Bước đầu nghiên cứu vi nhân giống cây cao su (hevena brasiliensis) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại bình dương

'

,.

.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT

‘ĩ

KHOA KHOA HỌC Tự NHIÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (CAO ĐẲNG)
NIÊN KHÓA 2011 - 2014

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU VI NHÂN GIỐNG CÂY
CAO SU (Hevea brasiliensis) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI
CẤY MÔ TẾ BÀO TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG
Chuyên Ngành: SƯ PHẠM SINH HỌC

: ThS. PHAN
VĂN
THUẦN
Giáo viên
hướng
dẫn
: HUỲNHSinh
NGỌC
ANH
viên
thực hiện

: 111C840002
MSSV
Lớp

: C11SH02

Bình Dương, Tháng 05 Năm 2014

LỜI CẢM ƠN


Để hồn thành khóa luận này trước tiên em xin cảm ơn thầy giáo ThS. Phan
Văn Thuần đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và động viên em trong suốt thời gian
qua.
Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo ThS. Nguyễn Thanh Thuận và bạn
Nguyễn Thị Xuân Thùy đã đồng hành và giúp đỡ em.
Em xin cảm ơn Trường Đại học Thủ Dầu Một, khoa Khoa học Tự nhiên, bộ
môn Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi để khóa luận này được hoàn thành.
Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong khoa Khoa học Tự nhiên, gia đình
và các bạn sinh viên lớp C11SH02 đã động viên và giúp đỡ nhiệt tình trong suốt
thời gian em thực hiện khóa luận này.
Sinh viên thực hiện
Huỳnh Ngọc Anh


NHẬN XÉT
Của giáo viên hướng dẫn

Bình Dương, Ngày tháng năm 2014

NHẬN XÉT
Của giáo viên phản biện


MỤC LỤC
MỤC LỤC ............................................................................................................ i
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... v
DANH MỤC BIỂU ĐỒ .......................................................................................vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...........................................vii
MỞ ĐẦU............................................................................................................... 1
1.
2.
3.
4.
5.

Lý do chọn đề tài............................................................................................. 1
Mục tiêu đề tài ............................................................................................... 2
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu....................................................................2
Nội dung nghiên cứu........................................................................................3
Bố cục của đề tài ............................................................................................3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................5
1.1. LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ.........................................5
1.2. NHỮNG ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG INVITRO..........10
1.2.1. Ưu điểm của nhân giống vơ tính in vitro ...................................................10
1.2.2. Hạn chế của nhân giống vơ tính in vitro ....................................................11
1.3. ỨNG DỤNG CỦA NHÂN GIỐNG INVTRO Ở MỘT SỐ CÂY

CÔNG NGHIỆP ...................................................................................................12
1.4. VÀI NÉT VỀ CÂY CAO SU .......................................................................15
1.4.1. Đặc điểm chung của họ Cao su .................................................................15
1.4.2. Đặc điểm riêng của cây Cao su .................................................................17
1.4.2.1. Tên khoa học.........................................................................................17
1.4.2.2. Đặc tính thực vật...................................................................................17
1.4.2.3. Thành phần hóa học .............................................................................19
1.4.3. Giá trị kinh tế của cây Cao su .................................................................. 20
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................22
2.1.

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU........................................................................ 22

2.1.1. Trang thiết bị và dụng cụ...........................................................................22


2.1.2. Vật liệu .................................................................................................... 22
2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................22

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu................................................................22
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.....................................23
2.2.2.1. Điều kiện và mơi trường ni cấy ......................................................... 23
2.2.2.2. Nghiên cứu khả năng khử trùng của mẫu.............................................. 25
2.2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro ................. 26
2.2.3.

Phương pháp xử lý thống kê số liệu ..................................................... 28

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN................................29
3.1.

THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG TỪ MỘT

SỐ MẪU CÂY CAO SU......................................................................................29
3.2.

THÍ NGHIỆM 2: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG TỪ

CÀNH CỦA CÂY CAO SU ................................................................................ 31
3.3.

THÍ NGHIỆM 3: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT SINH CHỒI

TỪ CÁC MẪU VẬT VÔ TRÙNG CỦA CÂY CAO SU..................................... 34
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ .................................................................... 39
1. KẾT LUẬN.................................................................................................... 39
2. KHUYẾN NGHỊ............................................................................................ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 40


DANH MỤC CÁC BẢNG

TT
1.
2.
3.
4.

TÊN CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 2.1. Thành phần môi trường cơ bản Murashige
và Skoog (1962) ......................................................................................24
Bảng 3.1. Tỉ lệ phần trăm (%) hiệu quả khử trùng của mẫu với
các chất khử trùng ( HgCl2 0,1% và nước javel) ....................................29
Bảng 3.2. Tỉ lệ (%) mẫu được vô trùng với chất khử trùng
HgCl2 0,1% ở thời gian khác nhau..........................................................32
Bảng 3.3. Khả năng phát sinh chồi từ các mẫu ở các môi trường
nuôi cấy ..................................................................................................34


DANH MỤC CÁC HÌNH

TT TÊN CÁC HÌNH TRANG
1.
2.
3.
4.
5.

Hình 3.1. Mẫu in vitro từ hạt cây cao su ..................................................31
Hình 3.2. Mẫu chồi đỉnh và chồi nách vô trùng khi
khử trùng bằng HgCl2 0,1% .....................................................................33
Hình 3.3. Chồi in vitro hình thành sau 8 tuần ni cấy
trên mơi trường MS...................................................................................36
Hình 3.4. Sự thích ứng của mẫu với môi trường MS
bổ sung 5 mg/L BAP + 5 mg/L IBA .........................................................37

Hình 3.5. Chồi in vitro hình thành từ chồi nách sau 8 tuần
ni cấy trên môi trường MS bổ sung BAP 5mg/L + IBA 5mg/L ............38


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

TT TÊN BIỂU ĐỒ TRANG
1.

Biểu đồ 3.1. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ phần trăm (%) hiệu quả khử
trùng của mẫu với các chất khử trùng ( HgCl2 0,1% và nước javel).........30


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ABA : Abscisis acid
BA : N6-Benzyl adenine
BAP : Benzyl amino purine
cs : cộng sự
DNA : Deoxyribonucleotid acid
IBA : Indole-3-butyric acid
MS : Murashige và Skoog (1962)
NAA : a - naphthaleneacetic acid
IAA : p -indolacetic acid
2,4-D : 2,4-D dichlorophenoxy acetic acid
TDZ : Thidiazuron


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một lĩnh vực bao gồm nhiều kỹ thuật khác
nhau trong nuôi cấy in vitro như: Nuôi cấy phôi, cơ quan, tế bào và protoplast. Việc
ra đời của các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mở ra một hướng mới cho
nghiên cứu thực vật, nó nhanh chóng dành được một vị trí quan trọng trong lĩnh
vực cơng nghệ sinh học về sản xuất và cải thiện giống cây trồng [24].
Kỹ thuật nhân giống in vitro không chỉ ứng dụng để nhân giống và phục tráng
cây trồng mà nó cịn đem lại hiệu quả kinh tế cao trong việc nhân nhanh và tạo ra
một số lượng lớn cây con đồng đều, sạch bệnh, đặc biệt là cịn giữ được tính trạng
q của bố mẹ và cho phép chủ động cung cấp nguồn giống cũng như vật liệu vơ
trùng cho các thí nghiệm [16].
Cho đến nay, có nhiều đối tượng cây cơng nghiệp đã được nhân giống bằng
phương pháp nuôi cấy mô, tế bào và thu được nhiều kết quả đáng kể như: Cây cà
phê, cây tiêu, cây chè...
Cây Cao su (Hevea brasiliensis), là một loài cây thân gỗ thuộc về họ Đại kích
(Euphorbiaceae) và là thành viên có tầm quan trọng kinh tế lớn nhất trong chi
Hevea. Nó có tầm quan trọng kinh tế lớn là do chất lỏng chiết ra tựa như nhựa cây
của nó (gọi là nhựa mủ-latex) có thể được thu thập lại như là nguồn chủ lực trong
sản xuất cao su tự nhiên [34].
Cây Cao su là loài cây thân gỗ, có thể cao tới trên 30 m. Nhựa hay mủ màu
trắng có trong các mạch ở vỏ cây. Cây đạt độ tuổi 5-6 năm thì người ta bắt đầu thu
hoạch mủ. Cho năng suất cao nhất trong độ tuổi từ 11 đến 25, sẽ ngừng sản sinh mủ
khi đạt độ tuổi 26-32 năm. Ngoài ra, gỗ cao su còn được dùng sản xuất đồ gỗ, được
xem là loại gỗ thân thiện với mơi trường vì chỉ được khai thác khi cây kết thúc chu
trình sinh mủ [36].
Cây Cao su không những mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân tỉnh Bình
Dương mà cịn là một lợi thế xuất khẩu của Việt Nam. Nhưng mặc khác chất lượng

1

giống cây Cao su ở Việt Nam còn chưa cao và chưa phù hợp với điều kiện khí hậu
ở nước ta, bên cạnh đó sâu bệnh phá hoại, các phương pháp nhân giống chủ yếu là
truyền thống làm cho mầm bệnh cây Cao su truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác,
chất lượng cây con không đồng đều...
Xuất phát từ tiềm năng to lớn và những hạn chế gặp phải, chúng tôi đề xuất đề
tài: “Bước đầu nghiên cứu vi nhân giống cây Cao su (Hevea brasiliensis ) bằng
phương pháp ni cấy mơ tế bào tại tỉnh Bình Dương.”

2. Mục tiêu đề tài
Thăm dò điều kiện khử trùng và mơi trường thích hợp để tạo cụm chồi cây Cao
su (Hevea brasiliensis) trong phịng thí nghiệm ni cấy mơ và tế bào thực vật.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1.

Đối tượng và nguồn mẫu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây Cao su (Hevea brasiliensis) thuộc:
Họ: Euphorbiaceae
Bộ: Euphorbiales
Lớp: Dicotyledonae
Ngành: Angiospermatophyta [20].
Nguồn mẫu nghiên cứu được lấy từ các hộ nông dân trồng cây Cao su tại

huyện Tân Uyên, tỉnh Bình Dương.

3.2.

Phạm vi nghiên cứu

Bước đầu nghiên cứu điều kiện khử trùng và khả năng tạo cụm chồi của cây

Cao su.
Khóa luận được tiến hành trong thời gian từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 05
năm 2014 tại phịng thí nghiệm bộ môn Sinh học, trường Đại học Thủ Dầu Một.

4. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 0,1%, dung dịch javel với các
2


thời gian khác nhau lên chồi đỉnh, chồi nách, hạt của cây Cao su.
Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh
trưởng khác nhau lên khả năng tạo cụm chồi in vitro của mẫu.

5. Bố cục của khóa luận
Bố cục của khóa luận gồm các phần sau:
- Mở đầu (4 trang)
Phần này gồm các nội dung: Lý do chọn đề tài, mục tiêu đề tài, đối tượng phạm
vi nghiên cứu, nội dung nghiên cứu và bố cục của khóa luận.
-

Chương 1. Tổng quan tài liệu (17 trang)
Trong chương này, chúng tơi trình bày các cơ sở lý thuyết và tình hình nghiên
cứu liên quan đến nội dung khóa luận. Gồm các nội dung: Lược sử phát triển
của nuôi cấy mô và tế bào thực vật, những ưu điểm và hạn chế của nhân giống
in vitro, ứng dụng của nhân giống in vitro ở một số cây công nghiệp và vài nét
về cây cao su.

-

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (7 trang)

Chúng tơi trình bày về vật liệu và phương pháp nghiên cứu bao gồm: Trang
thiết bị, dụng cụ và vật liệu nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu tài liệu,
phương pháp nghiên cứu trong phịng thí nghiệm, phương pháp xử lý thống kê
số liệu.

-

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận (10 trang)
Trong chương này, các kết quả nghiên cứu được trình bày và thảo luận. Chúng
tơi trình bày các nội dung sau:
+ Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng khử trùng từ một số mẫu cây Cao su và thảo
luận.
+ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng khử trùng từ cành của cây Cao su và thảo
luận.
+ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu khả năng phát sinh chồi từ các mẫu vật vô trùng

3


của cây Cao su và thảo luận.
- Kết luận và khuy ến nghị (1 trang)
Ở phần này, chúng tôi rút ra những kết luận trên cơ sở của kết quả nghiên cứu.
Đồng thời, chúng tôi cũng đưa ra những khuyến nghị cho việc tiếp tục nghiên
cứu vi nhân giống cây Cao su.
- Tài liệu tham kh ảo (4 trang)
Phần này, chúng tôi liệt kê các tài liệu tham khảo gồm có: Tài liệu tiếng việt, tài
liệu nước ngồi và tài liệu internet.

4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MƠ VÀ TẾ BÀO
THỰC VẬT
Kỹ thuật ni cấy mơ, tế bào thực vật là q trình ni cấy vơ trùng in vitro các

bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
nhanh chóng đi vào thực tiễn cuộc sống. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào
thực vật được bao hàm trong ứng dụng của Công nghệ Sinh học. Nó bao gồm nhân
giống và nhân nhanh giống, sản xuất sinh khối các sản phẩm sinh hóa, sản xuất và
chuyển hóa sinh học các dược liệu tự nhiên, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý,
cải thiện và tạo giống cây trồng, nghiên cứu bệnh học thực vật, làm sạch virus...
[16].
Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã chính thức
xây dựng học thuyết tế bào. Học thuyết tế bào khẳng định: Mỗi cơ thể động thực
vật đều bao gồm những thể tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế bào
[29].
Năm 1898, Haberlandt tiến hành nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào này tách từ
nhu mô lá, tượng tầng của tầng biểu bì và lơng hút của nhiều lồi thực vật, kết quả
thu được là không thành công [23]. Năm 1902, Haberlandt để chứng minh cho tính
tồn năng của tế bào ông đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật.
Theo ông, mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng
tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hồn chỉnh. Điều đó, theo kiến thức sinh
học hiện đại có nghĩa là: Mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ
toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện
thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hồn chỉnh. Tuy
nhiên, Haberlandt đã khơng thành cơng trong thí nghiệm chứng minh chứng tính

tồn năng của tế bào do bởi ông đã chọn cây Một lá mầm là đối tượng rất khó ni
cấy, mặt khác do ông lại dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh. Một nguyên


nhân khác nữa của sự thất bại là do vào thời kỳ đó những hiểu biết khoa học về nhu
cầu dinh dưỡng của mơ thực vật cịn hạn chế nên ông đã không tìm ra được môi
trường dinh dưỡng tối thích hợp cho sự phân chia tế bào [1], [16], [23].
Phải mất hàng chục năm sau mới có những thí nghiệm thành công để chứng
minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào. Nỗi bật là các cơng trình
sau:
Năm 1922, Kotte và cs. đã ni cấy đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ của một cây
hòa thảo và đã tạo được một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Nhưng sau một thời gian ngắn
thì hệ rễ này sinh trưởng chậm dần và ngừng lại [23], [32].
Đến năm 1934, White đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ Cà
chua (Lycopersicum esculentum) trên một mơi trường lỏng chứa muối khống,
glucose và nước chiết nấm men. Năm 1937, ông phát hiện tầm quan trọng của các
vitamin thuộc nhóm B là B1, B6 và PP để thay thế cho dịch chiết nấm men và thấy
rằng việc thay thế này hoàn toàn phù hợp. Từ đó việc ni cấy đầu rễ trong thời
gian vơ hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau. Cùng lúc với White,
Gautheret cũng đã thu được kết quả phân chia các tế bào của tầng sinh gỗ ở cây liễu
[16], [23].
Năm 1939, Nobécourt và Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh
trưởng trong thời gian vơ hạn của mô sẹo Cà rốt (Daucus carota) bằng cách cấy
chuyền đều đặn 6 tuần một lần. Lúc này, White đã thành công tương tự với cây
thuốc lá. Kỹ thuật nuôi cấy mơ thực vật được khai sinh từ đó [17].
Từ năm 1941 - 1954, những phát hiện về vai trò của các chất kích thích sinh
trưởng như IAA, NAA, 2,4-D, kinetin và vai trò của các vitamin, nước dừa là tiền
đề kỹ thuật cho việc làm thí nghiệm ổn định, dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của kỹ
thuật nuôi cấy mô, tế bào [31].
Năm 1951, Nitsch đã khắc phục được tính khơng giao hợp tiền giao tử khi

nghiên cứu và thành công trong nuôi cấy mô quả bầu non, cà chua, dưa chuột và lần
đầu tiên tạo được hạt trong quả cà chua in vitro có khả năng nảy mầm (hạt có sức
sống). Sau này có rất nhiều nhà khoa học thành công trong nuôi cấy hạt phấn, các
quá trình sinh trưởng của ống phấn, thụ tinh và tạo thành quả trong điều kiện in


vitro [19].
Năm 1953, Miller và Skoog tạo được rễ từ mãnh mô cắt từ thân cây Thuốc lá
(Nicotiana tabacum). Đến năm 1957, hai ông công bố kết quả nghiên cứu ảnh
hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ
quan của mơ sẹo thuốc lá. Khi giảm tỉ lệ kinetin/auxin mơ sẹo có khuynh hướng
phát triển rễ, ngược lại nếu tỉ lệ này tăng thì dẫn đến sự tạo chồi ở mơ sẹo. Hiện
tượng này được xác nhận trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau và đóng góp rất
lớn vào việc điều khiển sinh trưởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào
trong nuôi cấy [16], [17], [29], [32].
Năm 1958, Reinert và Steward tạo được phơi và cây cà rốt hồn chỉnh từ tế bào
đơn nuôi cấy trong dung dịch [30].
Năm 1960, Cooking ở Đại học Nottingham (Anh) lần đầu tiên đã tách được tế
bào trần (protoplast) khi dùng enzyme cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào
thực vật. Cũng trong năm 1960, Bergman thành công trong việc thu một số dung
dịch huyền phù khơng có các tế bào kết cụm mà gồm hầu hết các tế bào đơn. Các tế
bào này có thể gieo trên mơi trường, trong các hộp lồng, nó sẽ tiếp tục sống, phân
chia và tái tạo lại mô sẹo [16], [17].
Năm 1962, Kante và cs. thông báo về khả năng thụ phấn trong điều kiện in
vitro của cây Thuốc phiện (Papaver somniferum) [2].
Năm 1964, Guha và cs. thu được phôi trưởng thành từ nuôi cấy bao phấn cây
Cà độc dược (Datura inoxia) Năm 1966, ông tạo thành công cây đơn bội từ nuôi
cấy túi phấn cây Cà độc dược. Năm 1967, nhóm Bourgin và Nitsch lại thành công
khi tạo cây đơn bội từ túi phấn thuốc lá. Những thành công này đã khiến giới khoa
học bắt đầu chú ý đến việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn.

Việc này đã đóng góp rất nhiều kiến thức cho lĩnh vực di truyền thực vật và thực
tiễn chọn giống [29].
Năm 1966, Morel hồn thành quy trình nhân nhanh cây hoa lan thuộc chi
Cymbidium. Ý tưởng của ông được thai nghén từ năm 1960 khi ông ngẫu nhiên
quan sát sự sinh trưởng và phát triển của chồi ngọn cây hoa lan trong lúc cố tìm
cách để làm sạch bệnh cây hoa lan giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào


thực vật [2].
Năm 1970, Nagata và Takebe đã sử dụng kỹ thuật tế bào của Bergman để nuôi
cấy protoplast của lá cây thuốc lá và tái sinh được cây hoàn chỉnh. Cho đến nay, kỹ
thuật protoplast đã được thực tế xác nhận sau nhiều công bố lai thành công giữa các
lồi, một việc khơng thể thực hiện được bằng lai hữu tính cổ điển. Protoplast giúp
sự nghiên cứu hiện tượng nhiễm sắc thể hòa hợp của các tế bào khác loài sau khi
dung hợp, giúp cho việc nghiên cứu vai trò của các DNA trong các cơ quan tử và
quan hệ của chúng với DNA trong phân bào. Tính đến ngày 1/1/1985 kỹ thuật dung
hợp protoplast đã thu được 104 trường hợp lai, bao gồm con lai trong loài, con lai
giữa các loài, con lai giữa các chi và con lai giữa các chi phụ. Đến năm 1995, con
số trên đã gấp hai lần. Điều đó chứng tỏ kỹ thuật dung hợp protoplast đã trợ giúp rất
hiệu quả cho công tác chọn tạo giống [16], [17].
Từ năm 1972 đến 1977, Melchers đã đưa ra những cải tiến mới về phương
pháp nuôi cấy bao phấn và túi phấn để nhận được cây con đơn bội với số lượng lớn
và đưa ra các luận điểm cần phải gắn phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật với
các phương pháp chọn giống khác [18].
Từ năm 1980 đến nay là giai đoạn thành cơng của lĩnh vực cơng nghệ gene
thực vật. Đó là kỹ thuật đưa một gene cần thiết có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật
và động vật hay một gene tổng hợp vào các giống cây trồng muốn cải tạo. Chỉ trong
một thời gian ngắn một loạt phương pháp đưa gene ngoại lai vào thực vật được
công bố. Sau khi đưa được gene ngoại lai vào tế bào người ta sử dụng kỹ thuật nuôi
cấy mô, tế bào thực vật để nuôi cấy các tế bào đã được chuyển nạp. Sau đó cho tái

sinh lại thành cây nguyên vẹn mang những đặc tính sinh học mới. Chúng sinh
trưởng, phát triển, ra hoa, kết hạt bình thường và được coi như một giống cây trồng
mới. Lĩnh vực công nghệ gene đã có những thành cơng to lớn khơng chỉ trên đối
tượng thực vật mà cịn thành cơng trên đối tượng động vật và vi sinh vật. Năm
1988, Toriyama thành công khi chuyển gene kháng bệnh vàng lụi (Tungro) vào
protoplast lúa nhóm Japonica và tái sinh cây hồn tồn từ protoplast chuyển gene.
Năm 1991, Burbank đã thành công trong việc ghép gene miễn dịch đối với loài gián
cánh cứng Colorado cho khoai tây đã được trồng thử ở một vài nơi ở Maine Oregar.


Kết quả khoai tây có thể miễn dịch đặc biệt với loài gián cánh cứng [3], [16], [23].
Ở viện nghiên cứu Nông nghiệp Pháp (INRA), các nhà khoa học đã chuyển
thành công gene Capsul vào cây thuốc lá. Các nhà khoa học của viện lúa Quốc tế
(IRRI) đã chuyển thành công các gene khác nhau vào cây lúa, cụ thể là gene Bt
(gene chống sâu đục thân ở lúa), gene Chitinase chống bệnh do nấm gây ra như đạo
ôn, khô vằn. Các giống cây trồng chuyển gene hiện đang được khảo nghiệm và
trồng trong điều kiện nhà kính tại Cơng ty Di truyền chọn giống và sản xuất hạt
giống tại Bruxell (Bỉ). Ở Mỹ đã sản xuất hai loại cây trồng là cà chua cứng quả và
bảo quản lâu hơn 45 ngày, loại thứ hai là giống ngô chống sâu đục thân và có năng
suất cao. Thực vật chuyển gene thực tế đã trở thành hàng hóa trên thị trường. Năm
1996, người ta đã ứng dụng cho trồng trọt khoảng 18.000 km2 từ Ả rập đến Bắc Mỹ
và sản phẩm được đem bán trên thị trường với những ưu việt như bí ngơ chống chịu
được virus, khoai tây và bơng không bị côn trùng phá hoại, bông và đậu tương
chống chịu được các chất diệt cỏ. Ngô chuyển gene cũng đã được trồng đại trà và
được bán rộng rãi trên thị trường Châu Âu [1], [5].
Nói tóm lại, sự phát triển như vũ bão của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
cùng với sự ra đời của công nghệ gene thực vật đã mở ra một hướng mới cho nền
nông nghiệp thế giới. Với các giống cây trồng được tạo ra bằng các phương pháp
này, nền nông nghiệp thế giới đang bước vào “Cuộc cách mạng xanh lần thứ hai”,
góp phần khơng nhỏ vào đảm bảo an tồn lương thực và nhu cầu của con người.

Các nhà nông học sẽ có thêm một phương pháp mới trong việc cải tạo tự nhiên
[24].

1.2.

NHỮNG ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG IN
VITRO

1.2.1. Ưu điểm của nhân giống vơ tính in vitro
Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một
quần thể đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản phẩm thương mại,
dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền.
Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công


nghệ nhân giống vơ tính in vitro đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong
vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây.
Sản phẩm cây giống đồng nhất: Nhân giống vơ tính in vitro về cơ bản là cơng
nghệ nhân dịng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có
kiểu gene dị hợp hay đồng hợp.
Tiết kiệm khơng gian: Vì hệ thống sản xuất hồn tồn trong phịng thí nghiệm,
khơng phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ
cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng
ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống.
Nâng cao chất lượng cây trồng: Nuôi cấy mô là phương pháp hữu hiệu để loại
trừ virus, nấm, vi khuẩn khỏi các cây trồng đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo
ra bằng nuôi cấy mô thường tăng năng suất 15-30 % so với nguồn gốc.
Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác
nhau có thể tạo ra từ hệ thống nhân giống vơ tính in vitro như cây con in vitro hoặc
trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ.

Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ
dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận
là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các quy định về sinh thực vật quốc
tế.
Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể được tiến hành vào bất kỳ thời
gian nào, không phụ thuộc vào mùa vụ [12].
1.2.2. Hạn chế của nhân giống in vitro
Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải
tất cả cây trồng điều được nhân giống thương phẩm bằng nhân giống vơ tính in
vitro. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để
đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gene. Nhiều vấn đề lý thuyết
liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải quyết.
Chi phí sản xuất cao: Nhân giống vơ tính in vitro địi hỏi nhiều lao động kỹ
thuật thành thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với phương pháp truyền
thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.


Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con ni cấy mơ có thể sai
khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con
khơng giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỉ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn
đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng nhân lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng
hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý
khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền
[12].

1.3. ỨNG DỤNG CỦA NHÂN GIỐNG IN VITRO Ở MỘT SỐ CÂY
CƠNG NGHIỆP
Kỹ thuật nhân giống vơ tính in vitro thật chất là một tiến bộ vượt bậc về chất
của phương thức nhân giống vơ tính cổ điển như giâm cành, ghép cành, chiết
cành... Ở đây, giá trị thực tiễn của các tiến bộ khoa học là đã biến những phương

thức cổ điển đó thành những phương thức mới về chất cho phép giải quyết những
vấn đề khó khăn, những hạn chế mà phương thức nhân giống cổ điển không thể giải
quyết được [15].
Cây công nghiệp ở nước ta gồm cây cơng nghiệp ngắn ngày như: Mía, sắn, lơ
hội.; cây công nghiệp dài ngày như các cây: Cà phê, tiêu, điều, ca cao, cao su. là
những loại cây chiếm tỉ trọng rất cao trong lĩnh vực nông nghiệp ở nước ta, do
mang lại giá trị cao về mặt kinh tế, nhu cầu về những mặt hàng cây công nghiệp
trong nước và xuất khẩu khá cao và đang ngày càng tăng.
Phương thức nhân giống in vitro cho phép ta có thể tận dụng hầu hết các bộ
phận của cây từ đỉnh sinh trưởng, chồi nách, đoạn thân, mảnh lá,. để tiến hành nuôi
cấy và hiện nay đã mang lại những thành công rất lớn [24].
Kỹ thuật nhân giống in vitro đã được áp dụng rộng rãi để nhân giống các loại
cây trồng như: Cây nông nghiệp, cây thuốc, cây hoa. và đã mang lại kết quả cao.
Đối với các cây công nghiệp, phương thức nhân giống truyền thống đã được
tiến hành phổ biến từ lâu. Ngày nay, việc ứng dụng nhân giống vơ tính in vitro cây
cơng nghiệp cũng đã được áp dụng và phát triển mạnh.
Một số nghiên cứu ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro ở cây công nghiệp:


- Ở cây công nghiệp ngắn ngày:
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thanh, Dương Huyền Trang, “Nghiên cứu kỹ
thuật nhân giống vơ tính cây Lơ hội (Aloe vera L.) bằng phương pháp ni cấy in
vitro”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2008: Tập VI, Số 6: 514-521, khoa Nông
học, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đã đạt kết quả rất khả quan. Kỹ thuật tạo
vật liệu khởi đầu in vitro nên sử dụng mẫu lấy ở vụ xuân và khử trùng đơn trong
dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút cho hiệu quả khử trùng tốt, tỉ lệ mẫu
sống và bật chồi cao (68,5%). Mơi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi Lô hội in
vitro là môi trường MS bổ sung 2,5 mg/L BAP, có hệ số nhân cao (5,3 lần), chất
lượng chồi tốt. Mơi trường có kinetin và hỗn hợp BAP với ( - IAA đều khơng có tác
dụng làm tăng hệ số nhân và chất lượng chồi in vitro. Bổ sung 0,5 ppm a - NAA

hoặc IBA vào môi trường cho tỉ lệ ra rễ cao (79,1 - 89%). Mơi trường có than hoạt
tính 1,5 - 2,0 g/L cho khả năng ra rễ đạt cao nhất. Tỉ lệ ra rễ đạt 100%, chất lượng rễ
tốt. Giá thể ra cây Lơ hội in vitro thích hợp là cát mịn. Cây ra ngôi trên giá thể này
tỉ lệ sống đạt 81,4%, cây sinh trưởng phát triển tốt. Thời vụ không ảnh hưởng đáng
kể đến hiệu quả ra cây Lô hội in vitro [22].
- Ở cây công nghiệp dài ngày:
Trên thế giới: Phương pháp vi nhân giống tạo dòng cây Hồ tiêu sử dụng các
mảnh cấy như: Đầu rễ, mắt nhánh và chồi ngọn từ cả cây tiêu non và cây trưởng
thành (Mathews và Rao, 1984; Agarwal, 1988; Philip và cs. 1992; Nazeem và cs.
1993; Nirmal Babu và cs. 1993; Joseph và cs. 1996; Lissamma và cs. 1996) [7].
Phương pháp vi nhân giống cây tiêu P. chaba đã được (Nirmal Babu và cs.
1993; Rema và cs. 1995) tiêu chuẩn hóa. Sự chuyển hóa của mơ phân sinh rễ và mô
phân ngọn đã giúp cây con phát triển ở cây tiêu: P. longum và P. colurinum đã được
báo cáo về vấn đề này (Nirmal Babu và cs. 1993). Các cây con in vitro của giống
cây này đã được đánh giá, thử nghiệm ở phòng nghiên cứu chủng loại Calicus ở Ấn
độ. Những phương pháp vi nhân giống cây tiêu này đã đóng góp quan trọng cho
nền kinh tế và mối quan hệ giữa các giống tiêu [7].
Trong nước: Năm 2003, Đoàn Thị Ái Thuyền, TS. Thái Xuân Du và Đỗ Xuân


Giáp, “Bước đầu nghiên cứu nhân giống một số cây hồ tiêu sạch virus (Piper
nigrum L.)” tại viện Sinh học nhiệt đới. Mẫu chồi sau khi lấy được rửa sạch và sát
trùng bằng cồn 700 rồi dùng nước tẩy javel pha loãng khoảng 1/3 khử trùng mẫu
trong khoảng 30-40 phút. Có thể dùng HgCl2 0,1% hoặc dùng dung dịch kháng sinh
Cefotaxin 1% từ 1-2 giờ. Sau khi ngâm trong dung dịch kháng sinh Cefotaxin 1%
(1, 2, 24) giờ. Kết quả cho 20-70% mẫu bị nhiễm sau 7-14 ngày nuôi cấy. Khi bổ
sung Cefotaxin 1% vào môi trường nuôi cấy. Kết quả cho khoảng 20-30% mẫu
được vơ trùng hồn tồn sau 3-4 tuần nuôi cấy. Đồng thời khi cấy chuyển sang mơi
trường mới khơng có kháng sinh, chồi mới khơng có khả năng tái nhiễm trở lại.
Ngoài ra, khử nghiệm thử trùng bằng cách kết hợp dung dịch Acid Benzoic bão

hòa, dung dịch tẩy javel và kháng sinh. Kết quả thu được khoảng 40-50 % mẫu khử
trùng không tái nhiễm. Khả năng tạo chồi mới của đốt gốc là tốt nhất so với đốt
giữa và đốt ngọn. Khả năng tạo mô sẹo ở mỗi loại đốt cũng tương tự như ở tạo chồi.
Khi nồng độ BA hơn 5,0 mg/L hoặc TDZ sẽ ức chế khả năng hình thành chồi và khi
bổ sung một nồng độ Cytokinin và Auxin thích hợp sẽ làm tăng số chồi hình thành
ở đốt cấy hồ tiêu. Nồng độ NAA và IBA càng cao thì khối mơ sẹo tạo ra càng nhiều.
Các mô sẹo trắng, xốp khi chuyển sang mơi trường tạo chồi sẽ có ít khả năng tái tạo
chồi. Mơi trường MS có bổ sung BA (0,5 mg/L), Ki (0,5 mg/L), IBA (0,5 mg/L) là
thích hợp cho khả năng biệt hóa chồi từ mơ sẹo. Ở nồng độ BA (0,3 mg/L), Ki (0,5
mg/L), IBA (0,5 mg/L) chồi sẽ phát triển mạnh hơn, chồi lớn hơn và khi cắt chồi
ni cấy trên mơi trường MS thì khả năng tạo rễ và phát triển tốt hơn những môi
môi trường cịn lại. Mơi trường tạo rễ là MS + NAA (0,1-1,0 mg/L) hoặc IBA (0,11,0 mg/L). Môi trường MS có bổ sung than hoạt tính (1,0 mg/L) là thích hợp để cây
ra rễ ở cây hồ tiêu. Không sử dụng Auxin cho mục đích ra rễ [25].
Năm 2005, Nguyễn Hữu Định, ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học
Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh thực hiện “Nghiên cứu nhân giống vơ tính cây
Tiêu (Piper nigrum) bằng phương pháp nuôi cấy mô với chất khử trùng chồi tiêu
bằng kháng sinh Tetracylin hoặc Streptomyxin” cho hiệu quả cao nhất khi thời gian
xử lí là 6 giờ. Kháng sinh Tetracylin hiệu quả khử trùng cao hơn kháng sinh
Streptomyxin. Mơi trường thích hợp nhất cho mẫu lá tiêu hình thành và phát triển


mô sẹo là môi trường bổ sung 3 mg/L BA + 1 mg/L IBA. Mơi trường thích hợp nhất
cho mơ sẹo tái sinh chồi là mơi trường có bổ sung 3 mg/L BA + 0,3 mg/L TDZ [7].
Năm 2011, Nguyễn Cảnh Chính, trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội, đã
“Nghiên cứu khả năng nhân giống vơ tính cây Chè đắng (llex kaushue S.Y Hu)
bằng phương pháp giâm cành” [6].
Hiện nay, trên thế giới việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nhân nhanh
các loại cây trồng đã trở thành công cụ nhân giống chủ yếu. Tuy nhiên ở Việt Nam
với cây công nghiệp dài ngày như cao su, cà phê... kỹ thuật này còn chưa được
nghiên cứu ứng dụng nhiều mặt dù cũng đã có một số kết quả nhất định. Từ năm

1993 đã có cơng trình nghiên cứu tạo và nhân phơi vơ tính từ mơ lá cho cây cà phê
lai Arabusta của trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia tại thành phố
Hồ Chí Minh. Nhưng lượng cây tái sinh trực tiếp từ phôi là không cao và chưa được
ứng dụng rộng rãi cho sản xuất [37].

1.4. VÀI NÉT VỀ CÂY CAO SU
1.4.1. Đặc điểm chung của họ Đại kích hay họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)
Họ Thầu dầu là một họ lớn, gần 290 chi và khoảng 7500 loài, phân bố chủ yếu
ở các xứ nhiệt đới, nhưng các đại diện thân cỏ cũng gặp ở vùng ơn đới, thậm chí
vùng hàn đới; trung tâm phân bố chủ yếu của họ là Nam Mĩ, châu Phi, Đơng Á và
Đơng Nam Á. Nước ta có khoảng 80 chi với gần 460 loài [8].
Đặc điểm chung của họ là cây rất đa dạng: Thân gỗ, thân bụi, thân cỏ, đôi khi
mọng nước chứa đầy nhựa mủ như sữa. Lá cũng đa dạng: Mọc cách hoặc mọc đối,
đơn hoặc kép, gân lông chim hay chân vịt,... thường có lá kèm, đơi khi lá kèm biến
thành gai. Hoa tập hợp thành cụm hoa chùm, chùy. gồm nhiều xim hai ngả. Hoa
đơn tính, cùng cây hay khác cây. Hoa đều, gốc có là bắc, thường mẫu 5, ít khi mẫu
3. Bao hoa kép hoặc đơn (chỉ có đài), đơi khi hồn tồn khơng có bao hoa. Nhị từ
nhiều đến 5 hoặc giảm chỉ còn 1 (chi Euphorbia). Trong hoa đực có các dấu vết của
nhụy. Bộ nhụy ln ln gồm 3 lá nỗn dính lại với nhau thành bầu trên, 3 ơ, mỗi ơ
chứa 1 hay 2 nỗn đảo. Nỗn thường có nút đậy lỗ nỗn do vách bầu phát triển
thành, về sau để lại di tích trên hạt gọi là mồng. Quả mở thành 3 hay 6 mảnh vỏ, đôi


khi là quả mọng hoặc quả hạch. Hạt thường có nội nhủ dầu. [8].
Trong họ Đại kích hay họ Thầu dầu có đến 10 lồi cây cho mủ cao su, dưới đây
là tên một số loài Hevea khác Hevea brasiliensis [14].
+ H. benthamiana: Cây cao trên 27 m, gốc cây phình to. Cây thường mọc ở vùng
đất phù sa, ngập nước định kỳ vào mựa mưa ở dọc bờ sông Amazon. Năng suất mủ
cao su kém, chất lượng mủ tốt [14].
+ H. camagoana: Cây nhỏ, cao từ 2-12 m, mọc cạnh các dòng chảy và vùng đầm

lầy. Cây cho năng suất mủ kém, mủ trắng [14].
+ H. camporum: Cây thấp, chiều cao dưới 2 m, chỉ tìm thấy ở vùng đầu nguồn,
vùng sa mạc, Cây cho năng suất mủ kém, mủ trắng [14].
+ H. guianensis: Lồi này có vùng phân bố rộng nhất, cây cao 20-35 m, thân hình
trụ, thường chỉ phân cành ở chiều cao 1/2 thân trở lên. Năng suất mủ kém, mủ màu
hơi vàng, chất lượng mủ thấp [14].
+ H. microphylla : Cây cao 18-20 m, thân mảnh khảnh, gốc cây hơi to. Năng suất
mủ kém [14].
+ H. nitida : Cây nhỏ đến trung bình, thân hình trụ. Mủ màu trắng đậm đặc, chứa
nhiều chất nhựa (resin), ít cao su [14].
+ H. pauciflora : Cây lớn cao trên 25 m, thân hình trụ. Mủ có màu trắng, chứa
nhiều chất nhựa, ít cao su [14].
+ H. rigidifolia : Cây cao trung bình 12-18 m, thân hơi nghiêng. Mủ trắng, nhiều
chất nhựa, không chứa đủ cao su theo chất lượng thương mại đòi hỏi [14].
+ H. Spruceaa: Cây cao đến trên 25 m, gốc cây hơi phình to ra, tán lá nặng, lá mọc
hơi chúc xuống, mặt dưới lá có lơng tơ. Mủ trắng, ít cao su. Cây mọc trên đất thấp,
ngập nước định kỳ ở dọc bờ sông [14].
Ngồi Hevea brasiliensis và 9 lồi kể trên cịn có trên 2.000 lồi thuộc các họ
khác cũng có thể cho mủ cao su và phần lớn sống trong vùng nhiệt đới. Nhưng cho
đến nay chưa có một lồi nào có thể cạnh tranh được với cây Hevea brasiliensis
[14].
1.4.2. Đặc điểm riêng của cây Cao su
1.4.2.1.

Tên khoa học