Tóm tắt luận án: Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Nguyễn Hồng Trang

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
PHYTOSOME QUERCETIN
ỨNG DỤNG VÀO VIÊN NANG CỨNG

Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế
thuốc Mã số 62720402

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Hà Nội, năm 2020


Cơng trình được hồn thành tại:
Trường Đại học Dược Hà Nội
Trường Đại học Y Dược Huế
Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Vũ Thị Thu Giang
GS.TS. Phạm Thị Minh Huệ

Phản biện 1:………………………………………………
………………………………………………

Phản biện 2:………………………………………………
………………………………………………
Phản biện 3:………………………………………………
………………………………………………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp
tại: ………………………………………
Vào hồi……… giờ …… ngày …… tháng …… năm……

Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội


DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN
ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

1. Nguyễn Hồng Trang, Vũ Thị Thu Hà, Vũ Thị Thu Giang, Phạm Thị
Minh Huệ (2016), “Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằng phương
pháp kết tủa trong dung mơi”, Tạp chí Dược học, 448, tr. 13-17.

2. Nguyễn Hồng Trang, Trịnh Viết Đạt, Vũ Thị Thu Giang, Phạm Thị Minh
Huệ (2018), “Nghiên cứu quy trình bào chế và đánh giá phytosome
quercetin”, Tạp chí Nghiên cứu dược & Thơng tin thuốc, 9, 6, tr. 19-26.


A-GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1.Tính cấp thiết của luận án
Quercetin là một flavonoid tự nhiên được chứng minh có nhiều tác dụng

sinh học khác nhau như chống viêm, chống oxy hóa... Tuy nhiên, do những
đặc tính bất lợi như khơng tan trong nước, bị chuyển hóa, thải trừ nhanh khi
dùng đường uống, đã hạn chế khả năng ứng dụng quercetin trên lâm sàng.
Trong những năm gần đây, bào chế hoạt chất dưới dạng tạo phức hợp
với phospholipid (phytosome) được xem là một hướng nghiên cứu bào chế
hiện đại, có hiệu quả trong việc nâng cao sinh khả dụng đường uống của
quercetin. Trong phytosome, hoạt chất liên kết với phospholipid (PL) thông
thường là phosphatidyl cholin (PC) tạo thành cấu trúc tiểu phân hình cầu có
tính chất lưỡng tính, qua đó vừa cải thiện độ tan của hoạt chất trong dịch
ruột vừa tăng vận chuyển hoạt chất qua lớp màng lipid kép. Mặt khác,
phytosome được hấp thu theo cơ chế chủ động nhờ tế bào M ở ruột non vào
tuần hoàn chung qua hệ lympho, qua đó giảm chuyển hóa bước 1 qua gan
và tăng sinh khả dụng của quercetin [78]. Hoạt chất sau khi bào chế dưới
dạng phytosome có thể dễ dàng ứng dụng vào các dạng viên với quy trình
bào chế đơn giản, khơng địi hỏi cơng nghệ cao và thiết bị đặc biệt.
Tại Việt Nam, các chế phẩm chứa hoạt chất bào chế dưới dạng phytosome
mới bắt đầu được đưa vào nghiên cứu và sản xuất, phytosome chủ yếu là nhập
khẩu từ nước ngồi với giá thành cao. Do đó, việc tiến hành nghiên cứu bào
chế phytosome là cần thiết, góp phần phát triển cơng nghệ phytosome trong
bào chế thuốc. Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế
phytosome quercetin ứng dụng vào viên nang cứng” được thực hiện.
2. Mục tiêu của luận án

1. Xây dựng được cơng thức và quy trình bào chế phytosome quercetin.
2. Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hoá in vitro và tác dụng bảo vệ
gan in vivo của phytosome quercetin.

3. Xây dựng được cơng thức và quy trình bào chế viên nang cứng chứa
4

phytosome quercetin.

5


3. Những đóng góp mới của luận án

- Lần đầu tiên ở Việt Nam, phytosome quercetin đã được nghiên cứu hồn
thiện từ xây dựng cơng thức, quy trình bào chế đến xây dựng tiêu chuẩn
chất lượng và nghiên cứu độ ổn định. Phytosome quercetin bào chế có tỷ lệ
hoạt chất được phytosome hóa trên 90 %, các tiểu phân thu được có kích
thước từ 450 - 500 nm, phân bố kích thước đồng đều với giá trị PDI < 0,4,
ổn định trong 06 tháng theo dõi ở cả điều kiện thực và lão hóa cấp tốc.

- Ứng dụng thành cơng phytosome quercetin bào chế vào dạng thuốc nang
cứng với hàm lượng hoạt chất 50 mg. Viên bào chế có độ hoà tan > 96 %
sau 45 phút và ổn định trong thời gian nghiên cứu (06 tháng ở điều kiện lão
hóa cấp tốc và 12 tháng ở điều kiện thực).

- Đã chứng minh được tác dụng bảo vệ gan của phytosome quercetin và
viên nang chứa phytosome quercetin trên mơ hình chuột bị gây độc bằng
carbon tetraclorid so với quercetin tự do.
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm 4 chương, 66 bảng, 35 hình, 152 tài liệu tham khảo với 16
tài liệu tiếng Việt và 136 tài liệu tiếng Anh, 8 phụ lục. Luận án có 150 trang
gồm các phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); Chương 1. Tổng quan (28
trang); Chương 2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu (24
trang); Chương 3. Kết quả nghiên cứu (67 trang); Chương 4. Bàn luận (28
trang); Kết luận và kiến nghị (1 trang).

B.N ỘI DUNG LUẬN ÁN
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Đã trình bày và tập hợp có hệ thống các nội dung chính liên quan đến
luận án, bao gồm:

- Về hoạt chất: Nguồn gốc, cơng thức hóa học, các tính chất lý hóa và độ
ổn định của quercetin; tác dụng dược lý, dược động học, chỉ định, liều
dùng, tương tác thuốc. Những nội dung trình bày giúp lý giải được nguyên


nhân chính dẫn đến sinh khả dụng đường uống của quercetin thấp. Đã tổng
hợp các cơng trình nghiên cứu trên thế giới đề cập đến các hệ mang thuốc
có khả năng cải thiện sinh khả dụng đường uống của quercetin.


- Phytosome: Khái niệm và thành phần cấu tạo của phytosome; phân biệt
phytosome với liposome; ưu nhược điểm; kỹ thuật bào chế và phương pháp
đánh giá một số đặc tính lý hóa của phytosome; ứng dụng phytosome trong
lĩnh vực dược phẩm. Từ đó, có định hướng cho các nghiên cứu của luận án.

- Một số mơ hình đánh giá tác dụng bảo vệ gan in-vivo: Tổng quan được
các mơ hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về đánh giá tác dụng
bảo vệ gan in-vivo, cách bố trí thí nghiệm và các thông số đánh giá.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
- Chất chuẩn: Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh.
- Nguyên liệu: Quercetin dihydrat đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất.

Phosphatydin cholin đậu nành được hydrogen hóa (HSPC) và cholesterol
của hãng Lipoid - Đức. Nguyên liệu, hóa chất khác đạt tiêu chuẩn dược
điển hoặc tiêu chuẩn nhà sản xuất (tùy theo mục đích sử dụng).
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
Hệ thống cất quay Rovapor R - 210 (Buchi). Hệ thống máy sắc ký lỏng
hiệu năng cao HPLC Aligent 1260. Hệ thống thiết bị Zetasizer NanoZS90
(Malvern). Kính hiển vi điện tử quét FESEM Hitachi S-4800. Máy phân
tích nhiệt vi sai Mettler Toledo AB 204S. Máy thử độ hòa tan Erweka DT700. Các trang thiết bị, dụng cụ khác của phịng thí nghiệm tại trường
Đại học Dược Hà Nội và trường Đại học Y Dược Huế.
2.1.3. Động vật thí nghiệm
Chuột thuần chủng dịng BALB/c khoảng 5 - 6 tuần tuổi có khối lượng
khoảng 20 - 35 g, khoẻ mạnh, khơng phân biệt giống, đạt tiêu chuẩn thí
nghiệm do Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.1.4. Địa điểm thực hiện nghiên cứu
Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội; trường Đại học Y


Dược Huế; viện Hóa học; viện vệ sinh dịch tễ TW và viện Công nghệ sinh
học.


2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp bào chế phytosome quercetin
2.2.1.1. Bào chế phytosome theo phương pháp bốc hơi dung môi
Cân 3,56 g quercetin, PL với tỷ lệ hoạt chất : PL (mol:mol) từ 1:0,5 đến
1:1,5, và các tá dược khác (nếu cần), hòa tan trong 20 ml ethanol tuyệt đối.
Đưa vào bình cầu dung tích 1000 ml của hệ thống cất quay. Cất quay với
tốc độ (50, 100 hoặc 150 vòng/phút) ở nhiệt độ từ 60 đến 80oC. Kết thúc
thời gian phản ứng (khảo sát), hút chân không, điều chỉnh áp suất giảm để

dung môi bay hơi từ từ. Sau 15 phút hút chân không, dung môi bay hơi hết
và màng phim được hình thành thì giảm tốc độ quay xuống 100 vòng/phút.
Tiếp tục cất quay trong 16 giờ để đảm bảo loại hết hồn tồn dung mơi hữu
cơ. Phytosome sau khi tạo thành được hydrat hóa trực tiếp trong bình cất
quay tạo hỗn dịch phytosome thơ. Điều kiện hydrat hóa: 40 ml nước cất,
nhiệt độ 60oC, tốc độ quay 100 vịng/phút, thời gian 1 giờ. Hỗn dịch thơ
được làm giảm kích thước bằng phương pháp siêu âm liên tục trong thời
gian 5 phút với tần số 50 Hz, công suất 60 W, ở nhiệt độ 50 - 60oC. Để thu
được phytosome quercetin dạng bột có hàm ẩm khơng quá 5 %, tiến hành
sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 40oC trong thời gian 24 giờ.
2.2.1.2. Bào chế phytosome theo phương pháp kết tủa trong dung môi
Cân 3,56 g quercetin, PL với tỷ lệ hoạt chất : PL (mol:mol) từ 1:0,5 đến
1:1,5, và các tá dược khác (nếu cần), hòa tan trong 20 ml ethanol tuyệt đối.
Tiến hành khuấy từ ở điều kiện nhiệt độ từ 60 đến 80oC với tốc độ 400
vòng/phút. Kết thúc thời gian phản ứng (khảo sát), nhỏ từ từ n-hexan vào
hỗn hợp phản ứng và kết hợp khuấy trộn ở nhiệt độ phịng. Do thay đổi
dung mơi, phytosome sẽ kết tủa lại tạo hỗn dịch phytosome thô. Nhằm đảm
bảo loại hết dung môi hữu cơ, tiến hành ly tâm ở tốc độ 6000 vịng/phút
trong 3 phút, sau đó sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 45oC, áp suất 0,07 mmHg. Bột phytosome quercetin được lấy ra, thêm nước cất để
nghiền ướt và bổ sung thêm nước vừa đủ 40 ml. Khuấy từ với tốc độ 400
vòng/phút ở nhiệt độ 60oC để phân tán lại phytosome vào nước. Hỗn dịch


thơ được làm giảm kích thước bằng phương pháp siêu âm liên tục trong


thời gian 5 phút với tần số 50 Hz, công suất 60 W, ở nhiệt độ 50 - 60oC. Để
thu được phytosome quercetin dạng bột có hàm ẩm khơng q 5 %, tiến
hành sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 40oC trong thời gian 24 giờ.

2.2.2. Phương pháp bào chế viên nang cứng chứa phytosome quercetin
Viên nang chứa phytosome quercetin được bào chế theo phương pháp
phân liều theo thể tích với hàm lượng quercetin 50 mg. Tá dược trơn là
Aerosil và talc. Ethanol tuyệt đối là dung môi xát hạt.

2.2.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của quercetin và
phytosome quercetin

2.2.3.1. Thẩm định phương pháp định lượng quercetin bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao HPLC và quang phổ hấp thụ UV - Vis

a. Thẩm định phương pháp định lượng quercetin bằng HPLC
Tham khảo USP 41 và các tài liệu nghiên cứu, điều kiện sắc ký nh sau:
Ct Apollo C18 (4,6 ì 250 mm, 5 àm), bo v ct Apollo C18 (4,6 ì 12,5
mm, 5 àm); pha động là hỗn hợp acid phosphoric 0,2 % trong nước và
methanol với tỷ lệ 40:60 về thể tích (v/v); tốc độ dịng là 1 ml/phút; thể tích
tiêm mẫu 20 µl; detector UV, λ = 370 nm.
Thẩm định phương pháp định lượng dựa trên một số chỉ tiêu: Độ đặc hiệu;
tính thích hợp của hệ thống sắc ký; tính tuyến tính; độ chính xác và độ đúng.
b. Thẩm định phương pháp định lượng quercetin bằng UV-Vis
Quét phổ UV - VIS, lựa chọn cực đại hấp thụ và đánh giá ảnh hưởng
của HSPC tới khả năng hấp thụ quang học của quercetin.
Thẩm định phương pháp định lượng dựa trên một số chỉ tiêu: Tính thích
hợp của hệ thống; tính tuyến tính; độ chính xác và độ đúng.

2.2.3.2. Phương pháp đánh giá quercetin
a. Định lượng: Hàm lượng quercetin trong nguyên liệu được xác định bằng
HPLC, với các điều kiện chạy sắc ký đã lựa chọn ở mục 2.2.3.1.a.

b. Độ tan của quercetin trong các môi trường khác nhau được xác định

theo phương pháp lắc ở nhiệt độ 25 ± 0,5oC đến tan bão hòa và định lượng
quercetin bằng phương pháp HPLC.


c. Hệ số phân bố dầu nước của quercetin được đánh giá theo phương pháp
lắc ở nhiệt độ 25 ± 0,5oC trong hai mơi trường n-octanol bão hịa pha nước,
nước bão hòa n-octanol (dung dịch nước ở các pH khác nhau) và định
lượng quercetin bằng phương pháp HPLC.
2.2.3.3. Phương pháp đánh giá phytosome quercetin

a. Hình thái tiểu phân: Sử dụng kính hiển vi điện tử quét SEM.
b. Kích thước tiểu phân (KTTP) và phân bố kích thước tiểu phân được xác
định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động DLS với thiết bị Zetasizer
NanoZS90, cuvet nhựa.

c. Thế Zeta: Tiến hành tương tự như phương pháp xác định kích thước tiểu
phân, nhưng sử dụng cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng.

d. Định lượng quercetin toàn phần trong phytosome bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

e. Hệ số phân bố dầu nước và độ tan của phytosome quercetin trong các
môi trường: Tiến hành tương tự như đối với nguyên liệu quercetin nhưng
thay bằng bột phytosome quercetin với khối lượng tương ứng.

f. Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa được xác định theo phương pháp dùng
dung mơi có tính hịa tan chọn lọc, để tách quercetin dạng tự do hay
quercetin dạng phytosome ra khỏi hỗn hợp phytosome quercetin.

g. Hiệu suất quá trình bào chế được đánh giá bằng tỷ lệ giữa khối lượng

quercetin tương ứng với khối lượng sản phẩm thu được và khối lượng
quercetin ban đầu.

h. Độ hòa tan của phytosome quercetin được xác định với các điều kiện cụ
thể như sau: Cân một lượng chính xác mẫu thử tương đương 50 mg
quercetin, đưa vào cốc thử hòa tan chứa 900 ml dung dịch acid hydrocloric
pH 1,2 có 20 % ethanol, duy trì nhiệt độ mơi trường ở 37,0 ± 0,5oC. Thiết
bị thử kiểu cánh khuấy với tốc độ khuấy là 100 vòng/phút. Tiểu phân chưa
tan được loại bằng phương pháp siêu ly tâm 8000 vòng/phút trong thời gian
3 phút, sử dụng ống ly tâm siêu lọc Amicon 10 kDa. Phần dịch trong được


định lượng quercetin bằng phương pháp HPLC (mục 2.2.3.1.a).


i. Khả năng giải phóng qua màng celulose acetat của phytosome quercetin:
Sử dụng thiết bị đánh giá sự giải phóng thuốc qua màng của hãng Hanson
Research (bình khuếch tán Franz). Mơi trường giải phóng là dung dịch đệm
phosphat pH 6,8. Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút. Nhiệt độ: 37,0 ± 0,5oC.
Định lượng quercetin giải phóng bằng phương pháp HPLC.

j. Khả năng tạo phức giữa quercetin và HSPC: Sử dụng bột phytosome
quercetin đã tinh chế, loại quercetin tự do. Tương tác giữa quercetin và HSPC
được đánh giá thơng qua phân tích IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DSC, X-Ray, MS.

2.2.4. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của viên nang
cứng chứa phytosome quercetin

2.2.4.1. Phương pháp đánh giá cốm phytosome quercetin
a. Kích thước hạt: Sử dụng các rây có kích thước mắt rây 0,5 và 0,8 mm.

b. Mất khối lượng do làm khô được đánh giá bằng phương pháp sấy đến
khối lượng không đổi, theo phụ lục 9.6, Dược điển Việt Nam V.

c. Khả năng trơn chảy của cốm được đánh giá theo phương pháp gõ đến
khi thể tích khơng đổi.

d. Khối lượng riêng biểu kiến
e. Hàm lượng quercetin toàn phần trong cốm chứa phytosome quercetin
được định lượng bằng phương pháp HPLC.

2.2.4.2. Phương pháp đánh giá viên nang cứng chứa phytosome quercetin
a. Hình thức viên: Nang cứng HPMC số 0, thân màu trắng, nắp màu trắng
chứa các hạt cốm màu vàng nhạt, đồng đều, trơn chảy tốt, khơng vón cục.

b. Độ đồng đều khối lượng: Thực hiện theo Dược điển Việt Nam V.
c. Định lượng: Hàm lượng quercetin toàn phần trong viên nang chứa
phytosome quercetin (HLtp) được đánh giá bằng phương pháp HPLC.

d. Độ hòa tan của viên nang chứa phytosome quercetin được tiến hành
trong các điều kiện sau: Thiết bị kiểu giỏ quay; tốc độ giỏ quay 75 ± 2
vịng/phút; mơi trường 900 ml dung dịch HCl pH 1,2 có 0,75 % Tween 80;
nhiệt độ môi trường 37,0 ± 0,5oC. Thời gian thử nghiệm: 45 phút. Tiểu
phân chưa hòa tan được loại bằng phương pháp ly tâm 8000 vòng/phút


trong 3 phút. Định lượng phần dịch trong bằng phương pháp UV-Vis.


2.2.5. Nghiên cứu độ ổn định của bột phytosome quercetin và viên nang
chứa phytosome quercetin

Đánh giá sự thay đổi các chỉ tiêu chất lượng của bột phytosome quercetin
và viên nang chứa phytosome quercetin ở hai điều kiện bảo quản: Điều kiện
thực trong phịng thí nghiệm: Nhiệt độ 15 - 35oC, độ ẩm tương đối 60 - 90
%. Điều kiện lão hóa cấp tốc: Nhiệt độ 40 ± 2oC, độ ẩm tương đối 75 ± 5 %.

2.2.6. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của
phytosome quercetin
Tác dụng chống oxy hóa in vitro của phytosome quercetin được đánh
giá thơng qua khả năng trung hịa gốc tự do sinh ra từ 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl.

2.2.7. Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo
2.2.7.1. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của phytosome quercetin
Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình chuột bị gây độc bằng CCl4.
Thí nghiệm được thực hiện trên 42 con chuột BALB/c, chia ngẫu nhiên
thành 7 lô: Đối chứng sinh lý, đối chứng bệnh lý, đối chứng tham khảo,
mẫu thử (quercetin, phytosome quercetin ở hai mức liều 50 và 100
mg/kgP/ngày). Khả năng bảo vệ gan được đánh giá thông qua các chỉ tiêu:
Hàm lượng amino transferase (AST, ALT) trong huyết thanh chuột; hàm
lượng GSH, MDA trong gan và khối lượng gan chuột.

2.2.7.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo của viên nang chứa
phytosome quercetin
Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình chuột bị gây độc bằng CCl4.
Thí nghiệm được thực hiện trên 18 con chuột BALB/c, chia ngẫu nhiên
thành 3 lô: Đối chứng bệnh lý, mẫu viên nang quercetin, mẫu viên nang
phytosome quercetin. Khả năng bảo vệ gan được đánh giá thông qua các
chỉ tiêu: Hàm lượng amino transferase (AST, ALT) trong huyết thanh
chuột; hàm lượng MDA trong gan chuột.
2.2.8. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu

- So sánh hai đồ thị giải phóng hoạt chất in-vitro: Sử dụng chỉ số f2.


- Dựng phổ DSC, IR: Sử dụng phần mềm Origin Pro 9.0.


- Xử lý và biểu thị các kết quả nghiên cứu: Các số liệu được biểu diễn
dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn với n là số lần lặp lại thí
nghiệm.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Xây dựng/thẩm định một số phương pháp đánh giá
3.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký đã lựa chọn đạt yêu cầu
về thẩm định. Phương pháp đặc hiệu với thời gian lưu của quercetin là 7,3
phút; tính thích hợp của hệ thống sắc ký, độ chính xác và độ đúng cao với
RSD < 5 %. Có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
quercetin trong khoảng khảo sát (5 µg/ml đến 35 µg/ml) với R2 = 0,9995.

3.1.2. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-Vis
So sánh phổ UV-Vis của quercetin với phổ UV-Vis của HSPC và
phytosome quercetin nhận thấy khi hình thành phytosome, HSPC khơng
làm thay đổi tính chất hấp thụ quang học của quercetin. Do đó, có thể định
lượng quercetin trong phytosome bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ
UV-Vis mà không cần chất chuẩn phytosome quercetin hoặc phải phân hủy
phytosome giải phóng quercetin tự do. Đồng thời, thơng qua đánh giá các
tiêu chí khác như tính thích hợp của hệ thống, tính tuyến tính, độ chính xác
và độ đúng, có thể kết luận phương pháp UV-Vis đạt yêu cầu về thẩm định
và có thể sử dụng trong phân tích hàm lượng quercetin.
3.1.3. Phương pháp xác định tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa

Tiến hành khảo sát độ tan của quercetin và phytosome quercetin trong
các dung mơi nhận thấy cloroform là dung mơi hịa tan chọn lọc phytosome
và ethyl acetat là dung mơi hịa tan chọn lọc quercetin dạng tự do.
Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu ở bảng 3.10 cho thấy phytosome quercetin
không bền trong dung môi chloroform, bị phân hủy thành quercetin tự do và
phospholipid khiến dung dịch trở nên đục dần theo thời gian. Trong khi với
dung môi ethyl acetat, tỷ lệ hoạt chất được phytosome hóa ở các thời điểm
khác nhau khơng có sự sai khác thống kê (p > 0,01). Vì vậy, nghiên cứu lựa


chọn ethyl acetat làm dung môi tách riêng quercetin tự do trong đánh giá tỷ
lệ hoạt chất phytosome hóa.


Bảng 3.10. Kết quả đánh giá tỷ lệ hoạt chất quercetin phytosome hóa
khi sử dụng các dung mơi khác nhau theo thời gian (n = 3)
Dung môi cloroform
Thời điểm (phút)
EE (%)
10
69,28 ± 0,44
30
47,59 ± 0,65
60
23,08 ± 1,06

Dung môi ethyl acetat
Thời điểm (phút)
EE (%)
10

97,53 ± 0,15
30
97,59 ± 0,20
60
97,48 ± 0,14

Trong quá trình xử lý mẫu, thời gian siêu âm 10 phút được lựa chọn do
nồng độ quercetin tự do trong ethyl acetat tại thời điểm này (13,213 mg/ml)
khơng có sự sai khác thống kê (p > 0,01) so với thời các thời gian siêu âm
20 và 30 phút (13,592 mg/ml và 13,631 mg/ml), và nồng độ phytosome hịa
tan trong dung mơi sau 10 phút siêu âm là nhỏ nhất (0,104 mg/ml so với
0,135 mg/ml và 0,137 mg/ml).
Từ những kết quả khảo sát ở trên, quy trình xử lý mẫu phytosome
quercetin để xác định tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa được tiến hành như sau:
Cân lượng bột phytosome tương ứng với khoảng 0,1 g quercetin vào bình
định mức 20 ml. Thêm ethyl acetat đến vạch, lắc đều, sau đó siêu âm trong
bể siêu âm trong 10 phút và duy trì nhiệt độ 25oC. Sau đó, bổ sung ethyl
acetat đến vạch, lắc đều rồi lọc qua màng 0,2 µm để loại phần khơng tan,
thu lấy dịch lọc. Hút chính xác 1 ml dịch lọc vào cốc có mỏ. Bốc hơi dung
mơi trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 40oC trong thời gian 1 giờ. Tiếp
theo, hòa tan lại cắn trong methanol, pha lỗng đến nồng độ thích hợp và
tiến hành định lượng quercetin bằng phương pháp HPLC.
3.2. Xây dựng công thức và quy trình bào chế phytosome quercetin

3.2.1. Nghiên cứu bào chế phytosome quercetin
3.2.1.1. Lựa chọn phương pháp bào chế
Tiến hành bào chế 40 ml hỗn dịch phytosome theo hai phương pháp:
Bốc hơi dung môi (mục 2.2.1.1) và kết tủa trong dung môi (mục 2.2.1.2),
với công thức và thông số kỹ thuật chung như sau: Tỷ lệ quercetin : HSPC
là 1:1 (mol:mol); thời gian phản ứng là 16 giờ và nhiệt độ phản ứng là

80oC. Kết quả đánh giá đặc tính của hỗn dịch phytosome thu được như sau:


Bảng 3.16. Một số đặc tính của hỗn dịch phytosome quercetin
bào chế theo các phương pháp khác nhau (n = 3)
KTTP
(nm)
Bốc hơi dung môi
347,6 ± 3,5
Kết tủa trong dung môi 203,5 ± 8,7
Phƣơng pháp bào chế

PDI
0,303 ± 0,015
0,239 ± 0,024

Thế Zeta
(mV)
-22,1 ± 0,3
-33,5 ± 0,6

Hàm lƣợng
quercetin (mg/ml)
1,67 ± 0,07
1,65 ± 0,03

Nhận thấy, phytosome bào chế theo phương pháp bốc hơi dung mơi có
tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa và độ tan trong nước cao hơn (97,13 % so

với 93,87 % và 9,88 µg/ml so với 8,92 µg/ml). Việc sử dụng máy cất quay
sẽ thuận lợi hơn khi nâng cấp quy mơ bào chế. Dung mơi ethanol sau q
trình phản ứng có thể được thu hồi để tái sử dụng, giúp giảm chi phí khi
ứng dụng vào thực tế sản xuất. Do đó, phương pháp bốc hơi dung mơi được
lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu.

3.2.1.2. Xây dựng công thức bào chế phytosome quercetin
 Lựa chọn loại phospholipid
Bảng 3.19. Đặc tính của phytosome quercetin
bào chế với các loại phospholipid khác nhau (n = 3)
Đặc tính
Tính chất
Mất khối lượng do làm khơ (%)
Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (%)
Độ tan trong nước (µg/ml)
Mức độ làm tăng độ tan hoạt chất (lần)

HSPC
Bột khơ, mịn,
màu vàng nhạt
2,27 ± 0,13
96,13 ± 0,26
9,88 ± 0,13
11,6

Lecithin
Khối bột dính,
màu vàng
4,13 ± 0,19
92,48 ± 0,54

9,58 ± 0,17
11,3

Với giá thành rẻ và nguồn nguyên liệu sẵn có, lecithin phù hợp bào chế
phytosome sử dụng đường uống. Tuy nhiên, do PL này hút ẩm nhanh nên
thể chất của phytosome bào chế thường đặc quánh, dễ thay đổi khi bảo
quản trong một thời gian dài (sau 1 tháng ở điều kiện thực, hàm ẩm của bột
phytosome tăng từ 4,13 % lên 8,04 %). Ngoài ra, phức hợp quercetin với
HSPC ổn định vật lý hơn (độ tan trong nước và tỷ lệ hoạt chất phytosome
hóa thay đổi khơng đáng kể sau 1 tháng bảo quản ở điều kiện thực và lão
hóa cấp tốc). Do đó, HSPC được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu.


 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ quercetin:HSPC tới đặc tính của
phytosome
Bảng 3.21. Đặc tính của phytosome quercetin
bào chế với tỷ lệ quercetin : HSPC (mol:mol) khác nhau (n = 3)
Tỷ lệ
quercetin
: HSPC

1:0,5
1:0,75
1:1,0
1:1,25
1:1,5

KTTP
(nm)

PDI

Thế
Zeta
(mV)

Độ tan
trong nước
(µg/ml)

434,0
± 3,8
376,6
± 4,1
347,6
± 3,5
384,5
± 2,9
498,6
± 5,6

0,263
± 0,014
0,319
± 0,008
0,303
± 0,015
0,362
± 0,019
0,330

± 0,049

-13,2
± 0,1
-19,7
± 0,3
-22,1
± 0,3
-20,3
± 0,4
-12,4
± 0,1

4,31
± 0,22
6,75
± 0,17
9,88
± 0,13
9,56
± 0,32
9,23
± 0,28

Độ tan tăng so
với quercetin
(lần)

Tỷ lệ hoạt chất
phytosome hóa

(%)

5,1
7,9
11,6
11,2
10,8

60,31
± 0,65
76,33
± 0,93
96,13
± 0,26
95,79
± 0,79
92,45
± 0,83

Nhận thấy, các mẫu phytosome thu được có KTTP dưới 500 nm, và
không chênh lệch nhiều giữa các mẫu với PDI < 0,4. Phytosome quercetin
bào chế theo tỷ lệ quercetin:HSPC 1:1 có KTTP nhỏ, phân bố KTTP tương
đối hẹp, độ tan trong nước và tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa cao nhất. Vì
vậy, lựa chọn tỷ lệ này cho những nghiên cứu tiếp theo.

 Khảo sát ảnh hưởng của cholesterol tới đặc tính của phytosome
Bảng 3.22. Đặc tính của phytosome quercetin
bào chế với các tỷ lệ quercetin : HSPC: cholesterol khác nhau (n = 3)
Mẫu
bào chế

M1’
M2’
M3’
M4’

Tỷ lệ quercetin :
HSPC : cholesterol
1:1:0
1:1:0,1
1:1:0,2
1:1:0,5

KTTP (nm)

PDI

347,6 ± 3,5
354,9 ± 4,2
364,0 ± 5,7
503,0 ± 7,2

0,303 ± 0,015
0,311 ± 0,022
0,310 ± 0,031
0,365 ± 0,029

Thế Zeta
(mV)
-22,1 ± 0,3
-21,3 ± 0,5

-21,2 ± 0,5
-22,3 ± 0,7

EE (%)
96,13 ± 0,26
94,29 ± 0,69
97,01 ± 0,72
71,94 ± 0,45

Nhận thấy, khơng có sự thay đổi đáng kể giữa các cơng thức có
cholesterol (M2’, M3’) và không sử dụng cholesterol (M1’).
Ảnh hưởng của cholesterol tới độ ổn định của phytosome quercetin
được thể hiện rõ ở bảng sau:


Bảng 3.23. Độ ổn định của hỗn dịch phytosome quercetin
bào chế với các tỷ lệ quercetin : HSPC : cholesterol khác nhau (n = 3)
Sau 1 tuần
Mẫu
M1’
M2’
M3’

KTTP
(nm)
416,3
± 6,8
364,5
± 5,2
360,7

± 5,8

PDI
0,302
± 0,011
0,316
± 0,010
0,311
± 0,017

Sau 4 tuần
Zeta
(mV)
-22,1
± 0,5
-21,7
± 0,5
-21,5
± 0,4

KTTP
(nm)

PDI

Sau 8 tuần
Zeta
(mV)

KTTP

(nm)

PDI

Zeta
(mV)

Mẫu hỏng, xuất hiện kết tủa vẩn đục
373,5
± 4,2
367,2
± 7,3

0,322
± 0,012
0,318
± 0,018

-20,4
± 0,3
-21,3
± 0,6

402,2
± 6,1
362,9
± 5,0

0,328
± 0,009

0,321
± 0,012

-19,6
± 0,2
-21,7
± 0,3

Theo kết quả nghiên cứu ở bảng 3.23, lựa chọn tỷ lệ quercetin:
HSPC:cholesterol (mol:mol:mol) là 1:1:0,2 (M3’).
3.2.1.3. Xác định một số thông số kỹ thuật trong quá trình bào chế phytosome

 Lựa chọn thời gian phản ứng
Tiến hành bào chế phytosome quercetin ở nhiệt độ 80oC với tốc độ quay
là 150 vòng/phút. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến
tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa được thể hiện ở bảng 3.25:
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
hoạt
(n = 3) EE (%)
Thời gian (giờ)đến tỷ lệEE
(%)chất phytosome
Thời gianhóa
(giờ)
1
77,10 ± 0,35
6
93,33 ± 0,42
2
77,63 ± 0,40
8

94,82 ± 0,51
3
77,69 ± 0,34
10
96,07 ± 0,40
4
78,07 ± 0,43
16
97,79 ± 0,37
5
85,08 ± 0,31
20
98,99 ± 0,39
Để đạt được hiệu suất phytosome hóa cao ≥ 90 % và thời gian bào chế
không kéo dài, lựa chọn thời gian phản ứng 6 giờ.

 Lựa chọn nhiệt độ phản ứng
Bảng 3.26. Đặc tính của phytosome quercetin
bào chế với nhiệt độ phản ứng khác nhau (n = 3)
Nhiệt độ

KTTP (nm)

PDI

80oC
70oC
60oC

358,4 ± 4,4

367,6 ± 3,1
393,0 ± 2,8

0,281 ± 0,019
0,339 ± 0,016
0,318 ± 0,015

Thế Zeta
(mV)
-21,9 ± 0,3
-24,4 ± 1,1
-19,5 ± 0,7

Tỷ lệ hoạt chất
phytosome hóa (%)
93,33 ± 0,42
91,83 ± 0,43
84,78 ± 0,67