Máy xét nghiệm miễn dịch TOSHO AIA 360
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.2 MB, 90 trang )
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN ĐIỆN TỬ - VIỄN THÔNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ ĐIỆN TỬ & KỸ THUẬT Y SINH
--------
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
ĐỀ TÀI: MÁY XÉT NGHIỆM MIỄN DỊCH TOSHO AIA 360
Giảng viên hướng dẫn:
Sinh viên thực hiện:
TS Đặng Quang Hiếu
Hà Nội - 2017
Nhận xét đồ án dùng cho giảng viên hướng dẫn
Đánh giá quyển đồ án thực tập tốt nghiệp
(Dùng cho giảng viên hướng dẫn)
Giảng viên đánh giá:..........................................................................................................
Chọn các mức điểm phù hợp cho sinh viên trình bày theo các tiêu chí dưới đây:
Rất kém (1); Kém (2); Đạt (3); Giỏi (4); Xuất sắc (5)
Có sự kết hợp giữa lý thuyết và thực hành (20)
Nêu rõ tính cấp thiết và quan trọng của đề tài, các vấn đề và
1 các giả thuyết (bao gồm mục đích và tính phù hợp) cũng như 1
2
3
4
5
2
2
3
3
4
4
5
5
2
3
4
5
2
3
4
5
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
phạm vi ứng dụng của đồ án
2 Cập nhật kết quả nghiên cứu gần đây nhất (trong nước/quốc tế) 1
3 Nêu rõ và chi tiết phương pháp nghiên cứu/giải quyết vấn đề
1
Có kết quả mơ phỏng/thưc nghiệm và trình bày rõ ràng kết quả
4
1
đạt được
Có khả năng phân tích và đánh giá kết quả (15)
Kế hoạch làm việc rõ ràng bao gồm mục tiêu và phương pháp thực
5
1
hiện dựa trên kết quả nghiên cứu lý thuyết một cách có hệ thống
Kết quả được trình bày một cách logic và dễ hiểu, tất cả kết
6
1
quả đều được phân tích và đánh giá thỏa đáng.
Trong phần kết luận, tác giả chỉ rõ sự khác biệt (nếu có) giữa
7
kết quả đạt được và mục tiêu ban đầu đề ra đồng thời cung cấp
lập luận để đề xuất hướng giải quyết có thể thực hiện trong
tương lai.
Kỹ năng viết (10)
Đồ án trình bày đúng mẫu quy định với cấu trúc các chương
logic và đẹp mắt (bảng biểu, hình ảnh rõ ràng, có tiêu đề, được
8
đánh số thứ tự và được giải thích hay đề cập đến trong đồ án,
có căn lề, dấu cách sau dấu chấm, dấu phẩy v.v), có mở đầu
chương và kết luận chương, có liệt kê tài liệu tham khảo và có
9
trích dẫn đúng quy định
Kỹ năng viết xuất sắc (cấu trúc câu chuẩn, văn phong khoa
học, lập luận logic và có cơ sở, từ vựng sử dụng phù hợp v.v.)
Thành tựu nghiên cứu khoa học (5) (chọn 1 trong 3 trường hợp)
Có bài báo khoa học được đăng hoặc chấp nhận đăng/đạt giải
10a
SVNC khoa học giải 3 cấp Viện trở lên/các giải thưởng khoa
5
học (quốc tế/trong nước) từ giải 3 trở lên/ Có đăng ký bằng
phát minh sáng chế
Được báo cáo tại hội đồng cấp Viện trong hội nghị sinh viên
10b
nghiên cứu khoa học nhưng không đạt giải từ giải 3 trở
2
lên/Đạt giải khuyến khích trong các kỳ thi quốc gia và quốc tế
khác về chuyên ngành như TI contest.
10c Khơng có thành tích về nghiên cứu khoa học
Điểm tổng
Điểm tổng quy đổi về thang 10
0
/50
3. Nhận xét thêm của Thầy/Cô (giảng viên hướng dẫn nhận xét về thái độ và tinh
thần làm việc của sinh viên)
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
Ngày:
/
/ 2017
Người nhận xét
(Ký và ghi rõ họ tên)
Nhận xét đồ án dùng cho cán bộ phản biện
Đánh giá quyển đồ án thực tập tốt nghiệp
(Dùng cho cán bộ phản biện)
Giảng viên đánh giá:.........................................................................................................
Chọn các mức điểm phù hợp cho sinh viên trình bày theo các tiêu chí dưới đây:
Rất kém (1); Kém (2); Đạt (3); Giỏi (4); Xuất sắc (5)
Có sự kết hợp giữa lý thuyết và thực hành (20)
Nêu rõ tính cấp thiết và quan trọng của đề tài, các vấn đề và
1 các giả thuyết (bao gồm mục đích và tính phù hợp) cũng như 1 2 3 4 5
phạm vi ứng dụng của đồ án
2 Cập nhật kết quả nghiên cứu gần đây nhất (trong nước/quốc tế) 1 2 3 4 5
3 Nêu rõ và chi tiết phương pháp nghiên cứu/giải quyết vấn đề
1 2 3 4 5
Có kết quả mơ phỏng/thưc nghiệm và trình bày rõ ràng kết quả
4
1 2 3 4 5
đạt được
Có khả năng phân tích và đánh giá kết quả (15)
Kế hoạch làm việc rõ ràng bao gồm mục tiêu và phương
5 pháp thực hiện dựa trên kết quả nghiên cứu lý thuyết một 1 2 3 4 5
6
7
cách có hệ thống
Kết quả được trình bày một cách logic và dễ hiểu, tất cả kết
quả đều được phân tích và đánh giá thỏa đáng.
Trong phần kết luận, tác giả chỉ rõ sự khác biệt (nếu có) giữa
kết quả đạt được và mục tiêu ban đầu đề ra đồng thời cung cấp
lập luận để đề xuất hướng giải quyết có thể thực hiện trong
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
tương lai.
Kỹ năng viết (10)
Đồ án trình bày đúng mẫu quy định với cấu trúc các chương
logic và đẹp mắt (bảng biểu, hình ảnh rõ ràng, có tiêu đề, được
8
đánh số thứ tự và được giải thích hay đề cập đến trong đồ án,
có căn lề, dấu cách sau dấu chấm, dấu phẩy v.v), có mở đầu
1 2 3 4 5
chương và kết luận chương, có liệt kê tài liệu tham khảo và có
9
trích dẫn đúng quy định
Kỹ năng viết xuất sắc (cấu trúc câu chuẩn, văn phong khoa
1 2 3 4 5
học, lập luận logic và có cơ sở, từ vựng sử dụng phù hợp v.v.)
Thành tựu nghiên cứu khoa học (5) (chọn 1 trong 3 trường hợp)
10a Có bài báo khoa học được đăng hoặc chấp nhận đăng/đạt giải
5
SVNC khoa học giải 3 cấp Viện trở lên/các giải thưởng khoa
học (quốc tế/trong nước) từ giải 3 trở lên/ Có đăng ký bằng
phát minh sáng chế
Được báo cáo tại hội đồng cấp Viện trong hội nghị sinh viên
10b
nghiên cứu khoa học nhưng khơng đạt giải từ giải 3 trở
2
lên/Đạt giải khuyến khích trong các kỳ thi quốc gia và quốc tế
khác về chun ngành như TI contest.
10c Khơng có thành tích về nghiên cứu khoa học
Điểm tổng
0
/50
Điểm tổng quy đổi về thang 10
3. Nhận xét thêm của Thầy/Cô
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
Ngày:
/
/2017
Người nhận xét
(Ký và ghi rõ họ tên)
MỤC LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................... Error: Reference source not found
CÁC TỪ VIẾT TẮT
CAL.:
ACCEPT… Chấp nhận dữ liệu hiệu chuẩn tự động
REJECT … Chấp nhận dữ liệu hiệu chuẩn tự động
Kết quả:
INCOMPLETE… Khơng hồn thành kết quả phân tích
RATE… Chỉ chứa giá trị tỷ lệ
CONC… chỉ chứa giá trị tỷ lệ và nồng độ
* Chi tiết miêu tả của ký hiệu và hành động
SE:
Phân tích khơng thể hồn thành do xảy ra lỗi mà không phá hỏng các thiết bị.
ME: Item phân tích khơng thể đọc ở hiệu chuẩn hoặc nó là thiết bị khơng được sử
dụng trong AIA-360. Kiểm tra nhãn của cốc test và phân tích lại.
Kí hiệu xuất hiện liên tục, thiết bị đọc cốc đã được di dời. Liên hệ với phịng
dịch vụ
Kí hiệu có thể được gắn nếu cốc test không được kiểm tra bằng cách nhấn [SKIP]
in ở giao diện CALB REQUEST.
AE:
Item phân tích có thể khơng được đọc bởi thiết bị đọc cốc. Trong trường hợp
này, khơng có u cầu phân tích giả định và phân tích bị hủy. Kiểm tra nhãn
trên cốc test và phân tích lại.
Nếu kí hiệu xuất hiện liên tục, đầu đọc cốc có thể bị di rời. Liên hệ với phịng
dịch vụ
NB:
Khóa của cốc test khơng được phá.Phân tích bị hủy.
Van cơng tắc có thể bị bẩn lưỡi hoặc di rời. Liên hệ với phòng dịch vụ
IM:
Mẫu bị nhảy qua vì ID vào mẫu khơng khớp với một lần đọc bởi đầu đọc mã
hóa xây dựng. Phân tích lại sau khi kiểm tra vị trí nhãn mã hóa và chất lượng
cũng như yêu cầu mẫu.
WU: Trong khi rửa B/F, dung dịch rửa không nên tháo cạn.
Nếu xuất hiện kí hiệu liên tục, đầu của B/F rửa có thể bị bẩn hoặc tắc.Liên hệ
với phịng dịch vụ.
DS:
Phát hiện khơng đủ dung môi.
Bổ dung dung môi và lặp lại phân tích.
WS: Phát hiện khơng đủ dung dịch rửa.
Bổ dung dung dịch rửa và lặp lại phân tích.
SS:
Phân tích bị hủy vì khơng đủ mẫu.
Nếu kí hiệu xuất hiện đó có nghĩa là khơng đủ mẫu, do vòi phun mẫu hoặc cảm
biến phát hiện mẫu bị lỗi. Nếu vấn đề xảy ra thường xuyên, liên hệ với phịng
dịch vụ.
SP:
Bình chứa nước thải bị đầy.
Loại chất lỏng thải đi và phân tích lại.
SC:
Phân phát bị hủy bỏ vì tắc phát hiện trong quá trình hút mẫu.
Kiểm tra rằng mẫu khơng có fibrin hoặc các chất khác. Nếu mẫu khơng bị
nhiễm, vịi phun mẫu có thể bị lỗi hoặc các ống bị tắc. Nếu vấn đề xảy ra
thường xuyên, liên hệ với phịng dịch vụ.
LE:
Số lơ của item phân tích khơng thể được đọc bởi thiết bị đọc cốc.
Trong trường hợp này, khơng có u cầu phân tích được giả định và phân tích
bị hủy. Kiểm tra nhãn trên cốc test và phân tích lại. Nếu kí hiệu xuất hiện liên
tục, đầu đọc cốc có thể bị di rời. Liên hệ với phịng dịch vụ.
DO:
Khơng đo được kết quả vì vùng đo vượt quá phạm vi phát hiện của detector.
Pha loãng mẫu tới nồng độ được chấp nhận và phân tích lại.
NC:
Khơng có kết quả vì khơng có đường hiệu chuẩn cho item hoặc lơ.
Ngồi ra nồng độ được tính tốn bởi đường chuẩn trong vịng 60 ngày hoặc
sớm hơn.
Trong trường hợp này, xây dựng đương chuẩn và tính tốn lại kết quả.
CE:
Khơng có kết quả vì lỗi vận hành xảy ra trong khi tính tốn rate hoặc chuyển
đổi nồng độ. Một item sử dụng đường hiệu chuẩn đa điểm có thể gây lỗi đối với
một số liên hệ giữa dạng đường chuẩn và phạm vi chuyển đổi của nồng độ.
Kiểm tra đường chuẩn khơng có giá trị tối thiểu hoặc tối đa trong vùng hiệu
chuẩn, và các vùng hiệu chuẩn được chỉ định bởi nhà sản xuất.
Về phạm vi của vùng hiệu chuẩn, giá trị tối thiểu được đặt là ASSAY L và giá
trị tối đa được đặt là ASSAY R trong giao diện TEST FILE.
Giá trị tối đa
Giá trị tối đa
trị tối thiểu
Giá trị tốiGiá
thiểu
>H: Kết quả phân tích khơng được chấp nhận bởi nằm dưới vùng hiệu chuẩn. Pha
loãng mẫu tới nồng độ quy định và phân tích lại
IO: Nhiệt độ vượt quá vùng điều khiển được.
Kí hiệu xuất hiện thường xuyên, liên hệ với phịng dịch vụ
MF: Một kí hiệu được gắn do sự bất thường trong quá trình pha chế mẫu.
Tiếp tục vận hành nhưng lỗi trở lại vơ hiệu hóa phân tích.
BS: Khơng đủ cơ chất enzyme.
Thay thế cơ chất enzym.
HB: Các cơ chất đã bị phân hủy và đường nền cao.
Nếu đường nền cơ chất cao, sự khuếch tán vùng hoạt động của enzyme thấp sẽ
lớn. Thay thế cơ chất và phân tích lại.
Nếu kí hiệu này xuất hiện ngay cả khi sau khi cơ chất đã được thay, đường dẫn
cơ chất có thể đã bị ơ nhiễm. Trong trường hợp này, liên hệ với phòng dịch vụ
CV: Đường hiệu chuẩn hết hạn. Thiết lập đường chuẩn cho cùng lơ đó và tính tốn
trên giao diện RESULT REVIEW.
Nếu đã quá 60 ngày từ ngày hết hạn, kết quả phân tích sẽ bị báo cáo với giá trị
rate gắn kí hiệu NC.
DL:
Lượng pha chế cơ chất ít hơn lượng quy định hoặc cường độ của đèn huỳnh
quang thấp. Nếu gắn kí hiệu DL, thay thế cơ chất (giao diện MAINTE → 6.
REPLACE SUBSTRATE
) và phân tích lại. Nếu kí hiệu DK xuất hiện lại,
liên hệ với phòng dịch vụ.
MA: Phân tích item đọc bằng camera khác với item phân tích được yêu cầu. Kiểm tra
đọc và yêu cầu các item.
DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.2 - Đĩa ELISA pha rắn........................................................................................4
Hình 1.2 ELISA Pipet....................................................................................................4
Hình 1.3 Hệ thống máy rửa............................................................................................5
Hình 1.4 Máy đọc kết quả ELISA.................................................................................5
Hình 3.2: mặt ngồi của AIA-360................................................................................22
Hình 3.2.5: Khơng gian cần thiết cho việc lắp đặt.......................................................26
Hình 3.2.6: Lắp đặt các cổng phân nhánh....................................................................27
Hình 3.2.7: Thứ tự lắp đặt các chai..............................................................................28
Hình 1.2.8: Dây dẫn bộ cảm biến.................................................................................29
Hình 1.2.9.1: Máy in....................................................................................................30
Hình 1.2.9.2: Lắp đặt giấy in.......................................................................................30
Hình 1.2.9.3: Lắp đặt máy in.......................................................................................31
Hình 3.2.10.1: Bộ phận giữ cơ chất.............................................................................31
Hình 3.2.10.2: Gắn bộ phận giữ cơ chất......................................................................32
Hình 3.2.10.3: Giá đỡ cơ chất và chai chứa enzyme cơ chất........................................32
Hình 3.2.11: Vị trí cáp cung cấp điện...........................................................................33
Hình 3.3: Khái qt các bộ phận chính........................................................................34
Hình 3.3.1: Màn hình chính.........................................................................................35
Hình 3.3.2: Băng chuyền khi mở cửa...........................................................................36
Hình 3.4.2: Nút nguồn.................................................................................................38
Hình 3.4.2.2: Bản in mẫu.............................................................................................42
Hình 3.6.1: Quy trình nạp ông nghiệm và côc thuốc thử.............................................57
Hình 3.6.2: Bản in kết quả phân tích mẫu....................................................................62
Hình 3.9: Mẫu bản in của các kết quả đo đường nền cơ chất.......................................71
3：PRIME SAMPLE DILUENT：Được sử dụng khi làm đầy dung mơi. Q trình này
được sử dụng khi mồi hệ thống với dung mơi..............................................................71
Hình 3.10: Bản in mẫu TEST FILE.............................................................................73
LỜI NÓI ĐẦU
Ngày nay với sự phát triển ồ ạt của khoa học kỹ thuật, thời đại bùng nổ của
công nghệ, ngành y tế cũng không ngoại lệ với các ngành khác, nhờ khoa học kỹ thuật
tiên tiến, đã có một bước nhẩy vọt về công nghệ, đây là một phần quan trọng trong
việc chẩn đốn bệnh nhanh chóng, chính xác và hiệu quả. Sự phát triển kinh tế xã hội
nên nhu cầu khám chữa bệnh của người dân tại các cơ sở y tế ngày càng được chú
trong nhiều hơn, do vậy việc nâng cao chất lượng về cả chuyên môn lẫn trang thiết bị
y tế cần được đầu tư đồng bộ hiện đại có độ chính sác cao và sử dụng hiệu quả nhằm
đáp ứng đủ với nhu cầu thăm khám sức khỏe của người dân.
Cho nên thiết bị y tế là một phương tiện không thể thiếu được trong cơng tác
chăm sóc sức khỏe nhân dân của các thầy thuốc.Với sự trợ giúp của thiết bị, các thầy
thuốc hiểu rõ hơn các tổ chức và hoạt động sinh học của cơ thể con người từ các cơ
quan nội tạng đến từng tế bào của cơ thể, tiến tới chẩn đốn bệnh được chính xác
nhanh chóng và điều trị đạt kết quả tốt.
Các xét nghiệm miễn dịch được áp dụng nhiều trong bệnh học giúp các bác sỹ
chẩn đốn bệnh chính xác cũng như q trình điều trị của cá bệnh lý có liên quan như:
Ung thư, Tuyến giáp,Thai sản,Tim mạch,Thiếu máu,Đường huyết
Trong đồ án này em có trình bày những vấn đề sau :
*Tổng quát về miễn dịch elisa
* cấu tạo và nguyên lý trung của máy miễn dịch tự động tosho AIA 360
* vận hành TOSHO AIA 360
Để hoàn thành được đồ án này, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các
thầy hướng dẫn chỉ bảo những kiến thức cần thiết, những tài liệu tham khảo phục vụ
cho đồ án cũng như cho thực tế sau này.
Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đối với sự hướng dẫn
và giúp đỡ nhiệt tình của giáo viên hướng dẫn: thầy giáo TS Đặng Quang Hiếu. Đồng
thời em xin cảm ơn thầy cô cùng bạn bè đã giúp đỡ em trong quá trình học tập và
trong thời gian làm đồ án.
1
Quá trình thực hiện đồ án tuy đã cố gắng, song em khơng thể tránh khỏi những
thiếu sót do chưa có kinh nghiệm thực tế, em mong muốn nhận được sự chỉ bảo của
các thầy cô trong khi chấm đồ án và bảo vệ đồ án của em.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2017
Sinh viên thực hiện
2
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), còn được gọi là enzyme
immunoassay (EIA), là một kỹ thuật sinh hóa sử dụng chủ yếu trong miễn dịch
học để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một
mẫu. ELISA được sử dụng như một cơng cụ chẩn đốn trong y học và bệnh lý học
thực vật, cũng như kiểm tra kiểm soát chất lượng trong các ngành công nghiệp khác
nhau, chẳng hạn như ứng dụng ELISA trong ngành công nghiệp thực phẩm. Theo
thuật ngữ đơn giản, trong kỹ thuật ELISA, một lượng của kháng nguyên được gắn
liền với một bề mặt, và sau đó là một kháng thể đặc hiệu được cho vào trên bề mặt
để nó có thể liên kết với các kháng nguyên. Kháng thể này sẽ liên kết với một loại
enzyme, và cuối cùng thêm cơ chất để enzyme phân giải cơ chất và phát ra
những tín hiệu, phổ biến nhất là sự đổi màu một chất hóa học.
1.1. Cơ chế của ELISA là gì?
Để thực hiện một phản ứng ELISA bao gồm ít nhất một kháng thể bắt cặp đặc
hiệu với kháng nguyên cụ thể. Các mẫu có số lượng kháng nguyên chưa biết được cố
định trên một bề mặt vững chắc- giá thể rắn (thường là một tấm polystyrene vi
chuẩn) hoặc không đặc hiệu (thông qua hấp phụ lên bề mặt) hoặc đặc hiệu (thông
qua chụp bằng kháng thể khác đặc hiệu với kháng nguyên tương tự trong thí nghiệm
ELISA sandwich).
Sau khi kháng nguyên được cố định, các kháng thể phát hiện được thêm vào,
tạo thành một phức hợp với các kháng nguyên. Các kháng thể phát hiện có thể liên
kết với một loại enzyme, hay chính nó có thể được phát hiện bởi một kháng thể thứ
cấp liên kết với một loại enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử
sinh học. Các phần của kháng thể ELISA là tương tự với phương pháp western blot.
Giữa mỗi bước, các đĩa thường được rửa bằng dung dịch tẩy nhẹ để loại bỏ
các protein hoặc các kháng thể không gắn. Sau bước rửa cuối cùng, cơ chất
của enzyme được thêm vào để tạo ra tín hiệu có thể nhìn thấy, giúp chỉ ra số lượng
kháng nguyên trong mẫu.
1.2. Thiết bị cần thiết cho một phản ứng ELISA
3
- Đĩa ELISA pha rắn
Hình 1.2 - Đĩa ELISA pha rắn
Đĩa ELISA 96 giếng được sử dụng nhiều nhất trong ELISA thường là
polystyrene hoặc các dẫn xuất của polystyrene thu được bằng cách biến đổi hóa học
hoặc chiếu xạ bề mặt. Phổ biến nhất là đĩa 96 giếng được tổ chức thành 8 hàng và 12
cột. Mỗi giếng giữ khoảng 350 µl thể tích với một khu vực bên trong khoảng 2,5 cm 2.
Gần đây hơn, đĩa 384 giếng và 1536 giếng đã được phát triển với kích thước tổng thể
giống như truyền thống 96 giếng. Chúng được sử dụng trong việc kiểm tra lượng mẫu
lớn. Ngồi ra, cũng có đĩa 96 giếng với giếng bằng một nửa thể tích giếng truyền
thống. Phân tích được thực hiện trong các giếng với thể tích bằng một nửa này là
giống hệt về hiệu suất với đĩa kích thước truyền thống, nhưng tiết kiệm đáng kể về
thành phần phản ứng. Một sự đổi mới gần đây cũng đã đề nghị làm tròn phần đáy
giếng thay vì ở một góc 90 độ. Điều này đã giúp cho việc rửa dễ dàng hơn và tăng hiệu
quả rửa.
- ELISA Pipet
Hình 1.2 ELISA Pipet
Có 2 loại pipet thường được sử dụng là pipet đa kênh và pipet đơn kênh. Pipet
4
đơn kênh chia làm 2 dạng: cố định thể tích và điều chỉnh thể tích (1- 20 ml, 10- 100
ml, 20- 200 ml..), còn pipet đa kênh thường được dùng là loại 8 đầu tip và 12 đầu tip
để phù hợp với số lượng hàng và cột của đĩa ELISA. Về thao tác có thể chia thành
pipet phân phối bán tự động và pipet phân phối hoàn toàn tự động.
- Hệ thống máy rửa
Hình 1.3 Hệ thống máy rửa
Hệ thống máy rửa ELISA có thể chia thành các loại như sau: có thể rửa một
hàng hoặc cột tại một thời điểm, có thể rửa một lúc cả đĩa hoặc rửa một lần nhiều đĩa.
Tùy thuộc vào mục đích cơng việc mà ta lựa chọn loại máy phù hợp.
- Máy đọc kết quả ELISA
Hình 1.4 Máy đọc kết quả ELISA
Tương tự máy rửa ELISA, máy đọc ELISA cũng chia thành 3 nhóm: có thể đọc
5
một hàng hoặc cột trong một lần, có thể đọc kết quả của cả đĩa cùng một lần hoặc đọc
kết quả nhiều đĩa cùng một lúc.
1.3. Các loại ELISA
a) Direct ELISA ( ELISA trực tiếp) - Đơn giản và tiết kiệm thời gian
Phương pháp ELISA trực tiếp được coi là loại đơn giản nhất trong các phương
pháp ELISA, kháng nguyên (Antigen- Ag) được hấp phụ lên một tấm nhựa, sau đó
một lượng lớn của một loại protein (thường là albumin huyết thanh bị- BSA) được
thêm vào để khóa tất cả các vị trí liên kết khác. Trong lúc đó, một loại enzyme sẽ liên
kết với một kháng thể trong một phản ứng riêng biệt, phức hợp enzyme- kháng thể này
được sử dụng để hấp phụ các kháng nguyên. Sau khi phức enzyme- kháng thể dư thừa
bị loại bỏ hết, phức hợp enzyme- kháng thể nào gắn với kháng nguyên sẽ còn lại trên
giếng. Bằng cách thêm vào cơ chất của enzyme, tín hiệu phát ra đại diện cho lượng
kháng nguyên trong mẫu.
Tuy nhiên, so sánh ELISA trực tiếp với ELISA gián tiếp về mặt kỹ thuật thì
thấy, trong ELISA gián tiếp, các bước tiến hành cũng tương tự nhưng có những khác
biệt quan trọng và có thêm một bước bổ sung. Sau khi kháng nguyên được hấp thụ vào
các đĩa, và sau bước cho BSA, các kháng thể tiếp theo sẽ được thêm vào là các kháng
thể có thể nhận diện các kháng nguyên (kháng thể này không gắn enzyme). Sau đó,
một kháng thể gắn enzyme đã được chuẩn bị và thêm vào đĩa nhằm phát hiện các
kháng thể hấp phụ với kháng nguyên (còn trong ELISA trực tiếp, phức hệ kháng thểenzyme sẽ trực tiếp hấp thụ với kháng nguyên).
•
Ưu điểm của phương pháp ELISA trực tiếp
6
So với các phương pháp ELISA khác, phương pháp này được thực hiện trong
thời gian ngắn hơn vì chỉ có một kháng thể được sử dụng và ít bước tiến hành hơn.
Điều này có thể được sử dụng để kiểm tra phản ứng kháng thể - kháng nguyên cụ thể,
và giúp loại bỏ phản ứng chéo giữa các kháng thể khác.
•
Nhược điểm của phương pháp ELISA trực tiếp
Các kháng thể chính phải được đánh dấu riêng, nên tốn nhiều thời gian và
khơng linh hoạt khi thực hiện nhiều thí nghiệm.
Ngồi ra, kỹ thuật này có độ nhạy thấp hơn do các tín hiệu được khuếch đại ít
hơn, nghĩa là độ nhạy thấp hơn.
b) ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)- Thông dụng nhưng hiệu quả
Phương pháp ELISA gián tiếp bao gồm hai bước ELISA liên quan đến hai quá
trình gắn của kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp được đánh dấu. Kháng thể sơ cấp
được ủ với kháng nguyên và sau đó là ủ với kháng thể thứ cấp. Tuy nhiên, việc này có
thể dẫn đến các tín hiệu khơng đặc hiệu bởi vì xảy ra các phản ứng chéo của kháng thể
thứ cấp.
Các bước cơ bản trong ELISA gián tiếp:
1. Các đĩa giếng được ủ với kháng nguyên, rửa và khóa bằng BSA.
2. Thêm mẫu và kháng thể vào và rửa.
3. Enzyme gắn với kháng thể thứ cấp được thêm vào và rửa.
4. Thêm cơ chất, enzyme trên kháng thể tạo ra tín hiệu màu hoặc huỳnh quang.
•
Ưu điểm của phương pháp ELISA gián tiếp
+ Độ nhạy cao: Nhiều hơn một kháng thể được đánh dấu và gắn trên mỗi phân
tử kháng nguyên.
+ Linh động: Nhiều kháng thể sơ cấp khác nhau có thể được dùng với một
kháng thể thứ cấp có đánh dấu.
7
+ Tiết kiệm: Kháng thể thứ cấp được đánh dấu được dùng ít hơn.
Trong phân tích ELISA gián tiếp, kháng thể của mẫu được kẹp theo dạng
sandwich ở giữa kháng nguyên trên đĩa và enzyme đánh dấu, liên kết kháng đặc hiệu
globulin. Việc thêm cơ chất của enzyme vào tạo ra phản ứng màu. Cường độ màu tỉ lệ
thuận với lượng kháng thể của mẫu. Mẫu càng nhiều kháng thể, cường độ màu càng
mạnh. ELISA gián tiếp phù hợp cho việc xác định mức độ tổng kháng thể có trong mẫu.
c) ELISA sandwich - Độ nhạy cao
ELISA sandwich là một loại ít phổ biến của kỹ thuật ELISA, nhưng rất hiệu quả
trong việc phát hiện kháng nguyên trong mẫu. Hơn nữa, nhiều bộ kit thương mại
ELISA được xây dựng dựa trên loại ELISA này.
ELISA sandwich định lượng kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể (kháng thể
bắt- capture và phát hiện- detection). Các kháng nguyên được định lượng phải chứa ít
nhất hai epitope kháng nguyên có khả năng liên kết với các kháng thể, ít nhất là với hai
kháng thể hoạt động trong kỹ thuật sandwich. Các kháng thể đơn dòng hoặc đa dịng
đều có thể được sử dụng như là các kháng thể bắt và kháng thể phát hiện trong hệ thống
ELISA sandwich. Kháng thể đơn dịng có một epitope duy nhất cho phép phát hiện và
định lượng tốt sự khác biệt nhỏ trong kháng nguyên. Một kháng thể đa dòng thường
được sử dụng như các kháng thể bắt giữ càng nhiều kháng nguyên càng tốt. (EpitopeQuyết định kháng nguyên, là vị trí trên kháng nguyên, nơi gắn với kháng thể).
Quy trình ELISA sandwich có thể khó khăn để tối ưu hóa và cần phải kiểm tra
các kháng thể bắt cặp sai. Điều này đảm bảo các kháng thể này phát hiện được
các epitope khác nhau trên một protein đích để chúng không cản trở các kháng thể
đang gắn.
Các bước thực hiện:
8
•
Chuẩn bị bề mặt đã biết trước lượng kháng thể bắt được gắn.
•
Khóa các vị trí bám khơng đặc hiệu trên bề mặt.
•
Cho các mẫu có chứa kháng ngun lên đĩa.
•
Rửa đĩa, để loại bỏ các kháng ngun khơng gắn.
•
Thêm một kháng thể đặc hiệu vào, và gắn với kháng nguyên (do đó gọi là
"sandwich": kháng nguyên bị kẹp giữa hai kháng thể);
•
Thêm kháng thể thứ cấp liên kết enzyme - đây là kháng thể phát hiện, kháng
thể này sẽ liên kết đặc hiệu với vùng Fc của kháng thể (khơng đặc hiệu).
•
Rửa đĩa, để các liên kết enzyme- kháng thể khơng gắn bị loại bỏ.
•
Thêm cơ chất của enzyme để tạo màu hoặc tín hiệu huỳnh quang hoặc điện hóa.
•
Đo độ hấp thụ hoặc huỳnh quang hoặc tín hiệu điện của các giếng để xác
định sự có mặt và số lượng kháng ngun.
Những hình ảnh ở phía dưới bao gồm việc sử dụng một kháng thể thứ cấp liên
kết với enzyme, mặc dù, theo phương diện kỹ thuật, điều này là không cần thiết nếu
các kháng thể sơ cấp liên kết với enzyme. Tuy nhiên, việc sử dụng một liên kết kháng
thể thứ cấp sẽ tránh được quá trình tốn kém của việc tạo ra các kháng thể liên kết
enzyme cho mỗi kháng nguyên mà người ta muốn phát hiện.
Bằng cách sử dụng một kháng thể liên kết enzyme liên kết với các khu vực Fc
của kháng thể khác, một kháng thể liên kết enzyme giống như vậy có thể được sử
dụng cho một loạt các thí nghiệm. Nếu khơng có kháng thể bắt giữ ở lớp đầu tiên, bất
kỳ protein trong mẫu (bao gồm các protein huyết thanh) cũng có thể hấp phụ lên bề
mặt đĩa, làm giảm số lượng kháng nguyên cố định được. Sử dụng các kháng thể đặc
hiệu đã được tinh sạch để gắn với các kháng nguyên trong đĩa sẽ giúp giảm
bớt việc làm sạch kháng nguyên từ một hỗn hợp phức tạp trước khi định lượng, đơn
giản hóa phân tích và tăng độ đặc hiệu và độ nhạy của thí nghiệm ELISA sandwich.
Quy trình ELISA sandwich
9
(1) Đĩa được phủ một lớp kháng thể bắt giữ; (2) Thêm mẫu, bất kì kháng ngun
nào có mặt sẽ liên kết với kháng thể bắt giữ; (3) Kháng thể phát hiện được thêm vào, và
gắn với kháng nguyên; (4) Kháng thể thứ cấp liên kết enzyme được thêm vào, và gắn với
kháng thể phát hiện; (5) Thêm cơ chất của enzyme và phát tín hiệu.
•
Ưu điểm của phương pháp Sandwich ELISA:
+ Mẫu không cần phải được tinh sạch trước khi phân tích.
+ Độ đặc hiệu cao, vì sử dụng hai kháng thể nên các kháng nguyên/ chất phân
tích được bắt và phát hiện đặc hiệu.
+ Thích hợp cho các mẫu phức tạp, bới vì các kháng ngun khơng u cầu đòi
hỏi phải tinh sạch trước khi tiến hành định lượng.
+ Linh hoạt và độ nhạy cao, vì cả hai phương pháp phát hiện trực tiếp và gián
tiếp đều có thể được sử dụng. Độ nhạy cao hơn 2-5 lần so với phương pháp ELISA
trực tiếp hoặc gián tiếp, nhưng thấp hơn ELISpot.
d) ELISA cạnh tranh: Nguyên tắc cơ bản
Vấn đề chủ yếu của ELISA cạnh tranh là quá trình gắn cạnh tranh thực hiện bởi
kháng nguyên gốc (kháng nguyên mẫu) và kháng nguyên được thêm vào. Quy trình
của phương pháp ELISA cạnh tranh khác một vài điểm so với ELISA gián tiếp, ELISA
sandwich và ELISA trực tiếp.
Một quy trình đơn giản như sau:
1. Kháng thể chính- sơ cấp (chưa đánh dấu) được ủ với kháng nguyên mẫu.
2. Phức hợp kháng thể- kháng nguyên sau đó được thêm vào đĩa 96 giếng đã
được phủ trước các kháng nguyên tương tự.
3. Kháng thể không bám được sẽ bị loại bỏ thông qua bước rửa đĩa. (Càng
nhiều kháng nguyên trong mẫu, càng ít kháng thể sẽ có thể liên kết với các kháng
nguyên trong giếng, do đó gọi là "cạnh tranh".)
4. Các kháng thể thứ cấp gắn enzym mà đặc hiệu với các kháng thể sơ cấp
sẽ được thêm vào.
5. Thêm cơ chất, enzyme phân giải cơ chất và tạo tín hiệu màu hoặc huỳnh
quang.
10
Đối với phương pháp ELISA cạnh tranh, nồng độ kháng nguyên mẫu càng cao,
các tín hiệu cuối cùng càng yếu. Ưu điểm chính của phương pháp này là khả năng sử
dụng các mẫu thô hoặc không tinh khiết mà vẫn gắn chọn lọc bất kỳ kháng nguyên nào
có mặt. (Lưu ý rằng một số bộ kit ELISA cạnh tranh bao gồm kháng nguyên
gắn enzyme nhiều hơn là kháng thể gắn enzyme. Kháng nguyên đánh dấu sẽ cạnh
tranh vị trí gắn với kháng thể sơ cấp với kháng nguyên trong mẫu (kháng nguyên này
không đánh dấu). Kháng nguyên trong mẫu càng nhiều thì càng ít kháng ngun đánh
dấu được giữ lại trong giếng và tín hiệu càng yếu).
•
Ưu điểm của phương pháp ELISA cạnh tranh:
+ Độ đặc hiệu cao, sử dụng hai kháng thể nên các kháng nguyên/ chất phân tích
được giữ và phát hiện.
+ Thích hợp cho các mẫu phức tạp, vì các kháng ngun khơng địi hỏi tinh
sạch trước khi tiến hành phản ứng.
+ Tính linh hoạt và độ nhạy cao.
+ Phát hiện được lượng kháng nguyên ít - kháng nguyên càng ít tín hiệu càng mạnh.
1.4. Ứng dụng của kỹ thuật ELISA
Nếu một protein với nhiều epitope được phát hiện, thử nghiệm sandwich là một
lựa chọn tốt. Thử nghiệm này đòi hỏi hai kháng thể phản ứng với các epitope khác
nhau. Tuy nhiên, nếu các phân tử có nhiều epitope lặp đi lặp lại, trong một thử nghiệm
sandwich chúng ta có thể sử dụng các kháng thể tương tự cho cả việc bắt kháng
nguyên (capture) và phát hiện (detection). Ngồi ra, nếu có nguồn các chất cần phát
11
hiện ở dạng tinh sạch mà có thể được hấp thu một cách hiệu quả trong giếng, người ta
có thể thiết lập kỹ thuật ELISA cạnh tranh, trong đó chất cần phân tích dạng tinh khiết
được cố định sẽ cạnh tranh với chất phân tích trong mẫu để liên kết với các kháng thể
được đánh dấu. Trong trường hợp này chuẩn độ kháng thể là điều cần thiết, nếu không
độ nhạy thí nghiệm sẽ bị giảm.
Đĩa polystyrene sẽ giữ một loạt các protein với số lượng tăng dần tùy thuộc vào
nồng độ của chúng trong dung dịch. Số lượng cụ thể và tối ưu cần được xác định cho
mỗi protein, nhưng một số quan sát chung đã được thực hiện đối với các kháng thể.
Đĩa có độ bám từ trung bình đến thấp có thể gắn 100-200 ng IgG/cm2, trong khi đĩa
có độ bám cao thường có thể gắn lên đến 400-500 ng IgG/cm2. Ngồi protein, đĩa
polystyrene cịn hấp thụ các peptide có chiều dài từ 15 - 20 axit amin. Để đạt được liên
kết mạnh, một peptide sẽ cần cả hai tương tác kỵ nước và ưa nước. Thông thường,
nhược điểm để hấp phụ peptide trực tiếp là chúng có xu hướng có ít epitope, và nếu
chúng tương tác với nhựa, việc bắt của kháng thể sẽ gặp khó khăn. Một giải pháp khác
là gắn các peptide lên một protein lớn hơn thông qua một đoạn spacer- nhằm cung
cấp khoảng cách giữa các peptide và protein, cho phép các kháng thể tương tác
được với các peptide.
Xét nghiệm một sinh vật chẳng hạn như phát hiện một tế bào vi khuẩn hay virus
cũng có thể sử dụng kỹ thuật ELISA sandwich với kháng thể tương tự cho cả bắt và
phát hiện. Nếu các phân tử đích là hoặc chỉ có một epitope duy nhất, cần thay đổi các
phần đã mô tả ở trên. Bản thân các phân tử nhỏ hoặc khơng hấp thu tốt với pha rắn,
hoặc có thể bị che phủ bởi các protein được thêm vào, vì vậy, các phân tử nhỏ thường
có thể được gắn vào các protein lớn hơn, cung cấp một phương tiện để gắn các epitope
mong muốn với pha rắn, tạo ra một cấu hình cho phép các epitope bị bắt bởi một
kháng thể.
Carbohydrate và protein bị glycosyl hóa nhiều sẽ khơng hấp thu tốt với
polystyrene bởi các lực được mô tả ở trên, vì chúng có rất ít khả năng tham gia vào các
tương tác kỵ nước. Protein màng tế bào sản sinh từ các tế bào và duy trì trong dung
dịch bằng chất tẩy rửa cũng không được hấp thụ tốt khi có sự hiện diện của các chất
tẩy rửa. Sử dụng liên kết cộng hóa trị hoặc giảm nồng độ chất tẩy rửa là cách tốt nhất
để gắn các protein này. Trong thực tế, liên kết cộng hóa trị có thể được thực hiện trong
sự hiện diện của các chất tẩy rửa như Tween-20 và Triton X-100.
12
CHƯƠNG II: NGUYÊN LÝ CHUNG VÀ CẤU TẠO CỦA MÁY MIỄN DỊCH
TỰ ĐỘNG TOSHO AIA 360
2.1 lịch sử phát triển của các dòng máy miễn dịch TOSHO AIA
Dòng máy nhỏ
Năm 2004 AIA-360
Các dịng máy trung bình
1999 AIA-600II
1990 AIA-600
2010 AIA-900
Các dịng máy lớn
1986 AIA-1200
1996 AIA-21
2003 AIA-1800
2008 AIA-2000
2
Tosoh phát triển máy miễn dịch vào năm 1986, là hệ thống đầu tiên thực sự
đúng nghĩa truy cập ngẫu nhiên liên tục trên thế giới. Sau đó, máy và các loại hóa chất
đã được cải tiến liên tục với những công nghệ ưu việt. Chúng tơi cũng tạo ra các dịng
sản phẩm, bao gồm các model lơn, trung bình và nhỏ.
“AIA” là dịng máy tiên phong trong các dòng máy miễn dịch tự động truy cập
ngẫu nhiên liên tục.
13
2.2 Nguyên lý chung
2.2.1. Phương pháp đo một bước đơn
Mở nắp
Trộn
《Test cup《
《Lấy mẫu《
Hút
Nhả dung dịch
rửa
《Ủ để tạo 《B/F
phản ứng Wash《
miễn dịch《
《Nhả
subtrate《
Mixing
《Đo huỳnh
quang《
2.2.2. Phương pháp đo một bước sandwich
(Calibration curve)
2.2.3 phương pháp đo một bước competitive enzyme immunoassay
14
(Calibration curve)
15
