Khảo sát khả năng sinh enzyme celulase của nấm trichoderma phân lập từ đất vườn tài bình dương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
••

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
••
CHUYÊN NGÀNH : SƯ PHẠM SINH HỌC
••

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH
ENZYME CELULASE CỦA NẤM
TRICHODERMA PHÂN LẬP TỪ
ĐẤT VƯỜN TẠI BÌNH DƯƠNG
CAO TRƯƠNG ÁI NỮ


Bình Dương, tháng 5, năm 2014


TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
••

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CAO ĐẲNG
••

NIÊN KHĨA 2011 - 2014

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH
ENZYME CELULASE CỦA NẤM
TRICHODERMA PHÂN LẬP TỪ

ĐẤT VƯỜN TẠI BÌNH DƯƠNG
Ngành: SINH HỌC
Chuyên ngành: SƯ PHẠM SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: ThS. NGUYỄN ANH DŨNG Sinh viên
thực hiện: CAO TRƯƠNG ÁI NỮ MSSV: 111C840051 Lớp:
C11SH02

Bình Dương, tháng 5, năm 2014


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu, kết
quả trong khóa luận này là hồn tồn trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất
kỳ cơng trình nào khác.
Sinh viên

Cao Trương Ái Nữ


LỜI CẢM ƠN
Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Anh Dũng - Người
đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm quý báu trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Em xin bày tỏ lịng biết ơn đến quý thầy cô trong bộ môn Sinh khoa Khoa Học Tự
Nhiên và các thầy cơ phụ trách phịng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho em hồn thành tốt khóa luận này.
Cảm ơn các bạn cùng khóa đã đóng góp nhiều ý kiến, động viên trong suốt thời
gian qua.
Con xin chân thành kính tỏ lịng biết ơn đến gia đình đã động viên, an ủi và là chỗ

dựa tinh thần cũng như vật chất tạo điều kiện thuận lợi để hồn thành khóa luận.
Sinh viên

Cao Trương Ái Nữ


LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC

PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU

Tên bảng biểu Trang

6


DANH MỤC HÌNH

Tên hình Trang


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết
tắt
CMCase

Ý nghĩa

: Carbomexymethyl cellulase

CMC

: Carboxymethyl cellulose

CBH

: Cellobiohydrolase hay Exoglucanase

CBHI

: Exoglucanase I
: Exoglucanase II

CBH II
EG

: Endoglucanase

EGI

: Endoglucanase I

EGII

: Endoglucanase II

KHV

: Kính hiển vi

KL

: Khuẩn lạc

MT

: Mơi trường

PTN

: Phịng thí nghiệm

PGA
VSV

:
Potato glucose agar
: Vi sinh vật


TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Bình Dương, Ngày 7 tháng 5 năm 2014
BẢN NHẬN XÉT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

(Của giảng viên hướng dẫn)
1. Tên đề tài: Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của nấm Trichoderma
phân lập từ đất vườn tại Bình Dương
2. Sinh viên thực hiện: Cao Trương Ái Nữ
Lớp: C11SH02

Mã số SV: 111C840051

3. Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Anh Dũng Đơn vị: Khoa KHTN
NỘI DUNG NHẬN XÉT
1. Tinh thần, thái độ của sinh viên trong suốt q trình làm khóa luận
- Sinh viên có tinh thần cầu thị, ham học hỏi và siêng năng trong quá trình thực
hiện đề tài.
2. Khả năng đọc và khai thác tài liệu tham khảo
- Sinh viên có khả năng đọc, tra cứu và vận dụng tốt tài liệu tham khảo từ nhiều
nguồn khác nhau.
3. Kỹ năng viết và trình bày báo cáo
- Kỹ năng viết và trình bày báo cáo hợp lý. Có lí luận, so sánh, tham chiếu kết quả
của mình và kết quả khác.
4. Kết quả đạt được
- Kết quả đạt được của đề tài mang tính khoa học cao.
5. Đánh giá chung và kết luận
- Đề tài tốt và đủ khối lượng của một khóa luận tốt nghiệp của sinh viên.

Người hướng dẫn

Nguyễn Anh Dũng
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT

HỘI ĐỒNG CHẤM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NĂM 2013

PHIẾU NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

1. Tên đề tài: Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của nấm Trichoderma
phân lập từ đất vườn tại Bình Dương
2. Họ và tên SV thực hiện: Cao Trương Ái Nữ
Mã SV: 111C840051

Lớp: C11SH02

3. Họ và tên giảng viênphản biện: ThS. Trần Ngọc Hùng Đơn vị công tác: Khoa Khoa
học Tự nhiên

NỘI DUNG NHẬN XÉT
1. Đánh giá chung
(Mức độ thực hiện so với đề cương được giao)
Thực hiện đầy đủ các nội dung của đề tài với kết quả khá tốt
2. Đánh giá chi tiết
(Mục tiêu, nội dung, kết quả, và khả năng ứng dụng thực tế; Bố cục và hình thức trình
bày, ...)
Enzyme cellulase có nhiều ứng dụng trong thực tế nên việc tìm kiếm các nguồn
sinh tổng hợp cellulase có hoạt tính cao ln ln cần thiết. Trong đề tài, tác giả tìm kiếm
nguồn sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma phân lập tại Bình Dương nhằm phân hủy
nhanh rơm rạ, các phế phụ liệu nông nghiệp, phục vụ sản xuất phân hữu cơ vi sinh.
Trong 5 chủng Trichoderma phân lập được từ các nguồn khác nhau, tác giả đã
chọn được chủng Tr3 có khả năng sinh tổng hợp cellulase tốt nhất, xác định được một số
điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng như nhiệt độ, độ ẩm,
thời gian.

Đề tài phân lập các chủng Trichoderma tại khu vực Bình Dương có khả năng sinh
tổng hợp cellulase mạnh, làm nguyên liệu cho các ứng dụng tiếp theo. Kết quả đề tài
cung cấp các chủng Trichoderma để sản xuất các chế phẩm ủ hoai phế phụ liệu nông


nghiệp nhằm sản xuất phân hữu cơ vi sinh.
Tuy nhiên, tác giả chưa so sánh với các nghiên cứu trước và đánh giá hoạt tính
cellulase nên chưa có cái nhìn xác thực về mức độ sinh cellulase của chủng.
Việc ứng dụng cellulase từ Trichoderma vào các lạnh vực công nghiệp và chăn
ni cần phải có thêm nhiều nghiên cứu.
Phần chính khóa luận bao gồm các phần:
Mở đầu: 4 trang; Chương 1: 12 trang; Chương 2: 7 trang; Chương 3: 10 trang;
Kết luận và khuyến nghị: 1 trang
Nhìn chung, bố cục khóa luận cân đối, hợp lý, phần tổng quan tài liệu đầy đủ.
Khóa luận trình bày đẹp, theo đúng u cầu, ít lỗi chính tả.
3. Các vấn đề cần bổ sung, chỉnh sửa
Các vấn đề cần chỉnh sửa:
Trang 14: mục 1.3.2.2: tác giả không nên đặt thêm đề mục, nên viết gom lại ảnh
hưởng của các yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp cellulase.
Trang 17: thống nhất cách viết glucose và glucoza.
Trang 18: MT thử hoạt tính cellulase; Chỉnh sửa lại thành phần môi trường MT5
cho đúng 100%.
Trang 19: mục 2.2.2.1 bổ sung môi trường bảo quản các chủng Trichoderma phân
lập được.
Trang 23: mục 2.2.4, Word 2010 không dùng để xử lý số liệu.
Trang 24: bảng 3.1: thống nhất cách viết số thập phân, dấu ngăn cách và số chữ số
sau dấu phẩy.
Trang 25: bảng 3.2: các chủng Trichoderma phân lập trên mơi trường MT1 hay
MT2, thiếu tên hình.
Trang 27: bảng 3.3: thiếu nguồn (đất, lá, địa điểm) phân lập các chủng

Trichoderma.
Tài liệu tham khảo số 9 viết sai chính tả; nhiều tài liệu tham khảo khơng trích dẫn
trong tài liệu.
4. Câu hỏi sinh viên phải trả lời trước hội đồng (ít nhất 02 câu hỏi)
Tại sao hoạt tính enzyme lại giảm khi nuôi cấy từ 120 đến 168 giờ?
Bố trí thí nghiệm chưa thật hợp lý vì thời gian thường là yếu tố khảo sát sau cùng,


pH và nhiệt độ phải khảo sát đồng thời vì hai yếu tố này tác động qua lại lẫn nhau. Tác
giả trình bày rõ cơ sở của việc bố trí thí nghiệm như trên?
5. Kết luận
Đề tài đáp ứng được u cầu của một khóa luận tốt nghiệp.
Xếp loại: tốt
Bình Dương, ngày 07 tháng 05 năm 2014
GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN (Ký và ghi rõ
họ tên)


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

Việt Nam là nước nhiệt đới có nền nơng nghiệp dồi dào, hằng năm lượng phế thải
do ngành này thải vào môi trường rất lớn, trong đó thành phần chủ yếu là cellulose.
Trong tự nhiên cellulose rất khó bị phân hủy bởi cấu trúc phức tạp, q trình thủy phân
cellulose trong mơi trường kiềm hoặc acid rất tốn kém và gây hại cho môi trường. Vì
vậy, việc sử dụng các VSV có khả năng sinh enzyme cellulase là một hướng mới để giải
quyết vấn đề ô nhiễm do rác thải nông nghiệp gây ra. Ưu điểm khi sử dụng VSV vào
trong thực tiễn là thân thiện với môi trường, thời gian nuôi cấy nhanh, lượng enzyme
sinh ra lớn. [44]
Trong xu hướng phát triển nông nghiệp theo hướng bền vững, việc ứng dụng các

biện pháp sinh học vào sản xuất đã được áp dụng rộng rãi. Trong các loài vi sinh vật
được sử dụng, nấm Trichoderma đã chứng tỏ khả năng cho hiệu quả cao trong quản lý
dịch hại cây trồng nhờ đối kháng được với nhiều loại nấm bệnh bằng cách ký sinh, tiết
các kháng sinh hay các enzyme thủy phân glucanase, chitinase, cellulase...đồng thời cũng
là loại nấm hoại sinh đóng vai trị quan trọng trong việc phân hủy chất hữu cơ trong đất.
Mặt khác, Trichoderma là giống nấm phát triển nhanh và phân bố rộng, chúng
hiện diện ở hầu khắp các loại đất và thường chiếm ưu thế trong các hệ vi sinh vật đất.
Nếu xác định được khả năng sinh enzyme cellulase của nấm Trichoderma phân lập từ đất
cao hay thấp sẽ góp phần rất lớn cho việc cung cấp nguồn nguyên liệu cho ngành công
nghiệp chế biến thực phẩm cũng như việc bảo vệ môi trường.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tơi thực hiện khóa luận “Nghiên cứu khả năng
sinh enzyme cellulase của nấm Trichoderma phân lập từ đất vườn tại Bình Dương”.
2. Mục tiêu đề tài
Xác định được khả năng sinh enzyme cellulase của nấm Trichoderma phân lập từ
đất vườn ở điều kiện ảnh hưởng của các yếu tố môi trường.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập nấm Trichoderma từ đất vườn.
- Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của nấm Trichoderma phân lập từ đất
vườn.
4. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài
13


4.1.

Việt Nam

Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực phẩm
thải ra là rất lớn như: rơm, rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar...cac phế thải này có thành phần
chính là cellulose. Cellulose có thể bị thủy phân trong mơi trường kiềm hoặc acid. Tuy

nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém
và gây độc cho mơi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose
bằng công nghệ sinh học, đặc biệt là là việc sử sụng các enzyme ngoại bào vi sinh vật.
Các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase thuộc các chủng nấm sợi, xạ
khuẩn, vi khuẩn và một số trường hợp còn thấy ở nấm men. [17]
Vì thế, các chế phẩm sinh học chứa các VSV có khả năng sinh các loại enzyme
được sản xuất và được sử dụng ngày càng rộng rãi và phổ biến trong các lĩnh vực chăn
nuôi, trồng trọt,.Điều này giúp giảm bớt giá thành sản xuất, hạn chế được tình trạng ơ
nhiễm mơi trường.
Ở Việt Nam, Viện Sinh học nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI, BioII,
BioIII,..có dạng bột, chứa các enzyme amylase, protease, cellulase và các VSV dùng bổ
sung vào thức ăn cho bò, heo, cá. Chế phẩm có tác dụng phịng chống các chứng rối loạn
tiêu hóa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy thức ăn thừa và khí thải ở
đáy ao.[42]
Trung tâm Cơng nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh sản xuất chế phẩm Trichotech
chứa vi nấm Trichoderma, chế phẩm này có dạng rắn, tơi xốp, nhẹ, màu xám nâu đậm,
giúp cây trồng chống được các loại nấm bệnh.[43]
Công ty TNHH TM và sản xuất Mai Xuân (Tp. Hồ Chí Minh) sản xuất chế phẩm
TRICHO - MX chứa vi nấm Trichoderma, có dạng bột. Có tác dụng hạn chế nấm hại, cải
tạo đất, ủ phân bón cho cây trồng.
Cơng ty TNHH TM và sản xuất thuốc thú y - thuốc thủy sản Minh Dũng (Bình
Dương) đã sản xuất nhiều chế phẩm chứa vi nấm Aspergillus sinh enzyme cellulase,
dùng xử lý nước ao ni tơm cá, kích thích tiêu hóa, ở gia súc như: MD - Bio - Zemix,
Biofat, Bio vitamin, Biolaczym...
4.2.

Thế giới

Enzyme cellulase kỹ thuật chủ yếu được thu nhận từ Trichoderma reesei,
14

Aspergillus niger.và gần đây là các chủng vi khuẩn. [15]
Ở Đan Mạch, hãng Novo Nordisk có chế phẩm “Celluclast” dung trong thức ăn
gia súc. [22]
Ở Pháp, hãng Lyven dùng “Cellulase” từ T.reesei và từ A.niger trong công nghiệp
thực phẩm. [22]
Ở Nhật, hãng Amano hằng năm đã sản xuất trên 8000 tấn chế phẩm enzyme các
loại để dùng trong nông nghiệp. Enzyme “Panxenlase” chứa cellulase, hemicellulase,
protease và amylase, hoạt tính dùng trong chăn nuôi. Chế phẩm Cellubrix, Cellusoft,
Onozuka dùng trong công nghiệp làm mềm vải, trong thức ăn gia súc. [22]
Ở Canada, hãng Logen sử dụng “Cellulase” trong thức ăn gia súc, công nghiệp
giấy, chế biến hạt, sản xuất ethanol. [41]
Ở Liênhoạt
ni,
Xơ, tính
chế pectinase.
phẩm
1 - 50
“Cellolignorin”
đơn[41]
vị/g, chứa
được
cellulase,
sử dụng trong chăn
hemicellulase,

15

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên của tỉnh Bình Dương

1.1.1.

Vị trí địa lý

Bình Dương là một tỉnh thuộc miền Đông Nam Bộ của Việt Nam. Đây là một trong
tám tỉnh nằm trong vùng kinh tế trọng điểm phía Nam, có tốc độ tăng trưởng kinh tế cao,
phát triển công nghiệp năng động của cả nước. Bình Dương có tọa độ địa lý 10 051'46” 11030' vĩ độ Bắc, 106020' - 106058' kinh độ Đơng, phía Bắc giáp với tỉnh Bình Phước, phía
Nam giáp thành phố Hồ Chí Minh, phía Đơng giáp tỉnh Đồng Nai, phía Tây giáp tỉnh Tây
Ninh và thành phố Hồ Chí Minh. [45]
1.1.2.

Điều kiện tự nhiên

1.1.2.1.

Thổ nhưỡng

Đất đai của Bình Dương rất đa dạng và phong phú về chủng loại. Có nhiều loại đất
như: đất xám trên phù sa cổ, có diện tích 200.000 ha phân bố trên các huyện Dầu Tiếng,
Bến Cát, Thuận An, Thủ Dầu Một. Đất nâu vàng trên phù sa cổ, có khoảng 35.206 ha nằm
trên các vùng đồi thấp thoải xuống, thuộc các huyện Tân Uyên, Phú Giáo, khu vực Thủ
Dầu Một, Thuận An và một ít chạy dọc quốc lộ 13. Đất phù sa Glây (đất dốc tụ), chủ yếu
là đất dốc tụ trên phù sa cổ, nằm ở phía bắc huyện Tân Uyên, Phú Giáo, Bến Cát, Dầu

Tiếng, Thuận An, Dĩ An. [45]
1.1.2.2.

Khí hậu

Khí hậu Bình Dương cũng như chế độ khí hậu của khu vực miền Đông Nam Bộ
mang đặc điểm của khí hậu nhiệt đới gió mùa: nắng nóng và mưa nhiều, độ ẩm khá cao.
Đó là khí hậu nhiệt đới gió mùa ổn định, với 2 mùa rõ rệt trong năm: mùa mưa từ tháng 5
đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 năm đến tháng 4 năm sau. [45]
Lượng mưa trung bình hàng năm từ 1.800 - 2.000 mm với số ngày có mưa là 120
ngày. Mưa nhiều nhất vào tháng 9, trung bình 355 mm, năm cao nhất có khi lên đến 500
mm, tháng 1 ít mưa nhất, trung bình dưới 50 mm và nhiều năm trong tháng này khơng có
mưa. [45]
Nhiệt độ trung bình hàng năm ở Bình Dương từ 26 oC - 27oC. Nhiệt độ cao nhất có


lúc lên tới 39,3oC và thấp nhất từ 16oC - 17oC (ban đêm) và 18o C vào sáng sớm. Vào mùa
nắng, độ ẩm trung bình hàng năm từ 76% -80%, cao nhất là 86% (vào tháng 9) và thấp
nhất là 66% (vào tháng 2). Chế độ gió tương đối ổn định, không chịu ảnh hưởng trực tiếp
của bão và áp thấp nhiệt đới. [45]
Với khí hậu nhiệt đới mang tính chất cận xích đạo, nền nhiệt độ cao quanh năm, ẩm
độ cao và nguồn ánh sáng dồi dào, rất thuận lợi cho phát triển nông nghiệp, đặc biệt là
trồng cây cơng nghiệp ngắn và dài ngày. Khí hậu Bình Dương tương đối hiền hồ, ít thiên
tai như bão, lụt...
1.2.

Cellulose và enzyme cellulase

1.2.1.

Cellulose

Cellulose là polyme sinh học phong phú nhất trên trái đất và được sinh tổng hợp
chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.109 tấn/năm.
Hàng ngày có một lượng lớn cellulose tích lũy trong đất và là sản phẩm tổng hợp
của thực vật thải ra, cây cối chết đi, một phần do con người thải ra dưới dạng rác rưởi như
giấy vụn, mùn cưa...Trong số này có đến 30% là vách tế bào thực vật mà thành phần chủ
yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40 - 50% trong gỗ. [2, 3, 28]
1.2.1.1.

Cấu trúc phân tử

Cellulose là một loại homopolyme của p - D - glucose. Mức độ polyme hóa của
phân tử cellulose có thể đạt đến 15.000 đơn vị. Cellulose là polyme mạch thẳng, mỗi đơn
vị là một disaccharid gọi là cellobiose có cấu trúc gồm 2 phân tử D - glucose nối với nhau
qua liên kết p - D - 1,4 - glucoside. Các chuỗi celulose có đường kính khoảng 3nm và
thường có nhóm OH tự do, vì vậy mà các chuỗi cellulose gần nhau thường kết hợp với
nhau thành các vi sợi có đường kính khoảng 10 - 40nm. Những vi sợi này lại liên kết với
nhau tạo thành các bó sợi to và được bao bọc bởi lignin và hemicellulose. [11]
Cellulose có cấu trúc không đồng nhất gồm 2 vùng xen kẽ :
- Vùng kết tinh: có trật tự cao và bền vững với tác động bên ngồi.
- Vùng vơ định hình: có cấu trúc khơng gian khơng chặt do đó kém bền vững.


Hình 1.2: Liên kết hydro trong phân tử cellulose
1.2.1.2.
Tính chất vật lí
Cellulose là chất rắn dạng sợi, có màu trắng, khơng mùi, khơng vị. Có tính bền
vững cơ học cao, chịu được nhiệt độ đến 2000C mà không bị phân hủy.
Cellulose là những hợp chất phức tạp và không bền vững, không tan trong nước và

trong nhiều dung môi hữu cơ. Chúng chỉ có thể hấp thu nước và trương phồng lên.
Cellulose chỉ bị phân hủy khi đun trong acid hoặc kiềm ở nhiệt độ khá cao. [11]
1.2.1.3.

Tính chất hóa học

Liên kết glucosid không bền với acid nên cellulose dễ bị thủy phân với acid thành
các sản phẩm thủy phân khơng hịa tan có độ bền cơ học kém hơn cellulose tự nhiên, khi
thủy phân hoàn toàn sẽ thu được sản phẩm cuối cùng là đường D - glucose hòa tan.
Dung dịch kiềm làm trương phồng mạch cellulose và hòa tan một phần cellulose
thành các phân tử nhỏ hơn. Trong khi đó ở điều kiện bình thường hoặc ở nhiệt độ 25 400C một số VSV có khả năng phân giải cellulose nhờ enzyme cellulase [11].
1.2.2.

Enzyme cellulase

1.2.2.1.

Cấu trúc

Trong thiên nhiên khơng gặp cellulase ở dạng tinh khiết. Nó thường tồn tại ở dạng
kết hợp với các enzyme khác như: cellulase, hemicellulase, pentozanase thành hệ enzyme
gọi là Citolase. Cellulase là một phức hệ enzyme bao gồm enzyme C1, Cx và p -


glucosidase tham gia những phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose thành glucose.
Trong đó, cellulase C1 và Cx thủy phân cellulose thành cellobiose, còn glucosidase tiếp
tục thủy phân cellobiose thành glucose.
Theo Nguyễn Đức Lượng (2012) cho rằng hệ enzyme phân hủy cellulose gồm 3
loại: [14]
-

1,4 ft-D-glucan cellobiohydrolase (exoglucanase): enzyme cắt đầu không khử của
chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzyme này khơng có khả năng phân giải
cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho
enzyme endoglucanase phân giải chúng.

-

1,4 ft-D-glucan 4 glucanohydrolase (endoglucanase): enzyme này tham gia phân
giải liên kết p-1,4 glucosid trong cellulose trong lichenin p-Dglucan. Sản phẩm của
quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose. Chúng tham gia tác động
mạnh đến cellulose vơ định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh.

-

ft-D glucoside glucohydrolase (cellobiase): enzyme này tham gia phân hủy
cellobiose, tạo thành glucose. Chúng có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy.

1.2.2.2.

Cơ chế hoạt động

Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp
của ba loại enzyme cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme
cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là
glucose. Có nhiều cách trình bày khác nhau, cách trình bày cơ chế tác động của cellulase
do Erikson đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả. [14]
Vùng kết tinh

Vùng vơ định hình

Endoglucanase
v

z__________V

<

Exoglucanase
z
X
1

•

k
-

♦*
-•*

V


I cellobiase r • D - glucose
Hình 1.3. Cơ chế tác động của enzyme cellulase theo Erikson
1.2.2.3.
Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme cellulase
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng tổng hợp enzyme của VSV cũng

như tính chất của enzyme được tổng hợp. Sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme thường
bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp của từng loại enzyme.
Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới
hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme. Hoạt tính của enzyme đạt cực đại
ở nhiệt độ thích hợp vào khoảng 40 - 50 0C. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt
tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, cịn nhiệt độ thấp dưới 0 0C hoạt tính enzyme bị giảm
nhiều nhưng có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ bình thường. [46]
Ảnh hưởng của pH
pH mơi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt
ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng
của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp cho enzyme hoạt động
có thể là trung tính, acid hoặc kiềm. [46]
Ảnh hưởng của chất kìm hãm


Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các
phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính của enzyme nhưng lại khơng bị enzyme làm thay
đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng.
Các chất gây kìm hãm hoạt động của các enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô
cơ, các chất hữu cơ và cả protein. [46]
Ảnh hưởng của chất hoạt hóa
Các chất hoạt hóa enzyme có bản chất hóa học rất khác nhau. Chúng có thể là
những anion, các ion kim loại từ ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng hệ thống tuần hồn,
các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp. Tuy nhiên, các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng ở một
nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ này, chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme.
[46]
1.2.2.4.

Ứng dụng của enzyme cellulase

Enzyme cellulase thu hút được sự chú ý của các nhà cơng nghệ vì chúng có thể
được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực sau
Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose
Các chất thải hữu cơ chứa cellulose thường là những chất khó phân hủy. Trong
điều kiện tự nhiên thời gian phân hủy rất lâu (trên 8 tháng), ở điều kiện khí hậu nhiệt đới.
Thời gian phân hủy các thải này càng lâu càng gây ô nhiễm đất, nước, không khí. Các
chất thải này cũng khó tham gia vào dây chuyền chuyển hóa vật chất của thiên nhiên, gây
mất cân bằng sinh thái. Để khắc phục tình trạng này, các nhà khoa học đã đưa vào khối ủ
chế phẩm VSV giàu cellulase, kết quả là các chất thải bị phân hủy trong thời gian dưới 1
tháng, góp phần hạn chế ơ nhiễm mơi trường. [45]
Ứng dụng trong làm phân bón VSV
Các chế phẩm VSV có khả năng tổng hợp cellulase mạnh, khi được bón vào đất
trồng có nhiều chất hữu cơ chứa cellulose sẽ phân hủy nhanh các chất hữu cơ tạo thành
mùn, giúp cây trồng phát triển nhanh. [19, 45]
Ứng dụng trong công nghệ bột cellulose và giấy, công nghệ sợi dệt, công nghệ
chất tẩy rửa
Đây là hướng được các nhà sản xuất quan tâm nhiều trong
những năm gần đây. Sử dụng enzyme cellulase để tách mực
khỏi giấy báo và tạp chí cũ, cải thiện tính chất 9


quang học cũng như độ bền cơ lý của giấy sản xuất từ bột khử mực. Ở Mỹ, hơn 40%, ở
Nhật Bản khoảng 55% tổng lượng giấy sử dụng bắt nguồn từ giấy thải loại.
Trong công nghệ sợi dệt, enzyme này được sử dụng để sử lý quần áo bò, làm bóng
vải bơng, vải sợi nhân tạo giúp vải mềm mại hơn, độ hút ẩm tăng lên, bề mặt vải đẹp hơn.
Trong công nghiệp chất tẩy rửa, các chất tẩy rửa chứa enzyme cellulase làm sạch
các chất bẩn trong lòng xơ bông tốt hơn sử dụng phương pháp tẩy rửa thông thường. [29]
1.3. Nấm Trichoderma và enzyme cellulase từ nấm Trichoderma
1.3.1.

Nấm Trichoderma

1.3.1.1.

Đặc điểm phân loại nấm Trichoderma

Trichoderma là nhóm những loài nấm sợi tăng trưởng nhanh và phân bố rộng
khắp trên thế giới. Chúng có mặt trong hầu hết các loại đất và thường chiếm ưu thế trong
quần thể sinh vật đất. Trong những loài nấm sợi, Trichoderma được phân vào nhóm có
bào tử trần. [33, 36, 39, 40]
Theo Gary J Samuels, 2004 thì Trichoderma thuộc lớp nấm bất tồn. Năm 1801,
Persoon ex Gray đã xác định Trichoderma thuộc giới fungi, ngành Ascomycota, lớp
Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae, giống Trichoderma (trích dẫn của
Clipson, N. và cs, 2001). [32, 34]
1.3.1.2.

Đặc điểm sinh thái của nấm Trichoderma

Trichoderma hiện diện hầu hết trong tất cả các loại đất. Chúng được tìm thấy khắp
mọi nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát
triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Những
giống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp.
Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ tùy theo từng
giống. Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu
rừng nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất, trên xác sinh vật đã chết, thực phẩm bị chua, ngũ cốc,
lá cây hay ký sinh trên những loại nấm khác. Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật và
không sống nội sinh với thực vật. [39]
Trichoderma có sự phân bố rộng rãi, chúng có thể tồn tại trên gỗ mục và có thể
sống ký sinh trên những loại nấm khác, là do chúng có khả năng sản xuất nhiều loại
enzyme thủy phân.

22


Trichoderma cịn có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng rất cao do có một số đặc tính
như sau:
- Sinh trưởng mạnh và bào tử nảy mầm rất nhanh.
- Có khả năng sinh tổng hợp các hệ enzyme phân giải cao.
- Khả năng tạo kháng sinh, chịu được chất kháng sinh. [39]
1.3.1.3.

Đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma

Khuẩn ty của Trichoderma khơng màu, có tốc độ phát triển rất nhanh, trên mơi
trường PGA, ban đầu Trichoderma có màu trắng, khi sinh ra bào tử chuyển sang xanh
đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số lồi cịn có khả năng tiết ra một số chất làm
thạch của mơi trường PGA hóa vàng. [34]
Khuẩn lạc mọc rất nhanh sau đó hình thành bào tử đính sau một tuần ni cấy.
Bào tử đính có màu sắc khác nhau tùy theo từng loại nấm. Thơng thường có màu xanh
đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Bào tử có thể mọc dày đặc hoặc từng chùm riêng lẽ. Ở
một số loài, sợi nấm tiết ra những chất làm cho mơi trường bên trong có màu vàng, hay
tiết ra mùi thơm mang tính đặc trưng. Đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử
có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng, màu vàng hay xám. Chủ yếu hình cầu,
hình elip hoặc oval, đa số các bào tử trơn láng, kích thước khơng q 5^m. [34]
Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ chế
sinh sản vơ tính bằng bào tử đính từ khuẩn ty. Bào tử đính Trichoderma là một khối trịn
mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh). Mang các bào tử trần bên
trong khơng có vách ngăn, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. [34]
1.3.1.4.

Đặc điểm sinh lý của nấm Trichoderma

Mỗi dịng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm khác
nhau. [35]
Dãy nhiệt độ cho sự phát triển của các loài Trichoderma tương đối rộng, có thể
dưới 0oC (cho lồi T. polysporum) và ở 40oC (cho lồi T. koningii). Nhiệt độ khơng chỉ
ảnh hưởng trên sự tăng trưởng của các loài Trichoderma mà cịn ảnh hưởng lên hoạt tính
biến dưỡng của chúng, đặc biệt là sự tổng hợp các loại kháng sinh bay hơi và các
enzyme. [33, 40]
Các loài nấm trong hệ gen Trichoderma chịu ảnh hưởng tích cực từ những cơ chất

23


có tính acid. Hầu hết các lồi có pH tối ưu trong dãy 3,5 - 5,6. pH acid có sự ảnh hưởng
tốt đến sự nảy mầm của bào tử Trichoderma. Thậm chí có lồi phát triển ở pH = 2,1. [33]
1.3.1.5.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào của nấm Trichoderma

Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học trong và
ngồi cơ thể. Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 3.500 loại enzyme, trong đó
phần lớn là enzyme từ thực vật và VSV. Trichoderma là nấm có tiềm năng lớn sinh các
loại enzyme ngoại bào mạnh, phân giải và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, vơ cơ khó
tan trong tự nhiên. Một số enzyme đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ
biến như: cellulase, protease, amylase, pectinase và chitinase. [3, 14]
Enzyme cellulase. Xúc tác cho phản ứng phân giải các hợp chất ligon cellulose thành glucose. Ligon - cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật
gồm cellulose (30 - 40%), hemi-cellulose và ligin (15 - 30%). [8, 10, 12]
Enzyme protease. Protein là các polyme cấu tạo từ các axit amin liên kết với
nhau bằng liên kết peptid rất dễ bị cắt đứt tạo thành các chuổi polypeptide ngắn. Enzyme
protease được sử dụng nhiều trong công nghiệp chất tẩy rửa, bia, sữa và các lĩnh vực

công nghiệp khác như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da, công nghiệp thực phẩm,
xử lý chất thải...[2, 3, 14]
Enzyme amylase. Xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ
yếu của thực vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzyme amylase (a-amylase, Pamylase và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết a-1,4-glucoside và a-1,6-glucoside trong
phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose. Enzyme này góp phần trong
việc làm sạch mơi trường, được ứng dụng nhiều trong sản xuất rượu, bia, bánh mì, siro,
trong chế biến thực phẩm gia súc...[14, 15]
Enzyme pectinase. Thuộc nhóm enzyme thủy phân, nó thủy phân các chất
pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic, galactose, metanol. Enzyme pectinase
được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây nhằm mục đích gia tăng hiệu
suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả và có tác dụng làm trong (Nilay
Demir et al, 2000). [14]
Enzyme chitinase. Là các biopolyme chứa các gốc N-acetyl-glucozamin liên
kết với nhau bởi mối liên kết 0-1,4-glucosid. Chitinase là enzyme thủy phân chitin thành
chitobiose hay chititriose qua sự xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4-glucosid giữa C1 và C4
24


của hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Chitinase được ứng
dụng nhiều trong việc thu nhận tế bào trần, nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học, ước tính
sinh khối nấm...[14]
1.3.2.

Enzyme cellulase từ nấm Trichoderma

1.3.2.1.

Nấm Trichoderma tổng hợp enzyme cellulase

Rất ít VSV có khả năng sinh tất cả các loại enzyme cần thiết để phân giải

cellulose ở dạng tinh thể. Chúng phải tiết ra hệ enzyme phức tạp, có khả năng phân hủy
cellulose theo phương thức khác nhau như thủy phân, oxy hóa. [27, 28]
Cellulose được phân rã dưới tác dụng của vi khuẩn háo khí và kỵ khí. Song khả
năng phân hủy cellulose khơng bằng nấm, do vi khuẩn thường tạo ra enzyme cellulase
với hàm lượng nhỏ thấp hơn 0,1g/l. Cellulase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn
trong dạ cỏ Ruminococcus albus (Berger 1963), vi khuẩn hiếu khí Cellulomonas sp.
(Elberson, 2000), vi khuẩn kỵ khí Clostridium sp. (Parsiegla, 1998), các loài xạ khuẩn
Streptomyces, Thermomonospora...[20, 27]
Nấm Trichoderma là nấm được nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực phân hủy
cellulose. Các enzyme cellulase sản sinh từ Trichoderma được tạo ra với nồng độ rất cao,
khơng có các dạng vật lý phức tạp như cellulase bắt nguồn từ vi khuẩn và có tác dụng
phân hủy rất mạnh cellulose. [20]
1.3.2.2.

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme cellulase của nấm

Trichoderma
a. Thành phần MT nuôi cấy Trichoderma sinh enzyme cellulsae
Nguồn dinh dưỡng cacbon
Trong MT nuôi cấy Trichoderma sinh enzyme cellulase nhất thiết phải có
cellulose là chất cảm ứng và nguồn cacbon. Trichoderma có khả năng đồng hóa rất nhiều
nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbonhydrat là dễ hấp thu nhất, trong đó glucose là
nguồn cacbon duy nhất tham vào phản ứng trong 3 chu trình chuyển hóa: con đường
Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff. Cơ chất dùng để cảm ứng
Trichoderma sinh enzyme cellulase thường là giấy lọc, bông, bột cellulose, cám, lõi ngơ,
mùn cưa, bã mía...[19]
Nguồn dinh dưỡng nitơ
25