BÁO cáo THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH học ỨNG DỤNG TRONG bảo vệ THỰC vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ
THỰC VẬT

GVHD: TS. Nguyễn Ngọc Bảo Châu
TS. Hồ Bảo Thùy Quyên
Nhóm sinh viên thực hiện: Nhóm 3
1. Trần Hồng Ngọc Huyền

1753010090

2. Thái Thị Thúy Kiều

1753010106

3. Lê Thị Ý

1753010310

1


Ngày 31 tháng 8 năm 2020

Bài 1: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN NỘI SINH
I.

Các bước thực hiện

1. Thu thập và xử lý mẫu (Khử mẫu)
Mẫu cây cúc xuyến chi

Rửa sạch dưới vòi nước chảy mạnh. Lấy phần lá làm mẫu khử
(Cắt đoạn 2 – 4cm)

Ngâm mẫu trong ethanol 70%, 5 phút

Ngâm trong trung dịch javel, 3-5 phút

Ngâm trong ethanol 70%, 30s – 2 phút
2


Rửa mẫu với 5 lần nước cất vô trùng

Kiểm tra mẫu
(200µl nước cất vơ trùng đã
rửa mẫu ở lần 5 trang lên đĩa
môi trường NA và PDA, ủ
370C 24 giờ

Đặt mẫu lên giấy thấm vô
trùng cho ráo nước

3

2. Phân lập và làm thuần
Chọn mẫu đã khử trùng đạt yêu cầu
+ 10ml nước cất vô trùng

Dùng chày vô trùng nghiền mịn mẫu

200µl dịch nghiền mẫu cho vào ống môi trường NA bán đặc
ủ 300C, 1-3 ngày

Lấy sinh khối vi khuẩn đã tăng sinh, cấy ria trên đĩa môi trường NA
ủ 300C, 1-3 ngày

Chọn khuẩn lạc rời cấy cấy ria trên đĩa môi trường NA
(làm thuần lần 1)

Tiếp tục làm thuần đến khi chỉ có một loại khuẩn lạc trên đĩa

Cấy giữ chủng vào ống thạch nghiêng NA (40C)

II.

Kết quả
4


1. Kiểm tra mẫu khử trùng

A

B

C

Hình 1: Kết quả kiểm tra mẫu khử trùng
A: Kiểm tra mẫu khử trùng trên môi trường PDA và NA của Trần Hồng Ngọc Huyền
B: Kiểm tra mẫu khử trùng trên môi trường PDA và NA của Thái Thị Thúy Kiều
C: Kiểm tra mẫu khử trùng trên môi trường PDA và NA của Lê Thị Ý
 Nhận xét:
-

Trên đĩa mơi trường NA có sự hiện diện của một số khuẩn lạc
 Đại diện 1 nhóm khử mẫu lá nên việc thao tác chưa được thực hiện



Có thể vẫn cịn một số vi khuẩn bề mặt do xử lý chưa đạt



Do thao tác thực hiện gây vấy nhiễm VSV khác

-

Trên đĩa mơi trường PDA khơng có sự hiện diện của nấm
5


 Mẫu khử trùng cũng chưa loại bỏ được nấm bề mặt
 Vì chỉ có một mẫu nước khử duy nhất để sử dụng nên đĩa C có thể đốt que
trang quá nóng nên cả đĩa NA và PDA đều khơng có sự xuất hiện của

khuẩn lạc hay nấm.
2. Phân lập và làm thuần
a. Kết quả của quá trình tăng sinh mẫu cần phân lập

Có xuất hiện một lớp
màng mỏng pellicle cách
mơi trường ni khoảng
0.5cm chỉ thị có sự xuất
hiện của vi sinh vật nội
sinh

Hình 2: Kết quả của quá trình tăng

sinh mẫu

b. Kết quả của quá trình phân lập vi khuẩn sau tăng sinh

A

B

C
6


Hình 3: A: Kết quả của quá trình phân lập vi khuẩn của Trần Hồng Ngọc Huyền
B: Kết quả của quá trình phân lập vi khuẩn của Thái Thị Thúy Kiều
C: Kết quả của quá trình phân lập vi khuẩn của Lê Thị Ý
c. Kết quả của quá trình làm thuần

A

B

Hình 4: A: Kết quả của quá trình

C
làm thuần lần 1 của Trần

Hồng Ngọc Huyền
B: Kết quả của quá trình làm thuần lần 1 của Thái Thị Thúy Kiều
C: Kết quả của quá trình làm thuần lần 1 của Lê Thị Ý
 Nhận xét:
-

Trên đĩa phân lập A xuất hiện các khuẩn lạc có hình thái giống nhau, cần
nhuộm gram để so sánh với mẫu Bacillus trong PTN

-

Đĩa B và C cũng có các khuẩn lạc có hình thái giống nhau

7


d. Kết quả quá trình giữ chủng

A

B

C

Hình 6: A: Kết quả cấy giữ chủng của Trần Hồng Ngọc Huyền
B: Kết quả cấy giữ chủng của Thái Thị Thúy Kiều

8


 Nhận xét:
-

Kết quả q trình cấy giữ chủng khơng bị xâm nhiễm bới các sinh vật lạ.

9


III.

Khảo sát một số đặc điểm của chủng vi khuẩn Bacillus sp. phân lập được

1. Quan sát hình thái khuẩn lạc và trạng thái sống

Hình 7: Hình thái khuẩn lạc trên môi trường thạch
2. Nhuộm gram
a. Các bước nhuộm gram
Nhỏ giọt nước lên phiến kính. Tạo huyền phù với vi khuẩn.
Hơ nóng nhẹ, cố định mẫu
Nhuộm với Crystal violet (1-2 phút), rửa sạch bằng nước
Nhỏ dung dịch lugol (30 giây), rửa nhẹ lại với nước

Tẩy cồn 960 (15-30 giây), rửa lại với nước
Nhuộm với safarin O (1 phút), rửa lại với nước
Thấm khơ phiến kính, rồi quan sát dưới kính hiển vi

10


b. Kết quả nhuộm gram

B

A

C

Hình 8
A: Kết quả nhuộm gram chủng Bacillus sp. phịng thí nghiệm của Trần Hồng Ngọc
Huyền
B: Kết quả nhuộm gram chủng Bacillus sp. phịng thí nghiệm của Thái Thị Thúy Kiều
C: Kết quả nhuộm gram chủng Bacillus sp. phịng thí nghiệm của Lê Thị Ý

A

B

C
Hình 9: A: Kết quả nhuộm gram chủng phân lập của Trần Hồng Ngọc Huyền
B: Kết quả nhuộm gram chủng phân lập của Thái Thị Thúy Kiều
C: Kết quả nhuộm gram chủng phân lập của Lê Thị Ý

11


3. Thử nghiệm catalase
a. Cách thực hiện
Nhỏ một giọt H2O2 3% trên lam kính. Dùng que cấy lấy một ít sinh khối của khuẩn lạc
hịa vào giọt H2O2.
b. Kết quả

Hình 10: Kết quả thử nghiệm catalase của chủng Bacillus sp. phịng thí nghiệm

A

B

C

Hình 11: A: Kết quả thử nghiệm catalase chủng phân lập của Trần Hồng Ngọc Huyền
B: Kết quả thử nghiệm catalase chủng phân lập của Thái Thị Thúy Kiều
C: Kết quả thử nghiệm catalase chủng phân lập của Lê Thị Ý

12


IV.

Báo cáo kết quả
Bảng 1: So sánh các chỉ tiêu quan sát đại thể và vi thể vi khuẩn.
Chủng
Các chỉ tiêu

Khuẩ Hình dạng
Màu sắc
n lạc
Bề mặt
Hình thái
Hiển
vi

Cách bắt màu
Bào tử
Di động

Catal
ase

Dương/âm

Bacillus sp.
phịng thí
nghiệm
Mép răng cưa
Vàng nhạt
Nhăn nheo
Hình trực
ngắn
Tím
Hình bầu duc
Có

Chủng phân lập

Chủng phân lập

của Trần Hồng

của Thái Thị

Ngọc Huyền

Thúy Kiều

Mép trịn, lồi
Trắng đục
Trơn

Mép răng cưa
Vàng xanh
Hơi nhăn

Hình cầu

Hình trực ngắn

Tím
Tím
Chưa xác định* Chưa xác định*
Chưa xác
Chưa xác
định**

định**

+

+

+

Chủng phân lập
của Lê Thị Ý

Mép răng cưa
Vàng xanh
Hơi nhăn
Hình trực ngắn
Tím
Chưa xác định*
Chưa xác
định**
+

*: Cần phải thực hiện kỹ thuật nhuộm bào tử mới có thể xác định được có bào từ hay
khơng.
**: vi khuẩn quá nhỏ nên không thể quan sát đc

13


Bài 2: ỨNG DỤNG DNA MÃ VẠCH ( DNA BARCODE) HỖ TRỢ DDIHJ DANH

CƠN TRÙNG
I: Quy trình thực hiện
Dùng dao cắt chân cơn trùng

Ly trích (ngâm mẫu trong cồn tuyệt đối)

Thấm khơ mẫu

Nghiền mẫu trong 20µl NaOH 50%

Ủ ở 95°C, 15 phút

Làm trung tính mẫu bằng 2µl strip HCL

14


II: phản ứng PCR
1. Thành phần phản ứng PCR
-

Master mix: 6µl

-

Mồi xi COI 1490 ( 10µM/ml): 0.75µl

-

Mồi ngược COI 2198 ( 10µM/ml): 0.75µl

-

DNA: 4µl

-

H2O: 0.5µl

-

Tổng: 12µl

2. Chu kỳ cho phản ứng PCR
Bước
1

Nhiệt độ (°C)
95
95

2
72
72
4

3
4

Thời gian

5 phút
30 giây
30 giây
30 giây
10 phút

Số chu kỳ
1
35
1
1

3. Đổ gel và chạy điện di
a. Đổ gel

1g agarose + 100 ml dung dịch TAE

15


Đun bằng lị vi sóng đến khi tan

Để nguội 60°C và đổ vào khn có để sẵn lược

Để nguội và chô khuôn vào bể
b. Chạy điện di
Đổ đầy TAE 1X ngập khay điện di
Hút 1µl dung dịch Gelred + 4µl DNA trộn đều trên mảnh paraffin
( thang chuẩn: 1µl thang chuẩn ladder + 1µl Gelred)
Cắm điện cực cho dịng điện chạy từ (-) sang (+)

III: Kết quả
1. Kết quả đo OD

Hình 12
A: Kết quả đo OD của Trần Hồng Ngọc Huyền

A

B: Kết quả đo OD của Thái Thị Thúy Kiều

B

C

C: Kết quả đo OD của Lê Thị Ý
-

Hàm lượng DNA:

Huyền: OD260 × 50 × nồng độ pha lỗng = 0,358 × 50 × 100= 1790 µg/ ml
Ý: OD260 × 50 × nồng độ pha loãng = 0,598 × 50 × 100 = 2990 àg/ ml
Kiu: OD260 ì 50 ì nng độ pha lỗng = 0,378 × 50 × 100 = 1890 µg/ ml
16


-

Độ tinh sạch của DNA:

Tỉ lệ 260/280 < 1,8: Mẫu bị tạp nhiễm

OD
260 nm
280 nm
260/280

-

Huyền
0,358
0,367
0,97

Ý
0,598
0,419
1,43

Kiều
0,378
0,367
1,03

Kết quả: Cả ba mẫu đều có tỉ lệ 260/280 < 1,8 => Mẫu bị tạp nhiễm, chưa được
tinh sạch.

-

Biện luận:
+ Mẫu nhiễm tạp chất có thể do sai sót trong q trình thao tác, dụng cụ đo mật độ
quang chưa vệ sinh kĩ

+ Trong sản phẩm chứa nhiều protein cần phải sử lý thêm Protease K.

2. Kết quả điện di
A

C

B

17


Hình 14: A: Kết quả điện di mẫu DNA cơn trùng của Ngọc Huyền
B: Kết quả điện di mẫu DNA côn trùng của Thúy Kiều
A: Kết quả điện di mẫu DNA côn trùng của Lê Thị Ý
 Kết quả:
-

Mẫu DNA C xuất hiện sản pahmar 700 bp giống với kích thước lúc khảo sát, 2
mẫu A và B xuất hiện smear, chưa khuyếch đại thành công gen mong muốn.
 Biện luận:

-

Nguyên nhân có thể là: Mẫu bị tạp nhiễm, nhiệt độ bắt cặp DNA khơng đảm bảo.
 Giải trình tự

-

Các sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen COI có kết quả dương tính (kích thước

khoảng 700 bp với COI sẽ được gửi giải trình tự ở cơng ty)

18