Tài liệu Kỹ thuật điện di ADN - DNA electrophoresis pptx

Kỹ thuật điện di ADN
DNA electrophoresis
Khái niệm
DNA electrophoresis là quá trình
phân tách một hỗn hợp các phân
tử DNA nhờ một chất nền cố
định (gel) trong một điện trường.

ADN tich điện âm
vì gốc phosphat
hình thành khung
đường-phosphate
của phân tử AND
tích điện âm.

Trong điện trường di
chuyển về cực dương
Điện di ADN
Điện di ADN

Bản gel hoạt động như
một giá thể để phân tách
các đoạn ADN.

ADN th­êng ®­îc ®iÖn di
trªn hai lo¹i gel: agarose vµ
acrylamid

Các lỗ được tạo ra trong
bản gel. Chúng được xem
như là các giêngs để chứa

dung dịch AND
Agarose và Polyacrylamide
Agarose:
có khả năng phân tách các phân tử AND có kích
thước lớn khác nhau từ hàng chục thậm chí hàng
trăm Kilobase. Không độc
Polyacrylamide:
Có độ phân giả cao hơn song chỉ phân tách được
các đoạn AND có kích thước sai khác ít. Rất độc
Điện di ADN

Dung dịch AND
chứa hỗn hợp các
đoạn AND có kích
thước khác nhau
được đổ vào các
giêngs trong bản
gel.
Điện di ADN

Chất nền gel hoạt
động như một tấm
sàng (sieve). Các
phân tử AND lớn đi
qua các lỗ trong bản
gel khó khăn hơn các
phân tử AND nhỏ.

Vì vậy, các đoạn
phân tử lớn hơn sẽ bị

chậm lại so với các
phân tử nhỏ khi AND
di chuyển trong bản
gel.
Điện di ADN

Quá trình phân
tách cứ tiếp tục
tạo ra sự phân
tách giữa các
đoạn AND càng rõ
hơn.
Điện di ADN

Thang phân tử chuẩn
thương được đienj di
cùng với AND.

Thang chuẩn thường
là hỗn hợp các đoạn
AND đã biết trước
kich thước.

Được dùng để ước
lượng kích thước của
các đoạn AND trong
mẫu nghiên cứu.
Fig 20-1: DNA separation by gel electrophoresis
/>Một số bước chính trong kỹ thuật điện di
Hiện hinh các b ng ADN trên b n gel điện di

Phương pháp nhuộm Ethydium bromid, thuốc thử này
tạo các liên kết nhuộm với các bazơ nitơ. Khi chiếu
ánh sáng tử ngoại (cực tím) vào b n gel các liên kết
nhuộm sẽ hấp phụ các bước sóng 300 360nm và
phát huỳnh quang ở bước sóng 590 nm (màu da cam),
kết qu có thể ghi nhận bằng mắt thường và chụp nh
được.

Phương pháp nhuộm bạc. B n gel sau điện di được
ngâm vào dung dịch AgNO
3
, ADN sẽ tương tác với
AgNO
3
, khi bổ sung formaldehyt ở pH kiềm, ion bạc
chuyển thành bạc nguyên tử tạo các hạt bạc kết tụ có
màu xám, có thể phát hiện dễ dàng.
Kết quả điện di AND trên gel

This photograph is
of various types of
DNA that have
been
electrophoresed on
the same gel. Note
that high
molecular weight
DNAs do not
separate well on

this gel. This can
be corrected by
altering gel
density.


Kết quả điện di AND trên gel có nông đô
khác nhau
Faster migration
in a less concentrated gel
Tương quan giữa NĐ agarose và độ lớn của ADN
Stt % agarose KÝch th­íc m nh ADN (kb)ả
1.
 
0,3 5 - 60
2.
 
0,6 1 - 20
3.
 
0,7 0,8 - 10
4.
 
0,9 0,5 - 7
5.
 
1,2 0,4 - 6
6.
 
1,5 0,2 - 4

7.
 
2,0 0,1 - 3

Các đoạn DNA c c t b ng RE có thể tách khỏi nhau tương ứng với kích thước
của chúng khi chạy điện di trên gel agarose. Sau khi điện di các gel được nhuộm
ethidium bromide và có thể quan sát trực tiếp các đoạn cắt dưới ánh sáng tử ngoại
hoặc chụp nh. .vntime
Kỹ thuật lai phân tử
Cơ sở khoa học

Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế
bổ sung (Complementarity)
1) DNA-DNA.
2) DNA-RNA.
3) Protein-Protein (thường ở dạng phức hợp kháng
nguyên-kháng thể )

Các dạng phức hợp lai bổ sung
Lai DNA-DNA hoặc DNA-RNA
Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai
mạch đơn DNA. Cơ sở của việc lai phân tử là
các mối liên kết hydro giữa các base trên hai
mạch. Giữa một base A và một base T hình
thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình
thành ba liên kết.