Phân tích hàm lượng Melanin trong sữa bằng phương pháp sắc ký

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TPHCM
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HĨA HỌC

ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG
MELAMINE TRONG SỮA BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP
Giáo viên hướng dẫn: PHÙNG VÕ CẨM HỒNG

Danh sách sinh viên NHÓM 11 thực hiện:
PHẠM VĂN PHÁP 18139146 TRƯƠNG THANH THAO 18139177
NGUYỄN THỊ THẢO NHI 18139130

ĐẶNG THỊ MỸ NGỌC 18139115

VÕ THỊ ĐIỆP 18139027 NGUYỄN MINH TRỌNG 18139208
PHẠM CAO THĂNG 18139171

LÊ NGỌC PHÚ 18139150


Nội dung:

I.

II.

TỔNG QUAN VỀ MELAMINE

1.
2.
3.

4.
5.

Melamine là gì?
Sự ra đời và phương pháp tổng hợp
Tại sao melamine lại được cho vào sữa
Độc tính của melamine
Quy định sử dụng melamine

PHÂN TÍCH MELAMINE

1.
2.
3.
4.
5.

Giới thiệu phương pháp phân tích
Các phương pháp sắc ký dùng để phân tích melamine
Tại sao ta lại chọn phương pháp sắc ký lỏng để phân tích mealmine?
Hệ thống máy HPLC
Các thiết bị và hóa chất chuẩn bị phân tích

III. KẾT LUẬN


Melamine là gì?

Là hợp chất hữu cơ, màu trắng pha lê, khó tan trong nước.
Tên khoa học là 1,3,5-triazin 2,4,6-triamine, đơi khi cịn được

gọi là cyanuramide hay cyanurotriamine.

Cấu trúc gồm 3 Cacbon, 6 Hidro, 6 Nito.
Trọng lượng phân tử là 126.
Công thức tổng quát: C3H6N6.

 Công thức cấu tạo:


Sự ra đời và phương pháp tổng hợp

• Nhà hóa học người Đức Liebig là người tổng hợp melamine đầu tiên vào năm 1834.
• Ban đầu, calcium cyanamide được tiến hành biến đổi thành dicyandiamine, sau đó được đốt nóng trên
nhiệt độ tan chảy của nó thành melamine. Tuy nhiên, ngày nay các nhà máy sản xuất ure sử dụng ure trong
các phản ứng sau để tạo ra melamine.

• Ure được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất melamine như sau:
+ 3CO2

6(NH2)2CO → C3H6N6 + 6NH3


Sự ra đời và phương pháp tổng hợp

Trước hết, urê được phân tách tạo axit cyanic (HNCO) (phản ứng cần nhiệt độ cao):
(NH2)2CO → HCNO + NH3

Tiếp theo là phản ứng polyme hóa axit cyanic tạo dioxit cacbon và melamine (phản ứng tỏa nhiệt):
6HCNO → C3H6N6 + 3CO2
Quy trình kết tinh và rửa melamine tạo ra một lượng lớn nước thải. Thông thường nước thải được cô đặc

thành dạng rắn ( có chứa đến 75% melamine ).


Tại sao melamine lại được cho vào sữa

Ở Trung Quốc, nơi đầu tiên phát hiện thấy sự gian dối về melamin, đầu tiên người ta thêm nưóc vào sữa
để tăng lượng sản phẩm. Do pha lỗng nên sữa này có hàm lượng protein thấp.

Các công ty khi thu mua sữa tươi thường kiểm tra hàm lượng protein bằng cách xác định hàm lượng nitơ,
vì vậy để che giâu sự gian dối, người ta đã cho melamin vào sữa để tăng hàm lượng nitơ trong nguyên liệu.


Độc tính của melamine

Bản thân melamine khơng có độc tính ở liều lượng thấp nhưng khi kết hợp với axit
cyanuric (ở thận) sẽ tạo thành chất kết tinh đóng trong các ống thận nhỏ gây bít tắt, sỏi
thận, ảnh hưởng đến sự tạo nước tiểu và gây suy thận, tử vong.
Một số nghiên cứu trên động vật cho thấy melamine có khả năng gây ung thư.
Melamine cịn có khả năng hủy hoại hệ thống miễn dịch của con người.


Độc tính của melamine

Melamine (màu xanh) dễ dàng kết hợp với axit cyanuric (màu đỏ) qua liên kết hydro tạo kiểu liên kết phân tử
hình mái ngói, lắng đọng và gây sỏi thận.


Độc tính của melamine
Triệu chứng của nhiễm độc melamine: bị kích thích ở da, mắt, tiểu ra máu, tiểu khó hoặc khơng tiểu được, có dấu
hiệu nhiễm trùng đường tiểu (sốt, đau lưng, tiểu gắt, tiểu giắt), huyết áp tăng.

Cách xử lí khi sữa bị nhiễm melamine:
-Tiêu hủy tại cơ sở xử lí chất thải nguy hại đã được bộ tài ngun và mơi trường cấp phép.
-Xử lí bằng cách sản xuất gạch (rẻ hơn 70% so với đốt).
-Chôn sữa bị nhiễm xuống đất nhưng số lượng sẽ được khống chế để ngăn chặn nguy cơ ô nhiễm đất.


Quy định về sử dụng melamine
Nồng dộ an toàn cho sữa và thực phẩm: hàm lượng melamine an toàn tối đa là 0,15mg/kg với sữa nước
dành cho trẻ em, 1mg/kg với sữa bột dành cho trẻ em và 2,5mg/kg với thức ăn cho động vật và các thực
phẩm khác.
Liều lượng melamine an toàn dung nạp cho một người: nồng độ melamine dung nạp hằng ngày có thể
chấp nhận được (TDI) là 0,5mg/kg cân nặng. Ở Mĩ, đề nghị TDI là 0,63mg/kg cân nặng.
Thế nào là 0,5mg/kg cân nặng? Nghĩa là cứ mỗi 1kg cân nặng một người có thể hấp thụ 0,5mg melamine mỗi
ngày.


Giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng
Phương pháp sắc ký lỏng là một phương pháp được phát hiện vào năm 1903. Đây là một phương pháp vật lý
để phân tách, phân ly, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng ở pha động và pha tĩnh.


Các phương pháp sắc ký dùng để phân tích melamine
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) là sự kết hợp hai kỹ thuật sắc ký khí (GC) và khối phổ
(MS) để tạo thành một phương pháp duy nhất trong phân tích hỗn hợp các hóa chất.

Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) là sự kết hợp hai kỹ thuật sắc ký lỏng (LC) và phối
khổ (MS).
GC-MS ra đời sớm hơn tuy nhiên vẫn có một số hạn chế nhất định về chất phân tích nên
LC-MS xuất hiện để bù đắp khuyết điểm của GC-MS.

Các phương pháp sắc ký dùng để phân tích melamine
Sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu đò 3 tứ cực (LC-MS/MS): cũng khá giống hệ thống LC-MS nhưng tốn kém hơn, trang thiết bị
phức tạp cho nên tuy mang lại độ chính xác cao nhưng vẫn khơng được sử dụng rộng rãi.
Sắc kí lỏng cao áp (HPLC): Được Horvath.C tạo ra năm 1967 với các ưu điểm vượt trội như áp suất cao, độ phân giải cao, vận
tốc sắc ký nhanh… được áp dụng trong rất nhiều các lĩnh vực như dược phẩm, sinh lý, các hợp chất vô cơ hữu cơ, các loại dư
lượng.
HPLC dựa vào pha động để phân tách các thành phần trộn lẫn vào nhau, hỗn hợp này sẽ được hịa tan vào các dung mơi để thu
được nhiều cấu tử khác nhau mà các phương pháp phân tích khác khơng thực hiện được và nó dễ dàng phân tích số lượng lớn các
chất hóa học trộn lẫn vào nhau.


Tại sao ta lại chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân
tích mealmine?
Được sử dụng rộng rãi hơn cả trong phân tích lương thực thực phẩm như xác định các hóa chất bị cấm, các chất tồn
dư và kiểm sốt chất lượng, mang lại độ chính xác cao cũng như thời gian tiến hành ngắn và thỏa mãn các tiêu chí:
-Khơng tốn lao động.

-Hiệu quả.

-Giới hạn phát hiện thấp. -Phương pháp đơn giản.
-Giá rẻ.


Hệ thống máy HPLC

Bơm áp suất cao (hệ thống phân phối dung môi hoặc quản lý dung môi) được sử dụng để tạo và đo tốc độ
dòng chảy xác định của pha động, thường là ml/phút.



Dụng cụ tiêm mẫu (quản lý tiêm mẫu hoặc lấy mẫu tự động) có thể đưa (tiêm) mẫu vào dòng pha động liên tục mang mẫu vào cột HPLC.



Cột HPLC chứa vật liệu sắc ký cần thiết để thực hiện việc tách. Vật liệu này được gọi là pha tĩnh vì được giữ cố định bởi phần cứng cột.


Hệ thống máy HPLC

Máy dò là cần thiết để kiểm tra các dải hợp chất tách
biệt khi chúng rửa giải từ cột HPLC (hầu hết các hợp
chất khơng có màu, vì vậy chúng ta khơng thể nhìn thấy
chúng bằng mắt).



Máy tính ghi dữ liệu và điều khiển chung hệ thống.


Các thiết bị và hóa chất chuẩn bị phân tích

Sữa bột hoặc sữa lỏng.
Chất chuẩn: melamine (99%).
Dung môi: methanol.
Dung môi rửa giải: Triflouroacetic và methanol.
Nước tinh khiết: được chuẩn bị cho việc chuẩn bị pha động
và pha loãng được lọc bằng hệ thống Q-Pod Millipore.

Hệ thống sắc ký và số liệu cho việc định lượng

Hệ thống sắc ký – detector: đầu dò UV, cột C18 (150mm x 3,2mm ID, kích thước hạt 5 µm).



Giớ hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của sữa:


Pha dung dịch
Dung môi: Dung môi 50% methanol được chuẩn bị bằng cách pha thể tích bằng nhau của methanol và nước.
Dung dịch chuẩn Melamine:

• Cân chính xác 100 mg melamine vào bình định mức 100 mL, hịa tan với Methanol 50% bằng cách rung

trong bể rung siêu âm 30 phút. Lên thể tích 100 mL thu được dung dịch cú nng melamine 1000
àg/mL.

ã Pha loóng 5mL melamine trờn (1000 µg/mL) bằng 50 ml 50% methanol để được nồng melamine 100
àg/mL.

ã Pha loóng tip 5mL melamine 100 àg/mL bằng 50 ml methanol 50% để được nồng độ melamine 10
µg/mL.


Pha dung dịch

• Cho 10 ml (mẫu dạng lỏng) hoặc 1,0 g (mẫu khơ) vào bình định mức 100 ml. Mẫu được pha với 10 ml
dung dịch melamine của 1000 µg/mL, được pha loãng với 50 ml dung dịch methanol 50% và rung siêu âm

30 phút. Sau khi làm lạnh về nhiệt độ phịng, lên thể tích 100 ml bằng dung dịch methanol 50% và thu
được dung dịch hỗn hợp với nồng độ melamine là 100 µg/mL.


Pha dung dịch

• Cho dung dịch mẫu thu được vào ống li tâm và ly tâm (≥ 3200 rpm) rồi lấy phần dung dịch phía trên ống
(5 ml) chuyển sang bình định mức 50ml, và lên thể tích 50 ml bằng dung dịch methanol 50%. Mẫu được
lọc qua bộ lọc 0.45 µm (Acrodisc, 25mm, màng Nylon). Nghiên cứu về dịch lọc chỉ ra rằng các bộ lọc hấp
thụ melamine tại các mức sau: 22% (cho 1ml ban đầu), 10% (2 mL), <1% (3, 5 và 7ml). Như vậy, 3ml ban
đầu của dịch lọc bị loại bỏ phần lọc còn lại được bổ sung vào một lọ HPLC để phân tích.


Cài dặt thơng số thiết bị
Cột hấp phụ: VenusilASBC8 kích thước: 4.6 x 250 nm.
Pha động: buffer: acetonitrile (ACN) = 85:15; 10mM citric acid; 10mM sodium octane, pH=3.0.
Tốc độ chảy: 1.0 mL/min.
Bước sóng tia UV: 240 nm.
Nhiệt độ: 40°C.
Detector: DAD.


Tiến trình xử lý mẫu

Dung mơi dự trữ
Bộ phận xử lý và hiển thị thơng tin

Tín hiệu truyền sang bộ xử

Bơm để tạo áp suất

lý

cao

Đầu dò

Nơi tiêm mẫu

Cột HPLC
Thải


Kết luận
Phát hiện định lượng melamine có thể thực hiện nhanh chóng và dễ dàng bằng cách sử dụng
HPLC/UV.
Phương pháp này thường được sử dụng như một bài kiểm tra tiêu chuẩn melamine để tránh sản phẩm
sữa chết người đi vào thị trường.
Thị trường sữa hiện nay đang biến động không ngừng, các sản phẩm từ nội lẫn ngoại ồ ạt tung ra thị
trường. Chúng ta cần phải cẩn trọng, sáng suốt trong việc lựa chọn mua và sử dụng sữa, để đảm bảo
dinh dưỡng cũng như an toàn về sức khỏe, hãy là người tiêu dùng thông minh để bảo vệ bản thân và
chính những người thân yêu.