Qui trinh dinh luong tong coliform

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Khoa cơng nghệ thưc phẩm

QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG COLIFORMS


ĐẶC ĐIỂM COLIFOMRS

•
•
•
•
•
•

Là trực khuẩn gram âm khơng sinh bào tử.
Hiếu khí hoặc kị khí tùy ý
o
Có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37 C trong 24-48 giờ
o
Nhiệt độ phát triển: (-)2- 50 C
pH:4,4-9,0
Nhiễm trong nước hoặc thực phẩm

Coliforms được xem là nhóm vsv chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các mẫu
môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các loại vsv khác.


Coliforms gồm 4 nhóm :

echerichia

enterobacter

coliforms

klebsiella

citrobacter


ĐỊNH NGHĨA COLIFORMS

E.Coli

Coliform
phân

Coliforms phân + IMViC

Coliform
chịu nhiệt

Coliform
tổng số


Môi trường và thiết bị
VRB ( Violet Red Bile Agar)
Cao nấm men

3g

Peptone hay gelysate

7g

NaCl

5g

Muối mật

1,5g

Lactose

10g

Neutral red

0,03g

Crystral violet

0,002g

Agar

15g

Nước cất

1 lít

Hịa tan các thành phần trong nước đ/c pH 7,4 ± 0,2. Đun sôi trong 2p, Không hấp khử trùng, làm MT đổ đĩa.


BGBL ( Brilliant Green Bile Lactose Broth )

Peptone

10g

Lactose

10g

Mật bò

20g

Brilliant green

0,0133g

Nước cất

1 lít

Hịa tan pepton và lactose vào trong 500ml nước cất, mật bò trong khoảng 200kl và brilliant green trong khoảng 100ml nước mất.
Trộn đều 3 dd đạt V cuối là 1lit1, chỉnh pH MT khoảng 7,4. Rót vào mỗi ống nghiệm chứa ống Durham 10ml MT BGBL. Hấp ở
110 oC trong 15p, pH 7,2 ± 0,2 ở 25 oC.

0
- Tủ ấm 37±1 C


ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIẾM KHUẨN LẠC

NGUYÊN TẮC



Dựa vào sự lên lên men đường lactose ở môi trường thích hợp (thạch Violet red bile)  ở
0
37 C trong 24 giờ. Sau đó được khẳng định lại trong mơi trường canh Brilliant Green
0
Bile Salt. Coliforms sẽ sinh khí trong mơi trường này ở 37 C trong 24 giờ.


PHÂN TÍCH





Sử dụng phương pháp đỗ đĩa



Ủ 370C, 24h

Thể tích mẫu sử dụng: 1 ml
Đổ môi trường VRB 10 – 15ml, để đơng.

Đọc kết quả

Đếm các đĩa có khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc màu đỏ đến
đỏ đậm, đường kính > 0,5 mm, có vịng tủa muối mật


KHẲNG ĐỊNH



Cấy riêng ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ của mỗi loại vào các ống nghiệm chứa môi trường
0
canh BGBL có ống Durham, ủ ở 37 C trong 24 giờ. Phản ứng được coi là dương tính khi có
sự tạo khí dù chỉ một trong 5 ống nghiệm trên.

Sử dụng môi trường BGBL
- (+) vi khuẩn tăng trưởng làm đục MT & sinh hơi.


TÍNH KẾT QUẢ

Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng để qui về số coliform trong một g mẫu.

∑C

Coliform tổng số =
(cfu/ml) hay (cfu/g)

Trong đó:
C: tổng số khuẩn lạc điếm được
n1: Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất
n2: Số đĩa được giữ lại ở độ pha lỗng thứ hai
V: thể tích mẫu
d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất

xR
V x (n1 + 0,1 x n2) x d


ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN



Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vsv trong các độ pha loãng
khác nhau của mẫu.




Mỗi độ pha lỗng được ni cấy lặp lại nhiều lần ( 3- 10 lần).



Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê => giá trị ước đốn số lượng vsv
trong mẫu.

Các độ pha lỗng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số
lần âm tính.


 Hệ thống MPN:
Hệ thống 9 ống
Hệ thống 15 ống

 Đặc điểm:
Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như :
Sự tạo hơi : Coliforms
Sự đổi màu : S. aurius
Cho phép định lượng được mật độ vsv thấp trong thể tích mẫu lớn


Hệ thống MPN /g (ml)



MÔI TRƯỜNG


HĨA CHẤT

CỒN 70 Đ
Thiết bị
+ Tủ cấy vơ trùng
+ Nồi hấp
+ Tủ ấm

HCL 10%

+ Máy dập mẫu
+ Máy trộn mẫu
+ Cân kỹ thuật

NAOH 10%


QUY TRÌNH THỰC HIỆN


- Bước 1 : Chuẩn bị
mẫu
Cân 10g mẫu
cho vào túi dập mẫu
( nếu là mẫu rắn) hoặc
10ml mẫu ( mẫu lỏng )
cho vào bình tam giác
chứa 90ml dd SPW đã
vơ trùng , và đồng nhất
mẫu trong 1 phút .


Bước 2 : Chuyển 1ml
dung

dịch

mẫu

pha

loãng ở mỗi nồng độ 101 , 10-2, 10-3 vào ống
nghiệm có chứa 10ml
canh LSB, mỗi nồng độ
có 3 ống lặp lại, mỗi ống
nghiệm
Durham

cho

1

ống


Bước 3 :
+ Sau 48 giờ - các ống
nghiệm được ủ ở 37o C Ghi nhận các ống LSB sinh
hơi và canh trường đục
+ Kết luận các ống LSB
dương tính (+)


Bước 4 : Chuyển 1ml
từ các ống nghiệm
LSB ( + ) ở mỗi nồng
độ

vào

các

ống

nghiệm có chứa 10ml
canh BGLB rồi cũng
ủ 37

O

C , 48 giờ

10 ML BGLB


Bước 5 :
+ Ghi nhận số ống
sinh

hơi

và

canh

trường đục ở mỗi độ
pha loãng

+ Kết luận các ống
BGLB ( + ).


Bước 6 : Tính kết quả

- Từ kết quả thí nghiệm ta có:

•

Nồng

độ

10-1:

có

3

ống

10-2:

có

1

ống

BGLB(+)

•

Nồng

độ

BGLB(+)

•

Nồng độ 10-3 : khơng có ống
nào BGLB(+)

- Tra bảng Mac Crady :

Tra bảng MPN/100ml ta có kết quả : 430
coliform tổng / 100 ml mẫu