Luận văn thạc sĩ nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN VĂN THÀNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở
MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
CHUYỂN GEN THƠNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2020


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN VĂN THÀNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở
MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
CHUYỂN GEN THƠNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 8. 42. 02. 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN XUÂN VŨ

Thái Nguyên - 2020


i

LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu khả năng

tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen
thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” là trung thực, được thực
hiện tại Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nơng
Lâm- Đại học Thái Ngun. Ngồi ra, trong bài báo cáo có sử dụng một số nguồn tài
liệu tham khảo đã được trích dẫn rõ ràng và được phép cơng bố.
Em xin hồn tồn chịu trách nhiệm về tính trung thực của các nội dung khác
trong đề tài của mình.
Học viên


ii

LỜI CẢM ƠN
Trong q trình học tập và hồn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được
sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân.
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn
T.S Nguyễn Xn Vũ đã ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt q trình
thực hiện và hồn thành luận văn này.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm cùng các cán bộ, quý đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành đề tài nghiên cứu này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,

người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực
hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020
Học Viên


Từ, thuật ngữ
viết tắt
CT
LSD
CV
MT
TN
AS
LB
RB
MS


iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Diện tích lúa gieo trồng từ năm 2015 - 2019........................................................... 9
Bảng 1.2. Sản lượng lúa từ năm 2015 - 2019............................................................................... 9
Bảng 2.1. Danh mục giống nghiên cứu....................................................................................... 19
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của NaOCl 3% tới hiệu quả khử trùng mẫu
(sau 7 ngày nuôi cấy).......................................................................................................................... 29
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo

của một số giống lúa........................................................................................................................... 30
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D đến tỷ lệ tái sinh mô sẹo ở một số giống lúa
(sau 14 ngày).......................................................................................................................................... 33
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi một số giống lúa..............34
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh ở một số giống lúa................35
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen GUS
của một số giống lúa........................................................................................................................... 37
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen ở một số
giống lúa.................................................................................................................................................. 39
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng tiếp nhận gen GUS
của một số giống lúa........................................................................................................................... 40
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen......................42
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen...........43
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả chọn lọc mô sẹo
chuyển gen.............................................................................................................................................. 44


v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tình hình sản xuất và diện tích lúa tồn cầu năm 2018 [16].............................. 6
Hình 1.2. Tỷ trọng sản xuất lúa theo vùng năm 2018............................................................... 7
Hình 1.3. Vi khuẩn A. tumefaciens................................................................................................ 10
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens........................... 10
Hình 1.5. Cấu trúc Ti-plasmid......................................................................................................... 11
Hình 1.6. Cấu trúc T-DNA................................................................................................................ 12
Hình 1.7. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thơng qua A. tumefaciens....................13
Hình 2.1. T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen
điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải)................20
Hình 3.1. Mơ sẹo tái sinh trên môi trường N6 (A) và MS (B)

ở giống lúa Bao thai sau 7 ngày ni cấy................................................................................... 31
Hình 3.2. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa
(sau 14 ngày). A- Nếp 87; B- Bao thai; C- Khang dân; D- Đồn kết.........................33
Hình 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa
(sau 28 ngày). A-Đoàn kết; B- Nếp 87 ; C-Khang dân; D- Bao thai................................ 34
Hình 3.4. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa
(sau 28 ngày). A-Nếp 87; B- Đồn kết; C-Khang dân; D- Bao thai................................. 35
Hình 3.5. Biểu hiện gen GUS ở mô sẹo 3 ngày tuổi của giống Khang dân (A),
Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D)................................................................................. 38
Hình 3.6. Biểu hiện gen GUS ở nồng độ AS 100 µM ở giống Khang dân (A),
Bao thai (B), Đồn kết (C) và Nếp 87 (D)................................................................................. 40
Hình 3.7. Biểu hiện gen GUS sau 3 phút lây nhiễm với vi khuẩn ở giống
Khang dân (A), Bao thai (B), Đồn kết (C) và Nếp 87 (D)................................................. 41
Hình 3.8. Biểu hiện gen GUS sau 3 ngày đồng nuôi cấy ở giống Khang dân (A),
Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D)................................................................................. 43
Hình 3.9. Chọn lọc tế bào chuyển gen trên môi trường hygromycin 10mg/l (A),
15 mg/l (B), 20 mg/l (C) và 25 mg/l (D)..................................................................................... 44


vi

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................................................... ii
DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT.................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG............................................................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH............................................................................................................................... v
MỤC LỤC............................................................................................................................................... vi
MỞ ĐẦU................................................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề............................................................................................................................................. 1

2. Mục đích nghiên cứu........................................................................................................................ 3
3. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................................................... 3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.................................................................................. 3
4.1. Ý nghĩa khoa học........................................................................................................................... 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn............................................................................................................................ 3
Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................................... 4
1.1. Vai trò của cây lúa.......................................................................................................................... 4
1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa trên thế giới........................................................... 5
1.2.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa trên thế giới................................................ 5
1.2.2. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới..................................................................................... 6
1.3. Tình hình nghiên cứu vẩn xuất lúa tại Việt Nam............................................................... 7
1.3.1. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam..................................................................... 7
1.3.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam...................................................................................... 8
1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật .. 10

1.4.1. Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens..................................... 10
1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA...................................................... 11
1.4.3. Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật..............12
1.5. Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua
vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu................................................. 14
1.5.1. Gen gusA.................................................................................................................................... 14
1.5.2. Gen bar........................................................................................................................................ 14


vii

1.6. Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa............................................................................ 14
1.6.1. Phương pháp vi tiêm............................................................................................................... 14
1.6.2. Chuyển gen bằng xung điện................................................................................................ 15
1.6.3. Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube)......................................................................... 15

1.6.4. Chuyển gen bằng súng bắn gen.......................................................................................... 15
1.7. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens........................................................... 16
1.8. Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro cây lúa trên thế giới và Việt Nam..............16
1.9. Tình hình nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen cây lúa trên thế giới
và Việt Nam............................................................................................................................................ 17
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........19
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu......................................................................................... 19
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................................ 19
2.1.2. Vật liệu sử dụng và phạm vi nghiên cứu........................................................................ 19
2.1.3. Thiết bị sử dụng........................................................................................................................ 20
2.2. Địa điểm và thời gian tiến hành............................................................................................. 20
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu................................................................................ 21
2.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa..........21
2.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng
chuyển gen ở một số giống lúa....................................................................................................... 23
2.4. Điều kiện bố trí thí nghiệm...................................................................................................... 26
2.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá............................................................................................ 26
2.5.1. Các chỉ tiêu theo dõi............................................................................................................... 26
2.5.2. Các chỉ tiêu đánh giá.............................................................................................................. 26
2.6. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................................................... 27
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.................................................. 29
3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh invitro của một số giống lúa........................29
3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của NaOCl đến hiệu quả vô trùng mẫu nuôi cấy..........29
3.1.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo.............................30
3.1.3. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở một số giống lúa..................... 32
3.1.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa..................33


viii

3.1.5. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa
Việt Nam.................................................................................................................................................. 35
3.2. Kết quả nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen..................................................................... 36
3.2.1. Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến hiệu quả biến nạp gen........................................... 36
3.2.2. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen.................................... 38
3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến hiệu quả chuyển gen ở một số giống lúa.......39
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen.............................. 41
3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen......................42
3.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả chọn lọc chuyển gen.........43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................................... 45
1. Kết luận............................................................................................................................................... 45
2. Kiến nghị............................................................................................................................................ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................................ 47


1

MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề
Lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba loại cây lương thực chính quan trọng

hàng đầu của con người, cung cấp từ 60 đến 70% calories [25]. Trên thế giới, cây lúa
nước được xếp vào vị trí thứ 2 sau cây lúa mì về diện tích và sản lượng.Việt Nam
một đất nước đã gắn liền với nền văn minh lúa nước, cây lúa có vai trị đặc biệt quan
trọng, trong sản xuất lương thực, đóng góp sản lượng cao nhất (60%) và được canh
tác với diện tích 4.126,4 nghìn ha, với quy mơ giảm qua các năm, phân tán, manh
mún do sự phát triển của công nghiệp hố. Hiện nay, diện tích đất nơng nghiệp bình
qn/hộ chỉ vào khoảng 0,46 ha và trung bình được chia thành 2,83 mảnh [7]. Trong

khi dân số đang không ngừng tăng lên, việc tạo ra bộ giống có năng suất cao, chất
lượng tốt là yêu cầu cấp thiết trong giai đoạn hiện nay. Các giống lúa đột biến dựa
trên việc sử dụng tác nhân đột biến làm biến đổi bộ gen cho kích thước hạt dài, giá trị
dinh dưỡng, năng suất cao, đồng thời tạo ra cây lúa kháng thuốc diệt cỏ đồng hợp tử,
nhạy cảm với nhiệt độ thấp, đặc biệt là ở giai đoạn non. Việc tạo ra các giống lúa có
khả năng chống chịu được với điều kiện bất lợi ngoại cảnh đặc biệt là hạn hán có ý
nghĩa quan trọng đối với việc duy trì và tăng năng suất lúa gạo, góp phần giữ ổn định
an ninh lương thực quốc gia.
Sự phát triển của công nghệ sinh học cho phép chọn tạo ra những giống cây
trồng, vật ni mới phù hợp với mục đích sử dụng. Việc chỉnh sửa bộ gen cũng có
thể được sử dụng để sửa đổi gen lúa tạo ra các giống lúa an tồn và từ đó tăng giá trị
trong mỗi sản phẩm lúa gạo. Việt Nam khí hậu ơn hịa, đất đai phì nhiêu, điều kiện tự
nhiên phù hợp với phát triển nền nơng nghiệp lúa nước, diện tích đồng bằng ven
sơng lớn như đồng bằng sông Cửu Long 4.081,63 ha và đồng bằng Sơng Hồng
2.126,3ha [7]. Lượng mưa trung bình vào khoảng 700 – 5000mm,…là những thế
mạnh giúp chúng ta phát triển lĩnh vực nông nghiệp. Thế nhưng, khi đi sâu vào thực
tế, gạo Việt Nam vẫn còn tồn đọng một số hạn chế nhất định bên cạnh những ưu
điểm vang danh bấy lâu.
Hiện nay, phương pháp dùng để chuyển gen thơng qua vi khuẩn A. tumefaciens
khơng được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm [19, 30]. Tuy nhiên, có nhiều


2

cơng trình nghiên cứu báo cáo việc biến nạp gen thành công vào lúa nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens. Chan et al (1992) là những người đầu tiên chuyển gen vào callus lúa
mặc dù khi đó khơng thu được cây chuyển gen [9]. Đến năm 1993, nhóm nghiên cứu
này đã tạo ra được cây lúa japonica chuyển gen đầu tiên nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens bằng cách nuôi cấy phôi non. Hiện nay, biến nạp gen vào lúa nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens là phương pháp được lựa chọn sử dụng hơn cả, do số bản sao

của gen biến nạp được chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ thấp, bền vững [20].
Đặc biệt, phương pháp này cho hiệu quả chuyển gen cao, khả năng chuyển được
đoạn DNA có kích thước lớn và chi phí thấp.
Các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa trên các phương pháp lai
tạo nên hiệu quả đạt được không thực sự cao. Một số ứng dụng mới trong chọn giống
cây trồng nhờ dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến... tuy đã đạt được một số kết quả
nhất định nhưng vẫn có những hạn chế. Phương pháp chuyển gen ra đời được ví như
“chìa khóa đa năng” để mở những nút thắt vốn gây rất nhiều khó khăn cho các nhà
chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo ra một giống cây trồng “hoàn hảo” hơn khi
chúng được kết hợp với nhau. Với hướng nghiên cứu này, các gen quy định những
tính trạng quan tâm được chủ động chuyển vào lúa, từ đó tạo ra cácgiống lúa mang
các đặc tính như mong muốn của con người.
Những năm gần đây, ngành lúa gạo của Việt Nam gặp nhiều khó khăn cả về
điều kiện khí hậu, giá và thị trường xuất khẩu. Bên cạnh đó, các thách thức về biến
đổi khí hậu, thiếu hụt nguồn nước, thối hóa đất,…đang ngày càng hiện rõ. Duy trì
sản lượng lúa gạo lớn là một chính sách đã được áp dụng từ lâu. Nghị quyết
63/2009/NQ-CP về đảm bảo an ninh lương thực quốc gia yêu cầu duy trì sản lượng
lúa 41-42 triệu tấn đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu khoảng 4 triệu
tấn gạo/năm. Đây là một chính sách sản lượng nhằm hướng tới hai mục tiêu an ninh
lương thực trong nước và xuất khẩu với một chỉ tiêu cứng nhắc. Chính sách khuyến
khích sản lượng cao dẫn đến nhiều hệ quả bất lợi cho nông dân trồng lúa. Chính vì
vậy, hướng tiếp cận nghiên cứu nguồn gen lúa gạo Việt Nam phục vụ cho công tác
bảo tồn đa dạng sinh học nguồn gen ngành lúa được lưu giữ trong phịng thí nghiệm
cũng như ngồi thực địa dùng làm nguyên liệu ban đầu để tuyển chọn và phát triển
thương mại phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu. Vì vậy,


3

các nghiên cứu phải đặt trong hệ thống khép kín, tương tác lẫn nhau từ khâu điều tra,

xác định, phân loại, chọn, tạo giống, tới kỹ thuật nuôi trồng và định hướng thị trường
tiêu thụ sản phẩm tập trung và bền vững. Nhằm tận dụng và phát triển nguồn gen lúa
của Việt Nam chưa được khai thác một cách hợp lý và khoa học. Việc nghiên cứu
khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thơng
qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phục vụ cho công tác tạo giống lúa
chuyển gen đáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất là cần thiết.
“

Xuất phát từ những vấn đề trên tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu khả
năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thơng

qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy
trình chuyển gen thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phục vụ cho
công tác tạo giống lúa chuyển gen đáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất.
3. Đối tượng nghiên cứu
Một số giống lúa : Khang dân, Bao thai, Đoàn kết và Nếp 87
4.
4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1. Ý nghĩa khoa học

Đề tài tạo cơ sở lý luận cho việc nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số
giống lúa, xây dựng và hồn thiện được quy trình nghiên cứu chuyển gen của một số
giống lúa Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
4.

2. Ý nghĩa thực tiễn

Phân tích, đánh giá những mặt thuận lợi, tiềm năng lợi thế và hạn chế để tiếp
cận hướng nghiên cứu, kỹ thuật tái sinh, kỹ thuật nhân nhanh bằng phương pháp in
vitro cho sự phát triển của từng giai đoạn đảm bảo ý nghĩa thực tiễn là bảo tồn và
phát triển nguồn gen lúa gạo Việt Nam.
Việc nghiên cứu nguồn gen lúa gạo Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn đa
dạng sinh học nguồn gen được lưu giữ trong phòng thí nghiệm cũng như ngồi thực
địa dùng làm ngun liệu ban đầu để tuyển chọn và phát triển thương mại phục vụ
nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu.


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vai trò của cây lúa
Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng được trồng chủ yếu ở Châu Á,
đặc biệt là khu vực Đơng Nam Á trong đó có Việt Nam. Lúa gạo là nguồn lương thực
chủ yếu nuôi sống hàng tỷ người trên thế giới. Sản lượng lúa gia tăng trong thời gian qua
đã mang lại sự an sinh cho con người, đặc biệt đối với dân nghèo: gạo là nguồn cung cấp
thức ăn chủ yếu. Các nước nghèo thường dùng gạo là nguồn lương thực chính, khi thu
nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu hướng giảm xuống, thay thế bằng các loại thức ăn
cung cấp nhiều protein và vitamin hơn. Ở Việt Nam hiện nay mức tiêu thụ gạo bình qn
vẫn cịn ở mức cao, khoảng 120 kg/người/năm. Tuy nhiên có thể nói, trên khắp thế giới,
ở đâu cũng có dùng đến lúa gạo hoặc các sản phẩm từ lúa gạo. Khoảng 40% dân số trên
thế giới lấy lúa gạo làm nguồn lương thực chính. Trên thế giới có hơn 110 quốc gia có
sản xuất và tiêu thụ gạo với các mức độ khác nhau. Lượng lúa được sản xuất ra và mức
tiêu thụ gạo cao tập trung ở khu vực Châu Á. Năm 1980, chỉ riêng ở Châu Á đã có hơn
1,5 tỷ dân sống nhờ lúa gạo, chiếm trên 2/3 dân số Châu Á. Con số này theo ước đốn đã
tăng lên gần gấp đơi.

Lúa là cây trồng thân thiết, lâu đời nhất của nhân dân ta và nhiều dân tộc khác
trên thế giới, đặt biệt là các dân tộc ở Châu Á. Mặc dù năng suất lúa ở các nước Châu
Á còn thấp nhưng do diện tích sản xuất lớn nên Châu Á vẫn là nguồn đóng góp rất
quan trọng cho sản lượng lúa trên thế giới (trên 90%). Các quốc gia dẫn đầu về sản
lượng lúa theo thứ tự là Trung Quốc, Ấn Độ, Indoniesia, Bangladesh, Việt Nam, Thái
Lan và Myanmar tất cả đều nằm ở Châu Á. Như vậy, có thể nói Châu Á là vựa lúa
quan trọng nhất thế giới. Gạo là thức ăn giàu dinh dưỡng. So với lúa mì, gạo có thành
phần tinh bột và protein hơi thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra cao hơn do chứa
nhiều chất béo hơn. Ngồi ra, nếu tính trên đơn vị 1 hecta, gạo cung cấp nhiều calo
hơn lúa mì do năng suất lúa cao hơn nhiều so với lúa mì. Giả sử một người trung
bình cần 3200 calo mỗi ngày thì một hecta lúa có thể ni 2055 người/ngày hoặc
5,63 người/năm, trong khi lúa mì chỉ ni được 3,67 người /năm, bắp 5,3 người/năm.
Hơn nữa, trong gạo lại có chứa nhiều acid amin, thiết yếu như: Lysine, Threonine,
Methionine, Tryptophan… hơn hẳn lúa mì. Đối với một số quốc gia như Việt Nam,
Thái Lan, Miến Điện (Myanmar), Ai Cập lúa gạo chiếm một vị trí quan


5

trọng trong nền kinh tế quốc dân, không phải chỉ là nguồn lương thực mà còn là
nguồn thu ngoại tệ để đổi lấy thiết bị, vật tư cần thiết cho sự phát triển của đất nước.
Điều này chỉ rõ vị trí của lúa gạo trong cơ cấu lương thực thế giới và trong đời sống
kinh tế quốc tế.
Việt Nam là một trong những nước có nghề truyền thống trồng lúa nước cổ
xưa nhất thế giới. Nông nghiệp trồng lúa vừa đảm bảo an ninh lương thực quốc gia,
vừa là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước. Dân số nước ta đến nay hơn 90 triệu
người, trong đó dân số ở nông thôn chiếm gần 80% và lực lượng lao động trong nghề
trồng lúa chiếm khoảng 70% lực lượng lao động cả nước. Điều đó cho thấy lĩnh vực
nơng nghiệp trồng lúa thu hút đại bộ phận lực lượng lao động cả nước, đóng vai trị

rất lớn trong nền kinh tế quốc dân. Bên cạnh đó, ưu thế lớn của nghề trồng lúa cịn
thể hiện rõ ở diện tích canh tác trong tổng diện tích đất nơng nghiệp cũng như tổng
diện tích trồng cây lương thực. Ngành trồng trọt chiếm 4/5 diện tích đất canh tác
trong khi đó lúa giữ vị trí độc tơn, gần 85% diện tích lương thực. Theo số liệu sơ bộ
của Tổng cục Hải quan, tính chung cả năm 2019 cả nước xuất khẩu 6,37 triệu tấn
gạo, tương đương 2,81 tỷ USD, tăng 4,1% về lượng nhưng giảm 8,4% về kim ngạch
so với năm 2018. Giá xuất khẩu đạt 440,7 USD/tấn, giảm 12,1%. Kết quả báo cáo
tổng kết 7 tháng đầu năm 2020, Việt Nam xuất khẩu khoảng 3,9 triệu tấn gạo, đạt
kim ngạch 1,9 tỉ USD, tăng 10,9% về giá trị so với cùng kỳ năm trước. Đặc biệt là
giá gạo xuất khẩu của Việt Nam tăng cao, vượt Thái Lan, Ấn Độ và Pakistan. Đây là
lần thứ 2 Việt Nam có thể trở lại vị trí xuất khẩu gạo số 1 thế giới.
1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa trên thế giới
1.2.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa trên thế giới
* Nghiên cứu tái sinh invitro và chuyển gen
Tái sinh cây từ mô sẹo được thông báo lần đầu tiên ở loài cây ngũ cốc bởi
Tamaoki và Ullstrup năm 1958. Cho đến nay mô sẹo đã được tạo ra từ các mô lúa
khác nhau như lát cắt thân, hoa non, bao phấn, tiểu bào tử, đỉnh rễ, bao lá mầm, trụ
dưới lá mầm, hạt trưởng thành. Hiện nay, hạt trưởng thành và hạt non (phôi non)
được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu nhiều nhất vì các vật liệu này cho mơ sẹo có tỷ
lệ tái sinh cây cao hơn.
Năm 1985, tái sinh cây từ phôi trưởng thành ở các giống lúa Japonica được
thông báo bởi Fujimura và cộng sự [17]. Tạo mô sẹo và tái sinh cây ở các giống lúa


6

indica từ phôi non được thông báo bởi Koetije và cộng sự năm 1989 nhiều nghiên
cứu cũng chỉ ra rằng các giống lúa Indica có sự khác nhau đáng kể về phản ứng tạo
mô sẹo và tái sinh cây. Do đó, để cải thiện hiệu quả tạo mơ sẹo và tái sinh cây, cần
thiết tối ưu hóa mơi trường cho các giống lúa indica.

Lin và Zhang (2005) đã tối ưu hóa mơi trường và các điều kiện ni cấy phục
vụ biến nạp gen cho hiệu quả cao ở các giống lúa indica [26].
Lin và Zhang đã chỉ ra rằng nguyên nhân chính thu được tỷ lệ biến nạp thành
cơng thấp ở các giống lúa indica (so với các giống lúa japonica) có thể do hiệu quả
tái sinh của các giống lúa indica thấp hơn. Họ đã tìm ra được hai mơi trường mới để
cấy chuyển, phân hóa mơ sẹo và sử dụng quy trình tái sinh cây để biến nạp cho các
giống lúa indica.
Hiei và cộng sự (2008) đã tối ưu hóa quy trình biến nạp cho các giống lúa
indica bằng Agrobacterium tumerfaciens sử dụng phôi non của hạt non sau thu
phấn 8-12 ngày. Quy trình đã được áp dụng để biến nạp thành công với hiệu quả cao
(trên 7 dịng/phơi) cho các giống lúa indica IR8, IR24, IR26, IR36, IR54, IR64, IR72,
Xin Qing Ai 1, Nan Jin 11 và Suewon 258 [20].
1.2.2. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới
Theo cơ quan FAO tại Rome, sản xuất lúa thế giới trong 2018 tương đối thuận
lợi đạt đến 782 triệu tấn, tăng 1,6% so với năm 2017, mặc dù điều kiện khí hậu bất
thường xảy ra tại nhiều nơi, với diện tích trồng tồn cầu khoảng 168 triệu ha.

Hình 1.1. Tình hình sản xuất và diện tích lúa tồn cầu năm 2018 [16]


7

Hình 1.2. Tỷ trọng sản xuất lúa theo vùng năm 2018
Châu Á, sản xuất lúa đứng đầu châu lục chiếm gần 90,7% tổng sản ngạch thế
giới hay đạt đến 594,7 triệu tấn.
Ở

Châu Phi, sản xuất 22,6 triệu tấn, hay 3,4% mặc dù gặp hạn hán và ngập lụt

tại vài nơi ở Burkina Faso, Gambia, Niger, Tanzania và Madagascar.

Ở

Châu Mỹ, sản xuất lúa đạt đến 33,8 triệu tấn, Brazil là nước sản xuất lúa lơn

nhất của vùng, năm 2018 với sản lượng 11,3 triệu tấn.
Ở

Châu Âu, sản xuất trong 2018 khoảng 3,6 triệu tấn lúa. Hai nước trồng lúa

lớn của Châu Âu là Ý và Tây Ban Nha.
Châu Úc, năm 2018 Sản ngạch lúa thu hoạch đạt đến 815.964 tấn.
1.3. Tình hình nghiên cứu vẩn xuất lúa tại Việt Nam

1.3.1. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam.
1.3.1.1. Chọn tạo giống bằng lai hữu tính
Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự (2015) nghiên cứu giống lúa nếp N31 có năng
suất, chất lượng tốt và thời gian sinh trưởng ngắn ngày được chọn tạo bằng phương
pháp lai hữu tính giữa tổ hợp lai hai giống nếp DT22 và giống nếp N87-2 (N98) [2].


8

1.3.1.2. Chọn tạo giống bằng cơng nghệ tế
bào * Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro
Phan Thị Hương và cộng sự (2014) đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh
của bảy giống lúa bao gồm BM9630, NV1, NV2, NV3, J02 (thuộc nhóm japonica),
Hương Cốm và BC15 (thuộc nhóm indica) [4]. Tỷ lệ tạo mơ sẹo của các giống lúa
nghiên cứu trong khoảng 72-98%; trong đó, giống Hương cốm, NV1 và J02 có tỷ lệ
tạo mơ sẹo trên 90% (tương ứng 97%, 92% và 98%). Môi trường tạo mơ sẹo thích
hợp đối với giống Hương cốm và các giống japonica là môi trường muối N6 +

vitamin B5 + 3 mg/l 2,4-D + 100 mg/l myo-inositol + 500 mg/l L-proline + 500 mg/l
L-glutamin + 300 mg/l casein hydrolysate + 30 g/l sucrose.
1.3.1.3. Nghiên cứu chuyển gen
Nguyễn Thị Hồng Châu và cộng sự (2003) đã thực hiện chuyển gen vào giống
lúa C71 thơng qua A.tumerfaciens. Nhóm tác giả đã sử dụng môi trường MS làm
nền, cho tất cả các giai đoạn nuôi cấy, chuyển gen và tái sinh. Gen được chuyển gồm
3 gen là CryIA(b), CryIA(c) (gen mã hóa cho protein độc tố trừ sâu của vi khuẩn Bt
và gen Xa21 – gen kháng bệnh bạc lá). Vật liệu là giống lúa C71. Kết quả cho thấy
tỷ lệ tạo callus của giống lúa C71 khoảng 92%. Tỷ lệ biến nạp gen CryIA(c) đạt
6,6%. Tác giả cũng cho rằng khả năng tái sinh của lúa indica là thấp hơn so với
japonica. Thời gian cho cây chuyển gen mất từ 4,5 đến 5 tháng [1].
Ngồi kết quả tổng hợp ở trên, cịn nhiều cơng trình khác nghiên cứu về cơng
nghệ ni cấy mô tế bào lúa và chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn.
1.3.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam
Việt Nam có truyền thống trồng lúa lâu đời, lúa gạo là một lương thực quan
trọng và chủ yếu nhất đối với người dân Việt Nam, lúa gạo ngoài dùng làm lương
thực cho người, thức ăn cho vật ni cịn dùng để chế biến các sản phẩm khác… Đặc
biệt với một nước dân số đông tới khoảng trên 90 triệu người, việc tự sản xuất lúa là
rất quan trọng. Việt Nam có điều kiện tự nhiên thích hợp cho cây lúa có 2 vựa lúa
chính là đồng bằng sơng Hồng và đồng bằng sơng Cửu Long. Diện tích sản xuất lúa
được xếp hạng 5 và xuất khẩu gạo đứng thứ 3 trên thế giới, gạo Việt Nam đã được
xuất khẩu sang gần 160 quốc gia và vùng lãnh thổ, chiếm 15% thị phần gạo toàn cầu
và cũng bước đầu thâm nhập được các thị trường có yêu cầu chất lượng cao, như:
Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, EU,…


9

- Về gieo trồng:
Diện tích gieo trồng các vụ lúa ở nước ta từ năm 2015 đến năm 2019 có sự thay

đổi qua các năm, được thể hiện qua Bảng 1.1.
Bảng 1.1: Diện tích lúa gieo trồng từ năm 2015 - 2019
Năm

2015
2016
2017
2018
2019
(Nguồn: Tổng cục Thống kê, 2019)[7]
Nhìn chung từ năm 2015 đến năm 2019, tổng diện tích gieo trồng ở nước ta có
xu hướng giảm đi, do nhiều nơi người dân chuyển đổi dần từ trồng lúa sang trồng các
cây nông nghiệp (điều, cao su, tiêu,...) cho giá trị kinh tế cao hơn; một số địa phương
cũng phải ưu tiên dành đất nông nghiệp cho phát triển công nghiệp, kết cấu hạ tầng
và đơ thị hóa. Điều này làm ảnh hưởng rất lớn đến vấn đề an ninh lương thực quốc
gia.
- Về thu hoạch
Sản lượng lúa thu hoạch thay đổi qua các năm từ 2015 – 2019 và được trình
bày tại bảng 1.2:
Bảng 1.2. Sản lượng lúa từ năm 2015 - 2019
Năm

2015
2016
2017


2018
2019
(Nguồn Tổng cục Thống kê, 2019) [7]

10

Từ năm 2015 đến năm 2019, sản lượng lúa các mùa vụ sụt giảm qua các năm,
chỉ có năm 2018 là sản lượng có tăng so với năm 2017. Nguyên nhân là do diện tích
gieo trồng bị thu hẹp dần, người dân dần chuyển sang loại nông sản cho thu nhập cao
hơn. Điều này đã ảnh hưởng rất lớn đến tình hình xuất khẩu gạo của Việt Nam.
1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật

1.4.1. Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens

Hình 1.3. Vi khuẩn A. tumefaciens
A.tumefaciens là lồi vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2,5-3,0 x 0,70,8µm, dạng đơn bào, khơng tạo ra bào tử, có vỏ và lơng roi, là vi khuẩn hiếu khí,
nhuộm màu gram âm (-), khuẩn lạc trịn và rìa nhẵn. A.tumefaciens là lồi vi khuẩn
gây ra bệnh khối u hình chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm. Chỉ rất
ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u
hình chop [1].

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens


11

1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA
- Ti-plasmid

Hình 1.5. Cấu trúc Ti-plasmid
Plasmid là những phân tử DNA có kích thước nhỏ (2-5kb), dạng vịng, nằm
độc lập trong tế bào chất. Plasmid có khả năng sao chép độc lập, không phụ thuộc

vào sự sao chép DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn.
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dịng A. tumefaciens gây độc, có
kích thước khoảng 200-250 kb. Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở
0

nhiệt độ dưới 30 C. Bằng phương pháp lai DNA-DNA và lập bản đồ chuỗi kép dị
hợp, người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng. Trong đó, vùng TDNA (transferred DNA) và vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành
khối u cịn hai vùng khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong
Agrobacterium [1], [8].
Trong Ti-plasmid có hai vùng quan trọng cần thiết cho quá trình chuyển gen ở
thực vật. Thứ nhất, vùng T-DNA là vùng được chuyển vào thực vật nhờ quá trình tiếp
hợp giữa A. tumefaciens và thực vật ở những chỗ có vết thương. Hiện nay trong kỹ
thuật chuyển gen cây trồng, người ta lợi dụng vùng T-DNA đã mang đoạn gen cần
chuyển vào thực vật. Thứ hai, vùng vir là vùng gây độc cho thực vật nên không được
chuyển vào bộ gen của cây trồng, mà nó đóng vai trị hỗ trợ cho q trình chuyển TDNA vào trong tế bào thực vật.


12

- T-DNA
T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa cho
sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong Ti-plasmid, vị trí
của T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left
Border).
Ở

Ti-plasmid dạng nopaline, T-DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng

một đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-DNA là một
đoạn gen liên tục dài 13 kb. T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá

những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u
như tms1, tms2, tmr mã hố cho các enzyme liên quan đến q trình sinh tổng hợp
auxin và cytokinine. Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA vùng được
nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng
vir. Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir là một loạt các protein đặc
hiệu như virE2, virB, virD, virD2 [1], [8]..

Hình 1.6. Cấu trúc T-DNA
1.4.3. Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật

Các tế bào cây khi bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn
như: acetosyringon (As), alpha hydroxy-acetosyringon... Dưới tác dụng của các hợp
chất này, A. tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-DNA
vào tế bào thực vật. Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và RB,
LB. Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir
hoạt động và tăng cường biểu hiện. Sự tiếp xúc của A.tumerfaciens với các hợp
chất giải phóng từ mơ thực vật bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid
được hoạt hóa và phiên mã [1], [8]..


13

Hình 1.7. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens

Khi A.tumerfaciens gặp dịch rỉ của các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc As
tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương
tác với As và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm
của gen virG .
Sau đó protein virG đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen virB, C, D và E không
hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen virG. Các sản phẩm của operon virD

mã hóa một loại endonuclease tạo ra vết cắt trên Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25bp. Từ
đó một mạch đơn T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay thế vào đó là một
mạch đơn mới được tổng hợp theo chiều 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải.
Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường nhờ sự tương tác giữa protein VirD2
với một hoặc hai protein do gen VirC mã hóa. Cịn protein VirE2 gắn vào mạch đơn TDNA sau khi được cắt ra, để làm cho nó ổn định trong q trình chuyển vào nhân tế bào
thực vật. Còn gen VirB mã hóa cho các protein hình thành nên một cầu nối cho T-DNA
được chuyển sang tế bào thực vật [1], [8]..


14

1.5. Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông
qua vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu
1.5.1. Gen gusA
Gen gusA: chỉ thị nhuộm màu mô tế bào thông qua phản ứng oxy hóa cơ chất
X-Gluc khơng màu thành màu xanh lam dưới tác dụng xúc tác của β-Glucuronidase
(gus).
Gen gusA lần đầu tiên được phân lập từ E. coli.-glucuronidase thường được sử
dụng để làm chỉ thị chọn lọc để nhận biết cây chuyển gen bởi ưu điểm dễ nhận biết
thông qua nhuộm màu, phản ứng có độ nhạy và độ ổn định cao. Hoạt tính gus trong tế
bào, dịch chiết, cặn tế bào cịn có thể định lượng được thơng qua phản ứng xúc tác cơ
chất huỳnh quang MUG (4-methylumbelliferyl-D-Glucuronide) và đo bằng RE-Mini

150 Fluometer (Schimadzu; Columbia) với chất chuẩn là MU (4methylumbelliferone, Sigma) ở bước sóng 360 và 460 nm [1].
1.5.2. Gen bar
Gen bar được tạo dòng đầu tiên từ dòng vi khuẩn Streptomyses
hygroscopicus, là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin
acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT) là
hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos, Finale, Buster, Harvest và Basta.
Glufosinate là hợp chất tự nhiên được phân lập từ 2 loài nấm Streptomyces, ức chế

hoạt tính của enzyme tổng hợp glutamin, enzyme cần thiết cho sự tạo thành glutamin
và độc tính ammonia. Việc sử dụng glufosinate dẫn đến làm giảm hàm lượng
glutamin và làm tăng ammonia trong mô thực vật. Điều này làm cho quá trình quang
hợp ngừng và cây chết sau này [1].
1.6. Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa
Ngồi phương pháp biến nạp gen gián tiếp thơng qua vi khuẩn A.
tumefaciens, các phương pháp biến nạp gen trực tiếp cũng đã được ứng dụng nhiều
trong chuyển gen vào lúa, cụ thể:
1.6.1. Phương pháp vi tiêm
Các nhà nghiên cứu sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lượng
nhỏ DNA vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào nguyên vẹn. Phương pháp này