Bước đầu nghiên cứu quá trình lên men sản xuất màng cellulose sinh học từ phế phầm xơ mít

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA
CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016
NGHÀNH: KHOA HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN
SẢN XUẤT MÀNG CELLULOSE SINH HỌC
TỪ PHẾ PHẨM XƠ MÍT

THUỘC NHĨM NGÀNH KHOA HỌC:
KHOA TÀI NGUN MƠI TRƯỜNG

Bình Dương, 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA
CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016
NGHÀNH: KHOA HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN
SẢN XUẤT MÀNG CELLULOSE SINH HỌC
TỪ PHẾ PHẨM XƠ MÍT
THUỘC NHĨM NGÀNH KHOA HỌC:
KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG

Sinh viên thực hiện: Trần Thị Thanh Mỷ Nam, Nữ: Nữ Dân tộc: Kinh
Lớp: C14SH02
khoa: Tài nguyên môi trường
Năm thứ: 2 /Số năm đào tạo: 3
Ngành học: Sư phạm sinh học
Người hướng dẫn: Ths. Phan Văn Thuần
Bình Dương, 2016
UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG
CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI


1. Thông tin chung:
-

Tên đề tài: “Bước đầu nghiên cứu quá trình lên men sản xuất màng cellulose sinh
học từ phế phẩm xơ mít”

-

Sinh viên thực hiện: Lê Thị Trang - Hoàng Thị Thắm - Lê Thị Hà Mỹ - Trần Thị Thanh
Mỷ

-

Lớp: C14SH02

-

Khoa: Tài Nguyên Môi Trường

-

Năm thứ: 2

-

Số năm đào tạo: 3

-

Người hướng dẫn: Th.S Phan Văn Thuần

2. Mục tiêu đề tài:
-

Nghiên cứu tối ưu hóa mơi trường lên men tạo màng cellulose.
Tạo ra các màng cellulose sinh học từ phế phẩm xơ mít.

3. Tính mới và sáng tạo:
-

Tận dụng các phế phẩm xơ mít làm nguyên liệu để lên men tạo màng cellulose sinh học.

-

Nghiên cứu được mơi trường thích hợp cho q trình lên men tạo màng cellulose sinh
học.

4. Kết quả nghiên cứu:
Kết quả thu được màng cellulose từ các kết quả nghiên cứu sau:
-Đã tiến hành quá trình phân lập, nhân sinh khối, giữ giống thành cơng với chủng A. xilynum
tại phịng thí nghiệm.
-Dịch chiết xơ mít bổ sung vào mơi trường lên men nhằm giảm hàm lượng đường glucose và
tiến tới thay thế nước dừa, đây là những nguyên liệu làm tăng chi phí của sản phẩm. Kết
hợp %V dịch chiết xơ mít nồng độ thích hợp làm tăng hiệu suất tạo màng.
-Tất cả các mơi trường hiện diện dịch chiết xơ mít đều cho kết quả tạo màng cellulose, lớn
hơn so với môi trường đối chứng khơng bổ sung dịch chiết xơ mít.
-Giữa mít thái và mít tố nữ, dịch chiết mít thái cho hiệu quả tạo màng tốt hơn, môi trường tốt
nhất là MT lên men + 10g/L Glu + 20% dịch chiết, sau 6 ngày lên men thu màng ướt đạt
trọng lượng 4.31 g/100ml, màng khô đạt trọng lượng 0.58g/100ml.


5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, khả năng áp dụng của đề tài:
- Tận dụng hiệu quả các phế phẩm không còn sử dụng và giảm tải được chất thải ra mơi trường.
- Giảm chi phí ngun liệu tạo sản phẩm màng cellulose vi khuẩn.
- Bước đầu nghiên cứu quá trình lên men sản xuất màng cellulose vi khuẩn từ phế phẩm xơ mít
là tiền đề và được mong đợi là vật liệu hóa sinh mới với những ứng dụng có giá trị và đang tiếp
tục được nghiên cứu.
6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài:
Ngày tháng năm
Sinh viên chịu trách nhiệm chính
thực hiện đề tài
(Ký, họ và tên)

Trần Thị Thanh Mỷ

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực hiện đề tài
Tôi đánh giá cao về kết quả nghiên cứu đề tài. Trong thời gian nghiên cứu nhóm sinh viên đã
làm việc nghiêm túc và hoàn thành được nội dung lớn. Nghiên cứu tỉ lệ % dịch chiết xơ mít lên
năng suất của q trình tạo màng cellulose. Nghiên cứu thời gian thích hợp để thu nhận màng
cellulose năng suất lớn nhất. Nghiên cứu quá trình thu nhận và xử lý sản phẩm tốt nhất. Tuy kết
quả thu được màng cellulose với độ dai, độ kết tinh, hiệu suất chưa cao vì vậy tiếp tục nghiên
cứu.

Xác nhận của lãnh đạo khoa
(ký, họ và tên)
Ngày tháng năm Người hướng dẫn
(ký, họ và tên)


Phan Văn thuần


UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG
CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THƠNG TIN VỀ SINH VIÊN
CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I. SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN: Họ và tên: TRẦN THỊ THANH MỶ

Ảnh
Sinh ngày: 25/02/1995

4x6
Nơi sinh: Ninh Thuận
Lớp: C14SH02 - Khóa: 2014 - 2017
Khoa: Tài Ngun Mơi Trường
Địa chỉ liên hệ: 586 Lê Hồng Phong - phường Phú Hịa - TP Thủ Dầu Một - tỉnh Bình Dương
Điện thoại: 01677255520 - Email:
II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
* Năm thứ 1:
Ngành học: Cao đẳng Sư phạm Sinh học - Khoa: Khoa học tự nhiên
Kết quả xếp loại học tập: TB Khá
* Năm thứ 2:
Ngành học : Cao đẳng Sư phạm Sinh học - Khoa: Tài Nguyên Môi Trường
Kết quả xếp loại học tập: TB Khá

Ngày tháng năm
Xác nhận của lãnh đạo khoa

Sinh viên chịu trách nhiệm chính
thực hiện đề tài


MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH
•

7


DANH MỤC BẢNG
•

8


DANH MỤC VIẾT TẮT
- Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều kiện ni
cấy có khuấy đảo)
- A. xylinum: Acetobacter xylinum
- ATP: adenosine triphosohate
- BASYC®: bacterial synthesised cellulose
-

Cel-: non-producing mutants - chủng vi khuẩn đột biến không tổng hợp cellulose.

-

cfu: cololy-forming units - khuẩn lạc

-

CS: cellulose synthase

-

CSL: corn steep liquor

-

DAP: diamon phosphate

-

DP: degree of polymerization

-

FK: Fructosekinase

-

FBP: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase

-

Fru-bi-P: Fructose-1,6-bi-phosphate

-

Fru-6-P: Fructose-6-phosphate

-

GK: Glocosekinase

-

G6PDH: Fructose-1-phosphate kinase

-

Glc-6-P: Glucose-6-phosphate

-

Glc-1-P: Glucose-1-phosphate

-

HS: Hestrin-Schramm

-

HR/MAS 1H NMR: high resolution/magic angle spinning hidrogen-1 nuclear
magnetic resonance.

-

PGI: Phosphoglucoisomerase

9


- PGM: Phosphoglucomutase
- PTS: Phosphatransferase
- PGA: Phosphogluconic acid
- S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích
- SEM: Scanning electronic microscopy
- St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều kiện nuôi cấy
tĩnh)
- SA: Sulfate amon

- UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase
- UDPG: Uridine diphosephoglucose
- YPM: Yeast extract Peptone Mannitol
- YE: Yeast extract - cao nấm men

10


MỞ ĐẦU
Cellulose là một hợp chất hóa học thường được biết đến với vai trò là bộ khung xương
quan trọng trong cơ thể thực vật. Không những cellulose được tổng hợp bởi thực vật, mà
cellulose còn được tổng hợp nên bởi vi sinh vật, với tên gọi là cellulose vi khuẩn. Một trong
những lồi vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose rất tốt đó là A. xylinum. Cellulose vi
khuẩn ngày càng được quan tâm nhiều hơn bởi khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều
ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý
nước thải, bảo vệ môi trường... Gần đây, khả năng ứng dụng cellulose vi khuẩn không ngừng
được nghiên cứu, cải tiến bởi các nhà khoa học trên thế giới.
Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực
công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc
biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các
sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học. Đặc biệt trong lĩnh vực y học,
màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét
da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người.
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn, các nhà
nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu. Các kết quả ứng dụng của màng
BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm.
Trong cơng nghệ đồ uống và thực phẩm, cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng làm nhiều
sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng. Đặc biệt, một ứng dụng của cellulose vi
khuẩn mới được phát hiện gần đây là khả năng ứng dụng làm màng bao thực phẩm chống vi
sinh vật rất hiệu quả. Việc ứng dụng cellulose vi khuẩn vào sản xuất cơng nghiệp nói chung

và làm màng bao thực phẩm nói riêng địi hỏi phải có được các nguồn nguyên liệu cellulose
vi khuẩn dồi dào, ổn định, và phù hợp với tính chất của các ứng dụng. Nhiều kết quả nghiên
cứu đã cho thấy khi nuôi cấy dưới điều kiện có khuấy đảo thì hiệu suất sinh tổng hợp
cellulose của A. xylinum sẽ cao hơn khi nuôi cấy tĩnh. Tuy nhiên, với mục đích sử dụng
cellulose vi khuẩn làm màng bao chống vi sinh vật trong công nghệ thực phẩm, yêu cầu
cellulose thu được phải ở dạng màng. Với mục đích đó, chúng tơi thực hiện đề tài “Bước
đầu nghiên cứu quá trình lên men sản xuất màng cellulose sinh học từ phế phẩm xơ
mít”.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

11


1.1 Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose
1.1.1

Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn

Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum lần đầu tiên được báo
cáo bởi Brown (1986). Theo đó, khi nghiên cứu về vi khuẩn acetic, Brown đã phát hiện và
quan sát thấy một khối rắn mà theo ơng lúc đó khối rắn này khơng nằm trong các kết quả
nghiên cứu ông dự định trước. Khối rắn này khó bị phân hủy và giống với mơ động vật. Hợp
chất đó sau này được xác định là cellulose và vi khuẩn tổng hợp ra nó là Bacterium xylinum.
Đến nửa thế kỷ XX, các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu nhiều về cellulose vi
khuẩn. Đầu tiên, Hestrin (1954) đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn
A. xylinum. Ông đã chứng minh rằng vi khuẩn này có thể sử dụng đường để tổng hợp
cellulose. Sau đó, Next và Colvin (1957) chứng minh rằng cellulose được A. xylinum tổng
hợp trong mơi trường có đường và ATP. Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, cấu trúc
của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu khá rõ, đó là các chuỗi polymer do các

glucopyranose nối với nhau bằng liên kết -1,4-glucan.
Saxena (1990) đã giải thích cơ chế tổng hợp cellulose của A. xylinum bằng việc giải trình
từ đoạn gen tổng hợp cellulose. Ơng đã tách chiết được đoạn polypeptide liên quan đến quá
trình tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa. Từ đó đến nay đã có nhiều cơng trình nghiên
cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng dụng... của cellulose vi khuẩn [1]. [4].

1.1.2
1.1.2.1

Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn

Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên
kết -1,4-glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành thớ sợi
thứ cấp, có bề rộng 1,5 nm. Đây là những thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi
cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một vài loài thực vật. Các thớ sợi thứ cấp kết lại thành
những vi sợi, những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 3 4 nm, và chiều dài 130 - 177 nm (Yamanaka, 2000). Các dải siêu mịn của cellulose vi khuẩn
có chiều dài từ 1 ^m đến 9 ^m tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn định nhờ các liên
kết hydro, đó là lớp màng film [1].
[6].

12


Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn (Yamanaka , 2000)

1.1.2.2

Mức độ polymer hoá (Degree of polymerization - DP)

Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose bao
gồm các liên kết -1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hoá khác nhau. DP của cellulose thực
vật khoảng 13000 - 14000, và của cellulose vi khuẩn khoảng 2000 - 6000. Tuy nhiên, trong
một số trường hợp DP của cellulose vi khuẩn có thể đạt 16000 - 20000 phân tử glucose
(Watanabe, 1998). Đường kính của bacterial cellulose chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của
cellulose thực vật [1]. [6]. [7].

1.1.2.3

Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn

Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đại người ta đã xác định được cấu trúc
của cellulose vi khuẩn. Chẳng hạn như kỹ thuật nhiễu xạ tia X giúp xác định được kích thước
và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn. Những kỹ thuật khác như phổ hồng ngoại, phổ
Raman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose [6]. [7].
Như các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn được tạo thành bởi hai loại cấu trúc
tinh thể riêng biệt, cellulose I và I. Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia của hai loại cấu
trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii, 1993). Trong khi hầu hết tinh thể I tinh khiết thu được
từ cellulose thực vật thì vẫn chưa có cách nào thu nhận được các tinh thể I tinh khiết từ
13


nguồn này. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn A. xylinum chứa nhiều tinh thể I
hơn cellulose thực vật, hàm lượng loại tinh thể này có thể lên đến hơn 60%. Tỉ lệ này có thể
dao động trong khoảng 64% đến 71% tuỳ vào chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi trường
(Yamamoto & Horii, 1994). Ngược lại I chủ yếu có trong thành phần cellulose hình thành
nên thành tế bào của một số loài thực vật bậc cao như cotton và gai. Ở đó, cellulose I chỉ
chiếm khoảng 20%.
Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi như là một yếu tố quan trọng trong việc xác định
các tính chất của cellulose mặc dù cho đến bây giờ vẫn có rất ít các nghiên cứu về sự tương

quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc tính riêng biệt của cellulose được thực hiện [1]. [6].
[7].

1.1.2.4

Tính chất của cellulose vi khuẩn (El-Saied et al., 2004; Bielecki et

al., 2001)
- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành phần tỉ
lệ cao.
- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là cellulose I.
- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc.
- Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, khơng chứa ligin và hemicellulose.
- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể phục
hồi.
- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt.
- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng
suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao.

14


- Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản xuất một số sản
phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian. Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng
hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ.
- Có thể kiểm sốt được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn bằng cách tác
động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Từ đó có thể kiểm soát các dạng
kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose [3]. [4]. [6]. [7].

Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki, 2001)

1.1.3

Vi sinh vật tổng hợp cellulose

Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A. xylinum được
biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất và được
tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật
khác nhau là khác nhau. Sau đây là bảng tổng quan về các loài vi sinh vật có khả năng tổng
hợp cellulose.

Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose (Jonas, 1998)

Vi sinh vật
Acetobacter

Cấu trúc cellulose

Vai trò sinh học

Lớp màng ngoại bào Dải

Để giữ vi khuẩn trong mơi trường

cellulose

hiếu khí
15

Achromobacter

Sợi cellulose

Sự kết bông trong nước thải

Aerobacter

Sợi cellulose

Sự kết bông trong nước thải

Sợi ngắn

Tham gia vào mô thực vật

Alcaligenes

Sợi cellulose

Sự kết bông trong nước thải

Pseudomonas

Các sợi không tách biệt

Sự kết bông trong nước thải

Rhizobium

Sợi ngắn

Tham gia vào hầu hết thực vật

Sarcina

Cellulose dị hình

Khơng rõ

Agrobacterium

Zoogloea
Chưa xác định rõ cấu trúc
Sự kết bơng trong nước thải
Trong đó, Acetobacter được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong việc sản xuất cellulose.
Đặc biệt là A. xylinum vì những đặc điểm ưu việt của nó như: năng suất tạo cellulose cao,
cấu trúc cellulose phù hợp cho các mục đích sử dụng. [5]. [6]. [7].

1.1.3.1

Phân loại A. xylinum

A. xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm các giống
sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và Kozakia. Các
loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các tên gọi Acetobacter xylinus hay Acetobacter
xylinum, sau đó được xếp lại vào giống Gluconacetobacter với tên gọi Gluconacetobacter
xylynus.
A. xylinum có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau như từ nước quả (Kahlon &
Vyas, 1971), hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ (Faparusi, 1974), từ giấm

(Passmore & Carr, 1975), từ thạch dừa (Bernado, 1998), từ nấm Kombucha và trà [1]. [6].
[7].

1.1.3.2

•

Đặc điểm hình thái của A. xylinum

A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động,
không sinh bào tử. Là vi khuẩn Gram âm, chúng có thể đứng riêng rẽ hay xếp thành
chuỗi.

•

Nếu A. xylinum phát triển trên mơi trường thiếu chất dinh dưỡng, chúng biến đổi
thành dạng có hình thái đặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh hoặc
không phân nhánh và dần dần sẽ gây thối hóa giống làm giảm hoạt tính một cách
đáng kể.

•

Khuẩn lạc của A. xylinum có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần giữa khuẩn lạc

lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.
16


Hình 2.3: SEM của A. xylinum (Forge & Preston, 1977)

1.1.3.3

Đặc điểm sinh lý của A. xylinum (Jonas, 1998)

•

Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O.

•

Phản ứng catalase dương tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men.

•

Khơng tăng trưởng trên mơi trường Hoyer.

•

Chuyển hóa glucose thành acid gluconic.

•

Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton.

•

Khơng sinh sắc tố nâu.

•

Tổng hợp cellulose. [1]. [4]. [6]. [7].

1.1.3.4

Đặc điểm sinh trưởng của A. xylinum

Lớp màng cellulose tạo ra gây trở ngại đến khả năng biến dưỡng, vận chuyển chất dinh
dưỡng và oxi đến tế bào. Tuy nhiên lớp màng này có thể giữ nước nên giúp vi khuẩn có thể
phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại tia UV.
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và tùy thuộc vào chủng vi
khuẩn mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chẳng hạn chủng A. xylinum BPR 2001
sử dụng fructose tốt nhất (Matsuoka, 1993) trong khi chủng A. xylinum IFO 13693 sử dụng
glucose hiệu quả hơn (Masaoka, 1993)... A. xylinum có thể chuyển hóa glucose thành acid
gluconic, điều này là nguyên nhân làm cho pH của môi trường nuôi cấy giảm từ 1 đến 2 đơn
17


vị trong q trình ni cấy.
Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển từ 250C đến 300C và pH từ 5,4 đến 6,3. Theo
Hestrin (1947) thì pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 5,5 và không phát triển ở nhiệt độ
370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Maccormide, (1996) cho rằng A.
xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 đến 8, nhiệt độ từ 12 0C đến 350C và có thể
phát triển trong mơi trường có nồng độ ethanol lên tới 10%.
Khi ni cấy trên mơi trường thạch, lúc cịn non khuẩn lạc mọc riêng lẻ, khuẩn lạc nhầy
và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già tế bào mọc dính thành cụm, và chúng mọc
theo đường cấy giống.
A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế người ta thường bổ sung thêm acid
acetic hay acid citric vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ và tăng hiệu
suất tổng hợp cellulose [1]. [5]. [7].

1.1.3.5

Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với A. xylinum

Màng cellulose được sản xuất bởi A. xylinum đóng nhiều vai trò cho sự phát triển và tồn
tại của vi sinh vật trong tự nhiên.

•

Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn (Bielecki et al.,
2001).

•

Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A. xylinum giúp tế bào lơ lửng và tới được bề mặt
giàu khí oxy vì đây là vi khuẩn hiếu khí. Do đó chỉ những tế bào gần ranh giới lỏng
khí của mơi trường mới sản xuất cellulose (Krystynowicz, 2002; Watanabe, 1998)

•

Màng cellulose xúc tiến sự hình thành tập đồn của A. xylinum trên cơ chất và bảo vệ
vi khuẩn trước những đối thủ cạnh tranh sử dụng cùng cơ chất.

•

Vì độ nhớt và đặc tính ưa nước của lớp cellulose nên khả năng chống chịu với những
thay đổi bất lợi (thay đổi pH, sự có mặt của chất độc và vi sinh vật gây bệnh.. trong
mơi trường sống tăng lên.

•

Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV. 23% vi khuẩn acetic được
bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bị chiếu tia UV [1]. [6]. [7].

1.2 Sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A. xylinum
1.2.1

Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A. xylinum

Theo Ross et al. (1991), con đường sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn từ glucose thành
18


các sợi kết tinh địi hỏi phải có sự tổng hợp uridine diphosphoglucose (UDP- Glucose), sau
đó là một phản ứng tổng hợp cellulose và cuối cùng là sự tập hợp lại thành sợi cellulose nhỏ
để hình thành nên các dải tinh thể cellulose.
UDP-Glucose là một nucleotide tiền thân của sự tổng hợp cellulose trong A. xylinum.
Như sơ đồ duới đây, quá trình sinh tổng hợp UDP-Glucose từ glucose là một q trình trải
qua 3 bước có sự tham gia của 3 loại enzyme. Những bước này là sự phosphoryl hoá của
glucose bởi xúc tác của enzyme glucokinase thành glucose-6- phosphate, sự izomer hoá của
glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate bởi phosphoglucomutase, và sự tổng hợp
UDP-Glucose bởi UDP-Glucose pyrophosphorylase. UDP-Glucose pyrophosphorylase đóng
vai trị then chốt trong sự sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trong khi các
chủng A. xylinum đột biến không có khả năng tổng hợp cellulose bị thiếu enzyme này (Valla
& Kjosbakken, 1981).
Glucokinase
Phosphoglucomutase
Glucose ------------------► Glu co se-ớ-phosphate ------------ ------------->
uDP-Glucose pyrophosphorylase
Glu co se-1 - pho sphate --------------------— ----------------u DP- Glu co se

Cellulose synthase ----

► Cellulose

Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A. xylinum (Canon & Anderson,
1991)

1.2.2

Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn:

Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum trên được chia thành hai giai đoạn chính:
giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kết tinh [1]. [6]. [7].

1.2.2.1

Giai đoạn polymer hóa

Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển glucose
thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P). Sau đó enzyme phosphoglucomutase (PGM) tiếp tục
chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) thơng qua phản ứng
isomer hóa. Glucose-1-phosphate được enzyme UDP-Glucose pyrophospholyase chuyển hóa
thành UDP-Glucose. Cuối cùng, UDP-Glucose được polymer hóa thành cellulose và
cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose
synthase (Iguchi, 2000).
19


Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn sẽ tạo cellulose theo
con đường sau: lúc này hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành

fructose-1-phosphate. Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyển hóa thành fructose-1,6biphosphate nhờ enzyme fructose-1-phosphatekinase. Sau đó, enzyme phosphoglucose
isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6phosphate. Tiếp theo glucose-6-phosphate lại tham gia vào q trình chuyển hóa tương tự
như trên để tạo ra cellulose (Iguchi, 2000).

20


Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn (Iguchi, 2000)

1.2.2.2

Giai đoạn kết tinh

Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan. Các chuỗi glucan kết hợp
với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals. Lớp chuỗi glucan
này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hydro
tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo
thành các vi sợi, sau đó các vi sợi tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi và được
phun ra ngồi mơi trường thông qua các lỗ trên bề mặt của vi khuẩn (hình 2.6). Ảnh chụp
kính hiển vi điện tử bề mặt tế bào cho thấy có khoảng 50 - 80 lỗ sắp xếp thành hàng dọc
chiều dài của tế bào (Ross, 1991). Các lỗ này chính là các vị trí sinh tổng hợp cellulose trên
bề mặt tế bào. Đây là những lỗ có đường kính khoảng 3,5 nm sắp xếp song song theo đường
thẳng dọc trục vi khuẩn. Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10 nm chứa enzym tổng hợp
cellulose. Mỗi tiểu phần 10 nm tạo ra các chuỗi glucan hình thành vi sợi 1.5 nm [1]. [6]. [7]
CsliụlKe I

21


sự tổng hợp cellulose

80

Pv] Ví sợỉ cellulose

Thà nh phần xuât cellulose

sợ i sơ câ p

Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra mơi trường ngồi từ A. xylinum
(Iguchi, 2000)

1.2.3

Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình tổng hợp cellulose:

1.2.3.1 Kiểu ni cấy
Có 2 kiểu ni cấy thường được sử dụng để sản xuất cellulose vi khuẩn, đó là ni cấy
tĩnh và ni cấy có khuấy đảo.
a) Ni cấy tĩnh
Đối với ni cấy tĩnh, người ta sử dụng những khay nhựa đã chuẩn bị môi trường và tiến
hành nuôi cấy chủng A. xylinum ở điều kiện tĩnh.
Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, những thớ sợi thứ cấp liên tục được lộ ra từ lỗ sắp xếp
thẳng hàng trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết thành những vi sợi, lắng sâu xuống mơi
trường sinh trưởng, sau đó dải cellulose chồng chập và xoắn với nhau tạo thành tấm cellulose
trên bề mặt canh trường dinh dưỡng, ngay mặt phân cách pha lỏng khí giàu oxy.
Dù vẫn được sử dụng để sản xuất cellulose nhưng nuôi cấy tĩnh cho sản lượng thấp và
mang tính thủ cơng. Do đó, để sản xuất cơng nghiệp, cần thiết để thiết lập hệ thống sản xuất
hàng loạt sử dụng kĩ thuật nuôi cấy hiệu quả hơn [1].
22

b) Ni cấy có khuấy đảo
Tiến hành ni cấy trong thiết bị lên men chứa dung dịch mơi trường, có cánh khuấy,
thổi khí oxy hoặc lắc. Vi khuẩn phân bố đều trong toàn dung dịch và phát triển theo chiều
sâu của mơi trường. Cellulose được tạo ra có dạng viên hình cầu, clip...
Đây là kĩ thuật ni cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo cellulose cao, có thể ứng dụng
trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ mới
được sản xuất với sản lượng thấp. Sản xuất cellulose từ A. xylinum bằng phương pháp ni
cấy có khuấy đảo gặp phải một số trở ngại, trở ngại lớn nhất cho đến nay là tính khơng ổn
định khi ni cấy. Tính khơng ổn định được thể hiện bởi sự mất khả năng sản xuất cellulose
và thay thế dần tế bào sản xuất cellulose bằng chủng đột biến khơng có khả năng sản xuất
cellulose [1]..
Từ việc quan sát thấy rằng cellulose tổng hợp nhanh khi tế bào A. xylinum được gắn vào
những phần tĩnh trong bình lên men như điện cực, cánh khuấy, màng ngăn, Vandamme et al.
(1998) đã giới thiệu “điểm dính đa chức năng” trong bình ni cấy bằng cách cung cấp vào
mơi trường những phần tử nhỏ không tan như diatonit, silicagel, cát biển, những hạt thủy
tinh nhỏ, đất mùn, cellulose thực vật được giã nhỏ... Nồng độ phần tử nhỏ đưa vào được tối
ưu tuỳ theo mức độ khuấy, cũng như mức độ lắc của khay .
Sự lựa chọn kỹ thuật ni cấy phụ thuộc vào mục đích thương mại của polymer sinh
học, hơn nữa cấu trúc cellulose và đặc tính cơ lý của nó bị ảnh hưởng rất lớn của phương
pháp nuôi cấy (Hai-Peng, 2002). Trong điều kiện nuôi cấy bề mặt, màng cellulose dày được
tạo thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Trong khi dưới điều kiện nuôi cấy chìm, cellulose
lại được sản xuất dưới dạng huyền phù thớ sợi, những khối không đều, dạng viên kết hay
dạng cầu kích thước từ 10 ^m đến 1000 ^m.

23


Hình 2.7: Cellulose được tạo thành trong điều kiện ni cấy tĩnh (phải) và có

khuấy đảo (trái) (El-Saied, 2004)
Những phần tử hình cầu mịn của cellulose trong ni cấy chìm (Agitated bacterial
cellulose - Ag-BC) có cấu trúc mắt lưới tương tự cấu trúc mắt lưới của màng mỏng cellulose
thu được khi nuôi cấy bề mặt (Static bacterial cellulose - St-BC). Tuy nhiên, có vài sự khác
biệt về hình thái trong những sợi nhỏ và trong cấu trúc này giữa St-BC và Ag-BC. Sợi
cellulose của St-BC duỗi thẳng trong khi sợi cellulose Ag-BC cong và rối, làm cấu trúc mắt
lưới dày hơn so với cấu trúc St-BC. Bên cạnh đó, chiều rộng sợi Ag-BC mỏng hơn so với StBC, mặc dù rất khó xác định chính xác kích thước của mỗi sợi. Hình thái này có được có thể
do dịng chảy rối loạn và áp lực do dịch chuyển không ngừng của mơi trường khi ni cấy
dưới điều kiện có khuấy đảo. Những thay đổi về hình thái học có liên quan đến những thay
đổi trong cấu trúc vi mô như trọng lượng phân tử, độ kết tinh, thành phần I, bảng 2.2 cho
thấy rõ điều này [1].

24


Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện ni cấy tĩnh (a) và ni cấy có khuấy đảo (b)
(Watanabe et al., 1998)

Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC (Watanabe et al., 1998)
Đặc tính cấu trúc

Ag-BC

St-BC

Chỉ số kết tinh a

63

71

Kích thước tinh thể b

6.9

7.4

Sự kết tinh c (%)

72

80

Cellulose I c (%)

61

73

Độ polymer hố

10900

14400

Bảng 2.3: Tính chất St-BC và Ag-BC (Watanabe, 1998)

Đặc trưng

Ag-BC

St-BC

Young module của màng (GPa)

28,3

33,3

25