Ung dung phuong phap HPLC vao phan tich acid amin

ỨNG DỤNG PHƯƠNG
PHÁP HPLC VÀO
PHÂN TÍCH AXIT AMIN


NỘI DUNG CHÍNH
ĐẶC ĐIỂM PHƯƠNG PHÁP
NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP
 HỆ THỐNG THIẾT BỊ
 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ SẮC KÝ
 ỨNG DUÏNG


ĐẶC ĐIỂM PHƯƠNG
PHÁP
 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC – High

Pressure Liqid Choromatography) : SẮC
KÝ CỘT có pha động là chất lỏng.
 Dùng vật liệu nhồi cột có kích
thước rất bé (5-10µm) và độ đồng
nhất cao làm tăng đáng kể số đóa
lý thuyết.


ĐẶC ĐIỂM PHƯƠNG
PHÁP
 Sử dụng bơm cao áp duy trì

áp suất cao ở đầu cột
nhằm điều chỉnh, ổn định

vận tốc dòng và tăng tốc
quá trình phân tích.
HPLC có thể sử dụng nhiều
loại đầu dò khác nhau làm
tăng khả năng phát hiện,
tăng hiệu quả phân tích


ĐẶC ĐIỂM PHƯƠNG
PHÁP
 Cột HPLC : cột sắc ký phân bố,

sắc ký hấp phụ, trao đổi ion hay lọc
gel.
Ưu việt hơn so với sắc ký khí khi
phân tích các hợp chất hữu cơ do
có thể tiến hành phân tích mà
không cần phân hủy hoặc chuyển
thành các dẫn xuất dễ bay hôi


NGUYÊN LÝ PHƯƠNG
PHÁP
 Tách chất khí và lỏng đa cấu tử

thành từng cấu tử riêng biệt
nhờ ứng dụng quá trình hấp phụ
trong điều kiện dao động.
 Trong dạng đơn giản nhất, những
điều kiện này được đảm bảo khi

dòng hỗn hợp khí, hơi hoặc chất
lỏng đi qua một ống đặc biệt có
chứa lớp chất hấp phụ tương ứng


NGUYÊN LÝ PHƯƠNG
PHÁP
 Những cấu tử hoà tan trong một

chất lỏng xác định sẽ tạo thành
một chuỗi hấp phụ xác định A>B>C
phản ánh ái lực hấp phụ tương đối
của từng cấu tử đối với chất hấp
phụ.
 Mỗi cấu tử của chuỗi có ái lực
hấp phụ lớn hơn cấu tử sau sẽ thay
thế nó từ liên kết và đến lượt
mình bị thay thế bởi cấu tử trước .


NGUYÊN LÝ PHƯƠNG
PHÁP

 Trên bề mặt chất hấp phụ tồn tại

một trường lực có khả năng hút
các phân tử chất lạ, tạo ra một
lớp đơn phân tử từ các phân tử bị
hấp phụ.
 Giữa bề mặt của chất hấp phụ

và môi trường hình thành một cân
bằng động được xác định bởi sự
bằng nhau của vận tốc hấp phụ và
khử hấp phụ của các phân tử.


NGUYÊN LÝ PHƯƠNG
PHÁP
 Chọn dung môi bị hút nhỏ nhất

đối với chất hấp phụ được sử
dụng, vì các phân tử dung môi
bám trên bề mặt chất hấp phụ
có thể làm giảm tính bị hấp phụ
của các cấu tử hoà tan và làm
lệch dạng đường dẳng nhiệt.


HỆ THỐNG THIẾT BỊ
 HỆ THỐNG BƠM (SOLVENT

DELIVERY SYSTEM)
 BỘ PHÂN TIÊM MẪU (INJECTOR)
 CỘT SẮC KÝ
 ĐẦU DÒ (DETECTOR)
 THIẾT BỊ THU NHẬN DỮ LIỆU


HỆ THỐNG THIẾT BỊ

HỆ THỐNG THIẾT BỊ


HỆ THỐNG BƠM
 Bơm phải đẩy dung môi rửa

giải thành dòng qua cột tách
liên tục và không có xung ở áp
suất cao
 Áp suất phân tích thông thường
trong khoảng 100 đến 400 bar, tốc
độ từ 0,1 đến 10 ml/phút


HỆ THỐNG BƠM
Dùng nhiều bơm bố trí lệch pha
để loại trừ nhiễu đường nền.
Thường dùng loại bơm xilanh có
đệm, do sử dụng bánh răng cơ
học để điều chỉnh pittong sẽ
có tốc độ dòng ổn định và
có độ lặp lại cao.


BỘ PHẬN TIÊM MẪU
(INJECTOR)

•Hỗn hợp phân tích được bơm thủ
công bằng syringe hay dùng bộ

phận nạp mẫu tự động.


CỘT SẮC KÝ
 Trơ, nhẵn, bề mặt đồng

nhất, chịu áp suất.
 Thường dùng cột ngắn 100250 mm, đường kính 2-4 mm.
 Kích thước hạt thông
thường từ 4-10 µm.


CỘT SẮC KÝ
 Thường ghép nhiều cột để

có sự phân giải tốt.
 Tính phân cực của cột phụ
thuộc vào tính phân cực của
các nhóm chức liên kết.


CỘT SẮC KÝ
 Phân tích thực phẩm thường

sử dụng sắc ký phân bố dựa
trên sự khác nhau về hệ số
phân bố của các cấu tử
mẫu đối với pha tónh.
Sắc ký trao đổi Ion : phân tích
các hợp chất có khả năng ion

hoá, M<1500, pha tónh thường
dùng là nhựa hữu cơ tổng hợp


CỘT SẮC KÝ
 Dựa trên sự khác nhau về
ái lực hấp dẫn.
 nh hưởng bởi pH pha
động, nhiệt độ, loại ion,
nồng độ ion và những biến
đổi hữu cơ.


CỘT SẮC KÝ
 Sắc ký rây phân tử : dùng để
đo sự tập hợp hay phân rã của
các hợp chất tử, dựa trên sự
thay đổi của các kích thước cấu
tử qua coät


ĐẦU DÒ (DETECTOR)
 Có độ nhạy cao, thể tích

chiết ngoài detector nhỏ
 Không phá hủy mẫu.
 Không nhạy cảm vơi biến đổi
nhiệt độ và vận tốc dòng.
 Vận hành liên tục.
 Độ lặp lại cao, dễ sử dụng.

CÁC LOẠI DETECTOR
Detector tử ngoại –khả kiến (200-700 nm)
Detector chiết xuất vi sai
Detector hấp thu nhiệt
Detector huỳnh quang
Detector điện kế, volt kế, điện hoá.


PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
SẮC KÝ


PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
SẮC KÝ
 Đại lượng lưu giữ tương đối :
t2 − ta
α=
t1 − t a

 Số đóa lý thuyeát :
t 2
N = 16( )
w

hay

5  t 


N = 
54  W1 / 2 

2


PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
SẮC KÝ
 Độ phân giải R (sự phân ly hai
thành phần trong hỗn hợp)

2(t 2 − t1 )
R=
W1 + W2

 Diện tích peak và chiều cao của
peak tỷ lệ thuận với lượng chất
chiết rút từ cột.