Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố hóa lý và thành phần dinh dưỡng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase từ trichoderma

Trent đại học vinh

664

Tr-ờng đại học vinh
KHOA HểA HC
=== ===

đồ án tốt nghiệp
Đề tài:
NGHIấN CU NH HNG CA MT SỐ YẾU TỐ HÓA LÝ
VÀ THÀNH PHẦN DINH DƢỠNG TỚI Q TRÌNH SINH
TỔNG HỢP CHITINASE TỪ TRICHODERMA

Giảng Viên h-íng dÉn : Ths. Đào Thị Thanh Xuân
Sinh Viờn thực hiện

:

Nguyn Th Hồng

Líp

:

50K - C«ng nghƯ thùc phÈm

M· sè Sinh Viên

:

0952040425

NghƯ an - 1/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Hồng

Số hiệu sinh viên: 0952040425

Khóa:

50

Ngành:

Cơng Nghệ thực phẩm

1. Tên đề tài:“Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố hóa lý và thành phần
dinh dưỡng tới quá trình sinh tổng hợp Chitinase từ Trichoderma”.
2. Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp:
- Thu nhận enzyme chitinase từ nấm Trichoderma 095(2)TH.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian, nhiệt độ, pH đến khả năng sinh tổng hợp
chitinase.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng trong mơi trường ni
cấy đến q trình sinh tổng hợp chitinase.
3. Họ tên cán bộ hƣớng dẫn:

ThS. Đào Thị Thanh Xuân

4. Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày

tháng 8 năm 2013

5. Ngày hoàn thành đồ án:

tháng 12 năm 2013

Ngày

Ngày

tháng

năm 2014

Chủ nhiệm bộ môn

Cán bộ hƣớng dẫn

(Ký, ghi rõ họ, tên)

(Ký, ghi rõ họ, tên)

Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án tốt nghiệp ngày

tháng

năm 2014

Ngƣời duyệt
(Ký, ghi rõ họ, tên)


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC

BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Hồng

Số hiệu sinh viên: 0952040425

Khóa:

Ngành: Công nghệ thực phẩm

50

Cán bộ hướng dẫn: ThS. Đào Thị Thanh Xuân
Cán bộ duyệt:

PGS.TS. Trần Đình Thắng

1. Nội dung nghiên cứu, thiết kế:
- Thu nhận enzym chitinase từ chủng nấm Trichoderma 095(2)TH.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian, nhiệt độ, pH đến khả năng sinh tổng hợp
chitinase.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng trong môi trường ni
cấy đến q trình sinh tổng hợp chitinase.
2. Nhận xét của cán bộ hƣớng dẫn:
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………..
Ngày

tháng

năm 2014

Cán bộ hƣớng dẫn
(Ký, ghi rõ họ, tên)


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC

BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Hồng

Số hiệu sinh viên:

Khóa:

Ngành: Cơng nghệ thực phẩm

50

0952040425

Cán bộ hướng dẫn: ThS. Đào Thị Thanh Xuân
Cán bộ duyệt:

PGS.TS. Trần Đình Thắng

1. Nội dung nghiên cứu, thiết kế:
- Thu nhận enzyme chitinase từ nấm Trichoderma 095(2)TH.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian, nhiệt độ, pH đến khả năng sinh tổng hợp
chitinase.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi

cấy đến quá trình sinh tổng hợp chitinase.
2. Nhận xét của cán bộ duyệt:
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
Ngày

tháng

năm 2014

Cán bộ duyệt
(Ký, ghi rõ họ, tên)


LỜI CẢM ƠN

Đồ án được thực hiện tại phịng thí nghiệm, Trung tâm Kiểm định An tồn
Thực phẩm và Mơi trường, Trường Đại học Vinh.
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
ThS. Đào Thị Thanh Xuân - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh đã giao đề tài và tận
tình hướng dẫn em trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành đồ án.
Em xin được gửi lời cảm ơn đến cán bộ, giảng viên khoa Nông - Lâm - Ngư,
Trường Đại học Vinh đã cung cấp cho em bộ chủng Trichoderma (095TH).
Em cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Ngô Thị Thủy Hà – Khoa Hóa, Trường
Đại học Vinh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em hoàn thành đồ án.
Nhân dịp này em cũng xin được gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô, các cán bộ

trong khoa Hóa, các cán bộ hướng dẫn thí nghiệm phịng Hóa thực phẩm, phịng Vi
sinh trong Trung tâm thực hành thí nghiệm – Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện
thuận lợi và giúp đỡ em về kiến thức cũng như đóng góp ý kiến để em hồn thành đồ
án này.
Cuối cùng em xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ
em trong suốt quá trình học tập và làm đồ án. Đây là nguồn động viên vững chắc
giúp em vượt qua những khó khăn để hồn thành tốt đồ án.
Do hạn chế về trình độ chun mơn và kinh nghiệm, nên bản đồ án cịn nhiều
thiếu sót, rất mong được sự giúp đỡ và góp ý của các thầy, cơ và các bạn.
Em xin chân thành cảm ơn !
Vinh, tháng 01 năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Thị Hồng

i


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH VẼ................................................................................................. v
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1.

Lí do chọn đề tài ................................................................................................... 1

2.

Mục tiêu của đề tài ............................................................................................... 1

3.

Nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1.

Giới thiệu nấm sợi Trichoderma .......................................................................... 2

1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của Trichoderma ............................................... 2
1.1.2. Dinh dưỡng và con đường trao đổi chất cơ bản của Trichoderma ....................... 4
1.2.

Khái quát về enzyme chitinase ............................................................................. 6

1.2.1. Định nghĩa ............................................................................................................ 6
1.2.2. Phân loại ............................................................................................................... 7
1.2.3. Tính chất enzyme chitinase .................................................................................. 9
1.2.4. Cơ chế tác dụng của hệ enzyme chitinase .......................................................... 11
1.2.5. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase ............................................................... 12
1.2.6. Các phương pháp tinh chế enzyme .................................................................... 14
1.3.

Các loại cơ chất của enzyme chitinase ............................................................... 16

1.3.1. Chitin .................................................................................................................. 16
1.3.2. Các dẫn xuất của chitin ...................................................................................... 20
1.4.

Ứng dụng của enzyme chitinase trong nông nghiệp và y dược ......................... 21

1.4.1. Ứng dụng của enzyme chitinase trong nông nghiệp .......................................... 21
1.4.2. Ứng dụng trong y học ......................................................................................... 22
1.5.

Tình hình nghiên cứu thu nhận chitinase từ Trichoderma ................................. 24

1.5.1. Thế giới............................................................................................................... 24
1.5.2. Việt Nam ............................................................................................................ 25
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................................... 26
2.1.

Vật liệu, hóa chất và mơi trường ........................................................................ 26

2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................... 26
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................. 26
ii


2.1.3. Các môi trường nuôi cấy .................................................................................... 27
2.2.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 27

2.2.1. Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống........................................................................... 27
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy Trichoderma trên môi trường lỏng cho STH
chitinase .............................................................................................................. 27
2.2.3. Xác định hoạt độ enzyme chitinase (phương pháp Elson – Morgan) ................ 28
2.2.4. Xây dựng đường chuẩn glucosamine ................................................................. 30

2.2.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố vật lý đến sinh
tổng hợp chitinase ............................................................................................... 31
2.2.6. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng đến quá
trình sinh tổng hợp chitinase .............................................................................. 32
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 35
3.1.

Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng Trichoderma trên môi
trường lỏng ......................................................................................................... 35

3.2.

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố vật lý đến quá trình sinh tổng
hợp chitinase ....................................................................................................... 35

3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp chitinase ..... 35
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp chitinase ...... 36
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp chitinase .............. 38
3.3.

Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy
đến quá trình sinh tổng hợp chitinase ................................................................. 39

3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon đến quá trình sinh
tổng hợp chitinase ............................................................................................... 39
3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ đến quá trình sinh tổng
hợp chitinase ....................................................................................................... 40
3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng photpho đến quá trình sinh
tổng hợp chitinase ............................................................................................... 42
3.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của ion kim loại đến quá trình sinh tổng hợp

chitinase .............................................................................................................. 43
3.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất bề mặt nuôi cấy đến sinh tổng hợp
chitinase .............................................................................................................. 44
KẾT LUẬN .................................................................................................................. 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 47
iii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Hình 1.1:

Sự phát triển của nấm Trichoderma trên đĩa thạch (a) và hình dạng
sợi nấm Trichoderma (b) ............................................................................. 3

Hình 1.2:

Cấu trúc bậc 3 của enzyme chitinase ........................................................... 6

Hình 1.3:

Sơ đồ phân cắt chitin bởi các enzyme thuộc nhóm chitinase ...................... 7

Hình 1.4:

Mơ hình cấu trúc khơng gian của chitinase Serratia marcescens................. 8

Hình 1.5:

Mơ hình cấu trúc khơng gian của chitinase Hodeum vulgare ...................... 8

Hình 1.6:

Mơ tả trình tự amoni axit ............................................................................. 9

Hình 1.7:

Cấu trúc hóa học của allosamidin và dẫn xuất allosamidin ....................... 11

Hình 1.8:

Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase ở Trichoderma ...................... 12

Hình 1.9:

Chitin và vỏ tơm ......................................................................................... 17

Hình 1.10: 1) chitin; 3) cellulose .................................................................................. 18
Hình 1.11: Cấu trúc mạch chitin .................................................................................. 19
Hình 1.12: Cấu trúc bậc 3 của chitosan........................................................................ 20
Hình 2.1:

Chitin huyền phù 1%.................................................................................. 28

Hình 2.2:

Màu đỏ của glucosamine theo các nồng độ sau khi bỏ thuốc thử Erlich I ......... 30

Hình 3.1:

Đường chuẩn glucosamine nồng độ 300 - 500 (µg/ml) ............................. 35

Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính chitinase thơ chiết
tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH .......................................................... 36
Hình 3.3:

Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy lên hoạt tính chitinase
chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH ................................................. 37

Hình 3.4:

Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm
Trichoderma 095(2)TH .............................................................................. 38

Hình 3.5:

Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng cacbon lên hoạt tính chitinase
chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH ................................................. 40

Hình 3.6:

Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng nitơ lên hoạt tính chitinase
chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH ................................................. 41

Hình 3.7:

Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng photpho lên hoạt tính chitinase
chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH ................................................. 42

Hình 3.8:

Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính chitinase chiết tách từ
nấm Trichoderma 095(2)TH ...................................................................... 43

Hình 3.9:

Ảnh hưởng của chất bề mặt nuôi cấy lên hoạt tính chitinase chiết
tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH .......................................................... 44
iv


DANH MỤC HÌNH VẼ
Trang
Bảng 2.1: Cách pha nồng độ glucosamin 300 - 500µg/ml ......................................... 30
Bảng 3.1: Hoạt tính của chitinase theo thời gian nuôi cấy trong môi trường lỏng......... 36
Bảng 3.2: Hoạt tính của chitinase theo nhiệt độ ni cấy trong mơi trường lỏng ...... 37
Bảng 3.3: Hoạt tính của chitinase theo pH nuôi cấy trong môi trường lỏng .............. 38
Bảng 3.4: Hoạt tính chitinase theo nguồn dinh dưỡng cacbon trong mơi trường lỏng....... 39
Bảng 3.5: Hoạt tính của chitinase theo các dinh dưỡng nguồn nitơ trong môi
trường lỏng ................................................................................................. 41
Bảng 3.6: Hoạt tính của chitinase theo các nguồn dinh dưỡng photpho trong
mơi trường lỏng .......................................................................................... 42
Bảng 3.7: Hoạt tính của chitinase theo các ion kim loại trong môi trường lỏng ....... 43
Bảng 3.8: Hoạt tính của chitinase theo chất bề mặt nuôi cấy trong môi trường lỏng ....... 44

v


LỜI MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, có cấu trúc phân tử phức
tạp và tinh vi, hoạt lực xúc tác cao hơn nhiều so với chất xúc tác thông thường, có
tính đặc hiệu cao…
Chitinase là một trong những nhóm enzyme quan trọng trong các enzyme
cơng nghiệp, nó chứa các đơn phân là N-acetyl-glucosamine, liên kết với nhau bởi
các liên kết 1,4-β-glucoside. Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, phân cắt
chitin thành các sản phẩm khác nhau như oligosaccharide, N-acetyl-glucosamine. Là
enzyme được ứng dụng nhiều trong các ngành nông nghiệp và trong y dược như là
trong kiểm soát nấm gây bệnh và côn trùng ở thực vật, tổng hợp chitooligosaccharide.
Chitinase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật,
nấm, vi khuẩn … Tuy nhiên, những năm gần đây việc gia tăng sử dụng vi sinh vật là
nguồn cung cấp chitinase đang được sử dụng nhiều, sản phẩm của nó tạo ra nhiều
hơn và rút ngắn thời gian thu nhận hơn, nhưng giá thành các chế phẩm thu được vẫn
cịn khá cao, do đó sử dụng enzyme trong sản xuất vẫn còn hạn chế. Những nguồn
sinh vật để thu nhận chitinase đáng kể là các chủng vi khuẩn thuộc các
chi Enterobacter và Streptomces, các chủng nấm sợi thuộc các chi Asperillus,
Penicillium và Trichoderma và một số động vật nguyên sinh.
Vì những ứng dụng rộng rãi của chitinase, mục đích của tơi nhằm nghiên cứu
khả năng sinh tổng hợp chitinase từ Trichoderma trong môi trường và trong điều kiện
cho hoạt tính là cao nhất. Vì vậy, tơi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của
một số yếu tố hóa lý và thành phần dinh dưỡng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase
từ Trichoderma”.
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu để tìm ra mơi trường ni cấy thích hợp cho quá trình sinh tổng
hợp chitinase. Thu nhận enzyme chitinase từ canh trường.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Trong đồ án này chúng tơi có các nhiệm vụ:
- Thu nhận enzyme chitinase từ nấm Trichoderma 095(2)TH.
-

Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian, nhiệt độ, pH đến khả năng sinh tổng

hợp chitinase.
-

Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng trong mơi trường

ni cấy đến q trình sinh tổng hợp chitinase.
1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu nấm sợi Trichoderma
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của Trichoderma
1.1.1.1. Phân loại
Trichoderma là một trong những vi nấm gây nhiều khó khăn cho cơng tác
phân loại do cịn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết
đầy đủ. Theo Barnett và Hunter (1972) [17], Trichoderma thuộc lớp nấm, chúng
được phân loại như sau:
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Lớp: Euascomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Hypocreaceae
Giống: Trichoderma
Ainsworth và Sussman [16] lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp
Deuteromyctes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae.
Theo một số nhà khoa học khác lại cho rằng Trichoderma thuộc họ
Hypocreaceae, lớp nấm túi Ascomycetes , các lồi Trichoderma được phân thành 5

nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và Hypocreanum.
Trong đó, 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum có giai đoạn
telemorph (hình thái ở giai đoạn sinh sản hữu tính) là Hypocrea, nhóm Hypocreanum
hiếm khi gặp dưới dạng teleomorph độc lập, nhóm Saturnisporum khơng tìm thấy hình
thức teleomorph [25].
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái của Trichoderma
Trichoderma là một lồi nấm bất tồn, sinh sản vơ tính bằng đính bào tử từ
khuẩn ty [24].
Khuẩn ty của nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối
nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần khơng có vách, khơng màu,
liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình elip
hoặc hình thn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục vàng, xanh, lục
xỉn đến lục đậm. Các chủng của Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh chúng có thể
đạt được đường kính khuẩn lạc từ 2 - 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 200C [15].
2


a

b

Hình 1.1: Sự phát triển của nấm Trichoderma trên đĩa thạch (a)
và hình dạng sợi nấm Trichoderma (b)

1.1.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
 Đặc điểm sinh lý
Trichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ở đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng, đầm
muối và đất sa mạc. Hầu hết, chúng là những vi sinh vật hoại sinh, nhưng chúng
cũng có khả năng tấn cơng các loại nấm khác. Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực
vật sống và khơng sống nội kí sinh với thực vật. Chúng có thể tồn tại trong tất cả các

vùng khí hậu từ miền cực Bắc đến những vùng núi cao cũng như miền nhiệt đới. Tuy
nhiên, có một số tương quan giữa sự phân bố các lồi và các điều kiện mơi trường.
T.polysporum và T. viride có mặt ở vùng khí hậu lạnh, trong khi T. harzianum
có ở các vùng khí hậu nóng. Điều này tương quan với nhu cầu cần nhiệt độ tối đa cho
từng loài [15].
Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất axit và tương quan giữa sự hiện
diện của T. viride với đất axit trong vùng khí hậu rất lạnh ở Peru, Trichoderma phát
triển ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và có thể phát triển tốt ở đất kiềm nếu như ở đó có
sự tập trung một lượng CO2 và bicarbonate.
Trichoderma là vi nấm ưa độ ẩm, chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi
ẩm ướt, những khu rừng khác nhau. T. hamatum và T. pseudokoningii có thể chịu
điều kiện độ ẩm cao hơn so với những loài khác. Tuy nhiên, Trichoderma spp
thường không chịu được độ ẩm thấp và điều này được cho là một yếu tố góp phần
làm cho số lượng Trichoderma giảm rõ rệt trong những nơi có độ ẩm thấp, song các
lồi Trichoderma spp khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau [3].
3


Trichoderma spp có thể được phát hiện trong đất bởi mùi hương của chúng,
hương dừa (6-pentyl-α-pyrone dễ bay hơi) thường được tạo ra trong quá trình sinh
trưởng của Trichoderma [14].
Với phương pháp pha lỗng người ta ước tính Trichoderma có thể đạt đến 3%
tổng số vi nấm hiện diện trong các loại đất rừng và 1,5% số lượng trong đất trồng cỏ.
Các chủng T. longibrachiatum và T. citrinoviride có nhiều sự trùng nhau về khu
vực phân bố địa lí. Sự phân bố rộng khắp này có lẽ do sự phát tán hiệu quả (nhờ gió
hoặc cơn trùng) hoặc biểu hiện một q trình tiến hóa rất sớm.
 Đặc điểm sinh hóa
Các chủng Trichoderma có khả năng tổng hợp được nhiều loại enzyme ngoại
bào như chitinase, glucanase, xylase, lipase, pectinase, cellulose, protease ... để phân
hủy nguồn xác bã thực vật và vách tế bào nấm bệnh trong đời sống hoại sinh và ký

sinh của chúng [30].
1.1.2. Dinh dưỡng và con đường trao đổi chất cơ bản của Trichoderma
 Nguồn dinh dưỡng cacbon
Trichoderma nổi bật về khả năng tiết ra enzyme phân hủy nhiều loại
polysaccharide (như cellulose, hemicellulose) và những polymer liên quan như
chitin. Những enzyme này được cơng nhận có giá trị thương mại.
Trichoderma có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau và nguồn
cacbonhydrate là dễ hấp thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham
gia vào phản ứng trong ba chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof,
Pentose và Entner Doudoroff [3].
Nguồn cacbon là phương thức được sử dụng để phân loại các giống
Trichoderma thành từng nhóm. Theo phân tích, những nguồn cacbon sau được sử
dụng bởi tất cả những chủng đã nghiên cứu: D-glucose, D-galactose, D-fructose, Dmantose, D-cellobiose, trehalose, D-xylose, L-arabinose, d-mannitol, D-arabitol,
glycerol, salacin, esculin, arbutin, glycerol-1-monoacetate, β-methyl-D-glucoside và
N-acetyl- β-D-glucosamine.
Do chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng nên trong môi
trường nuôi cấy nấm Trichoderma sinh chitinase, cần có nguồn chitin là chất cảm
ứng và là nguồn cacbon nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp chitinase. Cơ chất dùng
để cảm ứng nấm Trichoderma sinh chitinase là chitin (có thể dạng huyền phù, dạng
4


bột hay dạng thô) và các dẫn xuất của chitin. Theo nghiên cứu cho thấy Trichoderma
chỉ tạo ra chitinase khi có nguồn cacbon từ chitin chứ khơng phải từ nguồn khác như
cellulose, glucose… hay chitosan.
 Nguồn dinh dưỡng nitơ
Trichoderma spp có khả năng sử dụng cả những nguồn nitơ khá phức tạp hay
đơn giản để tăng trưởng. Khi Trichoderma đang tăng trưởng trên nguồn cacbon là
carbohydrate, nguồn nitơ thường được sử dụng là ammonium hơn là nitrate. Một vài
chủng như T. reesei hay T. koningii T-1 cũng không thể sử dụng nitrate. Đó là sự

thiếu enzyme nitrate permease.
Nguồn nitơ hữu cơ như peptone thường được sử dụng trong môi trường để
hạn chế sự tăng trưởng chậm trên cơ chất polymeric như là cellulose. Tuy nhiên, cần
chú ý rằng peptone được sử dụng như là cả nguồn nitơ lẫn nguồn cacbon và được ưu
tiên sử dụng khi được cung cấp đồng thời với polysaccharide. Trong số những amino
axit, nguồn nitơ hữu cơ tốt nhất cho Trichoderma là alanine, axit aspartic và axit
glutamic. Ngồi amino axit thì T. lignorum (=T. viride) được báo cáo là có thể sử
dụng bazơ purin, purin nucleoside và nucleotide tương ứng như là nguồn nitơ duy
nhất [30].
Theo Kapat và cộng sự (1996) [36], khi loại ure ra khỏi môi trường nuôi cấy
sẽ làm tăng khả năng tổng hợp chitinase. Takahashi và cộng sự (1993) [41] nghiên
cứu khả năng sinh chitinase từ nấm sợi đã chỉ ra rằng hoạt tính chitinase cao khi sử
dụng nguồn nitơ từ (NH4)2SO4. Tuy nhiên, khi môi trường nuôi cấy Trichoderma
được cung cấp nguồn nitơ từ cả hai nguồn là cao nấm men và (NH4)2SO4 thì sản
lượng chitinase tăng từ 4 - 10% so với dùng riêng lẻ các nguồn này.
 Nguồn dinh dưỡng khác
Hầu hết các chủng phân lập hoang dại của Trichoderma không yêu cầu những
nhân tố tăng trưởng phức tạp hay vitamin. Những ion kim loại như sắt thì cần thiết
cho sự tăng trưởng và có thể được tìm thấy ở một nồng độ rất thấp trong môi trường.
Một số lượng lớn những ion kim loại khác cũng rất quan trọng cho sự tăng
trưởng ở những nồng độ thấp, ngược lại nồng độ cao lại ức chế tăng trưởng. Sự thêm
vào của Cd2+ và Hg2+ ở nồng độ 1 - 10mM dẫn đến ức chế tăng trưởng T. viride và
dẫn đến kiểu hình bất thường của nấm. Tuy nhiên, tương tự như loài nấm khác,
Trichoderma cũng bắt các ion kim loại trong màng tế bào của chúng, phát hiện này
5


đã được sử dụng trong viêc loại bỏ những ion kim loại nặng ra khỏi nước thải công
nghiệp bằng hệ sợi nấm Trichoderma [30].
 Oxi và CO2

Trichoderma là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, mặc dù những chủng đã phân
lập đều được thu nhận trên những môi trường sống có áp suất từng phần oxi rất thấp.
Sự cung cấp oxi và hoạt động của ti thể cũng được báo cáo là những nhân tố điều
hịa sự hình thành cellulose của T. reesei và nồng độ O2 ở mức dưới cực thuận dường
như là thích hợp cho sự tổng hợp enzyme.
CO2 sản phẩm cuối cùng của sự oxi hóa cacbon, sẽ được tích lũy ở một mức
độ nào đó trong môi trường tăng trưởng rắn, phụ thuộc pH và nhiệt độ. Vì vậy, vài
lồi Trichoderma spp bị ức chế bởi CO2 theo phương thức phụ thuộc vào pH, sự ức
chế mạnh nhất trong mơi trường kiềm nhẹ và trung tính. Hutchinson và Cowan
(1972) [31] báo cáo rằng T. harzianum tạo ra hiệu ứng ức chế CO2 và ethanol trên sự
tăng trưởng và tạo bào tử của nhiều nấm khác (Aspetgillus niger, Pestalotia
rhododendri), trên cây con của Lactuca sativa. Điều này cho thấy một vài chủng
Trichoderma có thể chấp nhận sự tích tụ CO2 nhiều hơn một số nấm khác [30].
1.2. Khái quát về enzyme chitinase
1.2.1. Định nghĩa
Chitinase hay poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosidglucanohydrolase,
thuộc nhóm enzyme thủy phân (Hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành
chitobiose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4- β-glucosid giữa C1 và C4 của 2
phân tử N-acetylglucosamine liên tiếp nhau trong chitin [34].

Hình 1.2: Cấu trúc bậc 3 của enzyme chitinase

6


1.2.2. Phân loại
1.2.2.1 Dựa vào phản ứng phân cắt
Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-chitobiosidse, Nacetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase).
- Endochitinase: là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu
nhiên tạo các đoạn oligosaccharide. Các enzyme này đã được nghiên cứu từ dịch chiết

môi trường nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (loại endochitinase: pI=7,8).
- Chitin-1,4-chitobiosidse: là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm
chính là các dimer chitobiose.
- N-acetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase): là enzyme tiếp tục phân cắt
chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-β-D-glucosamine [32].

Hình 1.3: Sơ đồ phân cắt chitin bởi các enzyme thuộc nhóm chitinase

1.2.2.2. Dựa vào cấu trúc phân tử
Enzyme chitinase được sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase:
- Họ Glycohydrolase 18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu
trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở hầu hết các lồi thuộc
Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngồi
ra cịn có các enzyme khác như: chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl-β-Dglucosaminidase. Các chitinase này hoạt động thông qua một cơ chế kiểm sốt mà
trong đó các đoạn β- polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm β-anomer. Các chitinase
thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ Aeromonas hydrophila, Bacillus
circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcscens …
7


Hình 1.4: Mơ hình cấu trúc khơng gian của chitinase Serratia marcescens

- Họ Glycohydrolase 19: họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật
như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum
sativum)…, ngoài ra còn ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophillus
influenzae …Chúng có cấu trúc hình cầu với một vịng xoắn và hoạt động thơng qua
cơ chế nghịch chuyển [32].

Hình 1.5: Mơ hình cấu trúc khơng gian của chitinase Hodeum vulgare

1.2.2.3. Dựa vào trình tự amoni axit
Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide
nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:
- Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cysteine
nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycine hoặc proline ở đầu cacboxyl
(C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cysteine có vai trị quan trọng đối với sự gắn kết
enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác.
- Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu
đoạn giàu cysteine ở đầu N và peptide nhận biết ở đầu C, có trình tự amino axit
8


tương tự chitinase ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn,
chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngồi.
- Nhóm III: Trình tự amino axit hồn tồn khác với chitinase nhóm I và II.
- Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 4147% trình tự amino axit ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I,
phân tử cũng có đoạn giàu cysteine nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so
với chitinase nhóm I.
- Nhóm V: Dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cysteine) có thể đã giảm đi nhiều lần trong q trình tiến hóa ở
thực vật bậc cao [34].

Hình 1.6: Mơ tả trình tự amoni axit

1.2.3. Tính chất enzyme chitinase
1.2.3.1. Trọng lượng phân tử
Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân
tử khoảng 30kDa (kilodalton). Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương
9

(cá, lưỡng cư, thú), một số chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40 - 90kDa hoặc
cao hơn cả là khoảng 120kDa. Trọng lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận
từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng từ 30 đến 120kDa.
Một số enzyme chitinase có trọng phân tử thấp có thể được tạo ra từ một
enzyme lớn hơn bằng cách phân cắt một số protein [34].
1.2.3.2. Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis
Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng từ 3 - 10 ở thực
vật bậc cao và tảo; pI từ 4,7 - 9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pI từ 3,5 8,8 ở vi sinh vật. Hằng số Michaelis: 0,010 - 0,011 (g/100ml) [34].
1.2.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động ở giới hạn nhiệt độ từ 20 - 50oC.
Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 400C,
ngoại trừ chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có
nhiệt độ tối thích là 50oC [32]. Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các
enzyme chitinase có thể có những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau. Các enzyme
chitinase thực vật thuộc nhóm III và chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở
suối nước nóng cho thấy khả năng chịu đựng nhiệt độ cao đến 80oC. Trong khi hoạt
tính thủy phân chitin mạnh nhất của chitinase từ Vibrio sp từ 30 - 45oC và chitinase
chịu nhiệt từ chủng Bacillus sp BG-11 hoạt tính cao nhất ở 40 - 60oC [18].
Khi khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng Trichoderma harzianum nhận
thấy enzyme này có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25 - 60oC,
nhiệt độ tối ưu là 40oC.
1.2.3.4. Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH tối thích (pHop) của hệ enzyme chitinase từ 4 - 9 đối với các
enzyme chitinase ở thực vật bậc cao và tảo, hệ enzyme chitinase ở động vật là 4,8 7,5 và ở vi sinh vật là 3,5 - 8,0.
Theo các nhà khoa học, pHop của enzyme chitinase có thể có sự phụ thuộc vào
cơ chất được sử dụng. Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pHop
khoảng 5,0 khi cơ chất là glycol chitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu [34].
Chitinase hoạt động được trong khoảng pH từ 4,0 - 8,5. Chitinase của nấm
hoạt tính cao nhất ở pH = 5, trong khi ở vi khuẩn pH tối thích là 8,0. Chủng Bacillus

sp. BG -11 cho hoạt tính của chitinase cao nhất ở pH = 8,5 [18].

10


1.2.3.5. Chất tăng hoạt – chất ức chế
* Allosamidin: allosamidin là chất ức chế được nghiên cứu, đặc biệt là với
chitinase côn trùng. Allosamidin ức chế cạnh tranh với enzyme chitinase, giá trị KI
khoảng 0,1μm. Chất này có cấu tạo tương tự dạng trung gian của cơ chất: một vòng
oxazoline, vịng này có thể ở giữa carbonyl oxygen của nhóm N-acetyl và C1 của Nacetyl-D-glucosamine trong quá trình thủy giải [34].

Hình 1.7: Cấu trúc hóa học của allosamidin và dẫn xuất allosamidin

Allosamidin:

R1=R2=CH3

Demethylallosamdin:

R1=CH3,R2=H

Didemethylallosamidin:

R1=R2=H

Các ion kim loại: Hg2+, Ag+ là những chất ức chế, cịn ion Cu2+ thì tùy theo
dạng enzyme chitinase: dạng chitinase bị ức chế hoặc tăng cường hoạt tính (tìm thấy
ở một số lồi cá và vi sinh vật). Bên cạnh đó albumin cũng có vai trị làm tăng hoạt
động của enzyme chitinase, nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõ ràng sau 2 - 3 giờ đầu
của phản ứng.

1.2.3.6. Ổn định hoạt tính
Enzyme chitinase thơ hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh
khoảng 2 năm. Chúng bị mất hoạt tính nhanh chóng ở 37oC trong trường hợp khơng
có mặt cơ chất. Chu kỳ bán hủy ở 37oC là 40 ngày và ở 5oC là 230 ngày.
Sự ổn định của enzyme chitinase sẽ cao hơn khi có mặt của cơ chất là chitin.
Enzyme chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 20oC là K = 0,145/h [32].
1.2.4. Cơ chế tác dụng của hệ enzyme chitinase
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer
sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử nhỏ và khác
nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc) 2 do hoạt tính
endochitinase khơng thể phân cắt thêm được nữa.
11


Chitin-1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp
lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)2 với n ≥ 3] từ đầu khơng khử và chỉ phóng thích
diacetylchitobiose (GlcNAc) 2..
β-N-acetyl-hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách
liên tục từ đầu khơng khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetylglucosamine
(GlcNAc)2 [3] .

Hình 1.8: Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase ở Trichoderma

1.2.5. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase
Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các giới vi sinh vật. Đến nay, đã có
nhiều nghiên cứu về enzyme chitinase của các vi sinh vật, thực vật, động vật.
1.2.5.1. Chitinase vi khuẩn
Enzyme chitinase được tìm thấy ở các vi khuẩn : Chromobacterium,
Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và đặc biệt là ở nhóm Streptomyces.
Enzyme chitinase có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy

nhiên, trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật, người ta đều cho thêm chitin - cơ
chất của enzyme chitinase để làm tăng khả năng tổng hợp enzyme chitinase, đồng
thời ổn định hoạt tính enzyme chitinase sau quá trình chiết tách. Vi khuẩn tổng hợp
12


enzyme chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trường tạo nguồn cacbon cho vi
khuẩn sinh trưởng và phát triển [34].
1.2.5.2. Chitinase nấm
Chitinase cũng được tạo ra bởi các loại nấm sợi. Các chủng nấm sợi cho
enzyme chitinase cao như : Trichoderma, Gliocladium, Calvatia..., đặc biệt là ở các
loài nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus...Các nấm phân hủy chitin cũng được tìm
thấy trong các thủy vực như loài nấm Karlinggiomyces asterocystic thuộc lớp
Phycomycetes.
Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm đóng vai trị quan trọng
về mặt dinh dưỡng, nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình
phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính
của vách tế bào nấm. Chitinase cịn giữ vai trị chính trong hoạt động ký sinh nấm
đối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật [32].
1.2.5.3. Chitinase thực vật
Chitinase tham gia vào cơ chế tự vệ của thực vật chống lại các loại côn trùng
và nấm ký sinh gây bệnh. Người ta đã quan sát thấy chitinase tách chiết từ cây cần
tây có khả năng ức chế sợi nấm phát triển. Tuy nhiên, cũng có tác giả cho rằng
chitinase cịn có vai trị khác như tham gia vào q trình hình thành phơi. Các thực
vật bậc cao có khả năng tạo enzyme chitinase như: cao su (Hevea brasiliensis), thuốc
lá (Nicotiana sp), lúa mạch (Hordeum vulgare), cà rốt, hạt đậu nành ... và đặc biệt
một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase [3, 34].
1.2.5.4. Chitinase động vật
Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu
hóa của nhiều lồi động vật khơng xương: ruột khoang, giun trịn, thân mềm, chân

đốt (ví dụ : trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa), ta có thể thu nhận được
enzyme chitinase. Đối với động vật có xương sống enzyme chitinase được tiết ra từ
tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dung dịch
dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ.
Trong động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực, hàm
lượng chitin chiếm khá cao từ 14 - 35% so với trọng lượng khô.
Mặc dù chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận
chính của chitin là từ vỏ cua và tôm. Trong công nghệ chế biến, do chitin tồn tại ở
13


dạng phức hợp với một số chất như: CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ … nên
việc tách chiết còn khó khăn vì phải đảm bảo cả hai yếu tố cùng một lúc là vừa loại
hết tạp chất đồng thời khơng làm biến đổi tính chất của chitin.
Ngồi ra, enzyme chitinase cịn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun trịn
trong suốt q trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các lồi chân đốt vào thời điểm
thay vỏ, lột da. Enzyme chitinase giúp cơn trùng tiêu hóa màng ngồi (cutincun)
trong q trình biến thái hay lột xác [4].
Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu, thu nhận enzyme chitinase từ chủng
nấm Trichoderma.
1.2.6. Các phương pháp tinh chế enzyme
Để tinh chế enzyme, loại bỏ các tạp chất lẫn trong dịch enzyme thơ thì người ta
có thể có nhiều phương pháp như phương pháp sắc ký, phương pháp phân tách hệ lỏng
- lỏng, phương pháp kết tủa phân đoạn enzyme.
1.2.6.1. Các phương pháp kết tủa phân đoạn enzyme
 Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính (NH4)2SO4
Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH 4)2 SO4 dựa trên cơ sở sự khác
nhau về khả năng kết tủa của các protein ở một nồng độ muối (tính theo % nồng
độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các
dịch enzyme. Các loại muối có thể được dùng là (NH 4)2 SO4, Na2 SO4,

MgSO4 …người ta đã nhận thấy muối (NH4)2 SO4 là tốt nhất vì nó khơng làm hại
mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại rất lớn (bão hòa 767 g/l ở 25oC). Ngoài
ra, nồng độ (NH4)2 SO4 cần thiết để kết tủa enzyme khác nhau thì khác nhau nhiều.
Ví dụ: Protein của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2 SO4 bão hòa của dung
dịch muối này. Điều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4 )2 SO4 cao hơn các
muối khác.
Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h hoặc để qua đêm, mục
đích là tạo kết tủa hồn tồn (ở phương pháp dùng dung mơi hữu cơ thì khơng cần để
lâu). Kết tủa được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phểu. Khi hòa tan kết tủa lại
người ta thường thêm ion Ca2+ làm bền (CaCl2 hoặc Ca(COOH)2).
Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích. Thời gian thẩm
tích thường là 24 - 28 giờ, nước thay càng nhiều càng nhanh càng tốt [10].

14


 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở độ hòa tan của protein phụ
thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân
tử nước.
Sự tương tác đó (cịn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào
dung dịch enzyme các dung môi hữu cơ. Dung môi hữu cơ thường dùng là ethanol,
isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu.
Ở phương pháp này cũng chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5oC trở xuống).
Dùng dung mơi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0oC và có thể đến - 200C,
như vậy nó có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein.
Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng
máy ly tâm. Phương pháp này có lợi thế là khơng cần loại muối, nhưng có nhược điểm
là chi phí cao, dễ cháy [10].
 Kết tủa bằng các polymer có khối lượng phân tử cao

Các polymer như dextran, polyetylenglycol được sử dụng với nhiều mục đích:
chất làm bền, chất làm đặc (bằng thẩm tính) hoặc là chất kết tủa. Các chất này thường
rất háo nước nên sẽ làm mất vỏ nước của các phân tử sinh học dẫn đến làm thay đổi
hằng số điện môi của môi trường xung quanh. Do đó mà ảnh hưởng đến các tương tác
khơng gian của các nhóm háo nước của các phân tử polymer. Polyetylenglycol được
dùng với nồng độ 50 % (w/w) trong nước có thể làm kết tủa phần lớn các protein có
nồng độ 6 – 20 %. Việc kết tủa phụ thuộc vào một số yếu tố như: nhiệt độ, lực ion, pH,
nồng độ protein và khối lượng phân tử của các enzyme [10].
 Thay đổi thành phần hóa học của môi trường để làm sạch enzyme
Khi thêm vào các chất đặc hiệu, người ta có thể thu được kết tủa của một số
phân tử. Chẳng hạn một số muối kim loại (Mn2+) tác dụng với axit nucleic sẽ làm dễ
dàng cho việc tách biệt các enzyme nội bào. Có thể kết tủa axit nucleic bằng protein
kiềm tính như protamin. Các protein tích điện dương sẽ kết hợp với nhóm phosphate
tích điện âm của axit nucleic. Bằng cách này ta có thể tách enzyme ra khỏi hợp chất
với axit nucleic tạo thành có thể được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm [10].
1.2.6.2. Phương pháp sắc ký
 Sắc ký lỏng cao áp
Dưới áp suất cao có thể sắc ký được các protein với năng suất phân giải cao và
vận tốc phân tách rất lớn, có điều phương pháp này chất mang phải có độ bền cơ lớn.
Người ta thường dung các gel silic.
15


Khi gắn một phối tử đặc hiệu cho một protein (hay enzyme) lên một gel silic đã
được tạo nhánh với glycerolpropylsilan nhằm tối thiểu hóa các tương tác phi đặc hiệu,
thì có thể dùng sắc ký ái lực cao áp.
 Sắc ký tương tác ưa béo
Các protein sẽ lần lượt được phân tách ra theo tương tác của chúng với một chất
mang có chứa nhóm ưa béo (kị nước).
Các protein chứa các nhóm ưa béo ở trên bề mặt, chất mang ưa béo và dung

môi ưa nước tạo thành một hệ ba thành phần và tương tác được với nhau. Hệ này có
thể bị rối loạn khi thay đổi pH, nhiệt độ hoặc lực ion.
Nói chung, các tương tác sẽ mạnh nếu ta tăng lực ion. Các protein bị giữ, tiếp
đó, có thể được rửa giải một cách chọn lọc bằng cách giảm lực ion này hoặc bằng cách
giảm độ phân cực của dung mơi rửa. Có thể gắn các nhóm khác nhau lên chất mang.
Chẳng hạn, ở octylsepharose (R) CL-4B và các nhóm octyl và phenyl đã được đính lên
các đơn vị monosaccarite của agarose bằng liên kết este khơng tích điện và bền hóa
học. Ở những chất mang khác thì có thể sử dụng những nhóm ưa béo khác...[10].
1.2.4.3. Phân tách lỏng - lỏng
Cơ sở của kỹ thuật này dựa vào sự phân bố khác nhau của các protein trong một
dung môi hai pha riêng biệt nhau, mỗi pha hòa tan được một trong các protein. Sự
phân tách này sẽ phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ của các polymer, khối
lượng phân tử của protein, nhiệt độ và lực ion. Thường các điều kiện tối ưu phải được
xác định bằng thực nghiệm. Việc phân tách các pha có thể thực hiện bằng kết tủa hoặc
ly tâm.
Hệ dung mơi sử dụng có thể là polyetylenglucol/dextran hoặc polyetylenglycol/
amoni sulfat. Kỹ thuật này, mới đây được đưa vào sử dụng trong lĩnh vực hóa học. Nó
có lợi là cho phép phân tách dễ dàng và liên tục các protein của pha rắn cấu tạo nên
màng thành và các mảnh vỡ bán hòa tan khác [10].
1.3. Các loại cơ chất của enzyme chitinase
1.3.1. Chitin
Cơ chất chủ yếu của enzyme chitinase là chitin. Chitin được tìm thấy trong
thành tế bào của nấm sợi và là chất hữu cơ chiếm khối lượng lớn hình thành nên lớp
vỏ ngồi của động vật không xương khớp (côn trùng, giáp xác, thân mềm) [34].

16