SẮC kí LỎNG HIỆU NĂNG CAO

SKL cao áp hay SKL hiệu năng cao
HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) có ưu điểm là:
 Thời gian sắc ký
 Kích thước hạt
 Độ phân giải


SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

(High Performance Liquid Chromatography)

ĐẠI HỌC Y DƯC TP. HCM- KHOA DƯC
BỘ MÔN PHÂN TÍCH-KIỂM NGHIỆM-10/2016
Ts. Phan Thanh Dũng


SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

(High Performance Liquid Chromatography)
MỤC TIÊU

 Định nghóa HPLC.
 Phân loại.
 Trang thiết bị cơ bản của HPLC.
 Các thông số đặc trưng của HPLC.
 Ứng dụng của HPLC.


1.ĐỊNH NGHĨA
- HPLC là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột được nhồi đầy

bằng các hạt có kích thước  10 m. Dùng một bơm có áp suất
cao (high pressure)  300 atm để đẩy pha động (mobile phase)
qua cột (pha tỉnh) với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho
phép phân giải nhanh (High Performance) một lượng mẫu nhỏ cở
20 g.
- HPLC ra đời từ 1960 đến nay đã được sử dụng rộng rãi trong
các phòng thí nghiệm áp dụng nhiều lónh vực do:
+ Có độ nhạy cao.
+ Độ đúng và độ chính xác cao đáp ứng các yêu cầu về định
lượng.
+ Thích hợp với các hợp chất không bay hơi và chịu nhiệt.


A
B
C
D

(A) Hỗn hợp chất cần phân tích khi bơm vào cột.
 Tập trung ưu tiên ở pha động (B).
 Tập trung ưu tiên ở pha tĩnh (B).
(C) Cân bằng mới được thiết lập.
(D) Quá trình lặp lại liên tục, sau 1 thời gian 2 chất tách rời nhau.


Bơm mẫu

Chiều di chuyển của pha động

Detector

T=0

T=10’

T=20’

Mạnh

Tương tác với pha tĩnh

Rf

Yếu

tr


Điều kiện sắc ký: mẫu: 40 ng mỗi thành phần; cột: 3 cm 4,6 nm, ID; pha tĩnh:
ChromSphere UOP C18, 1,5 m; pha động: hỗn hợp nước: acetonitril (85:15);
tốc độ dịng: 3,5 ml/phút; nhiệt độ phân tích: 350C; phát hiện: detector UV 254
nm; các peak được tách hoàn toàn: 1= bromazepam, 2= nitrazepam; 3=
clorazepam; 4= oxazepam; 5= flunitrazepam; 6= hydroxydiazepam(
ternazepam); 7= desmethyldiazepam( nordazepam); 8= diazepam(valium)


PHÂN LOẠI
Dựa vào cơ chế tách chiết phương pháp SKLHNC được chia làm 4 loại:
- Sắc ký phân bố (partition chromatography).
- Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

- Sắc ký ion (ion chromatography).
- Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được
những hợp chất từ khơng phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp
chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (< 3000).


PHÂN LOẠI
SKPB: chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và
pha động:
- Sắc ký pha thường (Normal phase chromatography): Pha tỉnh phân cực do
chất mang được phủ hoặc liên kết với những chất phân cực (nước, oxydipropionitril, PEG, trimethylenglycol….). Pha động là dung môi hữu cơ
ít phân cực. Trong NP, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động.
NP dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử
lượng không lớn lắm.
- Sắc ký pha đảo (Reversed phase chromatography): Pha tỉnh là những chất
lỏng ít phân cực (hydrocarbon….). Pha động là dung môi phân cực (nước,
methanol, acetonitril…). Trong RP pha tĩnh ít phân cực hơn pha động, dùng
phân tích các hợp chất từ khơng phân cực đến phân cực. Hầu hết các hợp
chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích
bằng RP. Dung mơi sử dụng trong RP là các dung mơi phân cực, trong đó
dung mơi nước đóng vai trị quan trọng mà lại rẻ tiền. Do đó, RP được ứng
dụng nhiều và phổ biến hơn NP.


2. TRANG THIẾT BỊ

1. Bình đựng pha động

2. Bộ phận khử khí
3. Hệ thống bơm cao áp
4. Bộ phận nạp mẫu

5. Lọc tiền cột
6. Cột sắc ký
7. Bộ phận phát hiện
8. Bộ phận xử lý và ghi tín hiệu


HỆ THỐNG HPLC HP1100
Solvent cabinet
Degasser
Pump module

Injector/Autosampler

Column compartment

Detector(s)

Computer


HỆ THỐNG HPLC Agilent 1260


HỆ THỐNG HPLC Water

2.1. Bình chứa dung môi
- Thủy tinh trung tính, rửa sạch thể tích 100 ml  2 lít.
- Thủy tinh màu nếu chứa những chất nhạy cảm với ánh sáng.
- Nắp đậy thích hợp để tránh bay hơi dung môi.
Xử lý dung môi
Lọc qua màng lọc thích hợp tùy theo loại dung môi:
- Dung môi là nước: cellulose nitrat hay cellulose acetat kích
thước 0,22 và 0,45 m.
- Hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước: màng lọc RC (regenerated
cellulose, cellulose tái sinh), polyamid hay nylon.
-Dung môi hữu cơ: lọc qua màng lọc teflon.


Pha động trong SKLHNC:

Pha động trong SKLHNC phải đạt những u cầu sau:
- Hịa tan được mẫu cần phân tích.
- Phù hợp với đầu dị.
- Khơng hịa tan, làm mịn hay hủy hoại pha tĩnh.
- Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.
- Đạt độ tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade).


- Bộ phận lọc dung môi: giá đỡ của bộ phận lọc dung môi thường
bằng thủy tinh thường có kích thước 5  10 m, cần phải thường
xuyên làm vệ sinh (DD acid nitric 5% + siêu âm khoảng 15’, rửa lại
bằng nước cất đã được lọc qua màng lọc 0,45 m.

2.2. Bộ phận loại khí dung môi (Degasser in line)

- Loại khí ngay trong bình chứa dung môi hoặc trên dòng chảy của pha
động trước khi dung môi vào bơm.

Khử khí ngay trên dòng (On-line membrane degassing)
Pha động chảy qua một sợi rỗng làm bằng màng bán thấm. Áp suất chân
không từng phần được duy trì bên ngoài màng. Do không khí có thể
khuyếch tán qua màng trong khi hơi dung môi không qua được nên khí
hoà tan thoát ra khỏi dung môi trước khi đến bơm.

Buồng chân không

Bình chứa
pha động

Bình chứa
pha động

Dung môi sau khi được khử khí

Màng khử khí này hay được đặt thẳng đứng ngay trên đường dung môi vào
bơm để không khí không thể hoà tan trở lại vào dung môi.


2.2. Bộ phận loại khí dung môi (Degasser in line)
Ngoài ra còn có các kiểu hay sử dụng để đuổi khí:

1. Lọc dưới áp suất giảm (chân không = vacuum): rất
thích hợp cho việc đuổi khí vì có thể kết hợp việc

lọc pha động bằng chân không để loại đi cả khí hoà
tan lẫn các tạp nhiễm.
2. Siêu âm (sonication): đặt bình đã chứa dung môi
vào bồn siêu âm. Đây là thao tác đuổi khí cho phép
khí thừa thoát ra khỏi dung môi trước khi vào bơm.
Siêu âm hay được thực hiện kết hợp với đuổi khí
bằng áp suất giảm (chân không).

3. Sục khí helium (helium sparge): một dòng khí
helium sục vào pha động có thể đuổi đi khí hoà tan
(helium không tan trong hầu hết các dung môi, do
vậy rất ít helium thay chổ của không khí).


2.3. Hệ thống bơm HPLC:
Hầu hết hệ thống bơm SKLHNC có bán tên thị trường là dựa trên mô hình
piston thuận nghịch.
Dung môi ra

Piston

Van đi ra

Chậm

Nhanh

Viên bi

Van đi vào

Dung môi vào

- Đầu bơm có 2 van điều tiết, mỗi van có một lỗ nhỏ với 1 bi, các van này

đảm bảo cho việc hút pha động vào thân bơm hoặc đẩy pha động từ thân
bơm vào cột sắc ký được hoàn toàn.
- Thân bơm có một pisston để chuyển động đi lại. Khi pisston tiến tới 1 bi
đóng lỗ phía cột lại và bi khác nhấc ra để pha động vào thân bơm. Khi
pisston lùi lại 1 bi đóng lỗ phía bình đựng dung môi và mỡ lỗ phía cột để
pha động vào cột sắc ký.


Bơm HPLC dùng để hút pha động từ bình chứa và đẩy chúng qua cột sắc
ký, gồm các loại khác nhau:
2.3.1.Bơm có lưu lượng hằng định:
- Lưu lượng thường không đổi & áp suất cũng không đổi. Bất lợi là thân
bơm có thể tích nhỏ. Do đó phải làm đầy pha động thường xuyên.
Bơm một pisston:
- Điều khiển bằng hệ thống tâm sai, lưu lượng không đổi nhưng áp suất
thay đổi.
Bơm 2 pisston:
- Khi pisston đẩy pha động vào cột thì pisston khác sẽ hút pha động vào
thân bơm. Do đó cột sẽ luôn luôn có áp suất không đổi, lúc đó lưu lượng
không đổi, áp suất hằng định và thể tích không bị giới hạn. Lưu lượng có
thể điều chỉnh bằng motơ.


2.3.2. Bơm đẳng dòng (isocratic pump):
Chỉ lấy được một loại dung môi không tự động pha trộn được dung môi

Van ra

Điều chỉnh sự
thay đổi áp suất

Van lọc

I

Van vào
Hai piston

Những điều cần chú ý khi dùng bơm đẳng dòng:
Không tăng tốc độ dòng đột ngột.
Theo dõi áp suất bơm trong quá trình phân tích.
Định kỳ rửa lọc dung môi đầu vào.
Nạp đầy hệ thống HPLC bằng methanol, acetonitril hay hỗn hợp
của chúng với nước khi không tiến hành phân tích để tránh sự phát
triển của nấm môùc.


2.3.3. Bơm nhị phân (binary pump):
Có thể lấy đồng thời 2 loại dung môi đầu.
Có thể chạy được chương trình hóa dung môi (gradient).
Tiết kiệm dung môi.

Cột phân tích

Bộ phận trôn

Van ra

Van vào

Van ra

Van vào


2.3.4. Hệ thống bơm tứ phân (quaternary pump)

Có thể lấy đồng thời 4 loại dung môi động.
Có thể chạy được chương trình dung môi (gradient) một cách uyển
chuyển và đa dạng.
Tiết kiệm dung môi.

Hệ thống khử khí trên
dòng chảy dung môi
Bình chứa dung
môi đi vào

Hệ thống trộn dung môi

Bộ phận tiêm mẫu
vào cột

Lưu ý khi sử dụng bơm nhị phân và bơm tứ phân
Tương tự như bơm đẳng dòng.
Phối hợp dung môi hợp lý tránh kết tủa chất điện giải trên đường ống.
Dùng dung môi trung gian một cách hợp lý khi phối hợp dung môi.

Cân bằng cột bằng hỗn hợp dung môi – nước với tỷ lệ tương tự như hỗn
hợp dung môi đệm.
Rửa kỹ đường ống chứa đệm bằng nước sau khi kết thúc quá trình phân
tích, sau đó rửa lại bằng hỗn hợp dung môi methanol hay acetonitril với
nước.


2.4. Bộ phận tiêm mẫu

Một nguyên tắc chung cần phải tôn trọng khi đưa mẫu thử vào cột tách là
không được làm xáo trộn chất nhồi trong cột
Phương pháp dùng syringe trực tiếp.
Phương pháp dùng van bơm với thể tích xác định (loop).
Bộ phận bơm mẫu tự động auto-sampler.
2.4.1. Phương pháp sử dụng syringe trực tiếp
Là phương pháp đưa mẫu phân tích vào cột bằng bơm tiêm (syringe)
Phải dùng đến vách ngăn (septrum): teflon, silicone
Yêu cầu bắt buộc
Không được tương kỵ với pha động của hệ thống sắc ký.
Không được chứa các chất dẻo hoá, chất chống oxy hóa.
Ưu điểm
Tiện lợi, đơn giản.
Có hiệu lực cao vì mẫu được đưa trực tiếp vào cột, hạn chế được thể tích
ngoài cột.
 Nhược điểm
Độ lặp lại không cao, vì thể tích mỗi lần bơm khác nhau, khó điều chỉnh
cho thật chính xác thể tích mẫu thử trong các lần đưa vào cột.
Đưa thẳng mẫu thử vào cột thì những hoạt chất có thể làm tắc kim, hoặc
chất liệu của vách ngăn có thể làm bẩn cột.
Mỗi lần đưa mẫu vào cột, phải cho ngưng dòng chảy, đợi đến khi áp suất

bằng áp suất không khí rồi mới tiêm mẫu do đó dòng chảy bị gián đoạn.