Tài liệu TIỂU LUẬN HOÁ SINH - Chủ đề: Sơ lược về các bước tổng hợp protein có hoạt tính mong muốn ppt

1






TIỂU LUẬN HOÁ SINH

Chủ đề: Sơ lược về các bước tổng hợp protein có hoạt tính
mong muốn












Sinh viên: Nguyễn Trọng Tuấn Dương
Mã SV: 0601080
Tổ 3 - Lớp A3K61
Các protein có hoạt tính sinh học đang ngày càng được sử
dụng rộng rãi để làm thuốc như các hormon, enzym...trước đây
nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là
chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên do nhu cầu ngày

càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá
thành lại đắt nên việc tổng hợp protein được đặt ra một cách cấp
thiết.
Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn
trong công nghệ sinh học phân tử việc tổng hợp protein không
còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học.
Mặc dù một số protein có thể tổng hợp bằng con đường hoá học
song phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính tối ưu và thực
tiễn cao. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng
rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc
như insulin, growht hormon...mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp
chất khác mà nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng
hợp hoá học gặp khó khăn.

Sau đây xin trình bày các bước cơ bản để tổng hợp một
protein theo phương pháp tổng hợp sinh học (synthetic biology)
trên tế bào vi khuẩn nhờ plasmid tái tổ hợp.

1. Thiết kế plasmid (vector) tái tổ hợp:

Nếu hai loại ADN được xử lý với cùng một enzyme giới hạn
(restrictase) thì mỗi ADN sẽ có đầu dính tương hợp nhau và 2
đoạn ADN ấy sẽ gắn lại được với nhau tạo thành ADN duy nhất.
Plasmid tái tổ hợp là plasmid có chứa 2 loại ADN có nguồn gốc
khác nhau.
Trong quy trình sản xuất protein, ta có thể gắn gen (bản sao
cADN) của sinh vật nhân thật bậc cao vào một plasmid: từ mô
sinh vật chủ chiết lấy pre-m-ARN từ gen mục tiêu rồi loại bỏ
các intron và ghép nối các exon ta được m-ARN trưởng thành.
Từ m-ARN trưởng thành nhờ enzyme phiên mã ngược tổng hợp

cADN bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription-
polymerase chain reaction), và cADN được ghép với plasmid
tạo thành plasmid lai.

2

2. Đưa plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn và tạo dòng
vi khuẩn:

Phương pháp dùng phổ biến để dưa plasmid tái tổ hợp vào tế
bào vi khuẩn là phương pháp biến nạp. Để tăng cường tần suất
biến nạp ta xử lý tế bào nhận với dung dịch CaCl
2
ở nhiệt độ
thấp (0-4
0
C với E.coli), bổ sung plasmid tái tổ hợp rồi đun nóng
tế bào nhận (tới 42
0
C) để gây shock nhiệt chung. Nhờ vậy tính
thấm của tế bào thay đổi, cho phép plasmid xâm nhập vào tế
bào. Cũng có thể dung shock điện để đưa plasmid tái tổ hợp vào
tế bào.
Người ta thường sử dụng gen kháng kháng sinh để làm dấu
hiệu chỉ thị tế bào đã dung nạp plasmid và để phân lập những tế
bào này trên môi trường thạch chứa kháng sinh chỉ thị.
Tế bào nhận plasmid tái tổ hợp được nuôi cấy để phát triển
thành 1 dòng. Với một số plasmid, việc cho vào môi trường
nồng độ thấp chloramphenicol ssẽ dẫn đến việc sao chép
plasmid mất điều khiển khiến cho hàng trăm bản sao plasmid có

thể được tổng hợp bởi một tế bào vi khuẩn (sự khuếch đại)

3. Nuôi cấy nhân bản dòng vi khuẩn đã được biến đổi để
tổng hợp protein:

Sau khi đã có được dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp
như mong muốn, ta đưa vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy thích
hợp. Quần thể vi khuẩn sẽ phát triển nhanh chóng và tổng hợp ra
chuỗi polypeptide mà gen mục tiêu đưa vào mã hoá. Bằng các
kỹ thuật khác nhau ta có thể tách và tinh chế các sản phẩm này.

4. Xử lý chuỗi polypeptide để được protein có hoạt tính
mong muốn:

Chuỗi polypeptide được tổng hợp xong thường ở dạng pro-
protein. Dạng này thường không có hoạt tính sinh học (protein
chưa trưởng thành). Các chuỗi protein này cần được xử lý bằng

3
các enzyme hoặc các tác nhân thích hợp để có được cấu trúc
không gian và hoạt tính mong muốn.

* Ngoài phương pháp dung plasmid tái tổ hợp ta còn có thể
dung phage để đưa gen mục tiêu vào genome của vi khuẩn
bằng tải nạp.

Hiện nay kỹ thuật trên đã được áp dụng để tổng hợp rất nhiều
thuốc có bản chất protein. Tổng hợp insulin người dung trong
điều trị tiểu đường là một điển hình:

Thiết kế plasmid: Gen mã hoá insulin chứa hai chuỗi ADN
(chuỗi dài chứa 18 phân đoạn nucleotide, chuỗi ngắn chứa 11
phân đoạn) hai chuỗi nucleotide này được tổng hợp thành 2
đoạn gen riêng biệt và được ghép riêng rẽ vào plasmid pBR322
gần phần cuối của gen β-galactosidase. Plasmid được biến nạp
vào E.coli và được nhân bản lên trong E.coli.




4
Sau khi được phiên mã sang mARN hai mạch của insulin
được tạo thành và được bài tiết ra cùng với β-galactosidase.
Sau khi tách từng polypeptide khỏi enzyme bằng BrCN, hai
mạch được gắn lại với nhau tạo insulin hoạt động (kỹ thuật 2
block)

Kỹ thuật sản xuất insulin một bước cũng bằng kỹ thuật tái tổ
hợp ADN , gen được gắn vào ở đây là gen mã hoá proinsulin.
Sau khi chiết, proinsulin được thuỷ phân bằng protease cắt
mạch peptid cho insulin hoạt động




THE END ^-^

5