Tài liệu Bài thuyết trình - Công nghệ sinh học pdf

MÔN: SINH HC PHÂN TỌ Ử
MÔN: SINH HC PHÂN TỌ Ử
GVHD:
GVHD:
NGUYN TH DUY KHOAỄ Ị
NGUYN TH DUY KHOA
Ễ Ị
GVHD:
GVHD:
NGUYN TH DUY KHOA
Ễ Ị
NGUYN TH DUY KHOAỄ Ị

1.
1.
NGUYN ĐÌNH BOỄ Ả
NGUYN ĐÌNH BOỄ Ả
2.
2.
TRN QUC HCẦ Ố Ọ
TRN QUC HCẦ Ố Ọ
3.
3.
NGUYN HU SĨỄ Ữ
NGUYN HU SĨỄ Ữ
4.
4.
PHAN NGC THNHỌ Ị
PHAN NGC THNHỌ Ị
5.

5.
TRN XUÂN ÁI Ầ
TRN XUÂN ÁI Ầ
6.
6.
QUÁCH TH QUỲNH MAIỊ
QUÁCH TH QUỲNH MAIỊ
7.
7.
H TH NH SANGỒ Ị Ư
H TH NH SANGỒ Ị Ư
8.
8.
PHM TH TNHẠ Ị Ỉ
PHM TH TNHẠ Ị Ỉ
9.
9.
VÕ TH BO ÁI Ị Ả
VÕ TH BO ÁI Ị Ả
10.
10.
NGUYN TH THU LUỄ Ị Ự
NGUYN TH THU LUỄ Ị Ự
11.
11.
NGUYN MINH THTỄ Ậ
NGUYN MINH THTỄ Ậ

TRN QUC HC
Ầ Ố Ọ

TRN QUC HC
Ầ Ố Ọ

NGUYN HU SĨ
Ễ Ữ
NGUYN HU SĨ
Ễ Ữ
PHAN NGC THNH
Ọ Ị
PHAN NGC THNH
Ọ Ị
TRN XUÂN ÁI Ầ
TRN XUÂN ÁI Ầ
QUÁCH TH QUỲNH MAIỊ
QUÁCH TH QUỲNH MAIỊ
PHM TH TNHẠ Ị Ỉ
PHM TH TNHẠ Ị Ỉ
VÕ TH BO ÁI Ị Ả
VÕ TH BO ÁI Ị Ả
NGUYN TH THU L U
Ễ Ị Ự
NGUYN TH THU L U
Ễ Ị Ự
NGUYN MINH THTỄ Ậ
NGUYN MINH THT
Ễ Ậ
TRN ĐÔNG ANHẦ
TRN ĐÔNG ANH
Ầ
NGUYN ĐÌNH BO

Ễ Ả
NGUYN ĐÌNH BO
Ễ Ả


I. KHÁI NI MỆ
I. KHÁI NI MỆ

PCR là ch vi t t t ca cm t ữ ế ắ ủ ụ ừ Polymerase Chain Reaction

PCR là Phn ng chui trùng hpả ứ ỗ ợ hay gi là "phn ng ọ ả ứ
khuch đi gen". ế ạ

PCR là mt k thut ph bi n trong sinh hc phân t nhộ ỹ ậ ổ ế ọ ử ằm
khuych đi (t o ra nhi u bn sao) mt đon DNA mà không ế ạ ạ ề ả ộ ạ
cn s dng các sinh vt sng nh ầ ử ụ ậ ố ư E. coli hay nm menấ .

PCR đ c s dng trong các nghiên cu sinh hc và y hc ượ ử ụ ứ ọ ọ
phc v nhi u mc đích khác nhau, nh phát hi n các ụ ụ ề ụ ư ệ
bnh di truynệ ề , nhn dng, chn đoán nhng ậ ạ ẩ ữ
bnh nhi m trùngệ ễ , tách dòng gene, và xác đnh huyt thngị ế ố

II.
II.
LCH SỊ Ử
LCH S
Ị Ử
Ph ng pháp căn bn chy PCR đ c
ươ ả ạ ượ
Kary Mullis

phát minh, ông đã đot
ạ
gi i Nobel v Hóa hc
ả ề ọ
vào
tháng 10 năm 1993 cho thành t u này, ch sau 7 năm
ự ỉ
khi ông đa ra ý t ng. Ý ki n c a Mullis là phát
ư ưở ế ủ
tri n mt quy trình mà DNA có th nhân lên nhi u l n
ể ộ ể ề ầ
mt cách nhân t o qua nhi u chu kỳ sao chép bi
ộ ạ ề ở
enzyme DNA polymerase

III. THC NGHI MỰ Ệ
III. THC NGHI MỰ Ệ
PCR
PCR


PCR đ c dùng đ khuch đi mt đon DNA ngn, đã ượ ể ế ạ ộ ạ ắ
xác đnh đ c mt phn. Đó có th là mt gen đn, hay ị ượ ộ ầ ể ộ ơ
mt phn ca gen.ộ ầ ủ

PCR cn r t nhi u thành phn. ầ ấ ề ầ
- DNA mu (template) cha mnh DNA cn khuch đi ẫ ứ ả ầ ế ạ
- Cp mi(primer), ặ ồ
- DNA-polymerase enzym xúc tác cho vi c nhân lên ca ệ ủ
DNA. - Nucleotides (ví d dNTP)là nguyên li u cho ụ ệ

DNA-polymerase đ xây dng DNA mi. ể ự ớ
- Dung dch đm, cung cp môi tr ng hóa hc cho ị ệ ấ ườ ọ
DNA-polymerase

III. THC NGHI M PCRỰ Ệ
III. THC NGHI M PCRỰ Ệ


PCR machine
chu kỳ nhi t. Đây là máy đun ệ
nóng và làm ngui trong ng ộ ố
phn ng nhi t đ chính ả ứ ở ệ ộ
xác cho mi phn ng. ỗ ả ứ
Đ ngăn nga s bay hi ca ể ừ ự ơ ủ
hn hp phn ng, phn np ỗ ợ ả ứ ầ ắ
đy ca máy PCR cũng đ c ậ ủ ượ
đun nóng, tr ng hp l ng ườ ợ ượ
dung dch phn ng quá ít, ị ả ứ
ng i ta cho mt l p du ườ ộớ ầ
(natural oil) lên trên b mt ề ặ
hn hp phn ng. Năm ỗ ợ ả ứ
2004, giá máy khong 2500 ả
USD Phn ng PCR đ c ả ứ ượ
thc hi n trong ự ệ

III.1 Đonạ miồ
Mi là nhng đon ngn, si DNA nhân t o –
ồ ữ ạ ắ ợ ạ
không quá 50 (th ng 18-25) nucleotides (vì
ườ

DNA th ng là si đôi, chi u dài ca nó đ c
ườ ợ ề ủ ượ
xác đnh bng s l ng cp base (bp); chi u
ị ằ ốượ ặ ề
dài ca si đn DNA đ c đo bng base hay
ủ ợ ơ ượ ằ
nucleotides)

III.2 Quy trình
Quy trình PCR gm 20 đn 30 chu kỳ. Mi
ồ ế ỗ
chu kỳ gm 3 b cồ ướ :
- Nhi t đ tăng lên 94-96°C đ tách hai si
ệ ộ ể ợ
DNA ra. B c này gi là bi n tính, nó phá v cu
ướ ọ ế ỡầ
ni hydrogen ni 2 si DNA.
ố ố ợ
- Sau khi 2 si DNA tách ra, nhi t đ đ c h
ợ ệ ộ ượ ạ
thp xung đ mi có th gn vào si DNA đn.
ấ ố ể ồ ể ắ ợ ơ
B c này gi là gn mi.
ướ ọ ắ ồ

- Cui cùng, DNA polymerase gn ti p vào
ố ắ ế
si tr ng. Nó bt đu bám vào và hot đng dc
ợ ố ắ ầ ạ ộ ọ
theo si DNA. B c này gi là kéo dài

ợ ướ ọ


IV. Nhng ng dng c a PCR
ữ ứ ụ ủ
IV. Nhng ng dng c a PCR
ữ ứ ụ ủ



Vân tay di truynề

Ki m tra huyt thngể ế ố

Chun đoán bnh di truynẩ ệ ề

Tách dòng gen

Gây đt bi n đi mộ ế ể

Phân tích mu DNA cẫ ổ

Xác đnh gen ca các đt bi n ị ủ ộ ế

So sánh mc đ bi u hi n ca genứ ộ ể ệ ủ


Bn Tre ng dng công ngh PCR Real-time trong
ế ứ ụ ệ
Bn Tre ng dng công ngh PCR Real-time trong

ế ứ ụ ệ
xét nghi m bnh tôm
ệ ệ
xét nghi m bnh tôm
ệ ệ

Vi c xét nghi m bnh tôm ệ ệ ệ
bng h thng PCR Real-time ằ ệ ố
đ c ti n hành theo qui trình ượ ế
khép kín.
Tr c tiên, mu tôm Post ướ ẫ
đ c nghi n nhuyn trong mt ượ ề ễ ộ
dung dch tách chi t gen di ị ế
truyn (DNA). ề
Sau đó, hn hp này ỗ ợ
đ c đa qua ni hp cách thy ượ ư ồ ấ ủ
trong vòng 10 phút nhm làm ằ
sc nhi t đ trích ly DNA. ố ệ ể

Bn Tre ng dng công ngh PCR Real-time trong xét
ế ứ ụ ệ
nghi m bnh tômệ ệ

Hn hp dung dch và tôm post ỗ ợ ị
nghi n nhuyn l i tr i qua công đon ề ễ ạ ả ạ
làm l nh nhanh, cho vào t đông ạ ủ ở
nhi t đ (-200C) trong vòng 15 phút. ệ ộ
Hn hp ti p t c đ c đa vào ỗ ợ ế ụ ượ ư
máy ly tâm khong 5 phút, vi t c đ ả ớố ộ
780.000 vòng/h đ loi t p cht. ể ạạ ấ

Phn cn bã và cht hu c b ầ ặ ấ ữ ơ ị
l ng xung đáy. Phn dung dch còn ắ ố ầ ị
l i có cha DNA. ạ ứ

Bn Tre ng dng công ngh PCR Real-time trong xét
ế ứ ụ ệ
nghi m bnh tômệ ệ

Dùng thi t b chuyên ế ị
dng l y khong 2 ụ ấ ả µl (microlít)
dung dch này cho vào mt ng ị ộố
có cha hóa cht gi là ng ứ ấ ọ ố
phn ng.ả ứ
ng phn ng đ c đt Ố ả ứ ượ ặ
vào máy l u nhi t trong vòng 2 ư ệ
ti ng đng h. Ti đây s di n ế ồ ồ ạ ẽ ễ
ra quá trình phn ng nhân ả ứ
bn DNA.ả

NG DNG K THUT PCR Ứ Ụ Ỹ Ậ
NG DNG K THUT PCR Ứ Ụ Ỹ Ậ
KHO SÁT S B TN SUT PHÂN Ả ƠỘẦ Ấ
KHO SÁT S B TN SUT PHÂN Ả ƠỘẦ Ấ
B CÁC ALEN CA LOCUS D7S820 Ố Ủ
B CÁC ALEN CA LOCUS D7S820 Ố Ủ
NG I VI T NAMƯỜ Ệ
NG I VI T NAMƯỜ Ệ

1. Nguyên li u
ệ

1. Nguyên li u
ệ
:
:
- Máu t i ca nhng ng i kho mnh
ươ ủ ữ ườ ẻ ạ
không có cùng quan h huyt thng do Vi n
ệ ế ố ệ
Quân y 108 cung cp.
ấ
- Hoá cht: Hoá cht cho tách chi t ADN
ấ ấ ế
(hãng Sigma); hoá cht dùng cho quá trình PCR
ấ
đi vi locus D7S820 (mi đc hi u cho locus
ố ớ ồ ặ ệ
D7S820 ca hãng Pharmacia-Thu Đi n; Taq ủ ỵ ể
ADN polymeraza-ca Vi n St rét Ký sinh trùng
ủ ệ ố
và Côn trùng Trung ng); hoá cht dùng cho
ươ ấ
đi n di và nhum băng ADN (ca các hãng
ệ ộ ủ
Promega, Pharmacia, Sigma, MERCK).
I. Ph ng pháp nghiên c uươ ứ

2. Ph ng pháp:ươ
a. Tách ADN:
ADN t máu đ c tách chi t theo ph ng pháp
ừ ượ ế ươ

chun dùng phenol và chloroform đ tinh s ch. Kt
ẩ ể ạ ế
qu tách chi t thu đ c ADN có đ tinh s ch khá
ả ế ượ ộ ạ
cao vi OD trung bình 1,75 và hàm l ng >50ng/ml
ớ ượ
b. K thut PCR:
ỹ ậ
Quá trình PCR vi các giai đon c bn: bi n tính,
ớ ạ ơả ế
gn mi và t ng hp. Quá trình đ c thc hi n vi
ắ ồ ổ ợ ượ ự ệ ớ
các nhi t đ gn mi khác nhau đ c l a chn t
ệ ộắ ồ ượ ự ọ ừ
50oC đn 58oC. Sn phm PCR sau đó đ c ki m
ế ả ẩ ượ ể
tra trên gel agaroza 2%, nhum ethidium bromide
ộ
(25mg/ml).

2. Ph ng pháp:
ươ
c. K thut đi n di:ỹ ậ ệ
Các mu sau khi thc hi n quá trình PCR ẫ ự ệ
đã đ c ki m tra trên gel agaroza 2% sau ượ ể
đó đ c đi n di trên gel polyacrylamide ượ ệ
6% s dng ure 7M. Băng ADN đ c ửụ ượ
phát hi n bng ph ng pháp nhum bc ệ ằ ươ ộ ạ
c a Bassam, 1991.ủ

d. Ph ng pháp chn l c và xây d ng
ươ ọ ọ ự
thang alen
* Đánh s alen theo quy c riêng: Da vào
ố ướ ự
các alen quan sát đ c c a các mu khác nhau
ượ ủ ẫ
trên bn đi n di, chúng tôi chn ra các mu
ả ệ ọ ẫ
mang các alen khác nhau và đánh s alen theo
ố
th t t d i lên trên (đánh s alen t băng
ứựừướ ố ừ
ADN có tr ng l ng phân t thp nht đn
ọ ượ ử ấ ấ ế
băng ADN có tr ng l ng phân t cao nht).
ọ ượ ử ấ
Vi c đánh s đây ch mang tính quy c sao
ệ ốở ỉ ướ
cho mi alen xác đnh đ c có ký hi u riêng, vì
ỗ ị ượ ệ
đây là quá trình kho sát ban đu cha có thang
ả ầ ư
alen chun đ so sánh.
ẩ ể

d. Ph ng pháp chn l c và xây d ng ươ ọ ọ ự
thang alen
* Xây dng thang alen: Trong quá trình ự
đánh s , chúng tôi đng thi chn ra

ố ồ ờ ọ
nhng mu mang nhng alen khác nhau
ữ ẫ ữ
t p hp l i đ t o thang alen. Thang alen
ậ ợ ạ ểạ
đ c t o bng ph ng pháp tr n mu.
ượ ạ ằ ươ ộ ẫ
* Chun thang alen: ký hi u l i các
ẩ ệ ạ
alen đã kho sát đ c theo quy c quc
ả ượ ướ ố
t . Alen c a locus D7S820 đ c ký hi u
ế ủ ượ ệ
t 6 đn 14 căn c vào s đon l p c a
ừ ế ứ ố ạ ặ ủ
mi alen. ỗ

II. Kt qu ế ả
1. Kt qu t i u nhi t đ gn mi quá
ế ảốư ệ ộ ắ ồ
trình PCR :
t t c các đi u ki n nhi t đ gn mi t ởấ ả ề ệ ệ ộ ắ ồừ
50oC đn 58oC đu có s hình thành sn
ế ề ự ả
phm PCR th hi n s có mt ca các ẩ ể ệ ởự ặ ủ
băng ADN trên bn gel agaroza. ả

Kt qu ki m tra s n phm PCR mt s mu trên gel ế ả ể ả ẩ ở ộ ố ẫ
agaroza theo đi u ki n nhi t đ gn mi 58oCề ệ ệ ộắ ồ

2. Kt qu chn l c alen và t o thang ế ả ọ ọ ạ
alen :
Thang alen chun ca locus D7S820 vi 7 alen khác ẩ ủ ớ
nhau đ c phân tách bng k thut đi n trên gel PA ượ ằ ỹ ậ ệ
bi n tính ế

Xác đnh quan h huyt thng: ị ệ ế ố
Xác đnh quan h huyt thng: ị ệ ế ố
Đt chính xác 99,9%ạ
Đt chính xác 99,9%ạ
GS Lê Đình L ng và các cng s đã t b ti n túi ươ ộ ự ựỏề
đ nghiên cu ng dng k thut này trong vi c
ể ứứ ụ ỹ ậ ệ
xác đnh quan h huyt thng
ị ệ ế ố
Đn năm 2000, vi đ tài "Xác đnh nhanh, chính
ế ớ ề ị
xác các đc tr ng cá th ng i bng k thut
ặ ư ểở ườ ằ ỹ ậ
PCR"
Vi các mu máu, tóc, n c bt các cá th khác
ớ ẫ ướ ọở ể
nhau, dùng PCR có th tìm ra các tính tr ng chung
ể ạ
các cá th có cùng huyt thng
ở ể ế ố

Hi n nay, đ xác đnh huyt thng, ệ ể ị ế ố
th gi i th ng dùng t 8-14 gen. ế ớ ườ ừ
Phòng thí nghi m ca chúng tôi đã ệ ủ

đa vào ng dng th ng xuyên hàng ư ứ ụ ườ
ngày 13 gen. Vì vi mi tr ng hp c ớ ỗ ườ ợ ụ
th, cn s dng nhng gien khác ể ầ ử ụ ữ
nhau và vi mi tr ng hp ch dùng ớ ỗ ườ ợ ỉ
t 8-14 gien là đ ừ ủ