Luận án tiến sĩ nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HỒNG TRANG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
PHYTOSOME QUERCETIN ỨNG
DỤNG VÀO VIÊN NANG CỨNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HỒNG TRANG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
PHYTOSOME QUERCETIN ỨNG
DỤNG VÀO VIÊN NANG CỨNG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC

PHẨM VÀ BÀO CHẾ
THUỐC
MÃ SỐ:

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu Giang
GS.TS. Phạm Thị Minh Huệ

HÀ NỘI, NĂM 2020


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng
trình nào khác
Tác giả

NCS. Nguyễn Hồng Trang


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thành luận án này, tôi luôn được sự
quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của các thầy, cơ giáo, các nhà khoa học
cùng với sự động viên của bạn bè đồng nghiệp và gia đình.
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
GS.TS. Phạm Thị Minh Huệ
PGS.TS. Vũ Thị Thu Giang
Những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, hết lịng giúp đỡ và trực
tiếp hướng dẫn tơi trong suốt q trình nghiên cứu, thực hiện luận án này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên,
các anh chị học viên, các bạn sinh viên của Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược
Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tơi có thể hoàn thành luận án này.
Trân trọng cảm ơn PGS. TS. Đỗ Thị Thảo, ThS. Đỗ Thị Phương cùng các
kiểm nghiệm viên của Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Hàn Lâm Khoa Học và
Công Nghệ Việt Nam.
Lời cảm ơn tiếp theo, tơi xin gửi tới tồn thể các thầy, cơ giáo, bạn bè đông
nghiệp, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Bào chế - Công nghiệp Dược thuộc
Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược – Đại học Huế đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường cùng các chuyên viên
phòng Đào tạo Sau Đại học đã quan tâm và giúp đỡ tơi trong q trình học tập và
nghiên cứu tại Trường Đại học Dược Hà Nội.
Lời cảm ơn cuối cùng tôi muốn dành tặng tới những người thân trong gia
đình và bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ để tơi có thể n tâm học tập,
nghiên cứu.
Hà Nội, ngày

tháng

năm

NCS. Nguyễn Hồng Trang


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................................................ 3
1.1. Quercetin................................................................................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc....................................................................................................................... 3
1.1.2. Cơng thức hóa học....................................................................................................... 3
1.1.3. Tính chất lý hóa............................................................................................................ 4
1.1.4. Độ ổn định...................................................................................................................... 5
1.1.5. Các phương pháp định lượng quercetin.............................................................. 5
1.1.6. Tác dụng dược lý......................................................................................................... 5
1.1.7. Dược động học.............................................................................................................. 7
1.1.8. Chỉ định........................................................................................................................... 8
1.1.9. Liều dùng........................................................................................................................ 8
1.1.10. Tương tác thuốc............................................................................................................. 9
1.1.11. Một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng đường uống của quercetin......9
1.2. Tổng quan về phytosome................................................................................................ 11
1.2.1. Khái niệm..................................................................................................................... 11
1.2.2. Thành phần cấu tạo................................................................................................... 11
1.2.3. Phân biệt phytosome với liposome..................................................................... 13
1.2.4. Ưu, nhược điểm của phytosome.......................................................................... 13
1.2.5. Kỹ thuật bào chế phytosome................................................................................. 16
1.2.6. Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của phytosome................19
1.2.7. Một số nghiên cứu về phytosome ở Việt Nam............................................... 24
1.2.8. Ứng dụng phytosome trong lĩnh vực dược phẩm......................................... 26
1.3. Một số mơ hình đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan...................................... 28
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU.................................................................................................................................. 31
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu............................................................................. 31
2.1.1. Nguyên liệu................................................................................................................. 31
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu................................................................................................... 32

2.1.3.
2.1.4.

Động vật thí nghiệm................................................................................................. 33
Địa điểm thực hiện nghiên cứu............................................................................ 33

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................................... 34
2.2.1. Phương pháp bào chế phytosome quercetin.................................................... 34
2.2.2. Phương pháp bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin.........36
2.2.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của quercetin và
phytosome quercetin................................................................................................................. 37
2.2.4. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của viên nang cứng
chứa phytosome quercetin...................................................................................................... 47
2.2.5. Nghiên cứu độ ổn định của bột phytosome quercetin và viên nang chứa
phytosome quercetin................................................................................................................. 49
2.2.6. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của phytosome
quercetin........................................................................................................................................ 50
2.2.7. Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo..................................... 51
2.2.8. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu............................................................. 54
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................................... 55
3.1. Xây dựng/thẩm định một số phƣơng pháp đánh giá....................................... 55
3.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC............................................ 55
3.1.2. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-Vis.................................................. 58
3.1.3. Phương pháp xác định tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa..................... 61
3.2. Xây dựng cơng thức và quy trình bào chế phytosome quercetin................66
3.2.1. Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin....................................................... 66
3.2.2. Nghiên cứu nâng quy mô bào chế phytosome quercetin lên 500 g/mẻ
và dự kiến tiêu chuẩn chất lượng......................................................................................... 80
3.2.3. Theo dõi độ ổn định của phytosome quercetin............................................ 101
3.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của phytosome quercetin thơng

qua khả năng trung hịa gốc tự do của DPPH.............................................................. 104
3.4. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình chuột bị gây độc bằng
carbon tetraclorid....................................................................................................................... 105
3.5. Nghiên cứu bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin..............111
3.5.1. Xây dựng công thức bào chế.............................................................................. 111
3.5.2. Dự kiến tiêu chuẩn cơ sở của viên nang cứng chứa phytosome
quercetin...................................................................................................................................... 118


3.5.3. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của viên nang cứng chứa
phytosome quercetin .........................................................................................
3.6.
3.6.1.
3.6.2.

Theo dõi độ ổn định của viên nang chứa phytoso
Theo dõi hàm
Theo dõi độ h

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ....................................................................................
4.1.
Về xây dựng công thức và quy trình bào chế phy
4.1.1.
Về phương ph
4.1.2.
Về cơng thức
4.1.3.
Về thơng số k
4.1.4.
Về nâng cấp q

4.1.5.
Về phương ph
4.1.6.
Về theo dõi độ
4.2.

Về đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của
.......................
4.3.
Về đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của phy
4.4.
Về bào chế viên nang cứng chứa phytosome que
4.4.1. Về công thức bào chế ..........................................................................
4.4.2. Về phương pháp bào chế ....................................................................
4.4.3.
Về tiêu chuẩn
4.4.4. Về đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của viên nang cứng chứa
phytosome quercetin .........................................................................................
4.4.5. Về theo dõi độ ổn định ........................................................................
4.5. Đóng góp mới của luận án .........................................................................
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................
KẾT LUẬN: .........................................................................................................
KIẾN NGHỊ: ........................................................................................................
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Ký hiệu
1

ALT

2

AST

3

BCS

4

CCl4

5

13

6

DĐVN

7

DLS

8

DMSO

9

DPPH

10

DSC

11

EE

12

ESI

13

US - FDA

14

FTIR

15

HCl

16

1

17

HPLC

C - NMR

H - NMR


18

HPMC

19

HSPC


STT

Ký hiệu

20

IUPAC

21

KCl

22

KTTP

23

Log P

24

MDA

25

MS

26

NaCMC

27

NMR

28

PC

29

PDI

30

PL

31

v/ph

32

RSD

33

SD

34

SEM

35

SKD

36

SPC

37

SSG

38

STT

39

t1/2

40

TBA

41

TCA

42

TEM

43

USP

44

UV-VIS

45

WHO

46

XRD


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân biệt phytosome và liposome........................................................... 13
Bảng 1.2. Một số chế phẩm viên nang chứa phytosome quercetin lưu hành trên thị
trường...................................................................................................................... 28
Bảng 1.3. Ảnh hưởng của CCl4 lên một số thông số phản ánh chức năng gan........30
Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng................................................ 31
Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.......................................................... 32
Bảng 2.3. Thành phần viên nang cứng chứa phytosome quercetin..........................36
Bảng 2.4. Tương quan giữa chỉ số nén và khả năng trơn chảy theo USP 41...........47
Bảng 2.5. Thành phần hỗn dịch quercetin và hỗn dịch phytosome quercetin..........51
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký............................... 55
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp....................................57

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ đúng của hệ thống sắc ký........................................ 57
Bảng 3.4. Phổ UV-Vis của quercetin và phytosome quercetin................................58
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống.......................................... 58
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp....................................60
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp UV-Vis định lượng quercetin .. 60

Bảng 3.8. Độ hấp thụ quang của mẫu chứa phytosome quercetin và mẫu placebo .. 61

Bảng 3.9. Độ tan của quercetin dạng tự do, dạng phytosome trong cloroform và
ethyl acetat.............................................................................................................. 61
Bảng 3.10. Kết quả đánh giá tỷ lệ hoạt chất quercetin phytosome hóa khi sử dụng
các dung mơi khác nhau theo thời gian................................................................... 62
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến nồng độ quercetin trong ethyl acetat .. 63

Bảng 3.12. Các thơng số MS của mẫu phân tích..................................................... 64
Bảng 3.13. Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa và độ tan trong nước của phytosome
quercetin tại các thời gian phản ứng khác nhau....................................................... 65
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp xác định tỷ lệ hoạt chất
phytosome hóa........................................................................................................ 65
Bảng 3.15. Các thơng số kỹ thuật trong q trình bào chế phytosome quercetin....66
Bảng 3.16. Một số đặc tính của hỗn dịch phytosome quercetin bào chế theo các
phương pháp khác nhau.......................................................................................... 67
Bảng 3.17. Một số đặc tính của hỗn dịch phytosome quercetin bào chế theo phương
pháp kết tủa trong môi trường nước........................................................................ 68


Bảng 3.18. Một số đặc tính của phytosome quercetin khi tiến hành hydrat hóa từ
màng film và hydrat hóa từ bột phytosome ..............................................................
Bảng 3.19. Đặc tính của phytosome quercetin bào chế với các loại phospholipid
khác nhau...................................................................................................................

Bảng 3.20. Độ ổn định của phytosome quercetin bào chế với các loại phospholipid
khác nhau...................................................................................................................
Bảng 3.21. Đặc tính của phytosome quercetin bào chế với tỷ lệ quercetin : HSPC
(mol:mol) khác nhau .................................................................................................
Bảng 3.22. Đặc tính của phytosome quercetin bào chế với các tỷ lệ quercetin :
HSPC : cholesterol khác nhau ...................................................................................
Bảng 3.23. Độ ổn định của hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với các tỷ lệ
quercetin : HSPC : cholesterol khác nhau .................................................................
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ tan trong nước của
phytosome quercetin .................................................................................................
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa ...
Bảng 3.26. Đặc tính của phytosome quercetin bào chế với nhiệt độ phản ứng khác
nhau ...........................................................................................................................
Bảng 3.27. Đặc tính của phytosome quercetin bào chế với tốc độ quay khác nhau ...
Bảng 3.28. Thành phần công thức bào chế phytosome quercetin .............................
Bảng 3.29. Một số đặc tính của hỗn dịch phytosome quercetin ...............................
Bảng 3.30. Độ tan trung bình (µg/ml) của quercetin ngun liệu và quercetin trong
phytosome ở các môi trường khác nhau ...................................................................
Bảng 3.31. Hệ số phân bố log D của quercetin và phytosome quercetin .................
Bảng 3.32. Khả năng giải phóng qua màng của phytosome quercetin và quercetin
2

dihydrat (µg/cm ) ......................................................................................................
Bảng 3.33. Độ hịa tan của phytosome quercetin và quercetin dihydrat (µg/ml) .....
Bảng 3.34. Kết quả phân tích phổ DSC của các mẫu nghiên cứu ............................
+

Bảng 3.35. Số sóng gốc -OH trong phân tử quercetin, gốc N (CH3)3, (RO)2PO2
trong phân tử HSPC của các mẫu .............................................................................
1

Bảng 3.36. Các thông số H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của quercetin ................
1

Bảng 3.37. Các thông số H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của HSPC .....................
13

Bảng 3.38. Các thông số C-NMR (125 MHz, DMSO - d6) của quercetin dạng tự
do và quercetin dạng phytosome ...............................................................................
Bảng 3.39. Các thông số MS của quercetin, HSPC và phytosome quercetin .........


Bảng 3.40. Kết quả đánh giá đặc tính phytosome quercetin bào chế và đề xuất tiêu
chuẩn chất lượng................................................................................................... 100
Bảng 3.41. Một số đặc tính của bột phytosome quercetin khi bảo quản ở các điều
kiện khác nhau trong thời gian 6 tháng.................................................................. 101
Bảng 3.42. Độ hòa tan của bột phytosome quercetin sau 6 tháng bảo quản ở điều
kiện thực và lão hóa cấp tốc.................................................................................. 102
Bảng 3.43. Khả năng trung hịa gốc tự do DPPH của các mẫu.............................. 104
Bảng 3.44. Khối lượng chuột trước và sau khi thí nghiệm.................................... 105
Bảng 3.45. Sự thay đổi nồng độ AST và ALT trong huyết thanh chuột BALB/c bị
nhiễm độc CCl4..................................................................................................... 106
Bảng 3.46. Sự thay đổi hàm lượng GSH và MDA trong gan chuột BALB/c bị nhiễm
độc CCl4................................................................................................................ 108
Bảng 3.47. Khối lượng gan tương đối của chuột ở các lơ thí nghiệm....................110
Bảng 3.48. Một số đặc tính của bột phytosome quercetin.....................................111
Bảng 3.49. Thành phần cơng thức bào chế cốm chứa phytosome quercetin..........111
Bảng 3.50. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của cốm phytosome quercetin....111
Bảng 3.51. Thành phần công thức bào chế viên nang chứa phytosome quercetin khi
thay đổi tỷ lệ lactose.............................................................................................. 113

Bảng 3.52. Khả năng giải phóng quercetin từ viên nang phytosome quercetin khi
thay đổi tỷ lệ lactose.............................................................................................. 113
Bảng 3.53. Thành phần công thức bào chế viên nang chứa phytosome quercetin khi
thay đổi tỷ lệ natri starch glycolat.......................................................................... 114
Bảng 3.54. Khả năng giải phóng quercetin từ viên nang phytosome quercetin khi
thay đổi tỷ lệ natri starch glycolat.......................................................................... 114
Bảng 3.55. Sự thay đổi tỷ lệ rã trong : rã ngồi trong cơng thức CT9...................115
Bảng 3.56. Khả năng giải phóng quercetin từ viên nang phytosome quercetin khi
thay đổi tỷ lệ rã trong : rã ngoài............................................................................. 115
Bảng 3.57. Thành phần công thức bào chế viên nang chứa phytosome quercetin khi
thay đổi tỷ lệ Tween 80.......................................................................................... 116
Bảng 3.58. Khả năng giải phóng quercetin từ viên nang phytosome quercetin khi
thay đổi tỷ lệ Tween 80.......................................................................................... 116
Bảng 3.59. Thành phần viên nang phytosome quercetin.......................................117
Bảng 3.60. Kết quả đánh giá đặc tính viên nang chứa phytosome quercetin và đề
xuất tiêu chuẩn chất lượng..................................................................................... 118


Bảng 3.61. Khối lượng chuột trước và sau khi thí nghiệm.................................... 118
Bảng 3.62. Sự thay đổi nồng độ AST, ALT trong huyết thanh chuột và hàm lượng
MDA trong gan chuột BALB/c bị nhiễm độc CCl4................................................ 119
Bảng 3.63. Phần trăm quercetin còn lại của các mẫu viên nang được bảo quản ở
điều kiện lão hóa cấp tốc....................................................................................... 120
Bảng 3.64. Phần trăm quercetin còn lại của các mẫu viên nang được bảo quản ở
điều kiện thực........................................................................................................ 120
Bảng 3.65. Độ hòa tan của các mẫu viên nang được bảo quản ở điều kiện lão hóa
cấp tốc................................................................................................................... 121
Bảng 3.66. Độ hịa tan của các mẫu viên nang được bảo quản ở điều kiện thực. . .121

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của quercetin.................................................................. 3
Hình 1.2. Các vị trí của quercetin có thể liên kết với các ion kim loại......................6
Hình 1.3. Hình minh họa q trình hấp thu và chuyển hóa của quercetin.................8
Hình 1.4. Cấu trúc của phytosome.......................................................................... 11
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của phopsholipid.......................................................... 11
Hình 1.6. Cấu trúc phân tử của phosphatidyl cholin................................................ 12
Hình 1.7. So sánh cấu trúc của phytosome và liposome.......................................... 13
Hình 1.8. Hình ảnh SEM của phytosome (tỷ lệ quercetin:PC:cholesterol 1:2:0,2)..20
Hình 1.9. Đồ thị phân tích nhiệt vi sai của quercetin (A), phosphatidyl cholin (B),
cholesterol (C) và phytosome quercetin tỷ lệ quercetin:PC:cholesterol là 1:2:0,2 (D)
................................................................................................................................ 23
Hình 1.10. Giản đồ nhiễu xạ tia X của naringenin, phosphatidyl cholin, và
phytosome naringenin tỷ lệ 1:1............................................................................... 24
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế phytosome quercetin theo phương pháp (a) bốc
hơi dung mơi và (b) kết tủa trong dung mơi............................................................ 35
Hình 2.2. Sơ đồ các giai đoạn bào chế viên nang phytosome quercetin..................36
Hình 2.3. Quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vivo
theo mơ hình gây độc tính gan bằng carbon tetraclorid........................................... 52
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic với nồng độ của dung
dịch quercetin trong methanol................................................................................. 56
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ hấp thụ quang (D) với nồng độ (C)
của dung dịch quercetin trong ethanol tuyệt đối...................................................... 59
Hình 3.3. Giản đồ nhiễu xạ tia X của phần dịch phía trên và phần lắng dưới đáy sau
khi siêu âm 10 phút trong dung môi ethyl acetat..................................................... 64
Hình 3.4. Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa và độ tan trong nước của phytosome
quercetin bào chế theo các phương pháp khác nhau................................................ 66
Hình 3.5. Ảnh hưởng của phương pháp bào chế phytosome đến kích thước và phân
bố kích thước tiểu phân........................................................................................... 67
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ quercetin : HSPC đến hiệu suất và độ tan trong nước

của phytosome quercetin......................................................................................... 72
Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ quercetin : HSPC : cholesterol đến kích thước tiểu
phân và hiệu suất phytosome hóa............................................................................ 73


Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ tan trong nước của phytosome
quercetin.................................................................................................................. 75
Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa
.........................................................................................................................................76

Hình 3.10. Giản đồ phân tích nhiệt vi sai của HSPC............................................... 77
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt phối hợp quercetin với HSPC đến kích thước và
phân bố kích thước tiểu phân.................................................................................. 78
Hình 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ quay của bình cất quay đến kích thước tiểu phân
và hiệu suất phytosome hóa..................................................................................... 79
Hình 3.13. Sơ đồ quy trình bào chế phytosome quercetin quy mơ 500 g/mẻ..........81
Hình 3.14. Hình ảnh chụp SEM của quercetin và phytosome quercetin..................82
Hình 3.15. Độ tan của quercetin dihydrat và phytosome quercetin trong các môi
trường có pH khác nhau.......................................................................................... 83
Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn khả năng giải phóng qua màng của phytosome quercetin
và quercetin dihydrat............................................................................................... 85
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn độ hịa tan của phytosome quercetin và quercetin
dihydrat................................................................................................................... 86
Hình 3.18. Giản đồ nhiễu xạ tia X của HSPC, quercetin dihydrat, hỗn hợp vật lý và
phytosome quercetin............................................................................................... 87
Hình 3.19. Giản đồ nhiệt quét vi sai của phytosome quercetin, hỗn hợp vật lý,
quercetin dihydrat, cholesterol và HSPC................................................................. 88
Hình 3.20. Phổ IR của phytosome quercetin, hỗn hợp vật lý, quercetin dihydrat,
cholesterol và HSPC............................................................................................... 91
1

Hình 3.21. Phổ H-NMR của (a) HSPC, (b) quercetin và (c) phytosome quercetin .. 95
13

Hình 3.22. Phổ C-NMR của (a) quercetin và (b) phytosome quercetin................97
Hình 3.23. Các pic m/z trên phổ MS của HSPC (a), quercetin (b), phytosome
quercetin (c, d, e)..................................................................................................... 99
Hình 3.24. Hình ảnh SEM của phytosome quercetin sau thời gian bảo quản ở điều
kiện dài hạn........................................................................................................... 103
Hình 3.25. Giản đồ nhiễu xạ tia X của phytosome quercetin sau 6 tháng bảo quản .. 103

Hình 3.26. Nồng độ AST và ALT trong huyết thanh chuột ở các lơ thử nghiệm. . .107
Hình 3.27. Hàm lượng GSH và MDA trong gan chuột ở các lơ thử nghiệm.........109
Hình 3.28. Khối lượng gan tương đối của chuột ở các lơ thí nghiệm....................110
Hình 3.29. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) quercetin giải phóng từ cốm và viên nang chứa
phytosome quercetin.............................................................................................. 113


Hình 3.30. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) quercetin giải phóng từ viên nang khi thay đổi
tỷ lệ lactose............................................................................................................ 114
Hình 3.31. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) quercetin giải phóng từ viên nang khi thay đổi
tỷ lệ natri starch glycolat....................................................................................... 115
Hình 3.32. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) quercetin giải phóng từ viên nang khi thay đổi
tỷ lệ rã trong : rã ngồi.......................................................................................... 115
Hình 3.33. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) quercetin giải phóng từ viên nang khi thay đổi
tỷ lệ Tween 80....................................................................................................... 116
Hình 3.34. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ (%) quercetin giải phóng từ các mẫu viên nang 117
Hình 3.35. Nồng độ AST, ALT trong huyết thanh chuột và hàm lượng MDA trong
gan chuột ở các lô thử nghiệm.................................................................................................... 119

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tìm kiếm và sử dụng các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học là một
trong những xu hướng phát triển của ngành Dược hiện nay. Theo thống kê mới nhất
ở các nước phát triển, hơn một nửa số chế phẩm lưu hành trên thị trường có nguồn

gốc từ dược liệu [25]. Sự gia tăng này xuất phát từ sự nâng cao nhận thức về vai trò
của hoạt chất có nguồn gốc từ dược liệu trong việc hỗ trợ nâng cao sức khỏe hay hỗ
trợ điều trị các bệnh mạn tính, bệnh thơng thường.
Quercetin là một flavonoid tự nhiên được chứng minh có nhiều tác dụng sinh
học khác nhau như chống viêm, chống dị ứng, ngăn ngừa hình thành khối u… Đặc
biệt, hoạt chất này cịn được biết đến với khả năng chống oxy hóa mạnh ngay cả ở
nồng độ thấp [54]. Tuy nhiên, do những đặc tính bất lợi xuất phát từ tính chất của
hoạt chất này, hầu như khơng tan trong nước, bị chuyển hóa, thải trừ nhanh khi dùng
đường uống, đã hạn chế khả năng ứng dụng quercetin trên lâm sàng [32], [47].
Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã đề cập đến một số biện pháp cải
thiện sinh khả dụng của quercetin dùng đường uống bao gồm hệ tiểu phân nano
lipid rắn [76], hệ tiểu phân nano polyme [135]... Trong số các biện pháp trên, bào
chế hoạt chất dưới dạng tạo phức hợp với phospholipid (phytosome) được xem là
một hướng nghiên cứu bào chế hiện đại, có hiệu quả trong việc nâng cao sinh khả
dụng đường uống của quercetin. Trong phytosome, hoạt chất sẽ liên kết với
phospholipid (PL) thông thường là phosphatidyl cholin (PC) tạo thành cấu trúc tiểu
phân hình cầu có tính chất lưỡng tính, qua đó vừa cải thiện độ tan của hoạt chất
trong dịch ruột vừa tăng vận chuyển hoạt chất qua lớp màng lipid kép. Mặt khác,
phytosome được hấp thu theo cơ chế chủ động nhờ tế bào M ở ruột non vào tuần
hoàn chung qua hệ lympho, qua đó giảm chuyển hóa bước 1 qua gan và tăng sinh
khả dụng của quercetin [78]. Hoạt chất sau khi bào chế dưới dạng phytosome có thể
dễ dàng ứng dụng vào các dạng viên như viên nén, viên nang... với quy trình bào
chế đơn giản, khơng địi hỏi cơng nghệ cao và thiết bị đặc biệt.
Tại Việt Nam, các chế phẩm chứa hoạt chất bào chế dưới dạng phytosome

mới bắt đầu được đưa vào nghiên cứu và sản xuất, nguồn nguyên liệu phytosome
chủ yếu là nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Do đó, việc tiến hành nghiên

1


cứu bào chế phytosome quercetin là cần thiết, góp phần phát triển công nghệ
phytosome trong bào chế thuốc.
Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế phytosome
quercetin ứng dụng vào viên nang cứng” được thực hiện với các mục tiêu chính
như sau:
1. Xây dựng được cơng thức và quy trình bào chế phytosome quercetin.
2. Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hoá in vitro và tác dụng bảo vệ gan

in vivo của phytosome quercetin.
3. Xây dựng được cơng thức và quy trình bào chế viên nang cứng chứa

phytosome quercetin.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Quercetin
1.1.1. Nguồn gốc
Quercetin là một trong những flavonoid bền vững với nhiều hoạt tính sinh
học khác nhau, thuộc nhóm flavonol, có màu vàng.
-

Quercetin có nhiều trong táo, nho, hành tây, tỏi, rượu vang đỏ... Trong các

nguồn thực vật này, quercetin thường tồn tại ở dạng liên kết với đường (glycosid) ít
khi gặp dưới dạng tự do (aglycon) [98].
-

Ở nước ta và một số nước châu Á khác, quercetin được thu nhận chủ yếu từ
rutin trong nụ hoa khơ của cây hịe (Sophora japonica L.) bằng phương pháp thủy
phân [4]. Ngoài ra, hoạt chất này cũng được tách chiết từ một số dược liệu khác như
củ hành tím (Allium cepa L.), cây diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.)...
-

Quercetin sử dụng trong các nghiên cứu thường ở dạng quercetin dihydrat
[17], [100], [138].
-

1.1.2. Cơng thức hóa học

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của quercetin [124]
- Tên IUPAC: 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4one.
-

Cơng thức phân tử: C15H10O7.

-

Khối lượng mol phân tử: 302,23 đvC [124].
Xét trên phương diện hóa học, quercetin có cấu tạo khung kiểu C 6 - C3 - C6

-

hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một

mạch 3 carbon. Một phân tử quercetin có 5 nhóm hydroxyl (ở các vị trí 3, 3’, 4’, 5
và 7) do đó quercetin là một trong những hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa
mạnh nhất trong nhóm flavonoid [114]. Phần lớn flavonoid là các dẫn chất có gốc
phenyl vì vậy về bản chất quercetin là polyphenol có tính acid yếu.

3


1.1.3. Tính chất lý hóa
 Đặc tính lý học:

Cảm quan: Tinh thể hình kim màu vàng nhạt. Bình thường tồn tại ở dạng

-

o

dihydrat, trở nên khan ở 95 - 97 C.
o

Nhiệt độ nóng chảy: 316,5 C [73].
Trong bảng phân loại sinh dược học bào chế (BCS), quercetin thuộc phân

-

-4

nhóm II vì hoạt chất có tính thấm tốt với hệ số thấm là (7,30 ± 1,95) x 10 cm/s
o

nhưng ít tan [79]. Ở nhiệt độ 25 C, độ tan của quercetin trong mơi trường nước
khoảng 1 µg/ml; trong dịch dạ dày nhân tạo là 5,5 µg/ml, trong dịch ruột nhân tạo là
28,9 µg/ml; trong ethanol khoảng 2 mg/ml và trong DMSO là 30 mg/ml [18]. Độ
o

tan của quercetin phụ thuộc vào nhiệt độ và pH. Khi nhiệt độ tăng từ 25 C đến
o

140 C, độ tan trong nước của quercetin tăng từ 0,00163 mg/ml lên 1,49 mg/ml
[121]. Sự gia tăng độ tan quercetin cũng nhận thấy khi pH thay đổi từ 1,2 - 7,4 [69].
- Hệ số phân bố là 1,82 ± 0,32 trong môi trường n-octan/nước [106].
3

Khối lượng riêng (g/cm ): 1,799 [55].
- Một đặc điểm quan trọng của quercetin là có khả năng hấp thụ tia tử ngoại do
hiệu ứng liên hợp tạo ra bởi 2 vòng benzen. Theo USP 41, hoạt chất có cực đại hấp
thụ tại bước sóng 255 nm và 371 nm trong methanol [124].
-

 Đặc tính hóa học:

Quercetin có tính acid yếu. Hằng số phân ly pKa 1 = 7,17 (phenol); pKa2 =
8,26 (phenol); pKa3 = 10,13 (phenol); pKa4 = 12,30 (phenol); pKa5 = 13,11
(phenol) [50].
- Phản ứng của nhóm hydroxyl (-OH) [2]:
+ Phản ứng oxy hóa: Dưới tác dụng của các chất oxy hóa (bạc nitrat, các gốc
tự do,…) hay enzym polyphenoloxydase, quercetin sẽ bị oxy hóa thành các gốc
-

.

ArO . Các gốc này có thể dimer hóa hay phản ứng oxy hóa với các gốc tự do khác
tạo thành liên kết mới C - C, C - O hoặc O - O.
Phản ứng của vòng thơm: Phản ứng thế dễ hơn benzen; phản ứng diazo và
azo hóa được sử dụng để phát hiện quercetin trên sắc ký đồ. Thuốc thử thường là
những amin thơm [2].
- Phản ứng của nhóm carbonyl [2]:
-

+ Phản ứng Shinoda (hay cyanidin): Đây là phản ứng khử, có sự tham gia

của kim loại như sắt, kẽm, magnesi trong môi trường HCl. Phản ứng này đặc trưng
cho các flavonoid có nhóm carbonyl ở vị trí C4 và có nối đơi giữa C2 = C3 điển
hình là flavonol (quercetin).
4


+ Phản ứng tạo phức với kim loại: Khả năng tạo chelat với kim loại nặng là

một trong những tính chất quan trọng, liên quan đến hoạt tính sinh học của
quercetin. Do có nhóm chức carbonyl ở vị trí C4 và hydroxy ở vị trí C3 - C5 nên
quercetin dễ tạo phức với kim loại (hình 1.2).
1.1.4. Độ ổn định
Độ ổn định của các flavonoid phụ thuộc vào cấu trúc hóa học. Thơng thường,
hợp chất nào có số nhóm -OH phenol càng nhiều thì càng kém ổn định. Tuy nhiên,
cấu trúc của quercetin có hơn một vịng benzen, do đó độ ổn định của hoạt chất
khơng phụ thuộc hồn tồn vào số nhóm -OH phenol.
-

Tại pH kiềm, quercetin kém ổn định. Sản phẩm trung gian của quá trình phân

hủy này là 2,4,6-trihydroxymandelat và 2,4,6-trihydroxyphenylglyoxylat [39].
-

Quercetin dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao. Số phân tử nước cũng có ảnh hưởng
đến sự nhạy cảm của quercetin với nhiệt độ, trong đó quercetin dihydrat thể hiện
tính ổn định nhất [30].
1.1.5. Các phương pháp định lượng quercetin
Dược điển Mỹ USP 41 [124] sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao để định lượng quercetin. Pha động là hỗn hợp methanol, nước và acid
phosphoric với tỷ lệ 100:100:1. Điều kiện sắc ký: Cột C18 (4,6 x 250 mm; đường
kính hạt 5,0 µm); tốc độ dịng 1 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 20 µl và detector UV với
bước sóng 370 nm. Mẫu thử và mẫu chuẩn được pha trong hỗn hợp methanol nước. Dựa vào đáp ứng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn để xác định lại hàm lượng
quercetin trong nguyên liệu. Một số nghiên cứu trong nước lựa chọn pha động là
hỗn hợp methanol - acetonitril - đệm phosphat 0,01 M pH 3 tỷ lệ 30:60:10. Điều
kiện sắc ký có một số sự thay đổi so với USP 41: Thể tích tiêm 10 µl; tốc độ dịng
0,6 ml/phút [10]. Ưu điểm của phương pháp HPLC là có độ nhạy cao, khoảng tuyến
tính rộng với độ lặp lại tốt. Ngồi ra, q trình định lượng có thể tiến hành trên
nhiều mẫu trong thời gian ngắn và các mẫu có thể ở nồng độ thấp. Tuy nhiên, quy
trình chuẩn bị mẫu, chạy sắc ký phức tạp và sử dụng nhiều dung môi hữu cơ. Vì
vậy, trong một số trường hợp khơng u cầu phương pháp định lượng có độ chính
xác q cao như trong phép thử độ hịa tan, có thể sử dụng phương pháp đo phổ tử
ngoại để định lượng quercetin ở bước sóng 370 nm [69], bước sóng 374 nm [73].
-

1.1.6. Tác dụng dược lý
- Tác dụng chống oxy hóa: Các gốc tự do có thể được tạo ra từ các hợp chất có
tính oxy hóa mạnh mang gốc kim loại (Fe) hay các hợp chất hữu cơ chứa các gốc
như nitrit (NO), carboxyl (O C=O), carbonyl ( C=O)…, dưới tác dụng của các tác
5

nhân gây oxy hóa như oxy phân tử (O2), tia cực tím (UV), phóng xạ, các chất xúc
tác (enzym)... Các chất mang gốc tự do sinh ra nhiều là nguyên nhân gây tăng sự lão
hóa, đột biến, bất thường sinh tế bào (ung thư) và các tác hại cho hoạt động sinh lý
(như sinh hóa máu, rối loạn tiêu hóa, gan thận…). Quercetin là hoạt chất có khả
năng chống lại các q trình oxy hóa có hại, hoạt tính này có thể được giải thích dựa
vào đặc điểm cấu trúc phân tử [54], [114]:
+ Trong phân tử quercetin, các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vịng
thơm có khả năng nhường hydro giúp hoạt chất có thể tham gia vào các phản ứng
.

oxy hóa khử, bắt giữ các gốc tự do (ví dụ: gốc peroxyl ROO ).
.

ROO + ArOH → ROOH + ArO

.

.

Gốc phenoxyl (ArO ) có thể nhường một nguyên tử hydro thành quinon hoặc
phản ứng với các gốc tự do, các gốc phenoxyl khác tạo thành chất ổn định hơn.
+ Chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C = C, C = O) tạo nên hệ

liên hợp giúp hoạt chất có thể bắt giữ, làm bền hóa các phần tử oxy hoạt động và
các gốc tự do.
+ Quercetin có thể phản ứng với ion kim loại để hình thành phức chelat, do
đó làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxy hoạt động. Về mặt lý thuyết, khả
năng trung hòa gốc tự do DPPH của quercetin tăng khi có sự hiện diện của ion Cu
3+

và Cr . Tuy nhiên, ion Sn

2+

và Cd

2+

2+

làm giảm hoạt tính của quercetin [141].

3M

n+

Hình 1.2. Các vị trí của quercetin có thể liên kết với các ion kim loại [147]
- Ức chế quá trình sinh tổng hợp chất màu melanin trên da thông qua việc ức
chế hoạt động của enzym tyrosinase [79].
- Giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch: Quercetin tác động lên gốc peroxyl

nên ức chế sự hình thành của hydroperoxyd, đồng thời tác động lên gốc alkoxyl nên
ngăn chặn sự oxy hóa của LDL - cholesterol [73].
- Chống dị ứng bằng cách ổn định màng tế bào của dưỡng bào [98].
Chống viêm: Quercetin ức chế hoạt động của cyclo - oxygenase và lipo –
oxygenase do đó hạn chế sự hình thành các tác nhân gây viêm [98].
-

Giảm một số triệu chứng của bệnh gút: Quercetin ức chế hoạt động của

xanthin oxidase, enzym có vai trị xúc tác phản ứng oxy hóa xanthin thành acid uric,
kết quả làm giảm lượng uric máu [47].
-

6


1.1.7. Dược động học
- Hấp thu: Sau khi uống chế phẩm có chứa quercetin, tại khoang miệng,
quercetin có thể tương tác với protein trong nước bọt hình thành dạng quercetin protein. Nhưng phức hợp này hầu như khơng có ảnh hưởng đến sự hấp thu của hoạt
chất trong cơ thể [32]. Tiếp theo, hoạt chất sẽ đi xuống theo thực quản tới dạ dày do
áp lực nhu động. Trong môi trường acid của dịch vị, một phần quercetin (khoảng 7
%) bị phân hủy thành acid phenolic (ví dụ acid protocatechuic). Các acid phenolic
này có thể được hấp thu tại dạ dày [29]. Quercetin được hấp thu chủ yếu qua niêm
mạc ruột non, với mức độ hấp thu thấp do hoạt chất ít tan trong nước. Theo nghiên
cứu của Yousry E. S. và cộng sự, nồng độ tối đa quercetin trong huyết tương chuột
sau khi uống liều 50 mg/kg là 2,01 µmol/lit, chứng tỏ sinh khả dụng (SKD) đường
uống của hỗn dịch quercetin chỉ khoảng 16% [145]. Tương tự, sau khi cho lợn uống
mức liều như trên, sinh khả dụng đường uống của quercetin khoảng 17 % [20].
Trong khi người tình nguyện khỏe mạnh (chỉ số khối cơ thể dao động trong khoảng
18,5 - 27) uống liều đơn 500 mg quercetin, nồng độ trong huyết tương rất thấp, chỉ
khoảng 10,93 ± 2,22 ng/ml [102]. Tại ruột non còn xảy ra quá trình glucuronid hóa
và methyl hóa quercetin thơng qua sự hoạt động hiệu quả của các enzym uridin
diphosphat glucuronosyltransferase (UGT) và catechol-O-methyltransferase. Ngồi
sự biến đổi sinh học tại ruột, q trình chuyển hóa quercetin cịn diễn ra ở gan.
Quercetin và các chất chuyển hóa của quercetin di chuyển theo tĩnh mạch cửa tới
gan. Tại gan, quercetin tiếp tục bị chuyển hóa bao gồm các phản ứng liên hợp với
acid glucuronid, sulfat và phản ứng O-methyl hóa [112]. Sau đó, quercetin dạng tự
do và các chất chuyển hóa của quercetin được đưa tới hệ tuần hồn thơng qua tĩnh
mạch cửa gan [88].

Phân bố: Sau khi được hấp thu ở ruột non, quercetin được phân bố đến khắp
các mô trong cơ thể. Quercetin có khả năng liên kết mạnh với albumin trong huyết
tương (98 %) [32]. Trên lý thuyết, hoạt chất gắn kết với protein thì khơng có tác
dụng (phân tử lớn khơng đi qua được thành mao mạch đến các tổ chức), chỉ có phần
hoạt chất ở dạng tự do mới cho tác dụng. Những yếu tố này lý giải một phần nào đó
sự khác biệt về tác dụng sinh học của quercetin trong thử nghiệm in vitro và in vivo.
-

- Chuyển hóa: Quercetin khơng tồn tại ở dạng tự do trong máu, mà chủ yếu được tìm
thấy dưới dạng các sản phẩm liên hợp với acid glucuronic, nhóm sulfat hoặc nhóm methyl (78
- 79 %), 10 - 13 % ở dạng tamarixetin (4′‐O‐methyl‐ quercetin) và 3′‐O‐methyl‐quercetin
chiếm tỷ lệ từ 8,5 % đến 11 % [129]. Các chất này đều có hoạt tính chống oxy hóa, tuy nhiên
phân cực hơn quercetin nên được bài tiết nhanh chóng [112].

7