PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC MÃ HÓA CÁC PROTEIN GÂY ĐỘC CỦA E.COLI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR

Báo cáo CNSH
ĐỀ TÀI:
PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC
MÃ HÓA CÁC PROTEIN GÂY ĐỘC
CỦA E.COLI BẰNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX – PCR
Nhóm: Nguyễn Thị Ngọc Hương
Nguyễn Minh Hồi
Trần Thị Kim Hồn
Phan Thị Hồng Nhung


Nội dung báo cáo
Giới

thiệu
Tổng quan
Phương pháp
Kết quả - Thảo luận


Giới thiệu


Tổng quan
1.

Vi khuẩn E.Coli:



Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống
Escherichia.
E. coli là trực khuẩn Gram (-), di động, kích thước
khoảng 2 – 3 x 0,5 ìm, khơng hình thành bào tử và
có giáp mơ
E. coli có mặt thường xun và chiếm ưu thế trong
ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuối
của ruột non và ở ruột già, được xem là vi khuẩn
chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước được đánh giá
dựa trên số lượng của chúng.






Tổng quan
2. Ni cấy và đặc điểm sinh hóa :
 E.

coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy ý.
 T op = 35 – 370C, pHop = 6.4 – 7,5.
 Sau 24 giờ mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng hình
thành những khuẩn lạc dạng S màu xám trắng, trịn, ướt,
bề mặt bóng, kích thước khoảng 2 – 3 mm.
Mt EMB: E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim.
Mt MacConkey: E. coli cho khuẩn lạc đỏ hồng.
Mt thạch nghiêng TSI: E. coli tạo acid / acid (vàng / vàng).

E.Coli trong môi trường EMB


E.Coli trên môi trường thạch MacConkey


Tổng quan
3. Yếu tố kháng nguyên :
 Kháng

nguyên thân O (somatic antigen):
 Kháng nguyên lông H (flagellar antigen):
 Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen):
 Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial
antigen):


Tổng quan
4. Phân loại E.Coli :
 STEC

(Shiga toxin-producing E. coli) hoặc VTEC
(Verotoxigenic E. coli) và EHEC
(Enterohaemorrhagic E. coli)
 EPEC (Enteropathogenic E. coli)
 ETEC (Enterotoxigenic E. coli)
 EAggEC hay EAEC (Enteroaggregative E. coli)
 EIEC (Enteroinvasive E. coli)

Tổng quan
5. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của
E. coli:
 Yếu





tố gây bệnh :

Cư trú trên màng nhầy
Kháng được sư phòng vệ của vật chủ
Nhân lên
Gây tổn hại cho vật chủ.

 Cơ chế gây bệnh :
 Sản xuất độc tố (ETEC, EAEC, STEC)
 Tấn công / xâm lấn (EIEC)
 Bám dính, truyền tín hiệu qua màng (EPEC và EHEC)



PCR: Polymerase Chain Reaction
: />

Tổng quan
Kỹ

thuật PCR

Nguyên tắc
PCR (polymerase chain reaction – phản
ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) do Karl Mullis và cộng sự
phát minh năm 1985
Đây là kỹ thuật in vitro cho phép nhân
nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu
lần trong thời gian ngắn.


Tổng quan
Kỹ

thuật PCR
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động
tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch
khuôn đều cần sự hiện diện của những
mồi chuyên biệt.
Các mồi này gồm có mồi “xuôi” (forward
primer: mồi tác động lên sợi 3’→ 5’) và
mồi “ngược” (reverse primer: mồi tác
động lên sợi 5’→ 3’).


Tổng quan
 Kỹ

thuật PCR
 Các giai đoạn của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau.

Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
 Bước 1 (giai đoạn biến tính - denaturation): hai mạch
của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơnPhân
tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng
chảy (Tm) của phân tử
 Bước 2 (giai đoạn ủ bắt cặp – anealing): Nhiệt độ được
hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) nhiệt độ này dao
động trong khoảng 40 – 600C tuỳ thuộc Tm của các mồi
sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.


Tổng quan
 Kỹ

thuật PCR
 Các giai đoạn của phản ứng PCR
 Bước 3 (giai đoạn kéo dài – elongation hay extension):
nhiệt độ ở giai đoạn này được tăng lên 72 0C giúp DNA
polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt nhất với sự
hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn
DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp tạo thành chuỗi
DNA.
Công thức:
Tổng DNA khuyếch đại = m * 2n
Với n là số chu kỳ, m là số bản sao của chuỗi mã hóa.


Tổng quan
 Kỹ

thuật PCR
 Các giai đoạn của phản ứng PCR
Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong một phản
ứng, vì:
Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ
lệ với lượng mẫu ban đầu.
Giai đoạn sau, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:
+ Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
+ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng.
+ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại
bắt cặp với nhau.
 Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban
đầu.


Tổng quan
 Kỹ

thuật PCR
 Các thành phần của một phản ứng PCR
 DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.
 Mồi (primer): Mồi là những đoạn oligonucleotide
mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình tự base của
hai đầu mạch khn để khởi đầu q trình tổng hợp
DNA.
 Taq polymerase: là một DNA polymerase chịu
nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus
aquaticus ở suối nước nóng, khơng bị phá hủy ở
nhiệt độ cao. Taq DNA polymerase tổng hợp DNA
theo hướng 5’ → 3’ và hoạt động tốt nhất ở 70 720C.

Tổng quan
 Kỹ

thuật PCR
 Các thành phần của một phản ứng PCR
 Các nucleotide (dNTP- deoxyribonucleotide
triphosphate)
 Dung dịch đệm: Thành phần dung dịch đệm có thể thay
đổi tuỳ loại enzyme được sử dụng, quan trọng nhất là
ion Mg2+
 Nồng độ Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là
một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc
hiệu của phản ứng PCR. Ngồi ra cịn có thể ảnh hưởng
đến quá trình bắt cặp của mồi, nhiệt độ để biến tính
DNA thành dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung
thực của kết quả.


Tổng quan


Tổng quan


Tổng quan
 Kỹ

thuật PCR

 Phân tích kết quả PCR
 Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được
khuếch đại) sẽ được phát hiện bằng phương pháp
điện di.
 Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc
đứng. Các DNA trong gel agarose được hiện hình
dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide
 Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose,
người ta sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng
phân tử” (molecular weight marker – MWM) là một
tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết
(DNA ladder).


Tổng quan
Kỹ

thuật PCR
 Multiplex – PCR
Là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong
đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn
DNA mong muốn bằng cách sử dùng đồng
thời nhiều cặp mồi trong một phản ứng.
Multiplex - PCR đầu tiên được mô tả bởi
Chamberlain năm 1988 và kể từ đó multiplex
- PCR được ứng dụng rất nhiều trong các
lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online).


Phương pháp

Phương hướng:
 Phân lập vi khuẩn

E. coli trong và thịt bị, heo
bằng phương pháp định lượng. Từ đó đánh giá
mức độ vệ sinh thực phẩm bằng cách so sánh với
TCVN về số lượng E. coli trên thịt tươi (TCVN
7046 - 2002).
 Sử dụng kỹ thuật multiplex - PCR để phát hiện
các gen độc lưc của vi khuẩn E. coli phân lập
được bằng qui trình định lượng.
 Phân lập định tính vi khuẩn E. coli trong thịt bị
và thịt heo. Phát hiện các gen độc lực của E.
coli đã phân lập định tính bằng kỹ thuật
multiplex - PCR.


Phương pháp
 Phương

pháp nghiên cứu:
Phân lập vi khuẩn E. coli
 Đối tượng lấy mẫu
 Thịt bò, heo được lấy từ các chợ lẻ (dùng cho qui trình
định lượng).
 Bề mặt quày thịt bò, thịt heo được lấy trong lò mổ
(dùng cho qui trình phân lập định tính).
 Cách lấy và bảo quản mẫu
 Mẫu thịt: Chọn ngẫu nhiên miếng thịt để lấy mẫu. Khối
lượng mẫu là 50 g thịt.

 Mẫu bề mặt quày thịt: Chọn ngẫu nhiên quày thịt ở giữa
ca giết mổ.