Nghiên cứu, xác định đồng thời hàm lượng vitamin a, d2, d3 trong một số thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ MAI HƢƠNG

NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI
HÀM LƢỢNG VITAMIN A, D2, D3 TRONG M T SỐ
THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU N NG CAO HPLC

LUẬN V N THẠC SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ MAI HƢƠNG

NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI
HÀM LƢỢNG VITAMIN A, D2, D3 TRONG M T SỐ
THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU N NG CAO HPLC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60.44.01.14

LUẬN V N THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS. MAI THỊ THANH HUYỀN

NGHỆ AN - 2015


LỜI CẢM ƠN
Luận văn được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chun đề - Khoa
Hóa, Trung tâm Kiểm định An tồn Thực Phẩm và Mơi trường, Trường Đại
học Vinh.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến:
 TS. Mai Thị Thanh Huyền - Bộ môn Hóa Phân tích, Trường Đại học
Vinh đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện trong suốt q trình
thực hiện luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn:
 PGS.TS Nguyễn Khắc Nghĩa, PGS.TS. Trần Đình Thắng, TS. Đinh
Thị Trường Giang - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện thuận
lợi, động viên tơi trong q trình làm luận văn.
 ThS. Chu Thị Thanh Lâm - Phòng thí nghiệm Khoa Hóa, Trường Đại học
Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tơi trong q trình làm thí nghiệm.
Nhân dịp này, tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cơ, Cán bộ bộ
mơn Hóa Hữu cơ, Hóa Phân tích - Khoa Hóa, Phịng Đào tạo Sau Đại học,
các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã
động viên và giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này.
Nghệ An, tháng 10 năm 2015
Tác giả

Nguyễn Thị Mai Hương

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1. L do chọn đề tài .......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................... 2
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1. Vitamin D .................................................................................................. 3
1.1.1. Giới thiệu, c u tạo, phân loại và tên gọi .......................................... 3
1.1.2. Nguồn cung c p vitamin D cho cơ thể ............................................. 7
1.2. Vitamin A ................................................................................................ 10
1.2.1. Giới thiệu ........................................................................................ 10
1.2.2. Vai trò của vitamin A ..................................................................... 12
1.2.3. Nguồn cung c p vitamin A cho cơ thể ........................................... 14
1.3. Các phương pháp xác định vitamin A và D ........................................... 14
1.3.1. Phương pháp thử nghiệm sinh học................................................. 14
1.3.2. Phương pháp quang ph ................................................................. 15
1.3.3. Các phương pháp x t nghiệm miễn dịch ....................................... 16
1.3.4. Phương pháp sắc k lỏng hiệu năng cao (HPLC).......................... 18
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM ....................................... 27
2.1. Hóa ch t, thiết bị và dụng cụ .................................................................. 27
2.1.1. Hóa ch t .......................................................................................... 27
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ......................................................................... 27
2.2. Thu thập và bảo quản mẫu ...................................................................... 28
2.3. Xử l mẫu ................................................................................................ 28

2.4. Chuẩn bị các dung dịch vitamin cho ph p đo HPLC............................. 28
2.5. Lựa chọn và cài đặt, vận hành thiết bị HPLC ........................................ 29
2.6. Chuẩn bị máy trước khi tiến hành phân tích .......................................... 30
2.7. Khảo sát ph h p thụ tia UV của vitamin A, D2, D3 trong dung dịch.......... 30
2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần pha động .................................. 30
2.9. Phương pháp khảo sát đánh giá .............................................................. 30
2.9.1. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn định lượng của phương pháp ..... 30
2.9.2. Giới hạn phát hiện (LOD) ........................................................ 31
2.9.3. Giới hạn định lượng (LOQ) ..................................................... 32
2.9.4. Xác định độ lặp lại (repeatability) ................................................ 33
2.9.5. Xác định độ thu hồi ........................................................................ 34
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 35
3.1. Các thông số khảo sát.............................................................................. 35
3.3. Khảo sát các điều kiện phân tích trên HPLC ......................................... 35
3.3.1. Khảo sát ph h p thụ tia UV của vitamin D2, D3, A trong
dung dịch ........................................................................................ 35
3.3.2. Lựa chọn cột phân tích cho máy HPLC ......................................... 36
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha động .............................. 37
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng ............................................. 41
3.3.5. Kết quả khảo sát phương pháp đo lập phương pháp chạy
chuẩn vitamin A, D2, D3................................................................. 42
3.4. Xây dựng đường chuẩn của vitamin....................................................... 42
3.5. Khảo sát độ lặp lại của máy .................................................................... 46
3.6. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp ..... 47
3.7. Xác định hiệu su t thu hồi ...................................................................... 49
3.8. Kết quả phân tích một số mẫu thực phẩm .............................................. 50
KẾT LUẬN......................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 55

PHỤ LỤC............................................................................................................ 58


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
25(OH)D

:

25-hydroxyl vitamin D

25(OH)D2 :

25-hydroxyl vitamin D2

25(OH)D3 :

25-hydroxyl vitamin D3

BHT

:

butylate hydroxytoluen.

BSTFA

:

N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide

DM

:

Ch t khô(dry matter).

EtOH

:

Etanol

FTIR

:

Ph p phân tích Fourier hồng ngoại (Fourier transform infrared)

HPLC

:

Sắc k lỏng hiệu năng cao

IT

:

Bẫy ion ( Ion trap)

IS

:

Ch t nội chuẩn(internal standard)

LC

:

Sắc kí lỏng (Liquid chromatography)

MeOH

:

Metanol

MS

:

Ph khối (Mass spectrometry)

MTBE

:

Methyl-tert-butyl ether.

SPE

:

chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)

UPLC

:

Sắc k lỏng hiệu năng cao

UV

:

Tia tử ngoại

DAD

:

Đầu dò mảng diot

RMSE

:

Độ lệch khởi động (root mean square error)

THF

:

Tetra hydro furan

ACN

:

Aceton nitril

LOD

:

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

:

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)


DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Khái qt về c u trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D ........... 4
Hình 2.1. Quy trình xử l mẫu ......................................................................... 29

Hình 3.1. Ph h p thụ UV-VIS của vitamin D2 .............................................. 36
Hình 3.2. Sắc k đồ của vitamin A, D2, D3 ở tốc độ dịng 0,3 ml/phút cột C8 ....... 36
Hình 3.3. Sắc k đồ của vitamin A, D2, D3 ở tốc độ dịng 0,5ml/phút cột C18 ..... 37
Hình 3.4. Sắc k đồ các vitamin khi thay đ i tỷ lệ MeOH:THF .................... 38
Hình 3.5. Sắc k đồ các vitamin khi thay đ i tỷ lệ MeOH:MTBE ................ 39
Hình 3.6. Sắc k đồ các vitamin khi thay đ i tỷ lệ MeOH:ACN ................... 40
Hình 3.7. Sắc k đồ của các vitamin ở các tốc độ dịng khác nhau ................ 41
Hình 3.8. Peak của các nồng độ vitamin D2, D3, A trong đường chuẩn xếp
chồng lên nhau ................................................................................. 44
Hình 3.9. Đường chuẩn vitamin A .................................................................. 44
Hình 3.10. Đường chuẩn vitamin D2 ...................................................................................................... 45
Hình 3.11. Đường chuẩn vitamin D3 ................................................................. 45
Hình 3.12. Sắc đồ mẫu cà rốt ............................................................................. 51
Hình 3.13. Sắc đồ mẫu gan bị ........................................................................... 51
Hình 3.14. Sắc đồ mẫu gan cá Tra ..................................................................... 51
Hình 3.15. Sắc đồ mẫu gan gà ........................................................................... 52
Hình 3.16. Sắc đồ mẫu n m sị .......................................................................... 52
Hình 3.17. Sắc đồ mẫu n m đơng cơ ................................................................. 52
Hình 3.18. Sắc đồ mẫu n m đùi gà .................................................................... 53
Hình 3.19. Sắc đồ mẫu n m Linh chi ................................................................ 53
Hình 3.20. Sắc đồ mẫu gan lợn .......................................................................... 53


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Nhu cầu vitamin D m i ngày của các lứa tu i ............................... 10
Bảng 3.1. Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đ i tỷ lệ
MeOH:THF ...................................................................................... 37
Bảng 3.2. Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đ i tỷ lệ
MeOH:MTBE .................................................................................. 39

Bảng 3.3. Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đ i tỷ lệ
MeOH:ACN ..................................................................................... 40
Bảng 3.4. Sắc k đồ của vitamin D2 ở dòng 1 ml/phút (a) và 0,5 ml/phút (b) ....... 42
Bảng 3.5. Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vitA ......... 43
Bảng 3.6. Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vit D2 ....... 43
Bảng 3.7. Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vit D3 ....... 43
Bảng 3.8. Độ lặp lại của máy HPLC ................................................................ 46
Bảng 3.9. LOD, LOQ của vitamin A ............................................................... 47
Bảng 3.10. LOD, LOQ của vitamin D2 .............................................................. 48
Bảng 3.11. LOD, LOQ của vitamin D3 .............................................................. 48
Bảng 3.12. Kết quả xác định hiệu xu t thu hồi đối với các vitamin ................. 49
Bảng 3.13. T ng hợp các điều kiện phân tích vitamin A, D2, D3 ..................... 50
Bảng 3.14. Kết quả phân tích một số mẫu thực phẩm ....................................... 50


1
MỞ ĐẦU
1. L

o chọn

tài

Vitamin là một ch t không sinh năng lượng nhưng nó khơng thể thiếu
trong sự sống của con người. Vitamin đóng vai trị là ch t xúc tác trong các
phản ứng sinh hóa, từ q trình trao đ i ch t, đến xây dựng hệ thống miễn
dịch trong cơ thể. M i loại vi ch t có những công dụng riêng và đều chứa
trong nguồn thực phẩm hàng ngày. Vitamin giúp chuyển hóa tối đa ch t dinh
dưỡng thành năng lượng sống cho cơ thể, tăng cường sức đề kháng, bảo vệ cơ
thể.Cơ thể con người cần 13 loại vitamin: A, C, D, E, K và 8 loại vitamin

thuộc nhóm B nhưng cơ thể con người chỉ t ng hợp được vitamin D khi có
ánh sáng mặt trời. Chính vì vậy cơ thể l y vitamin từ nguồn bên ngồi là chủ
yếu, có thể l y vitamin từ thức ăn, đồ uống chứa nhiều vitamin như các lại
rau, củ, trái cây…
Vitamin D và vitamin A là hai vitamin thuộc nhóm vitamin tan trong
dầu. Vitamin A r t cần thiết cho thị giác, cho sự tăng trưởng, sự phát triển và
duy trì của biểu mơ. Vitamin A có nhiều trong gan, thận động vật, các chế
phẩm từ sữa, trứng và dầu gan cá. Thiếu vitamin A gây hiện tượng tăng sừng
da, khô mắt, quáng gà lúc xẩm tối.Vitamin Dcó chức năng sinh học là duy trì
nồng độ canxi và phốt pho bình thường trong huyết tương bằng cách tăng
hiệu quả h p thụ các ch t khoáng từ khẩu phần ăn ở ruột non và tăng huy
động canxi, phốt pho từ xương và máu. Vitamin D có nhiều trong gan cá, bơ,
sữa, trứng, n m… Thiếu vitamin D sẽ gây còi xương ở trẻ em, yếu cơ.
Vitamin cần thiết cho cơ thể nhưng thừa vitamin cũng có thể gây nên những
v n đề nghiêm trọng. Trái với nhóm các vitamin tan trong nước khi thừa đều
thải ra theo đường nước tiểu thì các vitamin tan trong dầu được dự trữ ở gan
với các mức độ khác nhau. Với một lượng vitamin A, D quá cao có thể gây


2
ngộ độc cho cơ thể. Nếu thừa vitamin A trong thời gian dài gây đau xương
khớp, rụng tóc, mơi khơ nứt nẻ, chán ăn, gan lách to. Còn khi dùng với liều
cao D2, D3 hàng nghìn lần liều phịng có thể gây ngộ độc. Các triệu chứng hay
gặp là k m ăn, buồn nơn, nóng, tiểu nhiều, ngừng lớn, xanh xao, đơi khi gây
co giật khó thở.
Với những đặc điểm trên, kiểm soát và b sung hàm lượng vitamin phù
hợp là r t quan trọng, nh t là khi trên thị trường ngày càng xu t hiện nhiều
loại thực phẩm chế biến sẵn có b sung vitamin A và D. Vì vậy việc phân tích
hàm lượng vitamin A, D trong thực phẩm là cần thiết, vừa để xây dựng một
quy trình định lượng đồng thờivitamin trong thực phẩm, vừa để góp phần xây

dựng bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm địa phương.Có nhiều phương
pháp, kĩ thuật đánh giá hàm lượng vitamin A, D2, D3 trong thực phẩm, trong
đó phương pháp sắc k lỏng hiệu năng cao cho ph p phân tích với độ nhạy và
độ chọn lọc cao. Vì vậy chúng tôi đã chọn đề tài “NGHIÊN CỨU, XÁC
ĐỊNH ĐỒNG THỜI HÀM LƯỢNG VITAMIN A, D2, D3 TRONG M T S
TH C PH M

NG PHƯ NG PHÁP S C

L NG HI U N NG

CAO (HPLC)”.
2. Mục ích nghiên cứu
Xây dựng được phương pháp xác định đồng thời hàm lượng vitamin A,
D2, D3 trên máy HPLC.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội
tụ, độ nhạy cao, xác định được LOD và LOQ của phương pháp.
- Áp dụng phương pháp để khảo sát, xác định hàm lượng vitamin A,
D2, D3trong một số thực phẩm
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Hàm lượng vitamin A, D2, D3 trong một số thực phẩm gan, cà rốt và n m.


3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Vitamin D
1.1.1. Gi i thiệu, c u tạo, ph n oại và tên gọi
Vitamin D là tinh thể không màu không mùi không vị, không tan trong

nước mà tan trong ch t b o và các dung mơi hữu cơ. Nó được phát hiện ra
năm 1922, được phân lập năm 1932, tìm được c u trúc năm 1936, và đến năm
1959 được t ng hợp nhân tạo. Thuật ngữ vitamin D dùng để chỉ một nhóm
sterol có c u trúc tương tự nhau, có khả năng làm tăng h p thụ canxi và
photphat trong cơ thể chống bệnh cịi xương ở trẻ và lỗng xương hay xốp
xương ở người già. Nhóm ch t này gồm từ D2 đến D7 song quan trọng nh t là
D2 (ergocalciferol được t ng hợp từ ergosterol có nhiều trong n m và men
bia), D3(cholecalferol có trong thịt, cá, gan, trứng, sữa... được t ng hợp từ 7dehydrocholeterol ở dưới da nhờ ánh sáng tia từ ngoại). Trong cơ chế sinh
học, đặc tính và vai trị của chúng khá giống nhau. Trong cơ thể vitamin D
chuyển hoá ở gan và thận tạo ra ch t chuyển hố có đặc tính là 1,25 dihydroxycholecalciferol nhờ enzim deoxylase.
Vitamin D có vai trị quan trọng trong q trình tạo xương và răng nhờ
có tác dụng chuyển hoá và tăng h p thu canxi và phot pho ở ruột. Bên cạnh
đó, canxi cũng cần thiết cho hoạt động của tim, cơ bắp và hệ thần kinh, đồng
thời tham gia vào q trình đơng máu. Ở trẻ nhỏ vitamin D tham gia vào q
trình canxi hố sụn nên r t cần thiết cho sự phát triển xương ở trẻ. Trẻ em bị
thiếu vitamin D dẫn đến cịi xương, lùn, xương bị dị dạng, răng khơng đều bị
dị hình, ở người lớn nêu thiếu vitamin D sẽ dẫn đến loãng xương. Cung c p
đủ lượng vitamin D m i ngày làm giảm nguy cơ mắc bệnh cao huyết áp và
một số bệnh ung thư, vì vitamin D điều hoà lượng canxi trong máu ức chế tế
bào ung thư, đặc biệt là ung thư gan và ung thư đại trực tràng. Bà mẹ mang


4
thai nếu thiếu vitamin D dẫn đên con sinh ra còi xương, khuyết tật, nh t là 3
tháng đầu thai kì, sẽ là t n thương não khơng thể phục hồi.

Hình 1.1. hái quát về cấu trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D
Các biểu hiện cho th y trẻ bị thiếu vitamin D: thần kinh bị kích thích,
ngủ không yên gi c, hay tỉnh gi c, qu y khóc, và rõ ràng nh t là ở trẻ dưới 3
tháng tu i), hay bị mồ hôi trộm cả khi trời lạnh, bị co giật nếu sốt cao, có thể

khó thở. Nếu tình trạng thiếu vitamin D trầm trọng sẽ gây biến đ i cơ, biến
dạng xương, sẽ ảnh hưởng đến chiều cao tầm vóc của trẻ sau này và khó có
thể phục hồi. Vì vậy, các mẹ cần cung c p đủ lượng vitamin D m i ngày cho
trẻ để trẻ phát triển bình thường với tầm vóc cao to khoẻ mạnh.


5
Thiếu vitamin D làm giảm hàm lượng serotonin trong não, ảnh hưởng
đến tinh thần của con người. Serotonin là một loại hoocmon được gọi là
“hoocmon hạnh phúc”, suy giảm lượng hoocmon này khiến tâm trạng con
người b t n, dễ buồn chán, cáu bẳn, khơng kiểm sốt được hành động và suy
nghĩ, nếu thiếu hụt một cách trẩm trọng sẽ dẫn đến trầm cảm. Nguyên nhân
chính dẫn đến thiếu hụt lượng vitamin D trong cơ thể là ít tiếp xúc với ánh
nắng mặt trời, dù cho có chế độ ăn đầy đủ và đều đặn.
Vitamin D đã được hoạt hoá duy nh t ảnh hưởng đến 2000 gen, đặc
biệt là tăng cường hệ miễn dịch. Vì vậy, thiếu vitamin D trong cơ thể gây ra
các chứng bệnh nan y như:
1. Bệnh cúm: ở trẻ nếu thiếu hụt vitamin D sẽ làm giảm khả năng miễn
dịch và dễ nhiễm bệnh ở đường hô h p
2. Suy nhược cơ bắp: theo nghiên cứu, có những người khoẻ mạnh mà
cơ bắp yếu đó là do thiếu hụt vitamin D
3. Bệnh vảy nến: những người ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời khả
năng mắc bệnh là r t cao.
4. Bệnh thận mãn tính: do cơ thể thiếu hụt trầm trọng lượng vitamin D
làm tăng nguy cơ mắc bệnh thận.
5. Đái tháo đường: Theo nghiên cứu, cung c p đủ lượng vitamin D cho
trẻ thì làm giảm 80% nguy cơ mắc bệnh đái tháo đường typ 1.
6. Bệnh hen suyễn: Cung c p đầy đủ lượng 1200 IU/ngày cho trẻ làm
giảm rõ rệt nguy cơ mắc bệnh hen học đường.
7. Bệnh nha chu: những người bị bệnh về nướu mãn tính đau nhức và

chảy máu nướu nên b sung thêm lượng vitamin D để cơ thể sản xu t đủ
defensins và cathelicidin. Đây là các hợp ch t chứa các vi sinh vật giúp làm
giảm vi khuẩn gây bệnh trong miệng
8. Bệnh tim mạch: Thiếu hụt vitamin D trong cơ thể gây suy tim sung
huyết, nguyên nhân dẫn đến căn bệnh tim tiềm ẩn.


6
Theo các nghiên cứu đã đưa ra hàm lượng vitamin D thường được
chuẩn đoán bằng cách đo nồng độ hợp ch t 25-hydroxyvitamin D là một tiền
ch t của 1,25-dihydroxyvitamin D trong máu. Một báo cáo năm 2008 đã chia
thành 4 loại :
 Hơi thiếu 50-100nmol/l (20-40ng/ml)

(1nmol/l = 0.4 ng/ml)

 Thiếu nhẹ 25-50nmol/l (10-20ng/ml)
 Thiếu trung bình 12.5-25.0 nmol/l (5-10ng/ml)
 Thiếu nghiêm trọng <12.5 nmol/l (<5ng/ml)
Theo nghiên cứu hàm lượng cần thiết 25(OH)D trong máu cần thiết để
tránh bệnh còi xương ở trẻ và loãng xương ở người già là 15ng/ml. Lượng
cần thiết để tối ưu hoá sự h p thu canxi ở ruột là 34ng/ml. Gần đây đã phát hiện
ra rằng hàm lượng trung bình 29-38 ng/ml có thể làm giảm đáng kể nguy cơ mắc
bệnh ung thư về nội tạng và trên 33ng/ml sẽ làm giảm 50% tỷ lệ mắc ung thư trực
tràng và ở mức 52 ng/ml làm giảm 50% nguy cơ ung thư vú.
Tuy nhiên, bên cạnh các ưu điểm vượt trội của nó nếu quá lạm dụng
và cung c p quá nhiều cho cơ thể cũng sẽ dẫn đến hậu quả khá nghiêm trọng.
Đó là làm tăng hàm lượng canxi quá mức trong máu, tăng canxi niệu làm đau
nhức xương khớp, tăng huyết áp, tạo sỏi thận, đau mỏi, suy nhược, đau đầu
mệt mỏi, giòn xương...

Giải pháp ngăn ngừa thiếu hụt vitamin D
Nguồn cung c p vitamin D cho cơ thể gồm : ánh sáng mặt trời (phơi
nắng 20 phút/ ngày) và từ thuốc b . Bên cạnh đó có khoảng 10% hàm lượng
vitamin D c p cho cơ thể m i ngày được l y từ bữa ăn. Các thực phẩm giàu
vitamin D như : trứng, cá, gan, sữa, n m, các thực phẩm có b sung vitamin
D.... Lượng vitamin D cần thiết b sung theo khuyến cáo của Viện Dược
phẩm Mỹ là 200- 600IU/ngày. Nhưng thực tế, m i cơ thể cần một lượng
khác nhau tuỳ theo thể trạng, độ tu i của m i người. Có một số trường hợp
lên đến 2000-4000IU/ngày.


7
1.1.2. Nguồn cung c p vitamin D cho cơ thể
Có 3 con đường mà cơ thể h p thụ được vitamin D: qua da, bằng ăn
uống và bằng thuốc b sung.
Theo truyền thống, nguồn vitamin D con người bắt đầu từ da, không
phải bắt nguồn từ miệng. Sự t ng hợp vitamin D của da xảy r t nhanh
chóng và mạnh mẽ, quá trình t ng hợp diễn ra dễ dàng chỉ sau một vài phút
được tiếp xúc với ánh nắng mặt trời. Tiếp xúc với ánh nắng mặt trời chứ
không phải chế độ ăn uống là nguồn cung c p chính vitamin D cho cơ thể
cho dự trữ và tuần hồn, có thể xem đây là một chức năng của phần bề mặt
da hở. Nguồn cung c p vitamin D qua da giúp cung c p 80-85% nhu cầu
vitamin D của cơ thể. Dưới tác dụng của tia cực tím các tiền ch t vitamin D
có ở tuyến bã và lớp Malpighi của biểu bì sẽ được chuyển thành vitamin D.
Nếu được phơi nắng đầy đủ, sau 3 giờ, 1cm 2 da có thể sản xu t ra 18UI
vitamin D3 .
Ví dụ khi người có làn da được tắm nắng vào mùa h (toàn thân, liều
tối thiểu UVB), m i cơ thể sản xu t

20.000 IU vitamin D trong <30 phút.

Để đạt được điều này tương đương với con người sẽ phải uống 200 ly sữa
(100 IU/8 oz thủy tinh) hoặc dùng 50 viên vitamin t ng hợp tiêu chuẩn (400
IU/viên) trong một lần.
Nguồn cung c p tự nhiên vitamin D khác là qua thức ăn. Vitamin D có
trong nguồn thực phẩm từ động vật (D3) và thực vật (D2), có nhiều trong các
thực phẩm như dầu gan cá thu, dầu dừa, lòng đỏ trứng, sữa động vật.
Những thực phẩm chứa nhi u Vitamin D:
Gan n u chín:
Có lẽ nhiều người khơng biết rằng, gan là có một nguồn cung c p
vitamin D tuyệt vời cho cơ thể. Mặc dù t t các loại thực phẩm như gan bò,
gan gà và gan bê đều có chứa một hàm lượng lớn vitamin D, nhưng gan bê có
hàm lượng vitamin D cao nh t trong số đó. Gan bê khơng những hữu ích cho


8
sự phát triển xương mà còn giúp cho làn da, mái tóc khỏe mạnh và thúc đẩy
tái tạo tế bào.
Sữa:
Sữa được xem là một trong những nguồn cung c p vitamin D tốt
nh t. Một ly sữa có chứa r t nhiều ch t dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể.
Ngồi ra, sữa khơng những r t b dưỡng cho trẻ em mà cịn có tác dụng tốt
với sức khỏe của người lớn. Các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng vitamin D có
trong sữa có khả năng chống lão hóa, do đó hãy thêm sữa vào thực đơn
hằng ngày của bạn.
Lòng ỏ trứng:
Trứng là một thực phẩm giàu vitamin D, đặc biệt là phần lịng đỏ trứng.
Lịng đỏ trứng có khả năng điều hòa hệ thần kinh, hệ tim mạch và não. Hơn
nữa, trứng còn làm giảm nguy cơ bị đục thủy tinh thể cũng như kích thích tóc
mọc nhanh hơn.

Cá hồi:
Cá hồi cũng là những nguồn cung c p vitamin D r t lớn. Thực tế, cá
hồi là một trong những nguồn vitamin D tự nhiên và các axít b o thiết yếu
r t hiếm có. Loại cá này giúp cải thiện các chức năng của não bộ và bảo vệ
hệ thần kinh. Nó hoạt động như một ch t chống trầm cảm và do đó h trợ
trong việc giúp não thư giãn, tăng hiệu quả hoạt động của não và cải thiện
trí nhớ.
Dầu gan cá:
Dầu gan cá tuyết được biết đến rộng rãi như là một nguồn cung c p một
lượng lớn vitamin D. Loại dầu cá này có khả năng cải thiện tình trạng của tim
và hệ tim mạch. Hơn nữa, nó h trợ trong việc tăng cường các hoạt động của
cơ bắp và độ đàn hồi của mạch máu. Các nghiên cứu đã cho th y dầu gan cá
giúp làm giảm lượng cholesterol cao trong máu và làm lỗng máu, do đó giảm
nguy cơ tắc nghẽn động mạch.


9
Cá mịi óng hộp
Mặc dù cả cá mịi tươi và đóng hộp đều được ưa chuộng nhưng cá mịi
đóng hộp được cho rằng có lợi hơn cho sức khỏe. Ngồi các ch t dinh dưỡng
khác, cá mịi đóng hộp r t giàu vitamin D, do đó giúp cải thiện sức khỏe của
xương và sức khỏe tim mạch. Hơn nữa, loại thực phẩm này còn được biết đến
như một phương pháp điều trị viêm nhiễm hiệu quả và kiểm soát mức đường
trong cơ thể.
Pho mát
Pho mát là một trong những sản phẩm làm từ sữa r t giàu vitamin D.
Lượng vitamin D này sẽ giúp h p thụ lượng canxi cao từ phơ mai, qua đó tăng
cường độ chắc khỏe của xương và ngăn ngừa chứng loãng xương hiệu quả.
Hơn nữa, sự có mặt của vitamin D trong pho mát r t hữu ích cho việc tăng
cường sức khỏe răng miệng và tránh sâu răng. Điều này r t hữu ích trong việc

ngăn ngừa sự hao mịn men răng.
Cá trích
Cá trích là một trong những nguồn giàu chiết xu t vitamin D. Với hơn
952 IU vitamin D chỉ trong một ch n cá trích, loại cá giàu dinh dưỡng này là
một thực phẩm thiết yếu trong chế độ ăn uống khỏe mạnh. Đặc biệt là cá trích
Đại Tây Dương có lợi hơn nhiều so với cá ở Thái Bình Dương. Mọi cách chế
biến cá trích đều khơng làm giảm đi lượng vitamin D cung c p cho cơ thể.
N m
Dữ liệu về thành phần thực phẩm hiện nay cho th y n m là một nguồn
cung c p vitamin D tốt ngoài các nguồn từ động vật như trứng, sữa, thịt, cá
.v.v... và vitanmin D được bảo toàn tốt trong quá trình n u ăn 16 .
Các báo cáo về n m của một số nước trên thế giới cho th y hàm lượng
vitamin D trong n m tự nhiên ở trong khoảng 2 - 40 µg/100g, có thể đáp ứng
đủ nhu cầu vitamin D trong một ngày của cơ thể người và thay thế nguồn
vitamin D từ các sản phẩm từ động vật, đặc biệt đối với người ăn chay [20].


10
Lượng vitamin D cơ thể cần m i ngày phụ thuộc vào tu i của m i người.
Trung bình lượng khuyến cáo hàng ngày từ t chức Food and Nutrition Board cho
các lứa tu i khác nhau được liệt kê dưới đây đơn vị quốc tế (IU) bảng 1.1.
ng 1.1 Nhu c u vita in D

Liều lượng(IU)

Lứa tuổi

STT

i ngày c a các

a tu i 12 .
Liều lượng ( g)

Khuyến cáo-tối đa Khuyến cáo-tối đa

1

0-6 tháng

200-1000

5-25

2

6-12 tháng

400-1500

10-37,5

3

1-3 năm

600-2500

15-62,5

4

4-8 năm

600-3000

15-75

5

9-13 năm

600-4000

15-100

6

14-18 năm

600-4000

15-100

4

19-70năm

600-4000

15-100

5

Từ 71 tu i trở đi

800-4000

20-100

6

Phụ nữ mang thai và cho
con bú

600-4000

15-100

1.2. Vitamin A
1.2.1. Gi i thiệu
Vitamin A là một nhóm các hợp ch t hữu cơ dinh dưỡng khơng bão
hịa, là tên gọi chung của retinol và các este của nó (retinyl acetat, retinyl
propionat, retinyl palmitat) và một lượng pro vitamin A carotenoid và betacarotene [2].

H3 C

CH3

CH3

CH3
CH2

CH3

R


11
- Một số dạng vitamin A:
Retinol C20H30O (2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 - 6 - 6 trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - ol
CH3

CH3

H3 C

CH3
CH2

OH

CH3

Retinyl acetat C22H32O2 (2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 - 6 6 - trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - yl acetat
CH3

CH3

H3 C

CH3

O
CH2 O

C

CH3

CH3

Retinyl propionate C23H34O2 (2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 - 6 - 6
- trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - yl propionat
H3 C

CH3

CH3

CH3

O
CH2 O

C

CH2

CH3

CH3

Retinyl palmitat (C35H47O2 )(2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 6 - 6 - trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - yl
propionat

H3C

CH3

CH3

O

CH3
CH2 O

CH3

C

(CH2)14 CH3


12
Vitamin A có tính ch t hóa học sau:
- Khơng tan trong nước, tan tốt trong các dung môi của lipit, ete,
ethanol…
- Bền trong điều kiện yếm khí, bền với acid và kiềm ở nhiệt độ

không quá cao.
- Dễ bị oxy hóa bởi oxy khơng khí, ánh sáng làm tăng q trình oxy
hóa vitamin A
- Dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase thì retinol chuyển sang
dạng retinal.
- Phản ứng với SbCl3 cho phức ch t màu xanh.
- Phản ứng với H2SO4 cho phức ch t màu nâu.
1.2.2. Vai trò của vitamin A
Vitamin A có vai trị quan trọng trong sự phát triển của phơi thai, hình
thành cơ quan trong q trình phát triển của thai nhi, chức năng miễn dịch
bình thường, và phát triển của mắt và thị lực.
Vitamin A có các chức năng :
- Bảo vệ c u trúc của da trong toàn bộ cơ thể.
- Yểm trợ thị giác trong quá trình phân biệt vùng sáng và vùng tối.
- Xúc tác sự phóng thích tố sinh dục và hưng ph n quá trình thụ thai.
- Phát triển sự tăng trưởng của nhau và bào thai.
- Hưng ph n quá trình kiến tạo tủy xương.
- Ức chế độc ch t sinh ung thư và gây xơ cứng tế bào.
Vitamin A là một vi ch t có vai trị đặc biệt quan trọng với cơ thể, gồm
4 vai trị chính :
- Trên mắt: vitamin A có vai trị tạo sắc tố võng mạc giúp mắt nhìn
được trong điều kiện thiếu ánh sáng, nếu thiếu vitamin A sẽ giảm khả năng
nhìn trong bóng tối hay cịn gọi là mắc bệnh qng gà, nếu khơng điều trị sẽ
dẫn tới mù lịa.


13
- Trên da và niêm mạc: vitamin A giúp tăng tiết ch t nhày và ức chế sự
sừng hóa. Nếu thiếu vitamin A sẽ làm giảm bài tiết ch t nhày và tăng sự sừng
hóa khiến cho mắt bị khơ da bị khô, nứt nẻ và sần sùi.

- Trên xương : cùng với vitamin D, vitamin A có vai trị giúp cho sự
phát triển xương và tham gia vào quá trình phát triển cơ thể, đặc biệt ở trẻ em.
Nếu thiếu vitamin A trẻ em sẽ còi xương, chậm lớn.
- Trên hệ miễn dịch : vitamin A giúp tăng t ng hợp các protein miễn dịch
nâng, cao sức đề kháng của cơ thể do có tác dụng chống oxy hóa. Khi thiếu
vitamin A cơ thể dễ bị mắc các bệnh nhiễm khuẩn và t n thương ở đường hô h p,
tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục. Dễ nhạy cảm với tác nhân gây ung thư.
Mới đây người ta còn phát hiện vitamin A cịn có khả năng làm
tăng sức đề kháng với các bệnh nhiễm khuẩn, uốn ván, lao sởi, phòng
ngừa ung thư…
Thiếu vitamin A dẫn đến nguy cơ chậm lớn và ngừng phát triển, sừng
hóa các màng nhầy ( ở niệu đạo, phế nang, đường tiêu hóa,..) đặc biệt là sừng
hóa ở giác mạc gây mù lịa. Nếu thừa vitamin A sẽ gây đau bụng, buồn nôn,
bơ phờ, chậm chạp, phù gai thị, thóp phồng, vài ngày tiếp theo da bong toàn
thân rồi hồi phục dần khi đã ngừng thuốc. Nó có thể gây buồn nơn, vàng da,
dị ứng, biếng ăn, nơn mửa, nhìn mờ, đau đầu, t n thương cơ và bụng, uể oải
và thay đ i tính tình. Ngộ độc mãn có thể xảy ra sau khi uống 40.000 đơn vị
hoặc hơn m i ngày, dùng thời gian dài gây đau xương khớp, rụng tóc, mơi
khơ nứt nẻ, chán ăn, gan lách to. Trong các trường hợp kinh niên, rụng tóc,
khơ màng nhầy, sốt, m t ngủ, mệt mỏi, giảm cân, gãy xương, thiếu máu và
tiêu chảy có thể là các triệu chứng hàng đầu gắn liền với ngộ độc ít nghiêm
trọng. Các triệu chứng ngộ độc nói trên chỉ xảy ra với dạng tạo thành trước
(retinoit) của vitamin A (chẳng hạn từ gan), còn các dạng caretonoit (như βcarotene trong cà rốt) không gây các triệu chứng như vậy.


14
1.2.3. Nguồn cung c p vitamin A cho cơ thể
Vitamin A trong thực phẩm có nguồn gốc động vật dưới dạng retinol,
cịn thức ăn có nguồn gốc thực vật ở dưới dạng caroten (tiền vitamin A).
Retinol (các nguồn động vật): cá tuyết và cá bơn, dầu gan, thịt bò, bê, thịt

cừu và thịt gà, gan, bơ, phô mai, trứng, sữa, cá thu, thịt bị, cá mịi đóng hộp...
Beta-Carotene (pro-vitamin A, các nguồn thực vật): cải xoăn, cà rốt
thường xuyên, rau mùi tây, rau bina, khoai lang, mơ khô, cải xoong, cải xanh,
xồi, cà chua, bắp cải, đậu Hà Lan đơng lạnh...
1.3. Các phƣơng pháp xác ịnh vitamin A và D
1.3.1. Phƣơng pháp thử nghiệm sinh học
Phương pháp chính thức đầu tiên để xác định vitamin D là phương
pháp thử nghiệm sinh học, trong đó hoạt tính sinh học của vitamin D được
xác định bằng khả năng của nó ngăn ngừa hoặc cải thiện các triệu chứng thiếu
hụt vitamin D trong cơ thể. [16].
Bằng cách đo khả năng hoạt động chống cịi xương, bằng thử nghiệm
trên lồi chuột (kiểm tra điểm vơi hóa hoặc kiểm tra chữa bệnh cịi xương) đã
từ lâu được sử dụng để xác định vitamin D trong thực phẩm hoặc các dược
phẩm. Chuột còi xương được cho ăn bằng thức ăn có chứa một lượng khác
nhau của vitamin D đã được thiết lập theo các định mức tiêu chuẩn. Sau bảy
ngày, xương của những con chuột được xử l bằng dung dịch nitrat bạc.
Lượng canxi mới được chuyển vào xương được biểu hiện thành vết tối trên
ảnh chụp. Thang tiêu chuẩn được thiết lập bằng cách xây dựng mối liên hệ
giữa các vùng tối trên xương với lượng vitamin D trong chế độ ăn uống (cho
gà con mới sinh thức ăn b sung có chứa hàm lượng khác nhau của vitamin
D). Hàm lượng vitamin D trong mẫu sau đó được xác định bằng cách so sánh
với khu vực mờ tối của ch t chuẩn, từ đó xác định tỷ lệ tro xương sau ba tuần
với m i chế độ ăn uống.


15
Các sinh trắc nghiệm này có thể phát hiện vitamin D ở nồng độ r t
th p. Ví dụ, kiểm tra trên dịng chuột có thể phát hiện hàm lượng th p tới 12
ng vitamin D. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp là không phân biệt
giữa các dạng khác nhau của vitamin D, đòi hỏi thời gian chuẩn bị lâu dài, độ

tin cậy th p so với các phương pháp khác.
Phương pháp thử nghiệm sinh học với vitamin A là đã tiến hành cho
chuột ăn thực phẩm đã bị rút hết ch t b o bằng h n hợp ete-rượu (1909). Với
thí nghiệm này, Step đã đưa ra nhận x t rằng: trong thực phẩm có các yếu tố
hịa tan trong ch t b o cần thiết cho hoạt động sống của cơ thể gọi là yếu tố A,
sau này gọi là vitamin nhóm A.
Từ lâu người ta cho rằng vitamin A chỉ tồn tại chủ yếu trong các sản
phẩm động vật như gan cá, mỡ bò, trứng… Mãi đến năm 1920 Osborn,
Mendel và một số tác giả khác phát hiện th y có các hợp ch t tương tự ở thực
vật. Sau đó tới Eiler (1929), Mur (1930) đã đưa ra

kiến cho rằng các hợp

ch t tương tự đó, các Caroten chính là tiền thân của Vitamin A hay gọi là
provitamin A. Năm 1828-1931 nhà bác học Thụy Sỹ Paul Karrer đã dùng
phương pháp sắc k để phân chia và phát hiện ra c u trúc của Vitamin A và
Caroten. Năm 1950 nhiều nhà hóa học trong đó có Karrer đã t ng hợp thành
cơng ch t β-Caroten là một trong số 3 dạng phân quan trọng của Caroten.
1.3.2. Phƣơng pháp quang phổ
Ph hồng ngoại đã được sử dụng để phân tích định lượng của vitamin
D. Trong các pha rắn, vitamin D2 có thể được phân biệt với vitamin D3 dựa
vào đỉnh ph vitamin D2 tại 907 cm-1.Ph FTIR đặc trưng của tinh thể vitamin
D2 và D3 cũng đã được mơ tả. Vitamin D có thể được định lượng bằng cách
đo sự h p thụ tia cực tím tối đa ở 264 nm. Hạn chế của phương pháp này là
các hợp ch t h p thụ tia cực tím khác trong mẫu đo sẽ can thiệp vào kết quả
định lượng vitamin D [17].


16
Phương pháp so màu cũng được sử dụng rộng rãi nh t để phân tích các

vitamin A trước khi phương pháp HPLC ra đời. Phương pháp này dùng để
phân tích ch t t ng hợp và thực phẩm dựa trên sự hình thành một phức ch t
màu xanh giữa triclorua antimon hoặc trifluoroacetic acid với retinol trong
chloroform, được đo ở 620 nm. Phương pháp này được sử dụng trên toàn thế
giới nhưng dần được thay thế bằng phương pháp HPLC. Vì phương pháp so
màu có nhược điểm: thiếu đặc trưng, màu sắc khơng n định địi hỏi phải
nhanh chóng và thời gian đo lường phải phù hợp, và sử dụng các thuốc thử ăn
mòn và gây ung thư, các bước khảo nghiệm phải được kiểm soát cẩn thận.
1.3.3. Các phƣơng pháp x t nghiệm miễn ịch
Năm 2013 Wendy L. Arneson và cộng sự 24 đã đề cập đến các phương
pháp hiện tại được dùng rộng rãi để đánh giá hàm lượng vitamin D trong lâm
sàng bằng cách đo lượng 25(OH)D và các dạng chuyển hóa hydroxyl vitamin D
khác trong huyết thanh người. Trong bài báo này tác giả có đánh giá về các
phương pháp thường dùng ph biến nh t để định lượng vitamin D đó là phương
pháp miễn dịch phóng xạ (RIA), phương pháp LC-MS/MS và phương pháp
HPLC. Tác giả đã mơ tả khá đầy đủ về quy trình thực hiện phương pháp x t
nghiệm miễn dịch và nêu ra một số phương pháp x t nghiệm miễn dịch để định
lượng vitamin D được FDA ch p thuận hiện có gồm phương pháp x t nghiệm
miễn dịch quang hóa học (ECLIA), phương pháp RIA.
Phương pháp miễn dịch enzyme cũng được sử dụng để phân tích
vitamin D. Vitamin D cho liên kết với protein đồng nh t, từ đó đo lường hàm
lượng thực t ng cộng 25(OH)D. Các t hợp liên kết protein - vitamin D có thể
nhận diện vitamin D2 và D3 và cũng xác nhận hàm lượng t ng cộng 25hydroxy D một cách chính xác.
Lena Jafri và nhóm cộng sự 20 đã so sánh ba phương pháp miễn dịch
phóng xạ (RIA) với HPLC và phương pháp miễn dịch quang hóa học


17
(ECLIA) trong việc định lượng 25(OH)D trong huyết thanh người. Trong
nghiên cứu này, đối với phương pháp RIA: sử dụng một ống phóng xạ gama

đa năng Genesys ghi lại sự phát xạ của các phân tử. Giới hạn phát hiện dưới
của thử nghiệm là 1,5 ng/ml, giới hạn phát hiện trên là 100 ng/mL và CV của
thử nghiệm là 11%. Đối với phương pháp HPLC sử dụng hệ thống HPLC
Perkin Elmer series 200 để phân tích các 25(OH)D huyết thanh, với cột 5 μm
C-18 (4,6 150 mm, Supelco) và một đầu dò mảng diode. L y 0,5ml mẫu
huyết thanh thêm vào 25μl etanol sau khi votex và ủ trong vòng mười phút ở
nhiệt độ phịng thì thêm tiếp 500μl metanol và isopropanol (90:10, v/v) và
tiếp tục votex mười lăm giây. Dung dịch thu được thêm vào 1,5 mL n-hexane
và tiếp tục votex trong 1 phút và ly tâm trong ba phút. Lớp hexane được cho
bay hơi đến khơ dưới dịng khí nitơ. Các mẫu được pha trong 100 ml metanol
và đem phân tích tại tốc độ dịng chảy 1,75 ml/phút với pha động Metanolnước (85:15, v/v) bằng đầu dò UV ở 265nm. Giới hạn phát hiện là 3 ng/ml
trong khi khoảng tuyến tính tiêu chuẩn là 25-100 ng/ml. Với phương pháp
ECLIA sử dụng máy phân tích x t nghiệm miễn dịch Roche (Roche Modular
E170), bộ kit thương mại dựa trên phương pháp ECLIA từ Roche. Giới hạn
phát hiện dưới của thử nghiệm là 4,0 ng/ml, giới hạn phát hiện trên là 100
ng/ml và độ chính xác của thử nghiệm là CV = 9,9%. Hàm lượng trung bình
25(OH)D với HPLC so với RIA là 50,1 nmol/l ( khoảng tuyến tính là 17,7199,4 nmol/l) và 51,1 nmol/l (12,5-187,2 nmol/l), trong khi nồng độ 25(OH)D
trung bình với RIA so với ECLIA là 32,4 nmol/l (9,98-199,7 nmol/l) và 29,9
nmol/l (4,9-214,6 nmol/l). Dữ liệu so sánh cho HPLC so với RIA cho th y
RIA = -1.13 1.01 (HPLC) (RMSE = 11,2 nmol/l) và cho RIA so với ECLIA
thì ECLIA = 3.21 0.9 (RIA) (RMSE=9.6 nmol/l). Kết quả cho th y có mối
tương quan có thể ch p nhận được giữa HPLC và RIA cũng như RIA và
ECLIA trong định lượng 25(OH)D.