ung dung cong nghe vi sinh vat trong san xuat ruou vang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHỦ ĐỀ:

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT
TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG

Giảng viên bộ môn: PGS.TS Phan Thị Phượng Trang

Môn học: Công nghệ vi sinh vật
Lớp: Cao học vi sinh K30
Học viên thực hiện:
1. Phạm Thanh Truyền

20C64008

2. Nguyễn Huỳnh Thanh Nhi 20C64013

Tp. Hồ Chí Minh, 7/2021


MỤC LỤC
1. Giới thiệu 4
1.1. Vài nét về rượu vang................................................................................................4
1.2. Thành phần dinh dưỡng trong dịch ép nho...............................................................4
1.3. Các thời kì trong lên men rượu vang........................................................................6
1.4. Phân loại rượu vang.................................................................................................6
1.5. Thành phần và giá trị dinh dưỡng trong rượu vang..................................................7
1.6. Một số lợi ích của rượu vang...................................................................................8

2. Chủng vi sinh vật, phân lập và sàng lập 8
2.1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae......................................................................8
2.1.1. Nguồn phân lập..................................................................................................8
2.1.2. Phân lập và làm thuần........................................................................................9
2.1.3. Sàng lọc chủng nấm men có tiềm năng trong sản xuất rượu vang.....................9
2.1.4 Bảo quản giống.................................................................................................10
2.1.5 Hoạt hóa chủng.................................................................................................10
2.2. Vi khuẩn lactic......................................................................................................11
2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic...................................................................................12
2.2.2. Sàng lọc vi khuẩn lactic trong lên men malolactic...........................................12
3. Tối ưu hố q trình lên men 13
3.1 Tối ưu hóa q trình lên men rượu..........................................................................13
3.2 Tối ưu hóa q trình lên men malolactic.................................................................13
4. Quy trình sản xuất rượu vang 14
4.1. Thu hoạch nho.......................................................................................................14
4.2. Sơ chế nho.............................................................................................................14
4.3. Chuẩn bị men.........................................................................................................15
4.4. Lên men rượu.........................................................................................................16
4.5. Ép rượu.................................................................................................................. 16
4.6. Lên men malolactic................................................................................................16
4.7. Ủ rượu....................................................................................................................17
4.8. Lọc rượu................................................................................................................17
4.9. Chiết rót, đóng chai, dán nhãn...............................................................................17
5. Kiểm sốt chất lượng trong sản xuất rượu vang
17
5.1. pH và độ acid.........................................................................................................17
5.2. Hàm lượng đường..................................................................................................17
5.3. Hàm lượng Nitrogen..............................................................................................18
5.4. Chất rắn lơ lửng.....................................................................................................18
5.5. Lượng Oxy hòa tan................................................................................................18

2


5.6. Các chỉ tiêu đánh giá rượu thành phẩm..................................................................18
5.6.1. Chỉ tiêu cảm quan............................................................................................18
5.6.2. Chỉ tiêu hóa học...............................................................................................19
5.6.3. Giới hạn kim loại nặng....................................................................................19
5.6.4. Các chỉ tiêu vi sinh..........................................................................................20
6. Tài liệu tham khảo
20

3


1. Giới thiệu
1.1. Vài nét về rượu vang
Rượu vang là một loại rượu nhẹ được lên men từ dịch ép trái cây, thu được khơng qua
chưng cất, có hương vị thơm ngon của trái cây tự nhiên, độ cồn nhẹ (10 – 15%), là loại
nước giải khát thơm ngon có giá trị dinh dưỡng cao, rất thích hợp cho phụ nữ và người
cao tuổi. Quá trình lên men được thực hiện chủ yếu nhờ nấm men sử dụng hệ enzyme sẵn
có chuyển hóa glucose và một số đường khác thành cồn ethanol và các sản phẩm phụ như
ester, axit hữu cơ,…Ngồi ra, cịn có sự hỗ trợ một phần bởi vi khuẩn lactic tạo nên
hương vị đặc trưng cho rượu vang.
Trên thế giới, rượu vang đã ra đời cách đây khá lâu và ngành cơng nghiệp rượu vang
đã có nhiều bước tiến đáng kể, hồn thiện quy trình cũng như chất lượng sản lượng ngày
càng đáp ứng thị hiếu người tiêu dùng. Các quốc gia sản xuất rượu vang và tiệu thụ rượu
vang mạnh phải kể đến là Pháp, Ý, Đức, Mỹ, Tây Ban Nha…Việc sản xuất rượu vang
trong nước cũng đã phát triển nhưng chủ yếu tiêu thụ ở vùng nông thôn bởi chất lượng
chưa cao, giá thành vừa phải. Chưa có một quy trình sản xuất u cầu kĩ thuật và cơng
nghệ như của nước ngồi. Hầu hết vang được chiết xuất từ nhiều nguồn dịch quả khác

nhau nên chất lượng chưa đảm bảo. Hiện nay có hai công ty sản xuất rượu vang lớn ở
Việt Nam là vang Đà Lạt và vang Biên Hòa. Nguồn nguyên liệu nho thì chỉ có Ninh
Thuận được đánh giá là vùng trồng nho tiềm năng cho sản xuất nho. Tuy nhiên các nhà
sản xuất vang ở Việt Nam trong quá trình sản xuất vẫn cho thu mua một số lượng lớn quả
mà không quan tâm tới chất lượng và nguồn gốc dẫn tới chất lượng thành phẩm không
cao, không đáp ứng nhu cầu thị trường ngày một khắt khe.
1.2. Thành phần dinh dưỡng trong dịch ép nho
Trong quả nho và nhiều loại quả khác, hầu như chỉ có đường khử glucose, fructose là
những hợp chất có chứa nhóm aldehyde. Khi phản ứng với các nhóm amin tự do trong
dịch ép nước quả sẽ tạo nên hương vị và mùi thơm đặc trưng cho sản phẩm lên men.
Ngoài ra, glucose là loại đường có tốc độ sản xuất năng lượng lớn nhất thích hợp cho sự
phát triển sinh khối của nấm men. Do đó, nếu sử dụng dịch lên men hồn tồn từ dịch ép
quả thì quá trình lên men sẽ rất thuận lợi.
Các loại quả như nho, táo, xồi,… thâm chí cả cóc, bưởi, mận đều có thể dùng làm
nguyên liệu để chế biến lên men rượu vang. Nhưng nho vẫn là ngun liệu lí tưởng nhất
vì:
 Nho cho chất lượng rượu tốt nhất, hương vị đậm đà
 Vị ngọt, nồng của cồn ethanol cân đối với vị chua, chát của axit và tannin trong
quả nho
 Thành phần nước quả thích hợp cho việc lên men
4


Nho cho sản lượng nước quả cao trên diện tích thâm canh tốt (1ha đạt 2- 3 vạn
lít nước quả)
Nước ép nho tươi chứa 70 - 80% nước và nhiều chất rắn hịa tan (vơ cơ và hữu cơ).
Trong sản xuất rượu vang, các nhóm hợp chất quan trọng trong dịch ép nho bao gồm:
đường, axit hữu cơ, hợp chất phenolic, hợp chất nitơ, hợp chất thơm, khống chất, nhóm
chất pectic
+ Đường: Glucose và fructose được xem là loại đường chính trong nho. Hàm lượng

đường trong nước ép nho chín dao động trong khoảng 150 - 250 g /L. Trong quả chưa
chín, glucose là đường chủ yếu. Ở giai đoạn chín, glucose và fructose thường có mặt với
lượng bằng nhau (tỷ lệ 1: 1). Trong nho chín quá, hàm lượng fructose vượt quá glucose.
+ Axit hữu cơ: Axit tartaric, malic, citric,…là chất rắn có nhiều nhất trong nước ép
nho, là nguyên nhân tạo nên vị chua, có ảnh hưởng đến màu sắc; pH của rượu. So với
những loại trái cây khác, nho là loại trái cây hiếm hoi có chứa axit tartaric và hiện diện
dưới dạng axit tự do và muối, chẳng hạn như kali bitartrate. Bitartrate là một thành phần
quan trọng vì nó ảnh hưởng đến độ pH và độ ổn định lạnh của rượu
+ Hợp chất phenolic: Hai chất chính có trong nhóm hợp chất này là anthocyanins và
tannin. Anthocyanins là sắc tố chịu trách nhiệm tạo ra màu đỏ và tím cho nho và rượu
vang. Khi vang đỏ chín, anthocyanin sẽ kết hợp với các hợp chất phenol khác góp phần
ổn định màu sắc trong vang đỏ. Tannin là những hợp chất rất phức tạp, trọng lượng phân
tử lớn có vai trị làm tăng vị chát và đắng trong rượu. Trong quá trình tăng trưởng của
nho, tannin bắt đầu trùng hợp dẫn đến tăng kích thước phân tử, khi đó vị chát được cảm
nhận nhiều hơn vị đắng. Sự gia tăng kích thước phân tử làm cho các hợp chất này khơng
hịa tan và do đó, chúng kết tủa, và vị chát của rượu vang sẽ giảm.
+ Hợp chất Nitơ: Nho chứa nhiều hợp chất nitơ khác nhau, gồm các cation amoni và
các hợp chất nitơ hữu cơ như axit amin, peptite và protein. Tổng nồng độ nitơ của quả sẽ
tăng lên trong thời kỳ chín. Các hợp chất chứa nitơ rất quan trọng vì chúng đóng vai trò
là chất dinh dưỡng cho nấm men và vi khuẩn lactic. Nitơ ảnh hưởng đến sự hình thành
sinh khối, tốc độ lên men và sản xuất các sản phẩm phụ khác, do đó ảnh hưởng đến các
thuộc tính cảm quan của rượu vang
+ Hợp chất thơm: Ở rượu vang, nhiều hợp chất thơm dễ bay hơi cũng đã được tìm
thấy như 4-vinylguaiacol, 4-vinylphenol, Terpenes,... tạo ra mùi cay giống như đinh
hương và mùi thuốc đối với một số loại vang. Các hợp chất thơm này có nguồn gốc từ ba
nguồn chính đó là nho, q trình tăng trưởng của nho và trong q trình lên men
+ Khống chất: Khống chất trong nho sẽ được cây hấp thụ có nguồn gốc từ đất,
chiếm 0,2 - 0,6% trọng lượng tươi của quả, gồm các hợp chất khoáng quan trọng như:
kali, natri, sắt, phosphate, sunfat và clorua. Trong đó, kali là khống chất quan trọng nhất,


5


chiếm 50 - 70% các cation trong nước trái cây. Trong q trình chín, hàm lượng kali
trong nho tăng lên. Sự di chuyển của nó vào trái cây dẫn đến sự hình thành kali bitartrate,
làm giảm độ chua và tăng độ pH của nước trái cây.
+ Nhóm chất Pectic: Là chất kết dính có trong thành tế bào quả nho. Về mặt hóa học,
chúng là những polysaccharid phức tạp được tạo thành từ các phân tử axit galacturonic
liên kết với nhau. Trong q trình chín, pectic bị thủy phân bởi các enzym pectolytic có
trong tự nhiên, làm cho quả mọng mềm hơn khi chín.
1.3. Các thời kì trong lên men rượu vang
Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kì chính:
- Thời kì phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của O 2, tế bào nấm men phát
triển sinh khối
- Thời kì lên men chuyển đường thành rượu và CO 2 : giai đoạn này nấm men hấp thụ các
chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong
quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2
Sau thời kì này là hoạt động của các vi khuẩn lactic (LAB) giúp chuyển hóa đường
cịn sót lại trong rượu vang non, đặc biệt là quá trình lên men axit malic thành axit lactic,
citric, axetic,… góp phần hình thành hương vị đặc trưng của rượu vang (cịn gọi là Q
trình lên men malolactic)
1.4. Phân loại rượu vang
Rượu vang có thể được phân loại theo nhiều cách như sau:
 Theo màu sắc
+ Rượu vang đỏ (Red wine): được lên men từ nước ép và vỏ quả nho
+ Rượu vang trắng (White wine): chỉ được lên men từ nước ép nho
+ Rượu vang hồng (Rose wine): gần giống vang đỏ, tuy nhiên khi lên men, thời gian để
vỏ nho tiếp xúc với nước ép nho ngắn hơn so với vang đỏ
 Theo hàm lượng đường

+ Rượu vang khô (dry- wine): chọn những quả nho thường, trong quá trình lên men,
lượng đường trong nho sẽ được chuyển gần hết thành rượu (độ cồn cao), có vị chát
+ Rượu vang ngọt (sweet wine): chọn những quả nho chín kĩ (có lượng đường cao),
lượng đường vẫn được giữ lại một phần trong q trình lên men, có vị hơi ngọt
 Theo hàm lượng CO2
+ Rượu vang có gas (sparkling wine): được nạp CO 2 trong lên men, ví dụ rượu sâm panh
(champagne) là loại rượu vang ngon có CO2 nên khi uống có ga bọt
+ Rượu vang khơng có gas (table wine): khơng được nạp CO2

6


Ngồi ra, rượu cịn được phân loại theo nơi sản xuất: theo quốc gia thì sẽ có các loại
rượu vang như vang Pháp, Úc, Tây Ban Nha,…Theo vùng thì sẽ có các loại rượu thuộc
vùng Bordeaux (Pháp), Burgandy (Pháp), California (Hoa Kỳ), Chablis (Pháp),…
1.5. Thành phần và giá trị dinh dưỡng trong rượu vang
Rượu vang có thành phần rất phức tạp, đến nay ở các nước có cơng nghệ sản xuất
rượu vang lâu đời cũng chưa biết hết được các chất cấu thành của rượu. Theo một số
nghiên cứu, thành phần chủ yếu của rượu là: cồn ethanol, đường, các axit hữu cơ; vơ cơ
và muối khống
+ Cồn ethanol: thành phần quan trọng nhất, là nguồn cung cấp calo chính trong rượu
vang
+ Đường: glucose, fructose, galactose...Trong đó, rượu vang khơ (<10g đường/l), rượu
ngọt (80- 110g đường/l)
+ Axit vô cơ và hữu cơ: axit tartaric, malic, lactic,..quy định độ chua cao của rượu (pH=
2,9- 3,9)
+ Muối khoáng: hàm lượng rất thấp muối của các nguyên tố P, S, K, Na, Ca, Fe, Cu,
Mn…rất quan trọng trong việc làm tăng hương vị cho rượu, cung cấp nguồn vi lượng cho
cơ thể
Ngoài ra, tannin là một hợp chất polyphenol được chiết xuất từ phần vỏ và hạt nho, là

thành phần quyết định vị chát của rượu vang. Dựa vào quá trình sản xuất, vang đỏ sẽ có
tỷ lệ tannin nhiều hơn so với vang trắng do sử dụng cả phần vỏ nho để chế biến
Một giá trị dinh dưỡng đáng kể khác của rượu vang là giàu vitamin. Do một số biến
đổi sinh hóa trong lên men, một số vitamin sẽ được giữ lại trong nước quả, một số sẽ
được bổ sung thêm và một số sẽ mất đi
Bảng 1. Thành phần vitamin của nước nho tươi và của rượu vang nho
(Theo Lafon-Lafourcade, 1975)
Rượu vang
Vitamin
Nước nho
Trắng
Đỏ
Thiamin (B1)
160 – 450 (/l)
2 – 58
103 – 245
Riboflavin (B2)
3 – 60 (/l)
8 – 133
0,47 – 1,9
Axit pantothenic
0,5 – 1,4 (mg/l)
0,55 – 1,2
0,12 – 0,68
Pyridoxine (B6)
0,16 – 0,5 (mg/l)
0,12 – 0,67
0,13 – 0,68
Nicotinamide (PP)
0,68 – 2,6 (mg/l)

0,44 – 1,3
0,79 – 1,7
Biotin (H)
1,5 – 4,2 (/l)
1 – 3,6
0,6 – 4,6
Cobalamine (B12)
0 (/l)
0 – 0,16
0,04 – 0,1
Acid P15 – 92 (/l)
15 – 133
15 – 133
aminobenzoic
7


Cholin

19 – 39 (mg/l)

19 – 27

20 - 43

1.6. Một số lợi ích của rượu vang
Khi được tiêu thụ một cách vừa phải và có kiểm sốt, rượu vang có một số tác dụng
sau:
 Bảo vệ tim
 Kiểm soát lượng đường trong máu

 Tăng cường trí não
 Giảm cân, chống béo phì
 Ngăn ngừa sự tấn cơng của các bệnh ung thư
 Làm chậm q trình lão hóa
Các chất chống oxy hóa polyphenol, resveratrol và quercetin có trong rượu vang đỏ
ngăn ngừa sự tích tụ của các gốc tự do làm chậm quá trình xơ vữa động mạch, cải thiện
mức cholesterol HDL tốt và giảm mức cholesterol LDL xấu. Hợp chất piceatannol có
trong nho đỏ có cấu trúc hóa học tương tự resveratrol. Piceatannol giúp chống béo phì và
tăng cân bằng cách ngăn chặn sự phát triển và tăng trưởng của các tế bào mỡ.
2. Chủng vi sinh vật, phân lập và sàng lập
2.1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae là một lồi nấm men được biết đến nhiều nhất có trong
bánh mì nên thường gọi là men bánh mì, là một loại vi sinh vật thuộc chi Saccharomyces,
lớp Ascomycetes, ngành nấm. Lồi này có thể xem là lồi nấm hữu dụng nhất trong đời
sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay. Nó được dùng rộng rãi trong q trình
lên men làm bánh mì, rượu và bia
Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình
cầu hay hình trứng, có kích thuớc nhỏ, từ 5-6 đến 1014 µm, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử. Nguồn
dinh dưỡng chủ yếu của chúng là sử dụng đường glucose,
galactose, saccharose, maltose như nguồn cacbon, chúng sử
Saccharomyces
dụng amino
axit và muốicerevisiae
amon như nguồn nitơ
Hình 1.Saccharomyces cerevisiae

Chủng nấm men phân lập dùng trong sản xuất rượu vang cần mang một số đặc tính
như: có thể sinh trưởng và phát triển trong điều kiện pH thấp (3,5 – 5,5), nồng độ đường
cao, chống chịu được với các stress sinh học như độ axit, nhiệt đô, ethanol cao, hạn chế
được lượng khí CO2 sinh ra

2.1.1. Nguồn phân lập
8


Mẫu nho khơng có chất kích thích và chất phịng trừ sâu bệnh được thu nhận tại vườn
ở các tỉnh Ninh Thuận, Khánh Hòa, Lâm Đồng. Sau khi thu nhận sẽ được làm dập trong
túi nilon vô trùng, ủ lên men tự nhiên và giữ làm nguồn phân lập nấm men. Mẫu sau một
tuần lên men được bảo quản ở 4oC để tiến hành phân lập
2.1.2. Phân lập và làm thuần
Chủng nấm men được phân lập trên môi trường YPG (yeast extract- peptoneglucose) có bổ sung 6 g/L tartaric axit, 30 mg/mL chloramphenicol
Quy trình phân lập:
- Lấy 1 (g) mẫu nho lên men pha lỗng, cấy sang mơi trường YPG, ủ 30oC trong 24- 48h
- Chọn các khuẩn lạc điển hình cấy ria sang mơi trường YPG có bổ sung chloramphenicol
30 mg/l, ủ ở cùng điều kiện
- Cấy chuyền nhiều lần để làm thuần, sau đó chuyển sang ống thạch nghiêng YPG và bảo
quản ở 4oC chuẩn bị cho nghiên cứu tiếp theo
2.1.3. Sàng lọc chủng nấm men có tiềm năng trong sản xuất rượu vang
Dựa trên các thí nghiệm kiểm tra các khả năng:
 Khả năng lên men đường
 Khả năng chịu áp suất thẩm thấu với glucose và fructose
 Khả năng chịu ethanol
 Khả năng chịu nhiệt, pH
 Khả năng sinh H2S
 Khả năng sinh ethanol
Khả năng lên men đường: các dịng nấm men phân lập được ni cấy trên môi trường
YEPD lỏng (15g peptone, 10g yeast extract, 20g saccharose), trong ống nghiệm có chứa
ống Durham ở 30oC trong 48h. Nếu có sinh hơi sẽ làm cho ống Durham bị đẩy lên, chứng
tỏ có khả năng lên men đường
Khả năng chịu áp suất thẩm thấu với glucose và fructose: các dịng phân lập được
ni cấy trong mơi trường YPG có bổ sung glucose hoặc saccharose ở các mức nồng độ

khác nhau (0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% và 30%), 30˚C trong vịng 48h. Sau 48h ni
cấy tiến hành đo OD 600 nm
Khả năng chịu ethanol: các dòng phân lập được nuôi cấy trong 10 ml môi trường YPG
lỏng (bổ sung 5, 10, 15% ethanol), ở 30˚C trong 72h, đo OD
Khả năng chịu nhiệt: các dòng phân lập được nuôi cấy trong môi trường YPG và ủ ở
các mức nhiệt độ khác nhau từ 25, 30, 37 và 45˚C , đo OD
Khả năng chịu pH: các dòng phân lập nấm men được nuôi cấy trường môi trường
YPG với các mức pH khác nhau 2, 3, 4, 5 và 6 và ủ ở 30˚C trong 72h, đo OD
9


Khả năng sinh H2S: trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm men có thể sinh
nhiều hidrogen sunfit, đây là sản phẩm khơng mong muốn trong q trình lên men rượu
vì có thể ảnh hưởng đến mùi vị và chất lượng rượu vang thu được nên các chủng nấm
men được kiểm tra khả năng sinh H2S bằng cách nuôi cấy trên môi trường LA (Peptone
yeast extract, NaCl) ở 30˚C trong 10 ngày và kiểm tra sự thay đổi về màu sắc của môi
trường nuôi cấy. Nếu môi trường chuyển sang màu đen thì chủng nấm mem đó có khả
năng sinh H2S và là chủng không phù hợp dùng để lên men rượu vang
Khả năng sinh ethanol:
Bước 1: Xác định trọng lượng riêng (môi trường nuôi cấy ban đầu)
Cân trọng lượng của bình tam giác vơ trùng (W1), làm đầy bình bằng nước vơ trùng
khử ion và cân trọng lượng (W2). Sau đó làm đầy bình tam giác bằng mơi trường nuôi
cấy và cân trọng lượng (W3).
Trọng lượng riêng = S/W
Trong đó: S khối lượng thể tích của mơi trường (W3-W1)
W khối lượng của thể tích nước (W2-W1)
Bước 2: Xác định hàm lượng ethanol
Mỗi dịng phân lập được ni cấy trong mơi trường YPG có bổ sung saccharose. Sau
khi ni cấy tiến hành xác đinh trọng lượng riêng của canh trường nuôi cấy. Hàm lượng
ethanol trong canh trường nuôi cấy được xác định bằng công thức:

%Ethanol = (Trọng lượng riêng của môi trường ban đầu – Trọng lượng riêng của canh
trường sau khi nuôi cấy) x 131,25
2.1.4 Bảo quản giống
Tế bào nấm men được nuôi cấy trên môi trường YPG có thể được bảo quản lạnh sâu
trong glycerol ở -70°C
Nguyên tắc phương pháp làm lạnh sâu: dựa trên cơ sở sự phát triển của vi sinh vật bị
ức chế ở nhiệt độ lạnh sâu bằng cách trộn dịch tế bào với chất bảo vệ với nồng độ thích
hợp, sau đó đưa vào lạnh sâu ở nhiệt độ tối ưu để bất hoạt chủng
Quy trình thực hiện:
- Chuẩn bị 1mL dung dịch glycerol 30% vơ trùng vào lọ có nắp vặn vô trùng 4mL
- Bổ sung 1mL dịch nuôi cấy men được lấy ở pha log muộn vào dung dịch glycerol
- Trộn, làm đông trên đá khô và bảo quản ở –70°C
2.1.5 Hoạt hóa chủng
Mẫu sau một thời gian bảo quản sẽ bị bất hoạt, để thu nhận lại đặc điểm vốn có của
chủng gốc phục vụ cho các nghiên cứu, ta sẽ tiến hành hoạt hóa chúng. Sau thời gian bảo
quản lạnh sâu và được hoạt hóa, khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có đặc điểm hình thái
giống hệt hình thái của chủng nấm men trước khi bảo quản
10


Thực hiện: Cạo mẫu đông lạnh bằng tăm vô trùng hoặc que cấy diệt khuẩn, sau đó cấy
tế bào nấm men trên đĩa chứa môi trường YPG và ủ ở 30°C
2.2. Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là một bộ phận của hệ vi sinh vật tự nhiên trên quả nho, trong dịch
đường và rượu vang. Vi khuẩn lactic là những tế bào Gram dương, dị dưỡng hóa năng
hữu cơ, hoạt tính catalase âm tính và axit lactic được xem là sản phẩm cuối cùng của quá
trình trao đổi chất của chúng. Chính pH axit, hàm lượng ethanol và các thành phần khác
của rượu vang tạo ra áp lực chọn lọc đối với các vi khuẩn lactic. Chỉ có một số lồi rất
nhỏ có khả năng phát triển trong các loại dịch đường và rượu vang. Các loài thường gặp
trong quá trình sản xuất rượu vang chủ yếu thuộc các giống sau: Pediococcus,

Leuconostoc, Oenococcus và Lactobacillus
Sự xuất hiện của các loại vi khuẩn lactic này trên bề mặt quả nho là rất nhỏ, khoảng
100 tế bào/g quả. Loài Oenococcus oeni xuất hiện muộn hơn nhưng lại là quan trọng
nhất,
rất hiếm khi chúng xuất hiện trên lá nho, quả nho và chỉ có số lượng rất ít. Trong thực tế,
lồi này rất ít xuất hiện ở giai đoạn đầu của quá trình lên men. Các loại trực khuẩn và cầu
khuẩn xuất hiện trên quả nho thường xuyên hơn so với O.oeni. Trong số tất cả các lồi
này nói trên, lồi cuối cùng O.oeni được coi là có khả năng chống chịu cao nhất đối với
các điều kiện môi trường bất lợi của rượu vang như pH thấp, hàm lượng cồn và SO 2 cao
và do vậy chịu trách nhiệm chính cho quá trình lên men malolactic trong đa số các trường
hợp.
Chủng vi khuẩn lactic phân lập dùng trong sản xuất rượu vang cần mang một số đặc
tính như:
 Có khả năng chuyển hoá axit L-malic thành axit L-lactic, lên men được glucose,
fructose
 Hoạt tính catalase âm tính, phân giải CaCO3
 Tồn tại được ở mơi trường có nồng độ cồn cao, pH thấp (4,2 – 4,8)

11


2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic
Quả, lá nho
Nghiền
Lọc, pha loãng, phân lập trên môi trường MRS

37oC, 48h

Khuẩn lạc
vi khuẩn lactic

viXác định khả năng phân giải axit malic

Hình 2. Sơ đồ phân lập vi khuẩn lactic từ nguồn nguyên liệu quả và lá nho
2.2.2. Sàng lọc vi khuẩn lactic trong lên men malolactic
Dựa trên các thí nghiệm kiểm tra các khả năng:
 Khả năng sinh hoạt tính catalase
 Khả năng phân giải CaCO3
 Khả năng lên men dị hình (khả năng sinh CO2)
 Khả năng chịu pH, chịu ethanol
 Khả năng lên men malolactic
Xác định hoạt tính catalase: Nhỏ trực tiếp vài giọt H 2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc vi
khuẩn lactic đã được nuôi 48h trong môi trường MRS ở 37 oC. Quan sát sự xuất hiện bọt
khí bằng mắt thường. Nếu thấy có xuất hiện bọt khí thì phản ứng là dương tính, ngược lại
khơng xuất hiện bọt khí là phản ứng catalase âm tính
Xác định khả năng phân giải CaCO 3: Mơi trường thạch MRS có bổ sung 20g/l CaCO 3
được đổ vào các đĩa petri. Tiến hành đục lỗ trên các đĩa thạch với số lượng 3 lỗ/đĩa. Sau
12


đó hút 30µl dịch vi khuẩn lactic cho vào mỗi lỗ. Ủ các đĩa thạch ở nhiệt độ 37 oC trong 35 ngày và quan sát vòng phân giải CaCO3 của vi khuẩn
Xác định đặc tính lên men di hình: Ni cấy chủng vi khuẩn trên mơi trường MRS
lỏng (có glucose) trong ống nghiệm chứa ống Durham. Sau 24 - 48h, chủng nào sinh khí
CO2 sẽ tạo ra áp xuất đẩy ống durham lên phía trên bề mặt mơi trường, qua đó xác định
được các chủng lên men di hình. Chủng nào khơng sinh khí sẽ khơng đẩy được ống
Durham lên phía trên bề mặt mơi trường
Xác định khả năng lên men malolactic:
Sau khi sàng lọc sơ bộ có định hướng để thu nhận được các chủng vi khuẩn lactic về
các khả năng phân giải CaCO3, catalase âm tính, lên men dị hình, khả nặng chịu được
nồng độ cồn cao…, tiến hành xác định khả năng lên men malolactic của các chủng nhằm
tìm ra chủng có đặc tính cơng nghệ phù hợp nhất cho lên men malolactic rượu vang đỏ.

Chủng vi khuẩn lactic sẽ được chọn cho lên men malolactic nếu khả năng phân giải axit
malic cao nhất với hàm lượng axít malic cịn dư sau lên men thấp nhất
Thực hiện: cấy vi khuẩn lactic từ khuẩn lạc trên ống thạch nghiêng vào 10 - 50 ml
môi trường lên men malolactic (dịch vang non) sau khi lên men rượu, ủ ở 25oC, lấy mẫu
hàng ngày và đo OD để kiểm tra hàm lượng axit malic bị tiêu thụ hoặc hàm lượng axit
lactic tạo thành
3. Tối ưu hố q trình lên men
3.1 Tối ưu hóa q trình lên men rượu
Tỷ lệ giống: thông thường tỷ lệ giống trong lên men vào khoảng 4- 10 triệu tế bào/ ml
dịch nho. Men sau khi tăng sinh sẽ xác định mật độ tế bào và điều chỉnh ở các mức 4, 6,
8, 10 triệu tế bào/ ml dịch nho
Thời gian lên men: Thông thường thời gian lên men sẽ kết thúc khi trọng lượng riêng
của dịch lên men <1000. Khi dịch lên men đạt 1000, tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu rượu
sau mỗi 2 ngày
Nhiệt độ: thông thường nhiệt độ vào khoảng 25 – 32oC . Khảo sát 25, 27, 29, 32oC
Hàm lượng đường: Mơi trường dịch nho có hàm lượng đường từ 10 – 25% là thuận
lợi cho việc lên men. Khảo sát các mức nồng độ 10, 15, 20, 25%
Sau các bước khảo sát, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu sau để chọn các mức khảo sát,
điều kiện thích hợp cho việc lên men
+ Nồng độ cồn : 10 -14o
+ pH: 2,9 – 3,9
+ Hàm lượng đường: 80 – 110 g/l (rượu vang ngọt)
+ Hàm lượng SO2: 350 mg/l
+….
13


3.2 Tối ưu hóa q trình lên men malolactic
Sau khi tối ưu quá trình lên men rượu, tiến hành áp dụng các thông số lên men và thu
sản phẩm để tiến hành lên men malolactic:

 Tỷ lệ giống: 104, 105, 106, 107, 108 (tế bào/ml)
 Nhiệt độ: 21, 23, 25, 27, 29 (oC)
 Thời gian: 5, 10, 15, 20, 25 (ngày)
Các chỉ tiêu theo dõi:
+ Hàm lượng acid lactic: 1,5 – 2 g/l
+ Hàm lượng axit axetic: 0,28 – 0,35 g/l
+ Lượng axit malic giảm so với ban đầu: 0,11 – 0,12 g/l
+ Độ rượu : 10 -14o
+ pH: 2,9 – 3,9
+ Cảm quan: độ trong, màu, mùi, vị
4. Quy trình sản xuất rượu vang
4.1. Thu hoạch nho
Chất lượng sản phẩm rượu vang có thể nói là 60% nguyên liệu quyết định, 40% là do
cơng nghệ vì vậy ngun liệu tốt sẽ cho sản phẩm tốt, vì vậy quá trình tiếp nhận và phân
loại phải được tiến hành kỹ. Quá trình lựa chọn và phân loại có thể được tiến hành trước
khi bảo quản nguyên liệu hay trong khi chế biến trong phân xưởng sản xuất. Lựa chọn
nguyên liệu là yếu tố quyết định đến chất lượng sản phẩm.
Nho chưa đạt độ chín rượu sẽ bị nhạt và chua, đối với nho q chín rượu vang sẽ
khơng đạt mùi vị. Nho được chọn lựa đồng đều về độ chín, trái sâu, trái dập nát, thối hay
trái còn quá xanh. Sau đó, trái phải được vận chuyển nhanh chóng về các nhà máy sản
xuất rượu vang. Tại đó, trái được phân loại theo từng giống, loại (trái chín kỹ thuật, trái
chưa chín và quá chín). Việc phân loại rất quan trọng là yếu tố quyết định đến chất lượng
sản phẩm vì muốn sản phẩm có chất lượng cao thì cần phải có những giống nho cho năng
suất cao, phẩm chất tốt.
4.2. Sơ chế nho
- Rửa nho:
Q trình rửa có thể được tiến hành trước hoặc sau khi phân loại nguyên liệu.
Rửa là để loại bỏ bụi bẩn, đất cát và phần lớn vi sinh vật bám bên ngoài vỏ trái. Đồng
thời còn tẩy sạch một số chất bảo vệ thực vật gây độc còn lưu lại trên trái.
Rửa nhẹ nhàng tránh làm dập, không nên ngâm quá lâu trong nước sẽ làm tổn thất

chất khơ hịa tan.
- Ép nho: Ép ngun quả với thiết bị thép không gỉ, thép inox không bị acid ăn mịn,
khơng có vết sắt hoặc đồng. Thu được dịch ép của quả chuẩn bị cho quá trình lên men.
14


- Sulfit hóa:
Sau khi có dịch ép, người ta khơng tiến hành đun sôi dịch ép. Để tiêu diệt vi sinh vật
người ta thường dùng SO2. Lượng SO2 trong dịch lên men nếu quá nhiều sẽ gây ức chế sự
phát triển và hoạt động chuyển hóa đường thành rượu. Lượng SO 2 sử dụng khoảng 30 –
120 mg/l.
Mục đích của việc sử dụng SO2 là làm giảm hoặc tiêu diệt sự phát triển của vi sinh
vật, đặc biệt là vi khuẩn và nấm men dại gây bất lợi cho rượu vang. Chống oxy hóa là bảo
vệ rượu vang khỏi sự oxy hóa mãnh liệt của các hợp chất phenol và các chất thơm của
chúng. Đồng thời cũng có tác động đến một phần q trình oxy hóa – khử trong thời gian
tàng trữ rượu vang. Giúp cho việc giữ màu và ổn định màu vang được tốt hơn. Tuy nhiên
nếu dùng SO2 khơng đúng liều lượng có thể làm cho rượu có mùi khó chịu, tiêu diệt vi
khuẩn có lợi, đồng thời cũng là tác nhân gây ngộ độc rượu vang
4.3. Chuẩn bị men

15


Giống nấm men trên môi trường
thạch nghiêng được tăng sinh trong 10 ml môi trường YEPG lỏng, sau 24h tiếp tục
tăng sinh trong 100 ml môi trường tương tự ở điều kiện lắc trong 3 ngày. Tiếp tục tăng
thể tích tăng sinh lên 2l và cuối cùng là tăng sinh trong 20l dịch đường từ nho trong 3
ngày.
Tỷ lệ giống đầu vào sẽ ảnh hưởng đến chất lượng rượu cũng như thời gian lên
men. Tỷ lệ giống quá cao sẽ làm thời gian lên men nhanh hơn tuy nhiên cũng dẫn

đến làm thay đổi thành phần lên men, tỷ lệ giống thấp thời gian lên men sẽ kéo
dài, khả năng nhiễm cao.
Sau khi tăng sinh nấm men tiến hành xác định mật độ tế bào nấm men bằng
buồng đếm hồng cầu và bổ sung vào mẻ men theo tỷ lệ đã khảo sát ban đầu.
4.4. Lên men rượu
Đây là giai đoạn hình thành rượu non. Giai đoạn này bắt đầu xảy ra khi nho
được để nguyên trái để ép lấy dịch, có hoặc khơng bổ sung đường. Trong giai đoạn
này, nấm men hoạt động mạnh nhất, tiêu thụ các chất dinh dưỡng (đường, đạm,
vitamin) rất mạnh để chúng chuyển hóa đường thành ethanol, đồng thời giải phóng
CO2 làm tăng nhiệt độ lên men.
16


Trong quy mô công nghiệp, người ta sử dụng giống nấm men thuần chủng. Tỷ
lệ giống cho vào quá trình lên men như đã được khảo sát trước đó. Nấm men được
nhân giống ở một phân xưởng riêng, một số trường hợp khác, người ta sử dụng
một phần dung dịch đang lên men của mẻ này để lên men mẻ ở tiếp theo. Cách
làm này có ưu điểm là: giống nấm men trong quá trình lên men đã quen với điều
kiện sản xuất. Tuy nhiên, chỉ có thể sử dụng từ 5 – 7 lần.
Thời gian của quá trình lên men chính vài ngày lên đến vài tuần tùy thuộc vào
nhiều yếu tố có liên quan như nhiệt độ, độ đường, số lượng nấm men... Thời điểm
kết thúc quá trình lên men cũng đã được khảo sát ở thí nghiệm trước đó. Ở giai
đoạn này duy trì nhiệt độ thích hợp từ 20 – 22C trong khoảng từ 10 đến 20 ngày,
từ 6 đến 7 ngày nếu lên men ở nhiệt độ cao khoảng 25 – 28C. Ở giai đoạn này có
nhiều sự biến đổi trong dịch lên men, cần chú ý đến sự hình thành cồn. Kết thúc
quá trình lên men chính thường đạt khoảng 8 – 10 % cồn.
4.5. Ép rượu
Sau khi quá trình len men rượu kết thúc người ta thu phần dịch lên men và ép
thêm phần bã để thu thêm rượu. Kết thúc quá trình này ta thu được rượu non.
4.6. Lên men malolactic

Giai đoạn này được tính từ khi lên men rượu xong và gạn cặn lần đầu. Lên men
phụ thường được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ lên men trong giai đoạn
lên men chính.
Trong q trình lên men phụ, sự tạo thành cồn chậm lại rất nhiều do chỉ còn sót
lại một ít nấm men phân hủy lượng đường cịn lại, thay vào đó là một loạt các q
trình chuyển hóa phụ để tạo thành chất thơm. Đồng thời, ở giai đoạn này vi khuẩn
lactic bắt đầu hoạt động lên men malolactic, kết quả là acid malic được chuyển
thành acid lactic làm cho rượu từ vị chua gắt chuyển sang vị chua nhẹ, dễ chịu,
CO2 còn lại tiếp tục được giải phóng nhưng ít dần.
Chủng vi khuẩn lactic cũng được nhân giống trong mơi trường MRS lỏng với
quy trình nhân giống tương tự như ở chủng nấm men. Canh trường sau khi tăng
sinh sẽ được xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục.
Tỷ lệ giống, nhiệt độ, thời gian lên men malolactic được thực hiện tương tự
như thí nghiệm khảo sát ở trước đó.
4.7. Ủ rượu
Sau khi kết thúc quá trình lên men, rượu thường được ủ trong các thùng chứa
bằng gỗ, gốm, hoặc bằng thép.
Đây là giai đoạn ổn định sản xuất, ở giai đoạn này rượu đạt được sự hài hòa và
ổn định mùi, vị và chất lượng thì rượu phải được ủ nhằm cho khí oxy tác động thật
17


chậm. Ủ ở nhiệt độ 4 – 10C để rượu vang hồn thiện hương vị đặc trưng. Thời
gian ủ có thể là vài tháng, vài năm hoặc nhiều hơn.
4.8. Lọc rượu
Rượu sau khi ủ sẽ trải qua hai quá trình lọc thơ và lọc tinh, q trình lọc rượu
nhằm loại bảo các protein, các chất rắn cũng như các xác men và vi sinh đảm bảo
độ trong của rượu cũng như hạn chế sự hư hỏng trong quá trình bảo quản.
4.9. Chiết rót, đóng chai, dán nhãn
Sau khi lọc bỏ cặn và nấm men cịn sót thì ta chiết rót vào vào chai, đóng nút

và dán nhãn sản phẩm. Thường người ta dùng gỗ sồi để đóng nút và đóng thùng
lưu trữ.
5. Kiểm soát chất lượng trong sản xuất rượu vang
5.1. pH và độ acid
Độ pH điển hình trong rượu vang thường nằm trong khoảng 2,9 – 3,9 và được
khác định bằng máy đo.
Nồng độ axit là một trong những chỉ tiêu cơ bản quan trọng xác định chất
lượng rượu vang.
Độ axit trong rượu vang có thể được xác định bằng phương pháp chuẩn độ.
Rượu đạt chất lượng có hàm lượng axit citric trong khoảng 0,5 – 1 g/l, các axit
khác khoảng 1 g/l (benzoic và axit cinnamic).
5.2. Hàm lượng đường
Hàm lượng đường là một trong những yếu tố quan trọng quyết định thời gian
thu hoạch nho và thời điểm kết thúc quá trình lên men.
Hàm lượng đường được xác định bằng phương pháp đo chỉ số khúc xạ hoặc
xác định trọng lượng riêng.
Nước ép nho có trọng lượng riêng lớn hơn 1000, nhưng đến khi trọng lượng
riêng giảm xuống dưới 1000 thì gần như quá trình lên men đã hoàn thành.
5.3. Hàm lượng Nitrogen
Hàm lượng nitrogen được khuyến nghị phân tích trong q trình sản xuất rượu
để đảm bảo chất lượng rượu vang.
Nitrogen là yếu tố quan trọng cần thiết cho quá trình sinh trưởng của nấm men.
Tổng Nitrogen trong dịch nho dao động rất khác nhau, khoảng 50 mg/l đến
1000 mg/l.
5.4. Chất rắn lơ lửng
Chất lơ lửng (thường là các protein) sẽ ảnh hưởng đến cảm quan và chất lượng
rượu.
Chất lơ lửng này thường được xử lý bằng chất làm mịn hoặc bằng cách lọc.
Hàm lượng chất lơ lửng trong rượu đạt khoảng <15 g/100L là đạt yêu cầu.
18

5.5. Lượng Oxy hòa tan
Oxy hòa tan ảnh hướng lớn đến chất lượng, độ ổn định và tuổi thọ rượu.
Giám sát mức oxy hịa tan trong q trình sản xuất và đóng chai trở thành mối
quan tâm của các nhà máy sản xuất rượu.
Lượng oxy hịa tan trong q trình lên men trong khoảng 4 – 6 mg/l, còn lượng
oxy hịa tan trong đóng chai phải thấp hơn 1,25 mg/l đối với rượu vang đỏ và dưới
0,6 mg/l với rượu vang trắng.
5.6. Các chỉ tiêu đánh giá rượu thành phẩm
5.6.1. Chỉ tiêu cảm quan

5.6.2. Chỉ tiêu hóa học

19


5.6.3. Giới hạn kim loại nặng

5.6.4. Các chỉ tiêu vi sinh

6. Tài liệu tham khảo
Tiếng Việt
20


1. Lương Đức Phẩm, 1998, CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT. NXB Nông
Nghiệp.
2. Vũ Công Hậu,1993, CHẾ BIẾN RƯỢU VANG TRÁI CÂY TRONG GIA
ĐÌNH.

3. Lượng, Nguyễn Đức, 2002, THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ SINH HỌC, Tập
2, Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM
4. Trương Hương Lan, Lại Quốc Phong, Trần Thị Minh Hà, Ngô Anh Tuấn,
Taillandier Patricia, Lonvaud Aline (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất
rượu vang chất lượng cao tại Việt Nam Báo cáo tổng hợp, tr 12-24
5. Tiêu chuẩn Việt Nam (2002), Rượu vang - Quy định kỹ thuật, Trung tâm tiêu
chuẩn Việt Nam TCVN:7045:2002
Tiếng Anh
6. Teshome Edae Jiru, Naznin Sultana, Michael Wawire (2001), Fermentation
processing, NXB Trí Nhân Minh.
7. Amerine M.A. and Cruess W.V. (2003), The technology of wine making, The
AVI Publishing Company Inc., Connecticut

21