Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ để chẩn đoán ung thư vú

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM
LỜI CẢM ƠN

Để có thể hồn thành đồ án tốt nghiệp này, ngồi những kiến thức đã được học
và tích lũy trong 5 năm qua, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến
TS. Lê Lý Thùy Trâm đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tơi trong suốt thời gian làm
đồ án tốt nghiệp.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Đặng Đức Long và ThS. Tạ Ngọc Ly đã
đóng góp ý kiến, giúp đỡ tơi hồn thiện đồ án tốt nghiệp này. Đồng thời, tôi xin gửi
lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo phụ trách phịng thí nghiệm bộ mơn Cơng nghệ
sinh học là KS. Võ Công Tuấn và KS. Phạm Thị Kim Thảo đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tơi hồn thành tốt các thí nghiệm trong q trình làm đồ án tốt nghiệp.
Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cám ơn chân thành đến các anh, chị ở Trường Cao đẳng
Lương thực Thực phẩm, Trung tâm Y tế Dự phòng cũng như Bệnh viện Ung thư Đà
Nẵng đã hỗ trợ tôi trong việc sử dụng các máy móc, thiết bị liên quan đến đề tài tốt
nghiệp này.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn trong nhóm sinh viên nghiên cứu ngành
Cơng nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ và chia sẽ những kinh nghiệm hữu ích để
tơi có thể hồn thành tốt cơng việc của mình.
Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, do kiến thức bản thân còn hạn hẹp
nên khó tránh khỏi những hạn chế và thiếu sót. Vì thế tơi rất mong sẽ nhận được ý
kiến đóng góp của thầy cơ, bạn bè để đồ án của tơi có thể được hồn chỉnh hơn.
Một lần nữa, tơi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình, quý báu của thầy
cô và bạn bè.
Đà Nẵng, ngày 01 tháng 06 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đinh Thị Kim Ngọc

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
Lớp: 10SH – MSV: 107261101136

1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM
MỤC LỤC

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
Lớp: 10SH – MSV: 107261101136

2


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM
DANH MỤC HÌNH VẼ

ST
T
1
2
3
4
5
6

7
8

Hìn
h
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8

9

1.9

10

1.10

11

1.11

12

2.1

13
14

2.2
2.3

15

2.4

16
17

2.5
2.6

18

2.7

19

2.8

20

2.9

21

2.10

22

2.11

23

2.12

24

2.13

25

3.1

26
27
28
29
30

3.2
3.3
3.4
3.5
3.6

Tên hình vẽ

Trang

Cấu tạo bầu vú khi có tế bào ung thư
Các giai đoạn phát triển bệnh ung thư vú
Các giai đoạn phát triển bệnh ung thư vú
Cấu trúc của protein HER2
Cấu trúc của kháng thể
Các cách gắn kết các phân tử sinh học với hạt nano
Gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine-carboxylic
Gắn kết nhờ tạo cặp sulfhydryl-amine
Gắn kết các nhóm carbon-hydrate bị oxy hóa trên phần Fc
của kháng thể
Gắn kết khơng hóa trị giữa hạt nano silica gắn streptavidin
với các kháng thể được biotin hóa
Mơ hình thiết bị cảm ứng sinh học điện từ
Cơ sở của phương pháp cố định kháng thể lên MNPs
thông qua hoạt hóa bề mặt bằng APTES – GA
Quy trình hoạt hóa bề mặt MNPs bằng APTES – GA
Quy trình gắn Streptavidin lên MNPs đo UV - VIS
Quy trình đo phản ứng màu giữa enzyme HRP và cơ chất
TMB
Kiểm tra sự hiện diện của kháng thể sau khi gắn lên MNPs
Quy trình khảo sát sự hiện diện của kháng thể lên MNPs
Quy trình xác định hoạt tính kháng thể sau khi cố định lên
MNPs
Hình minh họa phương pháp xác định hoạt tính kháng thể
tự do
Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học của kháng thể tự do

Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học của kháng thể cố
định
Quy trình khảo sát lượng kháng thể gắn lên MNPs
Quy trình khảo sát khả năng bắt chước enzyme peroxydase
của MNPs
Quy trình khảo sát hoạt tính kháng thể dựa trên khả năng
bắt chước enzyme peroxydase của MNPs
Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa giá trị OD280nm với
nồng độ Streptavidin
Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs
Biến thiên giá trị OD450nm theo nồng độ kháng nguyên
So sánh hoạt tính của kháng thể tự do và kháng thể cố định
Kiểm tra hoạt tính của kháng thể sau khi gắn lên MNPs
Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs

2
3
4
5
6
8
10
10

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
Lớp: 10SH – MSV: 107261101136

3

11

11
12
14
15
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
30
33
34
37
38
40


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM
DANH MỤC BẢNG BIỂU

ST
T

1
2
3
4
5
6

Bảng
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6

7

3.7

8

3.8

9
10

3.9
3.10

Tên bảng

Biến thiên giá trị OD280nm theo nồng độ Streptavidin
Giá trị OD450nm giữa mẫu đối chứng và mẫu thử nghiệm
Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs
Biến thiên giá trị OD450nm theo nồng độ kháng nguyên
Biến thiên Delta OD450nm theo nồng độ kháng thể tự do
Biến thiên Delta OD450nm theo nồng độ kháng thể cố định
So sánh Delta OD450nm của kháng thể tự do và cố định ở
các nồng độ pha loãng
Biến thiên Delta OD450nm theo nồng độ kháng thể trong
khảo sát lượng kháng thể gắn lên MNPs
Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs
Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng nồng độ kháng thể

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
Lớp: 10SH – MSV: 107261101136

4

Trang
30
32
33
34
36
36
36
38
39
41

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM
CÁC CHỮ VIẾT TẮT

KÍ HIỆU
APTES
EDAC
ELISA
FDA
GA
HER2
HRP
MES
MNPs
OD
PBS
SMCC
TMB

TÊN ĐẦY ĐỦ
3-Aminopropyltriethoxysilane
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
Food and Drug Administration
(Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ)
Glutaraldehyde
Human Epidermal growth Receptor
Horseradish peroxydase

2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid monohydrate
Magnetic nanoparticles (Hạt nano sắt từ)
Optical Density
Đệm Phosphate pH = 7.4
Succinimidyl-4-( N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
Lớp: 10SH – MSV: 107261101136

5


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM
TĨM TẮT

Cơng nghệ sinh học cũng như cơng nghệ nano đều đóng vai trò quan trọng
trong nhiều lĩnh vực liên quan đến sự phát triển khoa học, xã hội và cuộc sống, đặc
biệt là trong việc cố định các phân tử sinh học như acid nucleic, enzyme hay kháng
thể,... lên hạt nano sắt từ (MNPs) để phục vụ cho mục đích chẩn đoán y sinh. Trong
phạm vi đề tài tốt nghiệp này, tôi khảo sát việc cố định kháng thể kháng kháng
nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư vú. Với mục tiêu này, bề
mặt hạt nano sắt từ được amin hóa bằng 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)
sau đó xử lý bằng Glutaraldehyde (GA) trước khi gắn kết với kháng thể. Kết quả
cho thấy rằng mặc dù phương pháp này đem lại hiệu suất gắn khá cao nhưng kháng
thể còn rất ít hoạt tính sinh học.
Từ khóa: hạt nano sắt từ; kháng nguyên HER2; kháng thể; ung thư vú.

ABSTRACT
Biotechnology and Nanotechnology play important roles in many fields
related to the development of science, society and life, especially, in the
immobilization of a variety of molecules such as nucleic acid, enzymes or
antibodies on ferric magnetic nanoparticles (MNPs) serving the biomedical
diagnostic purposes. In this study, we examine the immobilization of antibody anti –
HER2 on ferric magnetic nanoparticles to diagnose breast cancer. For this purpose,
the surface of ferric magnetic nanoparticles is covered by (-NH2) group with 3aminopropyltriethoxysilane (APTES) before treating with glutaraldehyde (GA) to
link to antibody. The result illustrates although this method brings high performance
of the antibody anti – HER2 immobilization on ferric magnetic nanoparticles,
antibody has low level of bioactivity to capture HER2 antigen.
Key words: antibody; ferric magnetic nanoparticles; HER2 antigen; breast
cancer.

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
Lớp: 10SH – MSV: 107261101136

6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

LỜI MỞ ĐẦU
Từ những năm đầu thế kỉ 21 đến nay, ung thư vú dần trở thành một trong hai
loại ung thư phổ biến nhất và gây tử vong nhiều nhất ở phụ nữ, tương tự như ung
thư tiền liệt tuyến ở nam giới. Trên thế giới nói chung, cũng như ở Việt Nam nói
riêng, các con số thống kê hằng năm về số lượng người mắc bệnh ung thư vú tăng
nhanh ở ngưỡng rất cao, đáng báo động.

HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mơ, có hoạt tính
tyrosine kinase, đóng vai trị quan trọng trong q trình sinh trưởng và biệt hố tế
bào. Sự biểu hiện quá mức HER2 có thể biến đổi tế bào thành dạng ác tính và làm
tăng q trình hình thành khối u. Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30%
bệnh nhân mắc ung thư vú có sự khuếch đại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen
này trong các tế bào ung thư. Chính điều này làm cho HER2 trở thành một trong
những chỉ thị quan trọng trong việc chẩn đốn ung thư vú.
Mặc dù ngày nay có rất nhiều phương pháp được áp dụng để sớm phát hiện và
điều trị căn bệnh quái ác này nhưng số người chết hằng năm chỉ giảm đi một lượng
rất nhỏ. Nguyên nhân một phần có thể vì những khối u được phát hiện khi chúng đã
hình thành, tăng kích thước và di căn. Vì vậy, việc phát hiện sớm đóng vai trò rất
quan trọng trong điều trị ung thư vú. Trên cơ sở này, nhóm nghiên cứu kết hợp giữa
bộ mơn Công nghệ sinh học và Điện tử viễn thông của trường Đại học Bách Khoa
Đà Nẵng đã đề xuất thiết kế một thiết bị đo tín hiệu từ dựa trên hạt nano sắt từ đã
được cố định kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên HER2, nhằm tìm ra phương
pháp mới chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú.
Trong phạm vi đề tài này, tôi bước đầu khảo sát khả năng cố định kháng thể
đặc hiệu với kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ mà vẫn đảm bảo giữ nguyên
hoạt tính sinh học của kháng thể này. Đề tài “Nghiên cứu cố định kháng thể
kháng kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ để chẩn đoán ung thư vú” là
tiền đề cho việc tìm ra cơng cụ giúp chẩn đốn ung thư vú sớm với hy vọng giúp
các bệnh nhân sớm phát hiện để điều trị căn bệnh này một cách hiệu quả nhất.

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. ag
1.1. Bệnh ung thư vú
1.1.1. Khái niệm chung về bệnh ung thư vú

Ung thư vú là một trong hai loại ung thư phổ biến và gây chết nhiều nhất ở
phụ nữ, theo sau đó là ung thư cổ tử cung. Thường khi về già, từ độ tuổi 40 trở đi,
các tế bào bất thường hay còn gọi là tế bào ung thư vú phát sinh từ biểu mô ống
tuyến hay biểu mô của tiểu thùy. Nếu không chữa trị sớm, các tế bào ung thư sẽ
phát triển nhanh chóng, tạo thành khối u ác tính. Trong q trình phát triển, từ khối
u đó cho ra những tế bào ung thư đi vào mạch bạch huyết, lan tới các hạch bạch
huyết. Có khi tế bào ung thư đi theo các mạch máu để xâm nhập các cơ quan nội
tạng (gan, phổi, óc...) hay bộ xương, dẫn đến nhiều biến chứng nguy hiểm chết
người [2].
Theo ước tính, từ khi tế bào hình thành khối u đến khi phát hiện được khối u
khoảng 1 cm thì mất khoảng từ 7 – 8 năm nhưng khối u có kích thước từ 1 – 2 cm
thì mất thời gian trung bình chỉ khoảng 4 tháng, đây là thời gian cần có sự chữa trị
sớm. Phụ nữ trẻ cũng có thể mắc ung thư vú, nhưng xuất độ (tần xuất, độ xảy đến)
thấp hơn nhiều so với người lớn tuổi [2].

Hình 1.1 Cấu tạo bầu vú khi có tế bào ung thư [15]

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

8

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

Hình 1.2 Các giai đoạn phát triển bệnh ung thư vú [14]
1.1.2. Tình hình mắc bệnh ung thư vú trên thế giới và Việt Nam

Mỗi năm có khoảng 1.3 triệu người chẩn đoán mắc bệnh ung thư vú và khoảng
465,000 người chết vì bệnh này. Ở Mỹ, năm 2009, tỉ lệ ung thư vú ở phụ nữ là
160/100,000. Ở Châu Âu, năm 2009 có khoảng 3.2 triệu trường hợp ung thư được
chẩn đốn và trong đó 1.8 triệu trường hợp tử vong do ung thư. Trong đó, loại ung
thư thường gặp nhất là ung thư vú (13.5%), sau đó là ung thư đại trực tràng (12.9%)
và ung thư phổi (12.1%) [17].
Ở Việt Nam, theo ghi nhận thì tỉ lệ mắc bệnh ung thư vú có xu hướng tăng
dần. Ở Hà nội, năm 2001, tỉ lệ ung thư vú ở phụ nữ là 20.3/100,000 trước khi tăng
lên 29.7/100,000 vào giai đoạn 2008 – 2011. Ở Thành phố Hồ Chí Minh, tỉ lệ này
lần lượt tăng từ 11.7 (năm 1997); 16.1 (năm 1998); 19.2 (năm 1999) đến
19.4/100,000 (năm 2003) và đến năm 2011 thì tăng lên đến mức 29.9/100,000 [17].
1.1.3. Phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư vú

Số lượng bệnh nhân mắc ung thư vú có xu hướng tăng trên tồn thế giới
nhưng số ca tử vong đã từng bước giảm dần nhờ những thành tựu đạt được trong
chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư vú. Một số phương pháp thơng dụng trong chẩn
đốn ung thư vú hiện nay bao gồm chẩn đoán lâm sàng (bệnh nhân thường xuyên
kiểm tra tại nhà hoặc có thể siêu âm để cho kết quả chẩn đoán tốt hơn), chụp nhũ
ảnh, chọc hút dịch tế bào và sinh thiết tế bào vú [13].
Đối với việc điều trị, bệnh nhân có thể được xạ trị, hóa trị hoặc kết hợp với
phẫu thuật. Tuy nhiên, các phương pháp điều trị này sẽ ảnh hưởng lên cả các cơ
quan bình thường xung quanh khối u nên vẫn còn nhiều hạn chế trong cuộc chiến

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

chống lại căn bệnh quái ác này. Sau khi tiến hành hóa trị, sức đề kháng của cơ thể
có thể bị suy giảm. Hơn nữa, một số trường hợp áp dụng biện pháp hóa trị làm tổn
hại đến tim, gan.. Đó là chưa kể, các biện pháp truyền thống trong điều trị ung thư
rất tốn kém. Chính vì vậy mà việc chẩn đốn sớm sẽ đtơi lại một tia hy vọng rất lớn
cho các bệnh nhân mắc ung thư vú để họ có thể tiếp tục cuộc sống của mình [13].

Hình 1.3 Các giai đoạn phát triển bệnh ung thư vú [14]
1.2. Tổng quan về kháng nguyên HER2
1.2.1. Cấu trúc kháng nguyên HER2

HER2 (Human Epidermal growth Receptor) là một loại thụ thể thuộc họ các
yếu tố phát triển biểu mô (Human Epidermal growth Receptor, EGFR), có hoạt tính
tyrosine kinase, đóng vai trị quan trọng trong q trình sinh trưởng và biệt hố tế
bào. Cho đến nay vẫn chưa tìm thấy ligand đặc hiệu của HER2; tuy nhiên nó có thể
tạo dạng nhị hợp (dimer) với chính bản thân nó hoặc với các thụ thể khác trong họ
để hình thành đồng thụ thể thúc đẩy các con đường truyền tín hiệu [2].
Sự khuếch đại gen HER2 trên nhiễm sắc thể 17 dẫn đến sự tăng biểu hiện thụ
thể HER2 trên bề mặt tế bào ung thư vú. Sự biểu hiện quá mức HER2 có thể biến
đổi tế bào thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u. Theo nhiều
nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có sự khuếch

đại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ung thư. Chính điều
này khiến HER2 trở thành một trong những chỉ thị hữu hiệu để chẩn đốn sớm cũng
như là đích tấn công cho các liệu pháp điều trị miễn dịch [2].
Protein HER2 có khối lượng phân tử 185 kDa, gồm 3 phần chính:

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

10


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

-

Một vùng ngoại bào giàu Cystein có chứa phần đầu (–NH 2). Nằm ở vùng ngoại bào

-

này là một vùng lớn có khả năng gắn kết với các yếu tố tăng trưởng biểu mơ.
Vùng xun màng lipit.
Vùng nội bào có chứa đi (–COOH) có mang các gốc tyrosine được phosphoryl
hóa chịu trách nhiệm cho hoạt tính tyrosine kinase của thụ thể [2, 10].

Hình 1.4 Cấu trúc của protein HER2 [2]
Cấu trúc của HER2/neu: (1): Vùng ngoại bào gồm có 2 vùng liên kết với chất cảm ứng LD1,
LD2 (Ligand binding regions); (2): Hai vùng giàu Cystein (CR1 và CR2); (3): Một vùng xun
màng (TM – transmembrane); (4): Một vùng có hoạt tính tyrosine kinase (TK); (5): Một đuôi

Cacboxyl (CT – Carboxyl terminal)
1.2.2. Ý nghĩa kháng nguyên HER2 trong việc chẩn đoán ung thư vú

Tất cả các tế bào biểu mơ bình thường gồm hai bản sao của gen HER2 và có
số lượng thụ thể HER2 trên bề mặt tế bào là thấp nhất. Trong vài trường hợp, số
lượng các bản sao của gen HER2 tăng lên dẫn đến sự phiên mã ra mARN tăng, số
lượng các thụ thể HER2 cũng tăng lên gọi là sự biểu hiện quá mức của gen HER2
[2].
Sự biểu hiện quá mức của HER2 là nguyên nhân của sự tăng dimer hóa với
chính nó và các thụ thể khác (HER1, HER3), đây là tín hiệu khởi đầu cho các con
đường tạo ra các tế bào ung thư khác nhau. Sự tăng dimer hóa đồng hình HER2 làm
mất tính phân cực của tế bào. Sự tăng dimer HER2 - HER3 có ảnh hưởng tới sự
tăng sinh, khả năng tồn tại, tính xâm lấn và chức năng trao đổi chất của tế bào. Tăng
sự biểu hiện quá mức của HER2 dẫn tới tăng cường độ truyền tín hiệu. Một vài yếu
tố phiên mã được cảm ứng trong những tế bào có sự biểu hiện quá mức HER2 là kết
quả của những sự thay đổi biểu hiện gen ở mức dư thừa [2].
SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

11


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

1.3. Kháng thể
1.3.1. Cấu tạo chung của kháng thể

Kháng thể là các globulin có trong huyết thanh của động vật có khả năng liên

kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó. Kháng thể theo định nghĩa
trên cịn gọi là kháng thể miễn dịch hay kháng thể đặc hiệu. Kháng thể tự nhiên hay
cịn gọi là kháng thể khơng đặc hiệu, có sẵn ở trong các dịch thể trước khi tiếp xúc
với kháng nguyên như sữa, nước tiểu [3].
Tất cả các kháng thể đều có cấu trúc giống nhau, gồm một hay nhiều đơn vị
hợp thành. Mỗi đơn vị là một phân tử protein chứa 4 chuỗi polypeptide, 2 chuỗi
nặng (kí hiệu là H) và 2 chuỗi nhẹ (kí hiệu là L). Chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được nối
với nhau bằng 1 cầu disulfide, hai chuỗi nặng được nối với nhau bởi 2 cầu disulfide
[3].

Hình 1.5 Cấu trúc của kháng thể [3]
Chuỗi nhẹ: Ở tất cả các lớp globulin miễn dịch đều có hai loại chuỗi nhẹ:
kapa (κ) và lambda (λ). Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai chuỗi nhẹ lambda hoặc
hai chuỗi nhẹ kapa mà không bao giờ chứa cả hai loại. Mỗi chuỗi nhẹ của Ig chứa 2
vùng axit amin, 2 vùng có trật tự axit amin có thể thay đổi gọi là vùng biến đổi có ki
hiệu VL(variable), nằm ở phía đầu amin (-NH2) của phân tử. Vùng cịn lại có trật tự
axit amin khơng thay đổi gội là vùng hằng định kí hiệu C L(constant), nằm ở phía
đầu cacboxyl (-COOH) [3].

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

12


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

Chuỗi nặng: có 5 loại chuỗi nặng là μ, γ, δ, α và ε ứng với 5 lớp kháng thể là

IgM, IgG, IgD, IgA và IgE. Chuỗi nặng chứa 4 vùng axit amin, 1 vùng biến đổi và 3
vùng cố định. Cũng tương tự như ở chuỗi nhẹ, vùng biến đổi của chuỗi nặng nằm ở
phần đầu amin. Vùng này có kí hiệu là VH. Vùng cố định nằm ở đầu cacboxyl, ba
vùng cố định của chuỗi nặng được kí hiệu là C H1, CH2, CH3. Hai vùng biến đổi của
chuỗi nặng và chuỗi nhẹ nằm kề nhau tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên do vậy
đảm bảo tính đa dạng của kháng thể [3].
1.3.2. Một số kháng thể đơn dòng sử dụng trong điều trị ung thư vú

Hiện nay trên thị trường đã có nhiều loại kháng thể được sản xuất để phòng
chống bệnh ung thư vú như: muMAb, Herceptin (Trastuzumab), Lapatinib,
Immunoliposomes. Riêng Herceptin đã được FDA (Food and Drug Administration)
chấp thuận (1998) và sử dụng lần đầu tiên kết hợp với paclitaxel trong việc điều trị
ung thư vú di căn dương tính với sự biểu hiện quá mức thụ thể HER2 [2].
1.4. Hạt nano sắt từ
1.4.1. Giới thiệu về hạt nano sắt từ

Ngày nay, công nghệ nano đang là một trong ba ngành công nghệ mũi nhọn rất
được quan tâm trên thế giới, đóng vai trị rất quan trọng trong sự phát triển của khoa
học và xã hội, đặc biệt trong lĩnh vực y sinh. Với các ưu điểm nổi bật như tính ổn
định cao khi bảo quản và đo đạc, đơn giản trong việc chế tạo nên không địi hỏi chi
phí cao cũng như q trình rửa có thể sử dụng nam châm nên hạt nano sắt từ đang
dần chiếm lĩnh các vị trí ưu thế.
Hạt nano sắt từ dùng trong chẩn đoán y sinh cần phải thỏa mãn ba điều kiện
sau: tính đồng nhất của các hạt cao, từ độ bão hịa lớn và vật liệu có tính tương hợp
sinh học (khơng có độc tính). Tính đống nhất về kích thước và tính chất liên quan
nhiều đến phương pháp chế tạo còn từ độ bão hòa và tính tương hợp sinh học liên
quan đến bản chất của vật liệu. Trong tự nhiên, sắt là vật liệu có từ độ bão hòa lớn
nhất tại nhiệt độ phòng, sắt khơng độc đối với cơ thể người và tính ổn định khi làm
việc trong mơi trường khơng khí nên các vật liệu như oxit sắt (Fe 3O4) được nghiên
cứu rất nhiều để làm hạt nano từ tính [1].

Các hạt nano từ tính có kích thước tương ứng với kích thước của các phân tử
nhỏ chính vì thế mà hạt nano có thể thâm nhập vào hầu hết các cơ quan trong cơ thể
SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

và giúp cho chúng ta có thể thao tác ở quy mơ phân tử và tế bào. Hơn nữa, diện tích
bề mặt lớn giúp cho các hiệu ứng xảy ra bên trên bề mặt diễn ra rất mạnh mẽ [1].
1.4.2. Các phương pháp hoạt hóa bề mặt MNPs để gắn phân tử sinh học

Hiện nay có rất nhiều phương pháp hoạt hóa bề mặt hạt nano sắt từ để có thể
gắn kết các phân tử sinh học cần quan tâm. Tuy nhiên, dù là phương pháp nào cũng
cần đáp ứng được các yêu cầu sau:
Hạt nano sắt từ phải liên kết chặt chẽ với các phân tử sinh học;
Phương pháp hoạt hóa khơng làm ảnh hưởng đến hình dạng, cấu trúc cũng như
−

−

hoạt tính sinh học của các phân tử sinh học được sử dụng, chẳng hạn như đối với
kháng thể thì phải cịn khả năng bắt giữ kháng ngun.
Thơng thường thì các phân tử sinh học sẽ được gắn lên hạt nano sắt từ theo
phương pháp gắn kết trực tiếp hoặc phương pháp gắn kết không trực tiếp [22].
1.4.2.1.

Phương pháp gắn kết trực tiếp

Cách gắn kết đơn giản nhất là các phân tử sinh học gắn trực tiếp lên bề mặt hạt
nano sắt từ (Hình 1.6a). Cách gắn kết trực tiếp thường được sử dụng nhiều nhất là
gắn kết đồng hóa trị giữa phân tử sinh học và hạt nano. Các hạt nano được biến đổi
với các nhóm carboxyl (-COOH) trên bề mặt hạt tạo điều kiện thích hợp cho liên
kết đồng hóa trị với phân tử sinh học có nhóm amin (-NH2) [22].

Hình 1.6 Các cách gắn kết các phân tử sinh học với hạt nano [22]
a) Gắn trực tiếp với các phân tử sinh học; b) Gắn gián tiếp qua phân tử trung gian; c) Liên
kết hóa học của phân tử sinh học với cầu nối trung gian hoặc được gắn kết hoặc liên kết hóa học
với bề mặt hạt nano; d) Liên kết hóa học trực tiếp của phân tử sinh học với hạt nano; e) Liên kết

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

14


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

hướng đích của phân tử sinh học đã được biotin hóa với streptavidin được bọc trên các hạt nano
qua liên kết biotin-streptavidin.
1.4.2.2.

Phương pháp gắn kết không trực tiếp

Các phân tử sinh học đầu dị thường có những vị trí có hoạt tính sinh học cao
để nhận biết các phân tử sinh học đích, do đó, khi gắn kết các hạt nano với các phân
tử sinh học đầu dò cần tránh những vị trí này. Vì vậy, phương pháp gắn kết khơng
trực tiếp thường được dùng trong gắn kết hạt nano với phân tử sinh học thông qua
một chất khác dùng làm cầu nối, một đầu gắn với hạt nano, đầu còn lại gắn với phân
tử sinh học [22].
Phương pháp này có thể thuận lợi hơn phương pháp gắn kết trực tiếp vì nó có
thể giúp các phân tử sinh học liên kết có tính định hướng thích hợp. Dựa trên liên
kết hóa học giữa các nhóm chức của phân tử sinh học (như thiol, amine) với các
phân tử cầu nối trung gian và các cầu nối trung gian này lại liên kết với bề mặt hạt
nano qua hút bám hoặc liên kết hóa học (liên kết cộng hóa trị) (hình 1.6c). Tuy
nhiên việc điều khiển các liên kết là vấn đề khó khăn trong phương pháp này. Hiện
này người ta thường sử dụng những cặp phân tử có ái lực cao với nhau để làm cầu
nối trung gian giữa hạt nano sắt từ và các phân tử sinh học như biotin –
streptavidin , biotin – avidin (Hình 1.6e) [22].
1.4.2.3.

Các phương pháp đã được nghiên cứu và sử dụng

Phức hợp hạt nano silica với kháng thể có thể được tạo ra bởi nhiều cơ chế
khác nhau. Theo các tác giả người Mỹ Xing Y và cộng sự (2008), thì hiện nay có 5
cách để tạo ra phức hợp này là:
a.

Gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine–carboxylic

Kiểu gắn kết này dựa trên phản ứng hóa học giữa nhóm carboxyl và nhóm
amin

nhờ

có

EDAC

(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)

carbodiimide

hydrochloride) làm chất xúc tác, được dùng để liên kết nhóm carboxyl với amin bậc
một, hình thành nên liên kết peptide (Hình 1.7). Sử dụng đệm MES (2-(NMorpholino) ethanesulfonic acid mono hidrate) có pH từ 4,7 - 6 là thích hợp nhất
cho phản ứng có EDAC xúc tác [22].

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

15


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

Hình 1.7 Gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine-carboxylic [22]
b.

Sử dụng SMCC làm xúc tác tạo cặp sulfhydryl-amine

Các liên kết disulfide trong vùng nối giữ hai chuỗi nặng cùng nhau được chia
ra một cách chọn lọc, tạo thành 2 đoạn kháng thể, mỗi đoạn chứa sulfhydryl tự do

và vị trí liên kết với kháng nguyên. Sự gắn kết các hạt nano silica với các mảnh
kháng thể thông qua sự khử lưu huỳnh và tạo cặp sulfhydryl-amine, có SMCC
(succinimidyl-4-( N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) làm chất xúc tác
[22].

Hình 1.8 Gắn kết nhờ tạo cặp sulfhydryl-amine [22]
c. Gắn kết trực tiếp thơng qua các nhóm carbon-hydrate bị oxy hóa trên phần Fc

của kháng thể
Kiểu gắn kết trực tiếp này thơng qua phản ứng cộng hóa trị giữa các nhóm
carbohydrate bị oxy hóa trên phần Fc của kháng thể với các hạt nano silica được cải
biến với nhóm hydrazide (hình 1.9). Các hạt nano bị carboxyl hóa có thể được điều
chỉnh với ADH (adipic dihydrazide) để cho ra hydrazide trên bề mặt. Sau đó, các
hạt này có thể gắn kết với các kháng thể bị oxy hóa thơng qua phản ứng cộng hóa trị
giữa aldehyde và hydrazide [22].

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

16


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

Hình 1.9 Gắn kết các nhóm carbon-hydrate bị oxy hóa trên phần Fc của kháng
thể [22]
d. Gắn kết khơng hóa trị của hạt nano silica được bọc streptavidin với các kháng

thể được biotin hóa
Streptavidin là một protein dạng tứ phân, có ái lực rất lớn với biotin. Một phân
tử streptavidin có khả năng liên kết được với 4 phân tử biotin. Dựa trên tính chất đó,
kiểu gắn kết thơng qua streptavidin, phân tử liên kết với kháng thể gắn biotin đã
được áp dụng để tạo ra phức hợp hạt nano silica và kháng thể (hình 1.10). Điều này
đảm bảo rằng các vị trí nhận biết của kháng thể được định hướng ra xa khỏi bề mặt
của hạt nano silica, vì thế, chúng sẽ không bị mất đi khả năng liên kết với vi khuẩn
đích mà vẫn giữ được hoạt tính [22].

Hình 1.10 Gắn kết khơng hóa trị giữa hạt nano silica gắn streptavidin với các
kháng thể được biotin hóa [22]
Tóm lại, có rất nhiều cách để gắn kết kháng thể với hạt nano sắt từ bọc silica.
Vì vậy, tùy theo các nhóm chức năng trên bề mặt hạt và tùy vào từng điều kiện cụ
thể mà sử dụng kĩ thuật gắn kết nào cho phù hợp.
1.5. Mơ hình thiết bị đo tín hiệu điện từ

Việc sử dụng phương pháp ELISA trong chuẩn đốn ung thư vú cịn bộc lộ
một số nhược điểm như kĩ thuật tương đối phức tạp, tín hiệu nền mạnh, thời gian
cho kết quả lâu,… Trên cơ sở đó, bộ môn Công nghệ sinh học và Điện tử viễn thông
SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

17


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

Đại học Bách Khoa Đà Nẵng đã đề xuất thiết kế thiết bị đo tín hiệu từ để phát hiện

ung thư vú. Với khả năng tương thích cao với các phân tử sinh học, dễ tổng hợp nên
không yêu cầu quá cao về mặt chi phí, cũng như có thể được phát hiện bằng tín hiệu
từ nên hạt nano sắt từ đã được nhóm nghiên cứu sử dụng để làm vật liệu cho đề tài.
Trên thế giới, từ trước đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu về việc cố định
kháng thể lên hạt nano sắt từ với nhiều phương pháp phát hiện khác nhau như việc
cố định Aflatoxin B1 lên hạt nano sắt từ bằng liên kết khơng hóa trị và phát hiện
bằng phương pháp ELISA [7], cố định kháng thể Goat IgG bằng liên kết hóa trị
(APTES – GA) và phát hiện bằng ELISA [5],… Tuy nhiên vẫn chưa có đề tài nào
sử dụng phương pháp đo tín hiệu từ, vậy nên chúng tôi tin tưởng rằng với đề tài này
sẽ mở ra nhiều hướng đi mới cho các nghiên cứu sau này cũng như đưa ra phương
pháp mới nhằm phát hiện ung thư vú hiệu quả hơn. Sau đây là mơ hình thiết bị đo
tín hiệu từ:

Hình 1.11 Mơ hình thiết bị cảm ứng sinh học điện từ [18]
(a) Kháng thể thứ nhất đặc hiệu với kháng nguyên HER2 được cố định lên đế
sinh học của thiết bị;
(b) Tiến hành phủ mẫu bệnh phẩm chưa xác định rõ nồng độ kháng nguyên
HER2, kháng nguyên HER2 đặc hiệu với kháng thể sẽ bị kháng thể bắt giữ;
(c) Thêm kháng thể thứ hai đặc hiệu kháng nguyên HER2 đã được gắn trên hạt
nano sắt từ nhờ vào phương pháp hoạt hóa bề mặt thích hợp;
(d) Hạt nano sắt từ có kháng thể thứ hai sẽ được giữ lại sau những lần rửa và
tạo phức hợp bền chặt giữa kháng thể và kháng nguyên;
(e) Dựa vào thiết bị đo tín hiệu từ sẽ xác định được lượng hạt nano sắt từ, từ
đó biết được nồng độ kháng nguyên có trong mẫu máu cần đo.
SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

18

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

19


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.
2.1. Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
−

Một số hóa chất thơng dụng như: NaOH 1M, HCl 98%, Alcohol 99%,
Streptavidin, Tween 20, Tris – HCl, KCl, NaCl, Na 2HPO4, KH2PO4, H3PO4,

NaCNBH3.
−
Những hóa chất như Glutaraldehyde (GA) 25%, (Sigma – Aldrich, Mỹ), 3Aminopropyltriethoxysilane (APTES) 99.8%, (Sigma – Aldrich, Mỹ) là những hóa
chất độc hại, cần cẩn thận trong quá trình thao tác.
−
Hạt nano sắt từ bọc SiO2 (Fe3O4.SiO2) được mua tại trường Đại học Khoa học Tự
nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.

−
Human ErbB2/HER2 ELISA Kit (Sigma – Aldrich, Mỹ) gồm: Giếng Elisa đã được
phủ kháng thể thứ nhất đặc hiệu với kháng nguyên HER2, kháng nguyên chuẩn
HER2, kháng thể thứ hai đặc hiệu với kháng nguyên HER2 đã được biotin hóa,
Streptavidin – HRP, 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine (TMB), dung dịch pha loãng
Diluent A, Diluent B, dung dịch rửa Wash Solution, dung dịch ngừng phản ứng Stop
solution.
2.1.2. Dụng cụ thí nghiệm

Eppendoff loại 200 µl và 1.5 ml
Đầu cơn loại 10 µl, 200 µl, 1000 µl
Đĩa petri
Micropipet 0.5 – 10 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1000 µl
Cốc 250 ml
Cuvette nhựa
Bình thủy tinh 500 ml
Đũa thủy tinh
Ống đong 10 ml, 1000 ml
2.1.3. Thiết bị
− Bể siêu âm
− Cân phân tích điện tử E1240 – OHAUS, Mỹ
− Cân kĩ thuật ARC 120 OHAUS, Mỹ
− Máy đo pH metter TOLEDO MP 220
− Máy đo quang phổ Bio – Rad Smartspec Plus
− Máy ly tâm, MIKRO 200 24 lỗ, Đức
− Máy NANODROP 2000
− Thiết bị đọc ELISA
− Thiết bị Vortex MS1 Mini Sharker
2.2. Hoạt hóa bề mặt MNPs bằng liên kết cộng hóa trị APTES – GA
−

−
−
−
−
−
−
−
−

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

20


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

2.2.1. Nguyên tắc

Hạt nano sắt từ (MNPs) cần phải có liên kết chặt chẽ, bền vững, chẳng hạn
như liên kết cộng hóa trị, với các phân tử sinh học, cụ thể ở đây là kháng thể đặc
hiệu với kháng nguyên HER2. Với mục tiêu này, bề mặt hạt nano sắt từ được amin
hóa bằng 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) sau đó xử lý bằng Glutaraldehyde
(GA) tạo nhóm aldehyde (-CHO) trên bề mặt hạt nhằm tạo liên kết chặt chẽ với
kháng thể (Hình 2.1) [7].

12 µl hạt MNPs (24 µg/µl)
L1: 388µl nước cất

Rửa 3 lần
L2+L3: 400µl cồn 500
Hình 2.1 Cơ sở của phương pháp cố định kháng thể lên MNPs thơng qua hoạt
Siêu âm hóa bề mặt bằng APTES – GA [7]
37Hz, 30 phút
400µl cồn 500
2.2.2. Quy trình hoạt hóa bề mặt MNPs
 
Dựa trên ngun tắc hoạt hóa bề mặt hạt nano sắt từ bằng liên kết cộng hóa trị
Lắcnêu
khơở 5h
ở 500C
APTES – GA đã
mục
2.2.1, tơi tiến hành400µl
quy trình
sau:1%
APTES
 
Rửa 3 lần

Vortex, 1 giờ, t0p

Rửa 3 lần

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

Bảo quản ở 40C
 

L1: 400µl cồn 500
L2,3: 400µl PBS pH=7.4
 
400µl GA 5%

400µl đệm PBS pH = 7.4

21


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

Hình 2.2 Quy trình hoạt hóa bề mặt MNPs bằng APTES – GA [4]
Phủ APTES lên hạt nano sắt từ:
Hịa 12µl MNPs (24 µg/µl) vào 388 µl nước cất để đạt nồng độ 7 µg/µl.
Rửa 2 lần với 400 µl cồn 500 để loại bỏ dịch bảo quản.
Siêu âm trong 30 phút ở điều kiện 37 Hz với 400 µl cồn 500.
Bổ sung 400 µl APTES 1%, lắc khơ 5 giờ ở 500C
Rửa 1 lần với cồn 500, 2 lần với đệm PBS pH = 7.4, loại bỏ dịch rửa.
−

+
+
+
+
+

Phủ GA lên hạt nano sắt từ:
+ Tái huyền phù với 400 µl GA 5%, ủ trong 1 giờ và lắc nhẹ
+ Rửa 3 lần với đệm PBS pH = 7.4.
+ Bảo quản trong đệm PBS pH = 7.4 ở 40C cho đến khi sử dụng.
2.2.3. Thử nghiệm gắn Streptavidin lên MNPs
2.2.3.1.
Thử nghiệm gắn Streptavidin lên MNPs, đo bằng UV –
−

VIS
Để khẳng định hạt nano sắt từ sau khi hoạt hóa bề mặt có thể gắn được các
phân tử sinh học hay khơng, đặc biệt là kháng thể kháng kháng nguyên HER2 phục
vụ cho mục đích chẩn đốn ung thư vú thì tơi tiến hành thử nghiệm gắn Streptavidin
lên hạt nano sắt từ trước vì Streptavidin và kháng thể đều có bản chất là protein.
Như vậy có thể bước đầu đưa ra quy trình tổng qt, sau đó sẽ tiến hành tối ưu hóa
quy trình để phù hợp với mục đích gắn kháng thể mong muốn.
SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

22


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

Tiến hành thử nghiệm gắn Streptavidin lên hạt nano sắt từ như sau:
−

Xây dựng đường chuẩn Streptavidin:

Chuẩn bị dãy Streptavidin với các nồng độ khác nhau lần lượt là 0, 0.05, 0.10,

0.20, 0.30, 0.40 mg/ml để xây dựng đường chuẩn Streptavidin và đo UV – VIS ở
bước sóng 280nm.
Chuẩn bị mẫu:
+ Hạt nano sắt từ sau khi hoạt hóa bề mặt được bổ sung Streptavidin 0,1mg/ml rồi
−

+

tiến hành lắc trong 3 giờ.
Sau đó thu dịch, tái huyền phù trong đệm PBS pH = 7.4 có chứa Tris – HCl, lắc

trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
+ Rửa 3 lần với đệm PBST (đệm PBS + 0.05% Tween 20) rồi li tâm 6,000 vòng/ phút
trong 5 phút.
+ Thu dịch rửa sau mỗi lần rửa và tiến hành đo nồng độ streptavidin trong dịch hút và
dịch rửa bằng phương pháp UV - VIS ở bước sóng OD280nm.

400µl Streptavidin
0,1mg/ml

400µl MNPs hoạt hóa bề mặt

Lắc nhẹ 3h, t0p
400µl PBS/1 lần
Li tâm 6,000v/p, 5phút
 

Rửa 3 lần với PBS

400µl PBS chứa Tris 0,2M + 1% NaCNBH3 Lắc , 1h, t0p
400µl PBS + 0, 05% Tween 20
Li tâm 6,000v/p, 5p, 40C
 

Rửa 3 lần

Bảo quản trong 400µl PBS
SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

23

Thu dịch hút

Thu dịch (1)

Thu dịch (2)

Thu dịch (3)


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

Hình 2.3 Quy trình thử nghiệm gắn Streptavidin lên MNPs đo UV - VIS
−

Đo nồng độ Streptavidin gắn trên hạt nano sắt từ bằng ở OD 280nm:
Đo nồng độ Streptavidin trong dịch hút và dịch rửa thu được. Từ đó thấy được

sự thay đổi giữa lượng Streptavidin gốc và Streptavidin trong dịch hút, dịch rửa để
suy ra được lượng Streptavidin gắn lên hạt nano sắt từ cũng như từ đó kiểm tra độ
tin cậy của phương pháp này.
2.2.3.2.

Thử nghiệm gắn Streptavidin lên MNPs, đo dựa trên phản

ứng màu giữa enzyme HRP và cơ chất TMB
Sau khi tiến hành đo bằng phương pháp UV – VIS, tơi nhận thấy có khả năng
giá trị OD280nm có thể phản ánh cả lượng Streptavidin và các loại protein khác. Do
đó, tơi phải thử nghiệm với một phương pháp khác đặc hiệu hơn dựa trên phản ứng
chuyển màu cơ chất TMB khi tiếp xúc với enzyme HRP được cố định trên
Streptavidin sau đó đo OD450nm để có thể định lượng chính xác hơn sự hiện diện của
Streptavidin gắn trên hạt sắt từ.
Thí nghiệm sử dụng Streptavidin – HRP được pha lỗng với Diluent B 1X có
nồng độ 500X (trong bộ kit).
Chuẩn bị mẫu:
+ Mẫu đối chứng bị biến tính bởi nhiệt độ (1000C trong 5 phút)
+ Mẫu thử nghiệm tiến hành quy trình gắn Streptavidin – HRP như quy trình đã được
−

tiến hành ở mục 2.2.3.1.
Mẫu đối chứng
MNPs – APTES – GA – Streptavidin – HRP, 1000C trong 5p
Mẫu thử nghiệm
MNPs – APTES – GA – Streptavidin – HRP.
− Tiến hành đo mẫu:

Sau khi đã gắn Streptavidin – HRP lên hạt nano sắt từ, tôi tiến hành xác định
lượng Streptavidin gắn
bằng
cách
dựa vào
phản ứng vào
màuđệm
giữaDiluent
enzyme
HRP
Rửađược
và tái
huyền
MNPs
- Streptavidin
solution
và cơ chất TMB tạo chất màu đo ở bước sóng OD450nm theo quy trình như sau:
+
+
+

Hút 50 µl mẫu Blank (mẫu a) và 50 µl mẫu thử nghiệm (mẫu b, c, d).
Thêm 50 µl TMB, ủ trong 30 phút ở Hút
nhiệt50µl
độ phịng,
trong
hạt nano
vào bóng
giếngtối.
Thêm 25 µl Stop solution vào mỗi giếng để dừng phản ứng, đo ở bước sóng OD 450

nm

.
50 µl TMB

ủ trong 30 phút, nhiệt độ phòng

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH25
– MSV:
107261101136
µl stop
solution

24

Đo OD450nm


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

GVHD: TS. LÊ LÝ THÙY TRÂM

Hình 2.4 Quy trình đo phản ứng màu giữa enzyme HRP và cơ chất TMB
2.3. Cố định kháng thể lên hạt MNPs

Sau khi đã tiến hành gắn Streptavidin lên hạt nano sắt từ, tơi nhận thấy quy
trình trên phù hợp với việc gắn kháng thể lên hạt nano sắt từ. Giả sử một khi đã gắn
được kháng thể mong muốn, tôi cần phải kiểm tra sự hiện diện cũng như hoạt tính
của kháng thể có trên hạt nano sắt từ.

2.3.1. Xác định sự hiện diện của kháng thể trên MNPs

Để xác định sự hiện diện của kháng thể sau khi cố định trên hạt nano sắt từ, tôi
sẽ tiến hành thử nghiệm dựa trên phản ứng màu xảy ra khi cho enzyme HRP tiếp
xúc với cơ chất TMB và đo độ hấp thụ ở bước sóng 450nm (Hình 2.5).
TMB

Y

Y

Stop solution

Y

Y

OD 450nm

1

2
3

1. Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên HER2.
2. Biotin.
3. Hạt nano sắt từ đã được hoạt hóa bề mặt

SVTH: NGUYỄN ĐINH THỊ KIM NGỌC
LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

25