƣợc chuyển các gene quý nhƣ chống chịu sâu bệnh, virus và cỏ dại, chống chịu các
điều kiện bất lợi của môi trƣờng, gene giữ cho quả chậm chín để vận chuyển, gene
giúp cho hoa quả chống lại sự hƣ hại và các hạt trở nên mẩy hơn, đầy dinh dƣỡng và
nhƣ vậy mang lại lợi ích kinh tế phong phú hơn. Năm 1988, Toriyama thành công khi
chuyển gene kháng bệnh vàng lụi (Tungro) vào protoplast lúa nhóm Japonica và tái
sinh cây hồn tồn từ protoplast chuyển gene. Năm 1991, Burbank đã thành công
trong việc ghép gene miễn dịch đối với loài gián cánh cứng Colorado cho khoai tây và
đã trồng thử ở một vài nơi ở Maine Oregar. Kết quả khoai tây có thể miễn dịch đ c
biệt với loài gián cánh cứng [5].
Ở viện nghiên cứu Nông nghiệp Pháp (INRA), các nhà khoa học đã chuyển thành
công gene Capsul vào cây thuốc lá. Các nhà khoa học của viện lúa Quốc tế (IRRI) đã
chuyển thành công các gene khác nhau vào cây lúa, cụ thể là gene Bt (gene chống sâu
đục thân ở lúa), gene chitinase chống bệnh do nấm gây ra nhƣ đạo ôn, khô vằn. Các
giống cây trồng chuyển gene hiện đang đƣợc khảo nghiệm và trồng trong điều kiện
nhà kính tại Cơng ty Di truyền chọn giống và sản xuất hạt giống tại Bruxell (Bỉ). Ở
Mỹ đã sản xuất hai loại cây trồng là cà chua cứng quả và bảo quản lâu hơn 45 ngày,
loại thứ hai là giống ngơ chống sâu đục thân và có năng suất cao. Thực vật chuyển
gene thực tế đã trở thành hàng hóa trên thị trƣờng. Năm 1996, ngƣời ta đã ứng dụng

12
cho trồng trọt khoảng 18.000 km2 từ Ả Rập đến Bắc Mỹ và sản phẩm đƣợc đem bán
trên thị trƣờng với những ƣu việt nhƣ bí ngơ chống chịu đƣợc virus, khoai tây và bông
không bị côn trùng phá hoại, bông và đậu tƣơng chống chịu đƣợc với chất diệt cỏ. Ngô
chuyển gene c ng đã đƣợc trồng đại trà và đƣợc bán rộng rãi trên thị trƣờng châu Âu
[8].
Nói tóm lại, sự phát triển nhƣ v bão của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
cùng với sự ra đời của công nghệ gene thực vật đã mở ra một hƣớng mới cho nền nông
nghiệp thế giới. Với các giống cây trồng đƣợc tạo ra bằng các phƣơng pháp này, nền
nông nghiệp thế giới đang bƣớc vào “Cuộc cách mạng xanh lần thứ hai”, góp phần
khơng nhỏ vào đảm bảo an toàn lƣơng thực và nhu cầu của con ngƣời. Các nhà nơng
học sẽ có thêm một phƣơng pháp mới trong việc cải tạo tự nhiên.

1.2 Những ưu điểm và hạn chế của công nghệ nhân giống vô tính in vitro
1.2.1 Ƣu điểm của nhân giống vơ tính in vitro
- Đƣa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ƣu việt bất kì đều có thể tạo ra một
quần thể đồng đều cao với số lƣợng không hạn chế, phục vụ sản xuất thƣơng mại, dù
cây đó là dị hợp về m t di truyền.
- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trƣờng hợp, cơng
nghệ nhân giống vơ tính in vitro đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ một cây trong
vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây.
- Sản phẩm cây giống đồng nhất: Nhân giống vơ tính in vitro về cơ bản là cơng
nghệ nhân dịng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng điều cao dù xuất phát từ cây mẹ có
kiểu gene dị hợp hay đồng hợp.
- Tiết kiệm khơng gian: Vì hệ thống sản xuất hồn tồn trong phịng thí nghiệm,
khơng phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thƣớc nhỏ. Mật độ cây
tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và
trong nhà kính theo phƣơng pháp truyền thống.
- Nâng cao chất lƣợng cây trồng: Nuôi cấy mô là một phƣơng pháp hữu hiệu để
loại trừ virus, nấm, vi khuẩn khỏi các cây trồng đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh

tạo ra bằng nuôi cấy mô thƣờng tăng năng suất 15-30% so với giống gốc.