Nghiên cứu tinh chế và xác định hoạt tính kháng khuẩn của peptide mastoparan từ nọc ong vespa velutina thu ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Phạm Thị Huế

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG
KHUẨN CỦA PEPTIDE MASTOPARAN TỪ NỌC ONG Vespa
velutina THU Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội- 2021


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Phạm Thị Huế

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG
KHUẨN CỦA PEPTIDE MASTOPARAN TỪ NỌC ONG Vespa
velutina THU Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn

TS. Lê Thị Bích Thảo
Hà Nội-2021


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là cơng trình nghiên
cứu của tơi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tơi tự tìm hiểu và nghiên
cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan
nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu
nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu
trách nhiệm.

Tác giả luận văn

Phạm Thị Huế


Lời cảm ơn

Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Lê
Thị Bích Thảo, người cơ đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tơi trong
suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn thiện luận văn.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tới GS.TS. Phan Văn Chi, TS. Bùi
Thị Huyền, TS. Phạm Đình Minh cùng tồn thể các anh chị làm việc tại phịng
Hóa sinh Protein, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Gen, Viện Cơng
nghệ Sinh học;
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Thị Phương Liên, Viện Sinh
thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam;
TS. Phạm Thị Hằng, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng- Côn trùng Trung ương;
Trung tâm Bệnh nhiệt đới, Bệnh viện Bạch Mai; và ban Lãnh đạo, phòng Đào
tạo, các phòng chức năng của Học viện Khoa học và Công nghệ đã hết lịng
giúp đỡ tơi thực hiện thành cơng luận văn này.
Cuối cùng, tơi vơ cùng biết ơn gia đình, bạn bè, những người thân đã
ln khích lệ, động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quãng
thời gian qua.
Xin chân thành cảm ơn!


Danh mục các ký hiệu và các chữ viết tắt
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitrile

AMP

Ampicillin

Ampicillin

CFU

Colony-forming unit

Đơn vị hình thành khuẩn lạc

CHCA

α-Cyano-4-

α-Cyano-4-hydroxycinnamic

hydroxycinnamic acid

acid

CIP

Ciprofloxacin

Ciprofloxacin

Da

Dalton

Dalton

F7

Fraction 7

Phân đoạn 7

F9

Fraction 9

Phân đoạn 9

FA

Formic acid

Acid formic

IMP

Imipenem

Imipenem

KAN

Kanamycin

Kanamycin

LEV

Levofloxacin

Levofloxacin

LPS

Lipopolysaccharid

Lipopolysaccharid

MALDI

Matrix-assisted laser

Kỹ thuật ion hóa theo cơ chế

desorption/ionization

giải hấp phụ sử dụng nguồn


laser với sự trợ giúp của chất

nền
Multidrug-resistant

Acinetobacter baumannii kháng

Acinetobacter baumannii

đa thuốc

mAu

Milli Absorbance unit

Mili đơn vị hấp thụ

MCD

Mast cell degranulating

Phân hủy tế bào Mast

MP

Mastoparan

Mastoparan tổng hợp

MRSE

Methicillin-resistant

Methicillin-resistant

Staphylococcus

Staphylococcus epidermidis

MDRAB

epidermidis
MS

Mass Spectrometry

Khối phổ

OXA

Oxacilin

Oxacilin

PLA2

Phospholipase A-2

Phospholipase A-2

RP-HPLC

Reverse Phase High-

Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha

Performance Liquid

đảo

Chromatography
SAM

Ampicillin/sulbactam

Ampicillin/sulbactam

SXT

Trimethoprim/Sulfameth

Trimethoprim/Sulfamethoxazol

oxazole

e

Trifluoroacetic acid

Acid trifluoroacetic

TFA

TFE

Tetrafluoroethylene

Tetrafluoroethylene

TOF

Time of Flight

Thời gian bay


Danh mục bảng
Bảng 1.1 Một số protein và peptide chính được tìm thấy trong nọc ong . ..... 13
Bảng 1.2 Trình tự amino acid của một số peptide mastoparan từ nọc của một
số lồi ong ....................................................................................................... 18
Bảng 2.1 Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu ....................... 29
Bảng 2.2 Các thiết bị được sử dụng chính trong nghiên cứu ......................... 30
Bảng 3.1 Kết quả nhận diện phân đoạn 7 bằng phần mềm PEAK. ............... 40
Bảng 3.2 Kết quả nhận diện phân đoạn 9 bằng phần mềm PEAK. ................ 41
Bảng 3.3 Hiệu quả ức chế sinh trưởng của F9 trên các chủng vi khuẩn ........ 46
Bảng 3.4 Hiệu quả ức chế sinh trưởng của các phân đoạn F7 trên các chủng vi
khuẩn. .............................................................................................................. 49
Bảng 3.5 Kết quả thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của MP trên
các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh ............................................................ 52
Bảng 3.6 Mức độ nhạy cảm của các vi khuẩn đối với các MP và các loại thuốc
kháng sinh ....................................................................................................... 56

Danh mục hình
Hình 1.1 Ong Vespa velutina (Lepeletier) ....................................................... 5
Hình 1.2 Ong Vespa velutina nigrithorax cái mặt lưng (phía trên) và bụng (phía
dưới) .................................................................................................................. 7
Hình 1.3 Ong Vespa velutina nigrithorax cái (bên trái) và đực (bên phải) ..... 8
Hình 1.4 Nọc ong săn mồi như một nguồn của các hợp chất có hoạt tính sinh
học và các ứng dụng của chúng. ....................................................................... 9
Hình 1.5 Một số hợp chất trong thành phần trong nọc ong ........................... 10
Hình 1.6 Cấu trúc 3D của Mastoparan X được xác định bằng NMR. ........... 16
Hình 1.7 Sự so sánh trình tự của các gốc amino acid của các polypeptide tiền
thân của mastoparan. ....................................................................................... 17
Hình 1.8 Các mơ hình để giải thích các cơ chế của sự thấm qua màng ......... 24
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình các bước tiến hành ................................................. 31
Hình 3.1 Ong Vespa velutina cái .................................................................... 35
Hình 3.2 Cơ quan nọc độc của ong Vespa velutina sau khi được giải phẫu. 36
Hình 3.3 Sắc ký đồ của các phân đoạn của dịch chiết nọc ong Vespa velutina
......................................................................................................................... 37
Hình 3.4 Phổ MALDI-TOF của phân đoạn 7 (A) và phân đoạn 9 (B) ......... 39
Hình 3.5 Giải trình tự peptide các phân đoạn F7 (A) và F9 (B) có chứa
mastoparan sử dụng De novo .......................................................................... 42
Hình 3.6 Sự so sánh trình tự của F7 và F9 với mastoparan từ các loài ong trong
chi Vespa ......................................................................................................... 43
Hình 3.7 Phổ MALDI -TOF của MP trong hỗn hợp peptide sau khi tổng hợp
......................................................................................................................... 44
Hình 3.8 Hiệu quả ức chế sự sinh trưởng của mastoparan phân đoạn số 9 trên
các chủng vi khuẩn .......................................................................................... 45

Hình 3.9 Hiệu quả ức chế sự sinh trưởng của mastoparan phân đoạn số 7 trên
các chủng vi khuẩn .......................................................................................... 48
Hình 3.10 Kết quả Thử hoạt tính kháng khuẩn của MP trên các chủng vi khuẩn
kháng kháng sinh theo các nồng độ ................................................................ 53
Hình 3.11 Kết quả xác định mức độ nhạy cảm của MP và các kháng sinh đối
với các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh ...................................................... 55


1

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ------------------------------------------------------------------------------- 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ----------------------------------------- 5
1.1 GIỚI THIỆU VỀ ONG Vespa velutina -------------------------------------- 5
1.1.1 Phân loại khoa học-------------------------------------------------------- 6
1.1.2 Phân bố của ong Vespa velutina ---------------------------------------- 6
1.1.3 Hình thái của ong Vespa velutina -------------------------------------- 6
1.2 GIỚI THIỆU VỀ NỌC ONG ------------------------------------------------- 8
1.2.1 Các thành phần của nọc ong-------------------------------------------- 9
1.2.1.1 Các enzyme ----------------------------------------------------------- 11
1.2.1.2 Các peptide ----------------------------------------------------------- 11
1.2.1.3 Các phân tử nhỏ khác ----------------------------------------------- 12
1.2.2 Ứng dụng của nọc ong ------------------------------------------------- 14
1.3 MASTOPARAN -------------------------------------------------------------- 15
1.3.1 Cấu tạo -------------------------------------------------------------------- 15
1.3.2. Hoạt tính của mastoparan -------------------------------------------- 20
1.3.2.1 Hoạt tính chung của mastoparan ---------------------------------- 20
1.3.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan -------------------------- 21
1.3.2.3 Cơ chế hoạt động của các mastoparan chung trên màng của vi
sinh vật ------------------------------------------------------------------------- 23

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM --------------------------- 25
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -- 28
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU ------------------------------------------------------- 28
2.1.1 Vật liệu sinh học--------------------------------------------------------- 28
2.1.2 Các hóa chất ------------------------------------------------------------- 29
2.1.3 Trang thiết bị ------------------------------------------------------------ 30
2.2 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU CHUNG ------------------------------------------- 31


2

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ------------------------------------------ 31
2.3.1. Thu thập và tách chiết nọc ong -------------------------------------- 31
2.3.2. Phân đoạn nọc ong và tinh sạch mastoparan --------------------- 32
2.3.3. Phân tích MALDI-TOF ----------------------------------------------- 32
2.3.4 Tổng hợp hóa học mastoparan bằng phương pháp tổng hợp
peptide pha rắn ---------------------------------------------------------------- 33
2.3.5 Phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên đĩa thạch ---------- 34
2.3.6 Xử lý số liệu -------------------------------------------------------------- 34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ---------------------------------- 35
3.1 THU THẬP VÀ TÁCH CHIẾT NỌC ONG Vespa velutina ----------- 35
3.1.1 Thu thập ong Vespa velutina ------------------------------------------ 35
3.1.2 Tách chiết nọc ong Vespa velutina ----------------------------------- 36
3.2 PHÂN ĐOẠN NỌC ONG VÀ TINH SẠCH MASTOPARAN-------- 36
3.3 NHẬN DIỆN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA
MASTOPARAN ------------------------------------------------------------------ 38
3.4 TỔNG HỢP NHÂN TẠO MASTOPARAN ------------------------------ 44
3.5 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MASTOPARAN
--------------------------------------------------------------------------------------- 45
3.5.1 Hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan tự nhiên --------------- 45

3.5.2 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của mastoparan được tổng
hợp nhân tạo (MP).------------------------------------------------------------ 51
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ---------------------------------- 58
4.1 KẾT LUẬN -------------------------------------------------------------------- 58
4.2 KIẾN NGHỊ ------------------------------------------------------------------- 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO -------------------------------------------------------- 59


3

MỞ ĐẦU
Thuốc kháng sinh là một trong những phát minh quan trọng nhất trong
nghiên cứu y sinh. Với sự phát hiện ra penicillin của Alexander Fleming vào
năm 1928, “kỷ nguyên kháng sinh” và nghiên cứu về thuốc kháng sinh đã được
bắt đầu. Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc chống nhiễm trùng
trong bệnh viện và công nghiệp đã làm phát sinh và gia tăng số lượng các chủng
vi khuẩn đa kháng thuốc. Các thuốc kháng sinh đang mất dần hiệu lực, vì vậy
hướng nghiên cứu tìm kiếm các chất có tính kháng khuẩn, đặc biệt là kháng lại
một số dòng vi khuẩn kháng kháng sinh là một nhu cầu cấp thiết của xã hội.
Các peptide kháng khuẩn đã được nghiên cứu và cho thấy tiềm năng trong việc
điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, nấm. Hiện nay, các peptide trong
nọc độc của các loài động vật/côn trùng đang được quan tâm nghiên cứu ngày
càng nhiều cho những ứng dụng phát triển chất kháng sinh mới. Trong số đó,
mastoparan là ứng cử viên được quan tâm nhiều nhất.
Vespa velutina là một trong những lồi ong vị vẽ nguy hiểm có xuất xứ
từ các nước Đơng Nam Á. Đây là lồi cơn trùng có nọc độc cực mạnh, có thể
tái tạo nọc độc nhiều lần. Nọc ong là một hỗn hợp phức tạp trong thành phần
có chứa các enzyme có bản chất là protein (hyaluronidase, phospholipase A và
B, phosphatase acid, các protease, esterase và glucidase); các peptide nhỏ
(apamin là chất độc thần kinh, melittin là chất độc gây tan máu, MCD peptide

- Mast cell degranulating peptide, kinin, bradykinin, kháng nguyên 5,
mastoparan); và cuối cùng là các phân tử nhỏ khác như các amin gây viêm
(histamin, noradrenalin, dopamin, serotonin, acetylcholine). Chúng đã được
phát hiện có tiềm năng trong việc điều trị nhiều loại bệnh như một số bệnh rối
loạn thần kinh, bảo vệ phóng xạ, chống đột biến, chống viêm, chống kích hoạt
đau, và cịn có khả năng sử dụng cho mục đích khác như kháng ung thư, kháng
khuẩn,..vv.
Từ những cơ sở dữ liệu đầu tiên về thành phần các protein/peptide có
trong nọc ong Vespa velutina thu thập ở Việt Nam, mastoparan đã được nhận
diện trong tổng số hơn 80 protein và peptide từ cơ sở dữ liệu này. Trên cơ sở
đó, chúng tơi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tinh chế và xác định hoạt tính


4

kháng khuẩn của peptide mastoparan từ nọc ong Vespa velutina thu ở Việt
Nam” với mong muốn phát hiện một loại mastoparan mới từ lồi ong này và
đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của peptide này trên một số chủng vi khuẩn
nhằm tìm kiếm khả năng ứng dụng của trong y dược của chúng, phục vụ đời
sống con người như một chất kháng sinh mới.


5

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 GIỚI THIỆU VỀ ONG Vespa velutina
Ong bắt mồi chân vàng, Vespa velutina (Hình 1.1) là một lồi ong có
nguồn gốc từ các nước khu vực Châu Á [1] và đã xâm nhập vào một số khu
vực của Châu Âu, lần đầu tiên xuất hiện ở Pháp vào năm 2004 [1]. Như một kẻ
săn mồi nói chung, chúng là một lồi gây hại cho ong mật và là mối quan tâm

chính của nhiều người ni ong.

Hình 1.1 Ong Vespa velutina (Lepeletier) [1]


6

1.1.1 Phân loại khoa học
Giới (regnum)

: Animalia

Ngành (phylum)

: Arthropoda

Lớp (class)

: Insecta

Bộ (ordo)

: Hymenoptera

Họ (familia)

: Vespidae

Phân họ (subfamilia)

: Vespinae

Chi (genus)

: Vespa

Loài (species)

: V. velutina

1.1.2 Phân bố của ong Vespa velutina
Vespa velutina có nguồn gốc từ Châu Á, là lồi bản địa ở Đông Nam Á,
xuất hiện ở Hàn Quốc [1], Trung Quốc [2] và Nhật Bản [3] và mốt số quốc gia
Châu Á khác. Nó được du nhập vào Pháp vào năm 2004, rất có thể thơng qua
việc nhập khẩu các chậu cây cảnh [2]. Lồi này có khả năng xâm lấn rất cao và
dễ dàng lây lan sang các khu vực châu Âu khác như Ý [4], Anh [5], Quần đảo
Balearic [6] và miền bắc nước Đức [7]
Phân bố của loài ong Vespa velutina ở Việt Nam
Loài ong Vespa velutina có thể được tìm thấy ở các tỉnh của Việt Nam như: Hà
Giang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Nghệ An, Hà
Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Lâm Đồng, v.v. [8]
1.1.3 Hình thái của ong Vespa velutina
V. velutina rất đa dạng về màu sắc và 10 phân loài đã được xác định [8],
[9], [10].
C. Villemant (Bảo tàng Lịch sử Tự nhiên Quốc gia, Paris, thông tin cá nhân của
Pháp, 2013) mô tả Vespa velutina nigrithorax (Hình 1.2 và Hình 1.3) như sau:


7

Ong cái: Đầu và ngực nhọn, có lơng tơ mịn mọc rải rác, bụng có rãnh.
Cơ thể màu nâu sẫm, mặt và miệng có màu cam (trừ răng sẫm màu); râu màu
nâu ở mặt lưng, màu cam ở bụng. Mặt lưng của các đoạn bụng màu nâu với các
rìa đỉnh rõ ràng hơn: một dải mỏng màu vàng ở đoạn thứ nhất và dải mỏng màu
cam ở đoạn thứ hai và thứ ba; đoạn bụng thứ tư gần như hoàn tồn màu cam
với một vạch đen hình tam giác ở giữa, thường khơng nhìn thấy khi ong bắp
cày cịn sống; đoạn bụng thứ năm và thứ sáu có màu nâu cam nhiều hơn hoặc
ít hơn. Phần bụng màu nâu, đỉnh hình tam giác thường nhạt hơn; phân đoạn thứ
hai và thứ ba màu vàng toàn thân với một vạch đen ở giữa. Chân màu nâu trừ
tarsi vàng; cánh màu nâu xám. Khơng có sự khác biệt rõ rệt về hình thái giữa
con cái (ong thợ) hữu tính và bất dục. Một số ong thợ nhỏ hơn (đặc biệt là vào
mùa xuân) nhưng vào mùa thu, nhiều ong thợ lớn như những ong chúa tương
lai. Bên trong đàn, có thể nhận ra ong chúa đẻ trứng bằng phần bụng căng phồng
và vào cuối mùa, đôi cánh bị hư hại.

Hình 1.2 Ong Vespa velutina nigrithorax cái mặt lưng (phía trên) và bụng
(phía dưới) [11]


8

Con đực: rất giống con cái về kích thước và màu sắc, râu dài hơn. Mặt
bụng của bụng màu nâu, đỉnh cụt có một đơi đốm vàng.
Ong đực và ong cái có thể phân biệt với nhau bằng các râu của chúng,
với các râu ong cái có vẻ mỏng hơn và chiều dài ngắn hơn so với râu của ong
đực. Như với tất cả các Bộ cánh màng, con cái có ngịi độc cịn con đực thì
khơng.

Hình 1.3 Ong Vespa velutina nigrithorax cái (bên trái) và đực (bên phải) [12]
1.2 GIỚI THIỆU VỀ NỌC ONG

Các sinh vật sử dụng nọc độc như một thứ vũ khí hố học hiệu quả để tự
vệ và săn bắt con mồi, vì vậy nọc của chúng được tiến hố theo hướng đặc
trưng cho lồi và độc tính cao. Bên cạnh đó, nọc độc cũng là nguồn dự trữ các
hợp chất có hoạt tính sinh học quý, mang lại nhiều hứa hẹn trong việc tìm tịi
và phát triển các loại thuốc chữa bệnh (Hình 1.4).


9

Hình 1.4 Nọc ong săn mồi như một nguồn của các hợp chất có hoạt tính sinh
học và các ứng dụng của chúng [13].
1.2.1 Các thành phần của nọc ong
Nọc ong là một hỗn hợp phức tạp chứa 3 nhóm chất chính: gồm các
enzyme có bản chất là protein (hyaluronidase, phospholipase A và B,
phosphatase acid, các protease, esterase và glucidase); các peptide nhỏ (apamin
là chất độc thần kinh, melittin là chất độc gây tan máu, MCD peptide - Mast
cell degranulating peptide, kinin, bradykinin, kháng nguyên 5, mastoparan); và
cuối cùng gồm các phân tử nhỏ khác như các amin gây viêm (histamin,
noradrenalin, dopamin, serotonin, acetylcholine) (Bảng 1.1) [14].


10

Hyaluronidase

Melittin

Phospholipase A2

Mastoparan

Hình 1.5 Một số hợp chất trong thành phần trong nọc ong


11

1.2.1.1 Các enzyme
Hyaluronidase và Phospholipase là hai enzyme chính có trong nọc độc
của các lồi ong. Hai enzyme này có thể kích hoạt phản ứng miễn dịch, bằng
cách cảm ứng IgE gây ra các phản ứng quá mẫn dẫn đến phá huỷ lớp lipid kép
trong màng tế bào, gây độc tế bào hoặc kích thích miễn dịch đối với các loại tế
bào khác [15], [16].
Hyaluronidase thuỷ phân và cắt đặc hiệu acid hyaluronic, có thể được sử
dụng như các tác nhân gây mê, giảm đau, chống ung thư và cũng hỗ trợ sự phân
tán thuốc trong mô [17].
Phospholipase A-2 (PLA2) là thành phần chủ yếu thứ 2 của nọc ong,
chiếm 10-12% trọng lượng khô của nọc. PLA2 là một enzyme phụ thuộc vào
canxi mà thủy phân sn-2 este của glycerophospholipids để tạo ra một acid béo
và một lysophospholipid. Nó có thể phá hủy phospholipids, phá vỡ tính tồn
vẹn của lớp lipid kép, do đó làm cho các tế bào dễ bị suy thoái hơn. Trên thực
tế, các sản phẩm phản ứng PLA2, chẳng hạn như lysophosphatidylcholine, acid
lysophosphatidic và sphingosine 1- phosphate, có thể có tác dụng gây độc tế
bào hoặc kích thích miễn dịch trên các loại tế bào khác nhau, gây viêm và phản
ứng miễn dịch [16]
1.2.1.2 Các peptide
MCD peptide (Mast cell degranulating peptide) là một peptide tích điện
dương gồm 22 amino acid chứa 2 cầu disulfide giữa Cys3 và Cys15, Cys5 và
Cys19, có cấu trúc giống như apamin, [18]. Peptide này có tiềm năng kháng
viêm, tuy nhiên khi ở nồng độ thấp MCD peptide lại là chất trung gian mạnh
của quá trình phân rã tế bào mast và giải phóng chủ động histamine từ các tế

bào mast, mà được hiện diện trong việc truyền máu và trong tất cả các cô được
truyền dịch bằng máu [19].
Bradykinin là peptide thuộc nhóm protein kinin, tác động vào hai thụ thể
được ký hiệu là B1 và B2 gây đau và làm giảm huyết áp [19]. Đối với thụ thể
B1 chỉ được biểu hiện do tổn thương mơ và nó được cho là có vai trị gây đau
mãn tính. Ngược lại, thụ thể B2 được biểu hiện chủ yếu, tham gia vào quá trình


12

giãn mạch thơng qua việc giải phóng prostacyclin, oxit nitric, và yếu tố tăng
phân cực có nguồn gốc nội mơ, do đó góp phần làm giảm huyết áp [19], [20].
Adolapin là peptide đầu tiên được tinh sạch từ nọc ong trong thập kỷ 80,
ức chế hoạt động của protstaglandin gây ra hiệu quả giảm đau và kháng viêm
mạnh khi thử nghiệm trên chuột [21], [22].
Melittin là peptide độc hoà tan trong nước chiếm 50% trọng lượng khô
của nọc. Đây là peptide xoắn lưỡng phần ( một phân tử có cả tính chất ưa nước
và kỵ nước ) bao gồm 26 gốc amino acid và trong đó cùng đầu N chủ yếu kỵ
nước và vùng đầu C là ưa nước. Melittin là thành phần hoạt động chính của nọc
ong (apitoxin) và chịu trách nhiệm phá vỡ và giết các tế vào. Khi một số peptide
melittin tích tụ trong màng tế bào, q trình đóng gói phospholipid bị phá vỡ
nghiêm trọng, do đó dẫn đến ly giải tế bào [23]. Melittin và phospholipase A-2
ức chế sự tăng sinh tế bào khối u và do đó có giá trị tiềm năng cho chữa trị ung
thư và giảm khả năng nhiễm HIV-1 [24].
Apamin là độc tố thần kinh trong nọc ong gồm có 18 gốc amino acid với
hai cầu nối disulfide mà liên kết vị trí 1 với 11 và vị trí 3 với 15 [25]. Apamin
được biết từ rất lâu như là chất ức chế chọn lọc cao của các kênh K+ đã kích
hoạt Ca2+ (kênh SK) được biểu hiện trong hệ thống thần kinh trung ương. Loại
kênh này đóng một vai trị quan trọng trong các hoạt động lặp đi lặp lại trong
các tế bào thần kinh, ngăn chặn nhiều hiệu ứng ức chế siêu phân cực [26].

Mastoparan là một peptide lưỡng phần hoạt động trên màng với 14
amino acid, cảm ứng sự vận chuyển tính thấm của màng nên ảnh hưởng đến
khả năng sống sót của tế bào [27].
1.2.1.3 Các phân tử nhỏ khác
Ngoài 2 thành phần cơ bản ở trên, trong nọc ong còn chứa một số phân
tử nhỏ khác như các chất khoáng, các amino acid và các chất có hoạt tính giống
như amin.
Trong nhóm này kể đến histamine là một chất chính điển hình, tham gia
vào q trình gây viêm thơng qua việc làm tăng tính thấm của thành mao mạch
[22].


13

Tương tự như vậy noradrenalin và dopamine làm tăng nhịp đập của tim
và gây ra tăng tuần hoàn máu. Tuy nhiên giống như histamin, tác dụng của hai
catecholamine này phần lớn bị lu mờ bởi những thành phần khác của nọc độc
[22].
Serotonin hoạt động như một chất kích thích và góp phần gây ra những
cơn đau.
Cuối cùng, acetylcholine có thể làm tăng cảm giác đau của một vết chích
bằng cách kích thích thụ thể đau đồng thời với tác dụng của histamine [22].
Bảng 1.1 Một số protein và peptide chính được tìm thấy trong nọc ong [22].
Nọc ong mật
(bee)

Nọc ong vị vẽ
(wasp)

Kiểu và MW (Da)

% Tỉ lệ trong
nọc khơ

Phospholipase A2 Phospholipase A2 Enzyme (~18 kDa) 10-12
Phospholipase B

Phospholipase B

Enzyme (~26 kDa) 1

Hyaluronidase

Hyaluronidase

Enzyme (~54 kDa) 1.5-2

Phosphatase

Phosphatase

Enzyme (~60 kDa) 1

- Gluosidase

- Gluosidase

Enzyme (~170 kDa) 0.6

Melittin

-

Peptide (2847 Da)

40-50

Apamin

-

Peptide (2027 Da)

2-3

MCD peptide

-

Peptide (2593 Da)

2-3

-

Mastoparan

Peptide (1422 Da)

-

-

Bradykinin

Peptide (1060 Da)

-


14

1.2.2 Ứng dụng của nọc ong
Nọc ong là một chất độc với con người, vì vậy hiểu biết cặn kẽ đặc tính
về thành phần phân tử, tác dụng phụ và độc học của chúng đóng vai trị đặc biệt
quan trọng trong việc bảo vệ con người cũng như tìm kiếm các thuốc mới một
cách an toàn, hiệu quả. Nọc ong mật đã được nghiên cứu rất nhiều trong thế kỷ
trước [18], [28]. Trình tự của hệ gen ong mật đã được công bố vào năm 2006
[29] và dữ liệu tổng thể nọc ong mật đã có được từ năm 2005 trên Peptide Atlas.
Tổng số có 2288 protein ong mật đã được xác định với ít nhất 2 peptide với
FDR (false discovery rate) là 1,2 % [30].
Các thành phần peptide trong nọc độc của ong rất khác nhau về cấu trúc
hóa học và có nhiều tác dụng dược lý trên các đích đặc hiệu. Chúng được tạo
ra từ q trình tiến hóa hàng triệu năm để đối phó với sự cạnh tranh khắc nghiệt
của môi trường sống. Các hợp chất này đặc biệt hữu dụng và triển vọng trong
các nghiên cứu sinh y học nhằm tìm cơ chế tác động ở trạng thái bệnh lý và
bình thường trên cơ thể người cũng như trong việc thiết kế tạo các dược phẩm
mới.
Trong lịch sử y dược thế giới, nọc ong đã được sử dụng trong y học
phương Đông (Trung Quốc và Hàn quốc) và trong cả thời kỳ Ai cập và Hy Lạp

cổ đại để kiểm soát một số bệnh rối loạn thần kinh [31], [32]. Trong những năm
trước, các nghiên cứu chú trọng đến lợi ích của nọc ong như bảo vệ phóng xạ
[33], chống đột biến [34], chống viêm [35], chống kích hoạt đau [36].
Gần đây, nọc ong khơng chỉ được phát hiện có tiềm năng điều trị bệnh
trên mà nó cịn có khả năng sử dụng cho một số mục đích khác như kháng ung
thư [36], kháng khuẩn [22] làm suy giảm sự nhiễm HIV-1 [24], v.v.
Dược phẩm chứa melittin có tác dụng kháng viêm giảm đau mạnh gấp
nhiều lần hydrocortison, dùng trong bệnh thấp khớp, dùng trong phẫu thuật
chỉnh hình và thẩm mỹ. Một vài loại thuốc sử dụng nọc ong mật thô đã được
đăng ký và xuât hiện trên thị trường Châu Âu và toàn cầu như Forapin (Đức),
Virapin (Slovakia), Apiven (Pháp), Melivenon (Bulgaria), và Apifor (Nga).
Trong những năm gần đây, nọc ong và các thành phần của nó đã cho thấy


15

hoạt tính kháng khuẩn tiềm năng. Jalaei và cộng sự (2014) đã thực hiện sàng
lọc tác dụng kháng khuẩn của nọc độc thô Vespa Orientalis trên hai vi khuẩn
gram dương (Staphylococcus aureus và Bacillus subtillis) và hai gram âm
(Escherichia coli và Klesiella pneumonia). Kết quả cho thấy nọc độc của Vespa
Orientalis có tác dụng đáng kể đối với các chủng vi khuẩn được thử nghiệm (ở
nồng độ nọc độc 30 µg/ khoanh giấy, vùng ức chế là 12,6; 22,7; 22,4 và 10,2
mm đối với S.aureus, B.subtilis, E. coli, và K.pneumonia tương ứng) [37].
Các peptide được nghiên cứu đặc tính và được tách chiết gần đây cho
thấy hoạt tính kháng khuẩn, đóng vai trị quan trọng trong việc ngăn ngừa sự
lây nhiễm tiềm ẩn bởi vi sinh vật trong quá trình tiêu thụ con mồi của ấu trùng
côn trùng. Melittin đã thể hiện đặc tính kháng khuẩn mạnh và nó cũng có hoạt
tính tan máu và đặc tính gây dị ứng rõ rệt [38]. Các peptide kháng khuẩn này
không chỉ được áp dụng để điều trị ở người mà còn để chống lại các mầm bệnh
cây trồng quan trọng về mặt kinh tế mà hiện nay đang là một trong những yếu

tố hạn chế chính trong việc sản xuất cây trồng trên toàn thế giới [39]. Các
peptide ly giải như mastoparan và anoplin cũng thể hiện khả năng ức chế tăng
trưởng mạnh đối với vi khuẩn gram dương và gram âm, vì chúng có thể chèn
vào lớp lipid kép của vi khuẩn và hình thành lỗ.
Như vậy có thể nói rằng nọc ong là nguồn cung cấp dồi dào nhiều loại
thuốc khác nhau phục vụ sức khỏe con người nếu ta nghiên cứu phát hiện được
ra chúng. Ong có thể giết hại hàng nghìn người mỗi năm nhưng nọc độc chết
người của nó tiềm tàng khả năng cứu chữa cho hàng nghìn người khác.
1.3 MASTOPARAN
1.3.1 Cấu tạo
Mastoparan là một peptide lưỡng phần, cation, ngắn, hoạt động màng,
gồm 10 tới 14 gốc amino acid, giàu các gốc kỵ nước như leucine, isoleucine,
valine or alanine, 2-4 gốc lysine, trong môi trường TFE tạo thành dạng cấu trúc
xoắn lưỡng phần, đặc biệt cấu trúc amin hố đầu C đã tạo nên những hoạt tính
q của mastoparan.
Mastoparan đại diện cho lớp thành phần phong phú nhất của các peptide