Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ cho tạo giống mía saccharum SSP chuyển gen

....

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
-------------

BÙI NGỌC TRANG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH PHỤC VỤ
CHO TẠO GIỐNG MÍA (SACCHARUM SSP.) CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT
Mã số : 60.62.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS LÊ HUY HÀM

HÀ NỘI - 2008


Lời cam đoan
Tơi xin cam đoan rằng số liệu kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chưa sử dụng ñể bảo vệ trong một học vị nào.
Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ trong luận văn này đã được cảm
ơn, mọi thơng tin trích trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, tháng 09 năm 2008
Tác giả

Bùi Ngọc Trang

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

i


Lời cảm ơn
ðể hồn thành luận văn, tơi nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ của
mọi người.
Trước hết, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy giáo, Cô giáo
khoa Nông học, khoa Sau ðại học,bộ môn Công nghệ Sinh học, trường ðại
Học Nông Nghiệp Hà Nội đã giúp đỡ tơi trong suốt thời gian học tập và làm
luận văn..
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn, sự kính trọng sâu sắc nhất tới Thầy giáo PGS.TS. Lê Huy Hàm, người đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ
tơi thực hiện luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thị Lý Thu cùng tập thể cán bộ công
nhân viên Viện Di truyền Nơng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi
trong q trình thực hiện luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn các bạn bè ñồng nghiệp ñã ñộng viên giúp đỡ
tơi hồn thành khố học!

Hà Nội, tháng 09 năm 2008
Tác giả

Bùi Ngọc Trang

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

ii

MỤC LỤC
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Bảng kí hiệu các chữ viết tắt

vi

Danh mục bảng

vii

Danh mục biểu đồ

ix

Danh mục hình

x

1.

Më đầu

1

1.1

đặt vấn đề

1

1.2

Mục đích và yêu cầu của đề tài

3

1.2.1 Mục đích

3

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

3

1.3

ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3

1.3.1 ý nghĩa khoa học

3

1.3.2 ý nghÜa thùc tiƠn

3

2.

Tỉng quan tµi liƯu

4

2.1

Mét sè nÐt vỊ cây mía (Saccharum Ssp.)

4

2.1.1 Phân loại và đặc điểm thực vật học

4

2.1.2 Phân bố và yêu cầu sinh thái

5

2.1.3 Giá trị cây mía

6

2.2

7

Cơ sở khoa học của xây dựng hệ thống tái sinh

2.2.1 Cơ sở khoa học

7

2.2.2 Vai trò của hệ thống tái sinh và một số hệ thống nuôi cấy sử dụng cho
biến nạp gen
2.3

8

Kỹ thuật chuyển gen vào thùc vËt

11

2.3.1 Kh¸i niƯm vỊ chun gen
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

11
iii

2.3.2 Các phơng pháp chuyển gen

11

2.3.3 Vai trò của gen chỉ thị trong kỹ thuật chuyển gen

14

2.4

15

Các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen vào cây mía

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

15

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

19

3.

nội dung, vật liệu và Phơng pháp nghiên cứu

22

3.1

Nội dung nghiên cứu

22

3.2.1 Vật liệu thực vật

22

3.2.2 Vật liệu di truyền

24

3.3

25

Phơng pháp nghiên cứu

3.3.1 Môi trờng nuôi cÊy

25

3.3.2 Chn bÞ mÉu thÝ nghiƯm

25

3.3.3 Bè trÝ thÝ nghiƯm

25

3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi

33

3.3.5 Xử lý số liệu

34

4.

Kết quả và thảo luận

35

4.1

Đánh giá khả năng tái sinh cây thông qua m« sĐo cđa 4 gièng mÝa nhËp néi 35

4.1.1 ThÝ nghiệm 1: Đánh giá khả năng tạo mô sẹo từ l¸ non cđa 4 gièng mÝa 35
4.1.2 ThÝ nghiƯm 2: Đánh giá khả năng tái sinh của 4 giống mía

38

4.2

40

Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh

4.2.1 Giai đoạn khởi tạo và nhân mô sẹo

40

4.2.2 Giai đoạn tái sinh, nhân chồi và ra rễ

50

4.2. 3 Giai đoạn vờn ơm

62

4.3

Thử nghiệm chuyển gen chỉ thị GUS vào mô sẹo của cây mÝa th«ng qua
64

Agrobacterium tumefaciens
4.3.1 ThÝ nghiƯm 13. Lùa chän chđng vi khuẩn thích hợp cho thí nghiệm
chuyển gen vào mô sĐo mÝa

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

65

iv


4.3.2 Thí nghiệm 14. Nghiên cứu ảnh hởng của mật ®é vi khn ®Õn møc ®é
biĨu hiƯn t¹m thêi cđa gen gus ở mô sẹo mía

66

4.3.3 Thí nghiệm 15. Nghiên cứu ảnh hởng của AS tới khả năng biểu hiện
tạm thêi cđa gen gus ë m« sĐo mÝa

67

4.3.4 ThÝ nghiƯm 16. Nghiên cứu ảnh hởng của thời gian lây nhiễm tới khả
năng biểu hiện tạm thời của gen gus ở mô sẹo mía

69

5.

Kết luận và đề nghị

72

5.1

Kết luận

72

5.2

Đề nghị

73

tàI LIệU THAM KH¶O

76

pHơ LơC

82

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

v


Bảng kí hiệu các chữ viết tắt
Đ/C

: Đối chứng

ĐTST

: Điều tiÕt sinh tr−ëng

2,4-D

: 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid

ADN

: Acid deoxy ribo nucleic

AS

: Acetosyringone

BAP

: 6-Benzylaminopurine

CS.

: Céng sù

CV

: Correlation of Variants

gus

: β-glucuronidase

IAA

: Indole-3-acetic acid

Ki

: Kinetin (6-Furfurylaminopurine)

LSD

: Least Significant Difference

MS

: Murashige vµ Skoog, 1962

N6

: Chu và cộng sự, 1975

OD600

: Mật độ vi khuẩn đo ở bớc sóng 600 nm

PCR

: Polymerase Chain Reaction

QĐ

: Quế đờng

ROC

: Republic of China

T-DNA

: Transfered-DNA

TDZ

: Thidiazuron

VIR

: virulence

X-Gluc

: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid

α-NAA

: α-Naphtalenacetic acid

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.

ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mơ sẹo từ lá non mía

27

Bảng 2.

ảnh hưởng phối hợp của auxin và cytokinin tới khả năng tạo mô
sẹo từ lá non mía

27

Bảng 3.

ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

28

Bảng 4.

ảnh hưởng của cytokinin đến khả năng nhân nhanh chồi mía

29

Bảng 5.

Khả năng tạo mơ sẹo từ lá non của 4 giống mía nhập nội

36

Bảng 6.

Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của 4 giống giống mía nhập nội 38

Bảng 7.

ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo

Bảng 8.

ảnh hưởng của cytokinin trong tổ hợp với 2,4-D tới khả năng

41

tạo mô sẹo
Bảng 9.

44

ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng nhân mô sẹo trên
hai nền môi trường MS và N6

46

Bảng 10. ảnh hưởng của hàm lượng 2,4-D tới khả năng nhân mô sẹo trên
nền môi trường N6

48

Bảng 11. ảnh hưởng của Ki và BAP tới khả năng tái sinh cây từ mô sẹo

50

Bảng 12. ảnh hưởng của α-NAA phối hợp Ki tới khả năng tái sinh cây từ mô
sẹo

54

Bảng 13. ảnh hưởng của Ki ñến khả năng nhân nhanh chồi mía

56

Bảng 14. ảnh hưởng phối hợp của auxin và Ki lên khả năng
nhân nhanh chồi mía

58

Bảng 15. ảnh hưởng của α-NAA lên khả năng phát sinh rễ của chồi mía

60

Bảng 16. ảnh hưởng giá thể ñến Tỉ lệ sống của cây mía ngồi vườn ươm 62
Bảng 17. Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumerfaciens thích hợp cho chuyển
gen vào mơ sẹo giống ROC 23

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

65

vii


Bảng 18. ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn tới tỉ lệ biểu hiện tạm thời của
gen gus ở mô sẹo cây mía
Bảng 19.

66

ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỉ lệ biểu hiện tạm thời
68
của gen gus

Bảng 20.

68
ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới tỉ lệ biểu hiện
69

tạm thời của gen gus

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

69

viii


DANH MỤC BIỂU ðỒ
Biểu đồ 1. Khả năng tạo mơ sẹo của 4 giống mía

37

Biểu đồ 2. Khả năng tái sinh cây từ mơ sẹo của 4 giống mía

40

Biểu đồ 3.

42

ảnh hưởng của auxin tới khả năng khởi tạo mô sẹo của cây mía

Biểu đồ 4. ảnh hưởng của cytokinin trong tổ hợp với 2,4-D

44

tới khả năng tạo mô sẹo cây mía

44

Biểu đồ 5. Tương quan giữa nồng độ 2,4D và khả năng nhân mô sẹo trên
hai nền môi trường MS, N6
Biểu ñồ 6.

47

Tương quan giữa nồng ñộ 2,4-D và hệ số nhân mơ sẹo của cây mía
49

Biểu đồ 7. ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo 51
Biểu đồ 8. Tương quan giữa nồng ñộ α-NAA trong tác ñộng tổ hợp với Ki
Biểu ñồ 9.

tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo cây mía

54

Tương quan giữa nồng độ Ki và khả năng nhân nhanh chồi mía

57

Biểu đồ 10. Tương quan giữa nồng độ auxin trong tác ñộng tổ hợp với Ki tới
khả năng nhân nhanh chồi mía

58

Biểu đồ 11. Tương quan giữa nồng α-NAAvà khả năng phát sinh rễ

61

của chồi mía

61

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

ix


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.

Cây mía (Saccharum ssp.)

4

Hình 2.

Sơ đồ thể hiện q trình phân hóa và phản phân hóa tế bào thực vật

8

Hình 3.

Vectơ nhị thể pCAMBIA1301

25

Hình 4.

Kết quả tạo mơ sẹo từ lá non của 4 giống mía nhập nội

37

Hình 5.

Tái sinh cây từ mơ sẹo của 4 giống mía

39

Hình 6.

ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mơ sẹo của cây mía

43

Hình 7.

Mơ sẹo khởi tạo trên mơi trường: (a) (b) 2 mg/l 2,4-D;

45

Hình 8.

Mơ sẹo được nhân trên mơi trường

49

Hình 9.

Chồi tái sinh từ mơ sẹo

52

Hình 10. Chồi mía tái sinh trên các cơng thức:

55

Hình 11. Chồi mía được nhân nhanh trên cơng thức :

59

Hình 12. Cây con ra rễ trên mơi trường:

62

Hình 14. Sơ đồ hệ thống tái sinh ở giống mía ROC 23

64

Hình 15. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên mơ sẹo mía sau khi lây nhiễm
với các chủng vi khuẩn A. Tumefaciens

66

Hình 16.

Biểu hiện tạm thời của gen gus ở các mật ñộ vi khuẩn khác nhau 67

Hình 17.

ảnh hưởng của hàm lượng AS tới biểu hiện tạm thời của gen gus

Hình 18 .

ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới biểu hiện tạm thời của gen gus 70

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

69

x


1. MỞ ðẦU
1.1 ðẶT VẤN ðỀ
Cây mía (Saccharum ssp.) là một trong những cây cơng nghiệp có giá

trị kinh tế cao, quan trọng ở các nước nhiệt ñới và á nhiệt ñới, ñược trồng ở
hơn 70 nước trên thế giới. 70% lượng ñường trên thế giới ñược sản xuất từ
cây mía [52]. Tầm quan trọng của mía ngày càng tăng bởi cây mía là nguồn
ngun liệu thơ cho ngành cơng nghiệp đường và các ngành cơng nghiệp sản
xuất rượu, acid acetic, butanol, giấy, gỗ dán, công nghệ enzyme và thức ăn
chăn ni. Những năm gần đây, mía trở thành một trong những ñối tượng
ñặc biệt ñược quan tâm trong chương trình sản xuất nhiên liệu sinh học.
Ở Việt Nam, mía là nguồn nguyên liệu duy nhất cho ngành công
nghiệp chế biến đường. Triển vọng phát triển ngành trồng mía ở nước ta là rất
lớn vì chúng ta có những điều kiện thuận lợi ñể nâng cao năng suất và sản
lượng mía, đáp ứng nhu cầu đường trong nước cũng như xuất khẩu [4]. Hiện
nay, ngành mía đường nước ta đã có những bước phát triển vượt bậc kể từ khi
thực hiện chương trình 1 triệu tấn đường do nghị quyết ðại hội ðảng lần thứ
8 đề ra. Tuy nhiên, bình quân trên cả nước năng suất mía trong suốt giai ñoạn
1996 - 2005 chỉ tăng 1,5%/năm. Giai ñoạn 2005-2006 năng suất bình qn
đạt 55,3 tấn mía/ha, bằng 67% năng suất bình qn của tồn thế giới và
thấp hơn nhiều các nước trong khu vực. Một số dự báo cho biết, với quy mơ
sản xuất như hiện nay thì năm 2010 Việt Nam phải nhập khẩu khoảng
500000- 600000 tấn ñường [54]. Tất cả các kết quả trên là hệ quả tất yếu của
việc thiếu nguyên liệu mía. Thực tiễn sản xuất cho thấy, các vùng trồng mía
trong nước cịn thiếu giống năng suất tốt, chất lượng cao, hầu hết các giống
mía ñang sản xuất là giống nhập nội. ðể khắc phục tình trạng đó và đạt chỉ
tiêu định hướng tới 2020 mức sản xuất ñường sẽ là 2,1 triệu tấn, ðảng và nhà
nước ta ñã và ñang triển khai nhiều biện pháp nhằm cải tạo giống mía.

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

1

Trải qua hàng ngàn năm, bằng phương pháp chọn giống cổ truyền,
người ta ñã ñưa ra hàng vạn giống cây trồng mới có đặc điểm q giá, phẩm
chất tốt, song vẫn còn nhiều hạn chế như năng suất thấp, khả năng chống chịu
sâu bệnh, ñiều kiện ngoại cảnh kém. Từ những năm 70, với sự ra ñời và ứng
dụng mạnh mẽ của sinh học phân tử ñã ñem lại nhiều thành công trong công
cuộc cải tạo giống cây trồng như: ni cấy tế bào trần, biến dị dịng soma,
chuyển gen. Trong đó, phương pháp chuyển gen là phương pháp hết sức mới
mẻ, hữu hiệu, là một kỹ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng [5], đặc
biệt với cây mía- cây có mức bội thể cao (2n=36-170), hay có những biến đổi
về mặt di truyền mà các chương trình nhân giống thơng thường khó có thể
thực hiện được [55] . Ở Việt Nam, việc phát triển mía chủ yếu ở các vùng có
điều kiện tự nhiên khó khăn khơng tưới (khơ hạn), cây thường bị bệnh (nấm,
virus, đen ngọn...) làm giảm giá trị. Vì vậy, nghiên cứu chuyển gen mang đặc
tính có giá trị vào cây mía là một hướng ñi mới cần ñược quan tâm. Mía là cây
tái sinh tốt, ñây là tiền ñề quan trọng cho việc xây dựng hệ thống tái sinh cây
hoàn chỉnh làm cở sở cho các nghiên cứu chọn tạo giống mía chuyển gen. Tuy
nhiên, ở nước ta chưa có tác giả nào nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục
vụ cho tạo giống mía bằng phương pháp chuyển gen.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ cho tạo giống mía
(Saccharum ssp.) chuyển gen"

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

2


1.2 MỤC ðÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ðỀ TÀI
1.2.1 Mục ñích
Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh cây mía (Saccharum ssp.) phục

vụ cho tạo giống mía chuyển gen- làm cơ sở cho chọn tạo giống mía năng
suất cao, chất lượng tốt,chống chịu những ñiều kiện bất thuận.
1.2.2 Yêu cầu của đề tài
- ðánh giá khả năng tạo mơ sẹo từ lá non và tái sinh cây của 4 giống
mía nhập nội
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng tới khả năng
hình thành, duy trì và nhân mô sẹo tạo nguyên liệu cho chuyển gen ở cây mía.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng tới khả năng tái
sinh, nhân nhanh, ra rễ của chồi mía in vitro.
- Xác định loại giá thể thích hợp cho tỉ lệ sống cao của cây mía in vitro
ở giai ñoạn vườn ươm.
- Thử nghiệm chuyển gen chỉ thị gus vào mơ sẹo của cây mía thơng qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ðỀ TÀI
1.3.1 Ý nghĩa khoa học
ðề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học về vấn ñề hệ thống tái sinh và
chuyển gen cây mía
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen tạo cơ sở cho
việc chuyển các gen mang các ñặc tính có giá trị vào cây mía.

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

3


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 MỘT SỐ NÉT VỀ CÂY MÍA (SACCHARUM SSP.)
2.1.1 Phân loại và đặc điểm thực vật học
Theo phân loại thực vật, cây mía thuộc:

Giới: Thực vật (Plantae)
Phân giới: Thực vật có mạch (Tracheobionta)
Liên ngành: Thực vật có hạt (Spermatophyta)
Ngành: Hạt kín (Magnoliophyta)
Lớp: Một lá mầm (Liliopsida)
Phân lớp: Commelinidae
Bộ: Hồ thảo (Poales)
Họ: Hịa thảo (Poaceae)
Chi: Saccharum L.
Hình 1. Cây mía (Saccharum ssp.)
Trong chi Saccharum có 13 lồi trong đó có 5 lồi đặc biệt quan trọng
trong sản xuất và lai tạo giống:
- Lồi Nhiệt đới (Saccharum officinarum L.)
- Loài Trung Quốc (Saccharum sinensis Roxb Emend. Jesw)
- Loài Ấn ðộ (Saccharum barberi Jesw)
- Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.)
- Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround and Jesw)
Cây mía thuộc nhóm thực vật quang hợp C4. Do vậy, nó được coi là
một trong những cỗ máy chuyển hóa năng lượng mặt trời hiệu quả và có tiềm
năng sản sinh ra một lượng lớn sinh khối [19].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

4


Cây mía thuộc họ hồ thảo, hoa lưỡng tính, mỗi hoa có 3 nhị đực, 1 bầu
nỗn và 2 đầu nhị cái. Hạt mía rất bé, kích thước khoảng 1-1,25 mm và nặng
khoảng 0,15-0,25 g.
Lá mía mọc thành 2 hàng so le, đối nhau hoặc theo đường vịng trên

thân cây mía.
Thân mía là đối tượng thu hoạch, ngun liệu để chế biến và là bộ
phận làm giống cho các vụ sau, gồm nhiều lóng và đốt hợp thành.
Rễ mía thuộc loại rễ chùm. So với những cây hoà thảo ngắn ngày khác,
cây mía có bộ rễ phát triển đặc biệt mạnh (1 khóm có 500-2000 rễ; Tổng
chiều dài rễ tới 100-500 m) [9]
2.1.2 Phân bố và yêu cầu sinh thái
2.1.2.1. Phân bố
Mía là cây có nguồn gốc nhiệt đới và á nhiệt đới nên có cần nóng ấm và
sợ giá rét.
Trên thế giới, cây mía phân bố từ vĩ độ 35o bắc ñến 35o nam, phần lớn
nằm từ vĩ ñộ 30o bắc đến 30o nam, tương đối ít ở vùng xích đạo, tập trung
nhiều ở gần nam, bắc chí tuyến.
Về ñộ cao, cây mía phân bố từ vùng ñất thấp duyên hải ñến vùng ñồi,
cao nguyên và giới hạn ñộ cao 1000-2000 m ở vùng xích đạo, giới hạn 700 m
độ cao ở vùng chí tuyến.
2.1.2.2. u cầu sinh thái
- Nhiệt độ: Mía sinh trưởng đạt đến mức độ tối ña khi nhiệt ñộ
khoảng 30o-34o C. Nhìn chung, nhiệt ñộ thích hợp cho cả q trình sinh
trưởng là từ 24o – 30o C.
- Ánh sáng: Mía là cây rất nhạy cảm với ánh sáng, cần cường ñộ ánh
sáng mạnh và rất sợ bóng râm. Trong suốt cuộc đời mình, cây mía cần khoảng
2000 đến 3000h chiếu sáng, tối thiểu phải có từ 1200h chiếu sáng trở lên.

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

5


- Nước: Mía là cây cần nhiều nước nhưng lại sợ úng thuỷ. ðể đạt

năng suất cao, mía cần một lượng mưa hữu hiệu tối thiểu là 1500mm cho cả
chu kỳ sinh trưởng. Lượng mưa hữu hiệu đó tương đương với lượng mưa thực
tế là 2000-2500mm.
- ðất: ðất thích hợp với cây mía là loại đất có khả năng giữ nước, hút
nước tốt, đất xốp, thống, có khoảng 40% chất rắn, 30% nước và 30% khơng
khí. ðất đạt các u cầu trên là ñất cát pha, ñất thịt nhẹ, ñất thịt trung bình và
trong đất cịn chất hữu cơ, nhiều mùn. Thành phần cơ giới có 10-15% sét, 2535% limơng, 40-50% cát. ðộ pH=5,5-7,5.
2.1.3 Giá trị cây mía
Hiện nay, mía là nguyên liệu chủ yếu ñể chế biến ra ñường (chiếm
70%) trên thế giới. Một cân ñường cung cấp năng lượng tương ñương 0,5kg
mỡ; 50-60kg rau quả. ðường cung cấp 10% nhu cầu năng lượng của cộng
ñồng [9]. Bên cạnh đó, mía cịn là cây xố đói giảm nghèo cho nơng dân
trung du, miền núi, là cây có hiệu quả kinh tế cao nhờ vào đặc tính thực vật
học, cho nên mía có khả năng chịu hạn khá, có thể trồng trên các vùng đồi
núi. Nếu được chăm bón tốt, nó có thể cho 200-250 tấn sinh khối/ha/năm.
Theo thống kê năm 2006 ở Việt Nam, giá bán 1 tấn mía cây trung bình là
700.000đ, cao hơn nhiều lần các cây trồng khác. Do đó, mía đã trở thành cây
làm giàu cho nhiều gia đình, nhiều khu vực rộng lớn, nhất là vùng trung du
và nhiều ñồi thấp.
Theo dự báo của một số nhà khoa học về kinh tế, cuối thế kỷ XXI và
các thể kỷ sau, năng lượng hoá thạch sẽ ngày càng cạn kiệt. Và để khắc phục
tình trạng này, người ta ñã nghĩ ñến việc sử dụng năng lượng mới từ thực vật.
Trong các cây có thể khai thác, chế biến ra nhiên liệu lỏng, cây mía được
nhiều người quan tâm nhất và ñược xếp là cây năng lượng hàng đầu trong số
các lồi thực vật. Từ 1 tấn mía tốt, người ta có thể sản xuất ra 35-50 lit cồn
96o – loại cồn thay xăng ñể chạy máy đốt trong. 1 ha mía có thể sản xuất

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

6

7000-8000 lit cồn làm nhiên liệu [9]. Gần ñây, ở Mỹ ñã cố gắng sản xuất cồn
nhiên liệu ñạt 5,67 tỷ lit/năm [6]
Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật phát triển thì giá trị cây mía ngày càng
được nâng cao. Ngồi các giá trị đã được biết đến ở trên, xenllulozo trong bã
mía được ngành giấy và cơng nghiệp gỗ ép, cơng nghiệp dệt khai thác. Cơng
nghiệp hố chất thơng qua các phản ứng khử, oxy hố, ester hố... để sản xuất
sobitol, glixerin, nannitol, axit gluconic... Từ bùn lọc có thể sản xuất sáp, chất
béo và phân bón
2.2 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH
2.2.1 Cơ sở khoa học
Việc xây dựng 1 hệ thống tái sinh ở thực vật nói chung và cây mía nói
riêng có thể thực hiện được nhờ vào tính tồn năng của tế bào thực vật.
Tính tồn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào ñã ñược
biệt hố (trừ một số loại tế bào đã biệt hố sâu như ống mạch, mao dẫn...) có
khả năng thể hiện tồn bộ hệ thống di truyền và có thể trong ñiều kiện phù
hợp sẽ phát triển phôi dẫn ñến việc hình thành cây hồn chỉnh mới
Trong một cơ thể thực vật bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác
nhau, trong ñó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng khác
nhau. Các mơ có cấu trúc chun mơn nhất định là nhờ sự phân hố. Phân hố
tế bào là sự chuyển hố các tế bào phơi sinh thành các tế bào của mơ chun
hố, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Trong ñiều kiện thích
hợp, các tế bào đã phân hố có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân
chia mạnh mẽ. Qúa trình này gọi là quá trình phản phân hố.
Sự phân hố tế bào

Tế bào phơi sinh

Tế bào chun hố

Sự phản phân hố tế bào
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

7


Hình 2. Sơ đồ thể hiện q trình phân hóa và phản phân hóa tế bào
thực vật [11].
Sự phân hố cơ quan cũng như tái sinh cơ thể nguyên vẹn là kết quả của
q trình tái phân hố các tế bào và mô nuôi cấy. Về mặt bản chất, các q trình
trên là sự hoạt hố của các gen trong tế bào. Trong ñiều kiện tự nhiên, ở những
giai ñoạn phát triển cá thể nhất ñịnh một số gen sẽ ñược hoạt hoá, một số gen
khác sẽ bị ức chế theo đúng chương trình đã được mã hố trong phân tử ADN.
Trong nuôi cấy thực vật in vitro, con người có thể điều khiển được sự
phân hố và phản phân hố để tái sinh một cây hồn chỉnh từ mơ, tế bào nhờ
việc tạo ra những mơi trường thích hợp cho mỗi loại đối tượng thực vật.
2.2.2 Vai trị của hệ thống tái sinh và một số hệ thống nuôi cấy sử dụng
cho biến nạp gen
Trong quá trình chuyển gen thực vật, việc xây dựng được dạng tế bào
đích có khả năng tiếp nhận gen mới và tái sinh thành cây hồn chỉnh là hết
sức quan trọng. Vì vậy, hệ thống tái sinh là ñiều kiện tiên quyết ñể thực hiện
thành công biến nạp gen.
Xây dựng một hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây hồn chỉnh là tiền đề
quan trọng cho các nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng nói chung và cây
mía nói riêng.
Một số hệ thống ni cấy thường được sử dụng:
2.2.2.1 Ni cấy phân hố
ðây là phương pháp dựa trên cơ sở nuôi cấy mô, từ các cơ quan xác
định có sự phân hố hình thành nên các cơ quan mới. Bao gồm 1 số phương

pháp như: Ni cấy đỉnh sinh trưởng và chồi bên; Ni cấy tạo chồi bất định
;Ni cấy tạo phơi vơ tính.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

8


• Ni cấy đỉnh sinh trưởng và chồi bên:
Ni cấy ñỉnh sinh trưởng là một phương pháp cấy mô ñược ứng dụng
rộng rãi nhất trong nông nghiệp và nghề làm vườn với các ưu ñiểm:
- Nhân nhanh hàng loạt, ñồng nhất với số lượng lớn cây giống từ một
cây mẹ ban ñầu
- Loại trừ bệnh virus
- Bảo quản quỹ gen in vitro
- Sử dụng trong chuyển gen
Nguyên liệu sử dụng trong ni cấy đỉnh sinh trưởng là các mơ phân
sinh của đỉnh sinh trưởng nằm ở chóp đỉnh chồi. Kích thước mẫu ni cấy
phụ thuộc vào lồi thực vật và mục đích nghiên cứu.
• Ni cấy tạo chồi bất định
Sự tái sinh chồi bất định chính là sự phát sinh, phân hoá các cơ quan
nhằm tạo mới các chồi bất ñịnh trên mẫu từ nhiều nguồn khác nhau thông qua
giai ñoạn callus. ðây là dạng nhân giống in vitro có thể sử dụng để tái sinh
dịng hoặc nhân nhanh với lượng lớn.
• Ni cấy tạo phơi vơ tính
Phơi vơ tính là các thể nhân giống có cực tính, bắt nguồn từ các tế bào
dinh dưỡng (tế bào soma). Khả năng tạo phơi vơ tính trong ni cấy mơ tế
bào thực vật, ngồi các điều kiện vật lý, hố học thuận lợi cho sự tạo phơi,
cịn phụ thuộc rất lớn vào lồi, giống, chủng trong cùng một lồi. Việc tạo ra
phơi vơ tính ở thực vật đem lại tiềm năng ứng dụng với mục đích nhân dịng
số lượng lớn, ni cấy tế bào trần, tạo các biến dị soma có lợi...

2.2.2.2 Ni cấy khơng phân hố

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

9


Từ các mô, cơ quan nuôi cấy sẽ tạo nên các khối tế bào vơ tổ chức,
khơng có hình dạng nhất định gọi là mơ sẹo (callus) và ở những mơi trường
thích hợp, mơ sẹo được ni cấy để nhân khối.
• Ni cấy mơ sẹo (callus)
Mơ sẹo là khối các tế bào mơ mềm có mức độ cấu trúc di truyền thấp,
chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền
cao. Mơ sẹo thu ñược bằng nuôi cấy in vitro các cơ quan của thực vật như
thân, rễ, lá, hoa... trong môi trường chứa chất điều tiết sinh trưởng nhóm
auxin với điều kiện ni cấy thích hợp. Mơ sẹo có thể được duy trì liên tục
trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển định kì.
• Ni cấy tế bào huyền phù
Ni cấy tế bào huyền phù là kỹ thuật nuôi cấy tế bào ñơn hoặc cụm
nhỏ tế bào trong môi trường lỏng. Các tế bào này cũng được tạo từ mơ sẹo
có nguồn gốc từ thân, rễ, lá, hoa, phôi... Tuy nhiên, nhược ñiểm của
phương pháp này là thời gian nuôi cấy dài và ảnh hưởng trực tiếp tới khả
năng tái sinh cây.
• Nuôi cấy tế bào trần
Tế bào thực vật bị phá bỏ tồn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ cịn lại khối
nguyên sinh chất ñược bao bọc bởi màng nguyên sinh khi được ni cấy trên
mơi trường thích hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành khối mô sẹo và
tái sinh thành cây hồn chỉnh. Ứng dụng có ý nghĩa nhất của phương pháp
này là tạo cây soma, tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp tế bào trần và
biến nạp gen.

Tuy nhiên, nhằm mục đích xây dựng một hệ thống nuôi cấy tái sinh cây
phục vụ chuyển gen, cần nghiên cứu đến khả năng sống sót của tế bào sau khi
chuyển gen trên môi trường chọn lọc. Do vậy, hệ thống nuôi cấy qua mô sẹo

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

10


thích hợp hơn cả với ưu điểm : Tỉ lệ tái sinh cây cao; Thời gian nuôi cấy
không quá dài...
Tái sinh cây qua con đường mơ sẹo có thể hình thành phôi hay tái sinh
tạo chồi trực tiếp. Tuy nhiên, cây tái sinh từ phôi soma xuất phát từ một tế bào
ñơn, riêng lẻ và phát triển thành một cây hồn chỉnh nên duy trì được tính đồng
nhất của hệ gen và do vậy hạn chế hiện tượng khảm ở cây chuyển gen [1].
2.3 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT
2.3.1 Khái niệm về chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết
kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các
sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật...) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các
gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện
các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen
2.3.2 Các phương pháp chuyển gen
Chuyển gen hữu ích vào cây trồng là một trong những bước tiến nhảy
vọt của công nghệ sinh học hiện nay. Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc rất lớn
vào bản chất cây trồng, đặc tính di truyền cũng như phương pháp biến nạp.
Mục đích chính của kỹ thuật chuyển gen là phải ñạt hiệu quả cao, áp dụng
ñược với nhiều ñối tượng cây trồng, từ ñó các nhà nghiên cứu cơng nghệ gen
đã xây dựng nhiều giải pháp kỹ thuật chuyển gen khác nhau.

Chuyển gen vào thực vật có thể chia làm 2 nhóm phương pháp chính:
phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp.
2.3.2.1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp
• Chuyển gen thơng qua vi khuẩn Agrobacterium:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

11


ADN ñược chuyển vào tế bào thực vật nhờ cơ chế truyền đặc trưng của
lồi vi khuẩn Agrobacterium làm mơi giới. Phương pháp chuyển gen thơng
qua Agrobacterium thường được áp dụng thành công ở các loại cây 2 lá mầm.
Nhờ áp dụng các kỹ thuật di truyền mà Ti-plasmid của vi khuẩn
Agrobacterium ñã trở thành một vectơ chuyển gen hữu hiệu. Người ta đã có
thể cắt bỏ những đoạn gen cần thiết, lắp ráp, bổ sung các cấu trúc và các gen
quan tâm vào các vị trí nằm giữa hai ñoạn biên của T-DNA.
Phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium là phương pháp chuyển
gen được sử dụng rộng rãi nhất, có nhiều ưu ñiểm hơn hẳn các phương pháp
chyển gen khác như:
- Số bản sao ñược chuyển vào tế bào thực vật rất thấp dẫn tới giảm sự
không biểu hiện của các gen ñã chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững,
hiệu quả chuyển gen cao [37].
- Tránh được sự hình thành các cây chuyển gen khảm (hiện tượng
thường gặp ở các phương pháp chuyển gen trực tiếp) [30].
Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn này đã được áp dụng thành
cơng trên nhiều ñối tượng cây trồng, ñặc biệt trên cây hai lá mầm. Người ta
cũng đã tìm ra các chủng Agrobacterium mẫn cảm với cây 1 lá mầm, trong đó
có ngơ, lúa và đã nhận được các cây chuyển gen hữu thụ bằng phương pháp
này [35][36][42].

• Chuyển gen nhờ virus
Ngồi vi khuẩn, người ta còn dùng virus làm vectơ chuyển gen cho cây
trồng do virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật. Bên cạnh đó,
trong cấu tạo của virus cũng có mặt axit nucleic làm cơ sở cho việc gắn các
gen cần chuyển vào.
Tuy nhiên, việc chuyển gen nhờ virus ít được sử dụng do vius không
truyền qua hạt nên việc nhân giống các cây chuyển gen nhờ virus phải tiến

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

12


hành bằng phương pháp vơ tính- phương pháp khơng thể thực hiện được cho
tất cả các loại cây. ðây chính là nhược ñiểm lớn nhất của phương pháp
chuyển gen này.
2.3.2.2 Phương pháp chuyển gen trực tiếp
• Phương pháp xung điện
Phương pháp này dựa vào hiện tượng phóng điện để tạo lỗ trên màng tế
bào, ñưa ADN vào tế bào dễ hơn, nhất là khi ADN ñã tiếp giáp với màng tế
bào trong nuôi cấy tế bào trần hoặc mô sẹo. Tuy nhiên phương pháp này chưa
có những kết quả chứng minh chắc chắn cho sự biến nạp. Hơn nữa, việc ni
cấy tế bào trần ở một số lồi cây trồng vẫn cịn gặp nhiều khó khăn. Phương
pháp này chủ yếu dùng trong nghiên cứu biểu hiện tạm thời của các gen.
• Phương pháp vi tiêm
Phương pháp sử dụng loại kim siêu nhỏ và kính hiển vi để tiêm ADN
vào những tế bào nhất định. Kỹ thuật này tạo được dịng biến nạp từ tế bào
trần và cây biến nạp khảm từ nuôi cấy hạt phấn của cây cải dầu. Tuy nhiên,
mỗi lần tiêm chỉ ñược một tế bào và thao tác địi hỏi rất khéo léo, chính xác.
• Phương pháp vĩ tiêm

Phương pháp này sử dụng kim tiêm có đường kính lớn hơn đường kính
tế bào để đưa ADN ngoại lai vào tế bào, các tế bào bị phá vỡ và ADN xâm
nhập vào tế bào bị thương và sau đó được chuyển vào tế bào bên cạnh.
• Phương pháp chuyển gen thông qua ống phấn
ðây là phương pháp chuyển gen dựa trên nguyên tắc là ADN có thể
xâm nhập vào hạt phấn ở giai đoạn nảy mầm, nhờ đó ADN có điều kiện di
chuyển vào nhân của tế bào hạt phấn hoặc hợp tử qua ống phấn. Kỹ thuật
chuyển gen này đơn giản nhưng hiệu quả chuyển gen thấp
• Phương pháp sử dụng súng bắn gen

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

13


Chuyển gen bằng súng bắn gen là một trong những kỹ thuật ñua các
gen ngoại lai và tế bào. Kỹ thuật biến nạp này dựa trên nguyên tắc sử dụng
các viên ñạn kim loại (thương dùng hạt vàng hoặc volfram) có kích thước
hiển vi, tỷ trọng cao để đạt gia tốc lớn xuyên qua vỏ và màng tế bào, ñưa lớp
ADN bọc ngoài tiếp cận với bộ mày di truyền của tế bào.
Phương pháp này thường áp dụng với những giống cây trồng mà việc
chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium khó thực hiện được hoặc khả
năng tái sinh kém do nó có những ưu điểm nổi bật như: Dễ sử dụng; Các
vectơ ñược thiết kế ñơn giản; Cần lượng nhỏ plasmid ADN; Biểu hiện gen
tạm thời có thể quan sát sau vài ngày; Chuyển ADN ngoại lai vào tế bào
nhanh. Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen này địi hỏi thiết bị ñắt tiền, hiệu
quả chuyển gen chưa cao, biểu hiện gen khơng bền vững.
2.3.3 Vai trị của gen chỉ thị trong kỹ thuật chuyển gen
Gen chỉ thị là gen có trách nhiệm thơng báo kết quả của q trình
chuyển AND ngoại lai vào hệ gen của thực vật.

Thực tế cho thấy, chỉ một Tỉ lệ ít tế bào thực vật được biến nạp thành
cơng nhờ các phương pháp chuyển gen. Do đó, rất cần có phương pháp nhận
biết những tế bào ñã ñược biến nạp gen ñể tạo cây con mang gen mong muốn
từ các tế bào chưa biến ñổi di truyền [8]. Sử dụng gen chỉ thị ñể nhận biết
những tế bào ñã ñược biến nạp là một trong những phương pháp phổ biến
hiện nay. Các gen như: Chloramphenicol-acetyl transferaza (CAT),βglucuronidaza (GUS) ñược dùng làm gen chỉ thị những tế bào ñã biến ñổi
chứa gen ngoại lai ổn định. Ngồi ra cịn có gen LUX của đom đóm, gen
vibrio harveyi mã hoá enzym uciferase phát tia sáng, dễ phát hiện nên ñược
sử dụng làm gen chỉ thị.
Ở nước ta, đã có những thành cơng nhất định trong nghiên cứu chuyển
gen vào thực vật. Ví dụ như việc chuyển gen kháng hgromycin, gen GUS và gen

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

14